專(zhuān)利名稱：一種與妊娠期糖尿病相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
一種與妊娠期糖尿病相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與妊娠期糖尿病相關(guān)的血清/血 漿miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期發(fā)生或首次發(fā) 現(xiàn)的不同程度的葡萄糖耐量異常，若發(fā)生在妊娠早期不排除葡萄糖耐量異常在妊娠前就已 經(jīng)存在的可能性。GDM是最常見(jiàn)的妊娠期合并癥之一，約有3% -8%的孕婦在妊娠期間出現(xiàn) GDM，尤為值得關(guān)注的是，隨著育齡婦女肥胖率的增加，GDM的發(fā)生率不斷上升。
GDM可給母體及胎兒帶來(lái)一系列的并發(fā)癥，如增加自然流產(chǎn)發(fā)生率、妊娠高血壓綜 合征、羊水過(guò)多等，也增加了巨大兒、胎兒發(fā)育異常、胎兒宮內(nèi)窘迫、死胎、死產(chǎn)發(fā)生率；并使 新生兒易發(fā)生低血糖癥、高膽紅素血癥，呼吸窘迫綜合征、紅細(xì)胞增多癥等。如果不及時(shí)進(jìn) 行診斷和治療，不僅孕產(chǎn)婦及胎嬰兒患病率和病死率將明顯上升，產(chǎn)婦及其后代遠(yuǎn)期糖尿 病患病率也將上升。因此，早期診斷、早期干預(yù)、及時(shí)合理治療是預(yù)防GDM、減少母嬰合并癥 的關(guān)鍵，是亟待解決的重大科學(xué)問(wèn)題。
目前國(guó)際上對(duì)GDM的篩查和診斷方法及標(biāo)準(zhǔn)尚未完全統(tǒng)一，通常GDM需在第2孕 期晚期或第3孕期才能進(jìn)行診斷，根據(jù)美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(American Diabetes Association, ADA)禾口美國(guó)婦產(chǎn)禾斗學(xué)會(huì)(American College of Obstetricians and Gynecologists, AC0G)指南，GDM的血清學(xué)篩查在對(duì)-觀孕周進(jìn)行，這樣可用于干預(yù)時(shí)間少之又少。因此，我 們亟需發(fā)現(xiàn)更加明確而有效的生物標(biāo)志物，對(duì)GDM做出輔助早期診斷，這將有助于早期干 預(yù)，減少不良妊娠結(jié)局。
MicroRNAs (即miRNAs)是近年來(lái)分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，它的成熟狀態(tài) 是一類(lèi)長(zhǎng)約19-23個(gè)核苷酸的小單鏈RNA分子，進(jìn)化上具有高度保守性。MiRNA的主要功 能是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)在的與機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病發(fā)生過(guò)程有關(guān)的基因的表達(dá)。自從參與調(diào) 控線蟲(chóng)時(shí)序發(fā)育的lin-4與let-7被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，miRNA分別在2002年和2003年兩度入選 Science雜志年度十大科技突破。2005年預(yù)測(cè)miRNAs至少能調(diào)控5300個(gè)人類(lèi)基因，即所 有基因的30%。隨著研究的深入，越來(lái)越多的miRNAs不斷被發(fā)現(xiàn)。聚光燈下的miRNA已經(jīng) 逐步擺脫了 DNA光芒的掩蓋，從“配角”變成“主角”，并且對(duì)DNA的中心地位提出了新的挑 戰(zhàn)。近年來(lái)，miRNA與疾病的關(guān)系已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA通過(guò)負(fù)調(diào)控 基因的表達(dá)與腫瘤，糖尿病等，心臟病的發(fā)病高度相關(guān)。
研究已經(jīng)證實(shí)血清/血漿中存在幾百種的miRNAs，這些小分子RNAs性質(zhì)穩(wěn)定、 含量豐富、易于定量檢測(cè)，且存在顯著的疾病特異性?，F(xiàn)有的成熟的技術(shù)，包括定性和定量 miRNA分子的技術(shù)，表明利用血清miRNAs作為分子生物標(biāo)志物的方法比傳統(tǒng)的特異蛋白分 子標(biāo)記方法將更加有效，為生物標(biāo)志物開(kāi)拓了新境界。
然而，目前還沒(méi)有用于GDM輔助早期診斷的較為穩(wěn)定的生物標(biāo)志物的報(bào)道，若能篩選出GDM特異或異常表達(dá)的血清/血漿miRNAs作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的輔助早期 診斷試劑盒，對(duì)我國(guó)GDM的診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動(dòng)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，提出一種與GDM相關(guān)的血清/血漿miRNA 標(biāo)志物。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述血清/血漿miRNA標(biāo)志物及其引物在制備GDM輔 助早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
本發(fā)明第四個(gè)目的是提供用于GDM輔助早期診斷的試劑盒。
發(fā)明人通過(guò)分離和研究GDM病例發(fā)病前及與其年齡匹配的健康孕婦對(duì)照血清/血 漿中的miRNAs，尋找一組與GDM發(fā)病高度相關(guān)的高特異性和敏感性的miRNAs，并研制出可 便于臨床應(yīng)用的GDM輔助早期診斷試劑盒，為GDM的篩查和早期診斷提供數(shù)據(jù)支持，為GDM 的干預(yù)提供數(shù)據(jù)支持。
本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種與GDM相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物，該標(biāo)志物為miR-132、miR-29a和 miR-222的組合。
所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物，這些引物為miR_132的引物為SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 ;miR-29a 的引物為 SEQ ID No. 7 和 SEQ IDNo. 8 ;miR_222 的引物為 SEQ ID No. 11和 SEQ ID No. 12。
所述血清/血漿miRNA標(biāo)志物在制備GDM輔助早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
所述血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物在制備GDM輔助早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
一種GDM輔助早期診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測(cè)血清/血漿中miRNA中 miR-132、miR-29a 和 miR-222。
所述診斷試劑盒，該試劑盒含有血清/血漿中miRNA中miR-132、miR-29a和 miR-222的引物。
所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物為miR_132 的引物為 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 ;miR_29a 的引物為 SEQ ID No. 7 和 SEQ IDNo. 8 ； miR-222 的引物為 SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12。
所述診斷試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液， dNTPs, MgCl2, DEPC水和Taq酶等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br> 具體地說(shuō)，本發(fā)明解決問(wèn)題的技術(shù)方案包括(1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫(kù)和數(shù)據(jù) 庫(kù)以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床 資料。( 血清/血漿miRNA差異表達(dá)譜分析選擇GDM病例、與GDM病例年齡匹配的健康 女性對(duì)照，檢測(cè)病例及對(duì)照16-19孕周血清/血漿miRNA表達(dá)譜及含量，分析GDM病例在 發(fā)病前和健康女性對(duì)照間血清/血漿miRNA的共性和特性，篩選差異表達(dá)miRNAs，進(jìn)行進(jìn) 一步多階段驗(yàn)證。( 篩選疾病特異血清/血漿miRNAs 對(duì)已篩選的血清/血漿差異表達(dá) miRNAs在大樣本人群中進(jìn)行定量分析，確定GDM特異性血清/血漿miRNAs (4)血清/血漿 miRNA篩查和輔助早期診斷試劑盒的研制根據(jù)GDM病例和健康女性對(duì)照的特異血清/血4漿miRNA開(kāi)發(fā)miRNAs診斷試劑盒。
本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口 學(xué)資料、臨床資料等(這些資料可用于判斷疾病進(jìn)展，患者年齡等因素對(duì)于發(fā)病的影響)， 并采用了 RT-PCR、Real-time PCR 方法、iTaciMan Low Density Array (TLDA)芯片檢測(cè)等。
具體來(lái)說(shuō)研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分
1.研究樣本的選擇
(1)采集16-19孕周的健康孕婦的血清
(2)上述研究對(duì)象在M-觀孕周GDM篩查時(shí)經(jīng)OGTT確診為GDM的孕婦定義為病例
(3)上述研究對(duì)象在M-觀孕周GDM篩查時(shí)未發(fā)生GDM，與病例年齡、BMI、孕周匹 配的健康孕婦定義為對(duì)照
本研究共采用120例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。
2. Trizol 試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN 公司) 提取血清/血漿總RNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到 5yg RNA/50ml血清或血漿。
3. TLDA(Applied Biosystems 公司)芯片檢測(cè)
(1)總RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品
(2)cDNA樣品進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)
(3)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TLDA芯片檢測(cè)，得到miRNA的表達(dá)譜
(4)數(shù)據(jù)分析與處理
4. Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法
(1)取受試者的血清/血漿總RNA，通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；
(2)設(shè)計(jì)引物；
(3)加入熒光探針或染料進(jìn)行PCR反應(yīng)；
(4)檢測(cè)并比較GDM病例與健康對(duì)照血清/血漿樣本中miRNA的量的變化。
5.診斷試劑盒制備方法
TLDA芯片檢測(cè)方法綜合確定GDM病例和健康對(duì)照中有表達(dá)差異的miRNA，通過(guò) qRT-PCR技術(shù)篩選在GDM病例和健康對(duì)照中表達(dá)量和差異程度大的一組血清/血漿miRNA， 作為GDM早期診斷的指標(biāo)。最后篩選出的與GDM發(fā)病有關(guān)的血清/血漿miRNA組成診斷試 劑盒(miR-132、miR-29a和miR_22》。診斷試劑盒包括這些血清/血漿微小核糖核酸組合 的引物，探針，以及Taq酶、dNTP等試劑。
6.統(tǒng)計(jì)分析方法
運(yùn)用χ 2檢驗(yàn)(用于分類(lèi)變量)或者student t檢驗(yàn)(用于連續(xù)性變量)比較人 口學(xué)特征，血糖水平和miRNA平均表達(dá)水平在研究對(duì)象組間分布的差異。
我們?cè)谔剿餍詷颖救巳?4例GDM病例和M例健康對(duì)照)中運(yùn)用TLDA芯片的研 究結(jié)果發(fā)現(xiàn)有11種miRNAs與⑶M發(fā)病情況有顯著關(guān)聯(lián)。個(gè)體miRNAs檢測(cè)的不同表達(dá)水 平以2_Δ"表示，其中ACt =，我們?cè)诿恳粋€(gè)樣本提取時(shí)加入cel-mir-39的RNA 作為參照，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的miRNAs在另外36例GDM病例和36例 對(duì)照中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，進(jìn)而觀察本研究結(jié)果的穩(wěn)定程度。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均通過(guò)專(zhuān)門(mén)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件完成(SAS，v. 9. 1. 3)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水 平P值設(shè)為0. 05，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。
以下是本發(fā)明進(jìn)一步的說(shuō)明
在上述M例符合條件的GDM病例及M例健康對(duì)照中，兩組年齡按個(gè)體精確匹配。 我們將這兩組人群作為探索性樣本經(jīng)TLDA芯片檢測(cè)獲得相關(guān)結(jié)果。
根據(jù)TLDA芯片檢測(cè)，本發(fā)明人檢測(cè)到在“妊娠期糖尿病病例”組和“健康女 性對(duì)照”組的血清中存在差異表達(dá)(Δ ACT > 3)的微小核糖核酸包括hSa-miR-103、 hsa-miR-125a_5p、hsa_miR-125b、hsa-miR-127_3p、hsa-miR-128、hsa_miR-130a、 hsa-miR-132、hsa-miR-141、hsa-miR-1、hsa-miR-145*、hsa_miR-148b、hsa-miR-181a_2*、 hsa_miR-18a、hsa_miR-196b、hsa_miR-200b、hsa-miR-203、hsa-miR-206、hsa-miR-211、 hsa-miR-212> hsa-miR-22*> hsa-miR-22U hsa-miR-222> hsa-miR-26b*> hsa-miR-27a*> hsa-miR-296_5p、hsa_miR-29a、hsa_miR-29c*、hsa_miR-302d、hsa-miR-31> hsa-miR-338-3p>hsa-miR-378>hsa-miR-41hsa-miR-433> hsa-miR-49l-5p> hsa-miR-493*、 hsa-miR-495、 hsa_miR-513_3p、 hsa_miR-516b、 hsa-miR-517a> hsa-miR-518d_3p、hsa_miR-518e*、hsa-miR_518f、hsa_miR-519a、hsa-miR-524_3p、 hsa-miR-525_3p、 hsa-miR-539、 hsa-miR-543、 hsa-miR-545、 hsa-miR-548c_3p、 hsa—miR-564、hsa-miR-571、hsa-miR-584、hsa-miR-604、hsa-miR-629、hsa-miR-632、 hsa-miR-635、hsa-miR-636、hsa-miR-639、hsa-miR-640、hsa-miR-642、hsa-miR-644、 hsa-miR-650、hsa-miR-660、hsa-miR-661、hsa_miR-67l_3p、hsa-miR-744> hsa-miR-768-3p、hsa-miR-801、hsa-miR-9*、hsa-miR-923、hsa-miR-92a-l*、hsa-miR-93*、 hsa—miR-95、hsa-miR-99a。
根據(jù)上述兩種方法檢測(cè)的結(jié)果，選擇TLDA芯片中兩組研究對(duì)象的CT值均不大于 35的miRNAs用qRT-PCR方法進(jìn)一步的驗(yàn)證，以提高檢測(cè)效率。
滿足上述條件的miRNAs 包括miR_l、miR_125b、miR-132、miR_29a、miR-203、 miR—222、miR—378、miR—518d_3p、miR—632、miR—923、miR—99a。
探針?lè)ê腿玖戏╭RT-PCR結(jié)果均發(fā)現(xiàn)在M例GDM病例和M例健康對(duì)照中，有3 種miRNAs (miR-132, miR-29a, miR-222)在“GDM病例”組和“健康對(duì)照”組中的表達(dá)情況存在顯著性差異。
多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明，這3種miRNAs的表達(dá)水平均與GDM的發(fā)病 存在著顯著關(guān)聯(lián)3種miRNAs均在對(duì)照中高表達(dá)。
根據(jù)上述結(jié)果，將這3個(gè)與妊娠期糖尿病發(fā)病相關(guān)的miRNAs在另外36例GDM病 例和與其年齡、BMI、孕周匹配的36例健康女性對(duì)照進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。我們發(fā)現(xiàn)血清/血漿 低表達(dá)miR-132、miRj9a、miR-222均與妊娠期糖尿病發(fā)病相關(guān)聯(lián)，染料法的結(jié)果與探針?lè)ㄒ恢隆?br> 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于GDM輔助早期診斷的試劑盒，包 含測(cè)定受試者血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測(cè)的成熟miR-132、miRj9a和miR-222的引物 和其他檢測(cè)試劑。
具體而言，這3種miRNAs的組合，或者這3種miRNAs的引物組合構(gòu)成的相關(guān)診斷 試劑盒有助于GDM的早期診斷，為臨床醫(yī)生準(zhǔn)確預(yù)測(cè)孕婦的GDM發(fā)病結(jié)局，及時(shí)采取更具個(gè) 性化的防治方案提供支持，從而最大限度的降低GDM的發(fā)病率，減少不良妊娠結(jié)局。
本申請(qǐng)中“血清/血漿”中的“/”表示“和”及“或”的關(guān)系。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明提供的血清/血漿微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)標(biāo)志物作為GDM早 期診斷的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于
(1)血清/血漿miRNAs是一種新型生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，不僅穩(wěn) 定、微創(chuàng)、易于檢測(cè)，且定量精確，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類(lèi)小分子RNA 生物標(biāo)志物的成功開(kāi)發(fā)將為GDM的早期輔助診斷開(kāi)創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的 研制提供借鑒。
(2)血清/血漿miRNAs試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷和監(jiān)測(cè)試劑盒，可用于GDM 的早期診斷，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確預(yù)測(cè)孕婦GDM結(jié)局、及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提 供支持。
(3)采用嚴(yán)密的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)體系，本發(fā)明人初期采用TLDA芯片檢測(cè)獲取疾病特異 和異常表達(dá)的血清/血漿miRNAs表達(dá)譜，并應(yīng)用qRT-PCR的方法在大樣本中進(jìn)行了驗(yàn)證， 采用了兩種不同的方法(熒光探針?lè)ê腿玖戏?進(jìn)行驗(yàn)證；以上方法和策略的應(yīng)用加速和 保證了血清/血漿miRNAs生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的應(yīng)用，也為其他疾病生物標(biāo)志物的研 制提供方法和策略上的借鑒。
本發(fā)明通過(guò)控制年齡等對(duì)疾病發(fā)展的影響因素，研究血清/血漿miRNA在GDM早 期診斷的應(yīng)用前景，闡述異常表達(dá)的miRNAs對(duì)于GDM進(jìn)展的影響，揭示其篩查和早期診斷 價(jià)值。因此，本發(fā)明獲得了 GDM發(fā)病特異性血清/血漿miRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)和特異性標(biāo)志物； 通過(guò)血清/血漿miRNAs生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得GDM的早期診斷更 加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情，為臨床治療效果評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn) 具有潛在治療價(jià)值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。


圖1.顯示GDM病例組和健康對(duì)照組的miR-132的表達(dá)箱線圖。
圖2.顯示GDM病例組和健康對(duì)照組的miR49a的表達(dá)箱線圖。
圖3.顯示GDM病例組和健康對(duì)照組的miR-222的表達(dá)箱線圖。
圖中
DS 探索性樣本，IS 驗(yàn)證性樣本，control 對(duì)照，case 病例具體實(shí)施方式
實(shí)施例1樣品的收集和樣品資料的整理
發(fā)明人于2008年開(kāi)始至今從南京市婦幼保健院收集了大量的16-19孕周孕婦的 外周血樣品(用于研究的樣本為同期收取，采樣、分裝、保存條件均一)，通過(guò)對(duì)樣品資料 的整理，發(fā)明人從中選擇了 120例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本作為T(mén)LDA芯片檢測(cè)和后續(xù)一系列 qRT-PCR驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)樣品
1、采血時(shí)為16-19孕周健康孕婦
2、上述研究對(duì)象在M-觀孕周GDM篩查時(shí)經(jīng)OGTT確診為GDM的孕婦定義為病例
3、上述研究對(duì)象在24- 孕周GDM篩查時(shí)未發(fā)生GDM，與病例年齡、BMI、孕周匹配 的健康孕婦定義為對(duì)照
并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料、臨床資料等情況。
實(shí)施例2血清/血漿中miRNA的TLDA芯片檢測(cè)
將上述符合條件的M例GDM病例和M例健康對(duì)照經(jīng)TLDA芯片檢測(cè)獲得相關(guān)結(jié) 果。具體步驟為
1、分別取“妊娠期糖尿病病例”組和“健康女性對(duì)照”組患者的血清600 μ 1，加入 3倍體積的Trizol試劑；
2、相分離室溫放置15min，加入終濃度為l(T4pm0l/ μ 1的cel_39 (TAKARA)作為 內(nèi)參，然后加入與血漿等體積的氯仿，震蕩50s，室溫15min，14，OOOrpm，4°C，離心15min ；
3,RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)移到新的15ml的離心管，加入1. 5倍水相體積的無(wú)水乙醇， 充分混勻；
4、用QIAGEN miRNeasy kit試劑盒富集RNA 每次吸取700 μ 1樣本至離心柱中， 14，OOOrpm離心15s，棄去收集管中濾液，重復(fù)至樣本均過(guò)柱；加入700 μ 1試劑盒提供的洗 液1，14，OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；加入500 μ 1試劑盒提供的洗液2，14，OOOrpm 離心15s，棄收集管中濾液；再加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm離心2min，棄收集管中濾 液；將離心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm離心^iin以干燥離心管；將離心管放入新的 1. 5ml管中，加入50 μ 1無(wú)核酸酶水，10，OOOrpm離心Imin ；將管中的液體倒回離心柱中， 14，OOOrpm離心lmin，棄離心柱；
5、測(cè)量濃度通常能得到 1250ng RNA/600 μ 1血清；
6、用TLDA芯片配套的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng) 體系包括0. 8μ 1逆轉(zhuǎn)錄引物(10Χ)、0. 2μ 1 IOOmM dNIPs混合物、1. 5 μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/ μ L)、0. 8 μ 1 IOX逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0. 9 μ 1 25mM氯化鎂、0. 1 μ 1 RNA抑制劑以及0. 2 μ 1無(wú) 核酸酶水。加入3μ l(l-350ng)的總RNA。反應(yīng)步驟為16°C孵育2分鐘，42°C反應(yīng)1分鐘， 50°C反應(yīng)1秒，上述3步經(jīng)40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，再85°C孵育5分鐘；
10、對(duì)芯片特異性的miRNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增以增加表達(dá)所需的cDNA的量。預(yù)擴(kuò)增的反 應(yīng)體系包括12. 5μ 1預(yù)擴(kuò)增Master Mix (2 X) ,2. 5 μ 1預(yù)擴(kuò)增引物(10 X)、7. 5 μ 1無(wú)核酸 酶水、2. 5 μ 1 CDNA。反應(yīng)步驟為95°C 10分鐘一55°C 2分鐘一72°C 2分鐘一95°C 15秒、 600C 4分鐘，12個(gè)循環(huán)一99. 90C 10分鐘；反應(yīng)結(jié)束后加入75 μ 1 0. IX TE稀釋?zhuān)?br> 11、取9μ 1稀釋后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，加入450μ 1基因表達(dá)Master Mix，441 μ 1無(wú)核 酸酶水，充分混勻后，在TLDA芯片上加入100 μ 1/孔；IOOOrpm離心lmin，離心2次。TLDA 芯片實(shí)驗(yàn)使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀。選擇384-well TaqMan Low Density Array特定的程序進(jìn)行反應(yīng)；
12、數(shù)據(jù)分析與處理用RQ-Manger軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Ct閾值設(shè)為0. 2，Δ Ct = Ct #*-CT U6 (U6為T(mén)LDA芯片中的內(nèi)源性U6，用以控制板間差異)，兩組樣品血清miRNAs的表達(dá) 量比值可用方程Δ Δ Ct表示，Δ ACt =厶(^病例-厶(^對(duì)照_厶(^小39，其中Δ CTcel_39 = CTcel_39 病例_CT。el-39對(duì)照，(cel-39用以控制RNA提取時(shí)的差異)。運(yùn)用TLDA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的“GDM病 例”組和“健康女性對(duì)照”組中血清差異表達(dá)的微小核糖核酸在上文中已經(jīng)羅列出。
實(shí)施例3血清/血漿中miRNA的qRT_PCR實(shí)驗(yàn)
根據(jù)上述TLDA 結(jié)果，選擇 miR-l、miR-125b、miR-132、miRj9a、miR-203、miR-222、 miR-378、miR-518d-3p、miR-632、miR-923、miR-99a 等 11 個(gè) miRNAs 設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)錄和 qRT-PCR的引物。對(duì)“GDM病例”組和“健康對(duì)照”組的血清單個(gè)個(gè)體進(jìn)行miRNA的qRT-PCR檢測(cè)，見(jiàn) 表1。在整個(gè)研究過(guò)程中均實(shí)施嚴(yán)格的質(zhì)控。每個(gè)樣本連續(xù)檢測(cè)三次。所有檢測(cè)均采用盲 法，即在不清楚樣本背景的情況下完成以避免偏倚。分別用染料法和探針?lè)▋煞N方法進(jìn)行 qRT-PCR 檢測(cè)。
(1)制備RNA樣品a)取100 μ 1血清；b)加3倍體積的Trizol室溫放置15min， 加入終濃度為10_4ρπιΟ1/μ 1的cel-39 (TAKARA)作為內(nèi)參，然后加入與血漿等體積的氯仿， 震蕩50s，室溫15min，14，000rpm，4°C，離心15min ；c)將水相轉(zhuǎn)移到新的15ml的離心管， 加入1. 5倍水相體積的無(wú)水乙醇，充分混勻；d)用QIAGEN公司的miRNeasykit富集RNA 每次吸取700 μ 1樣本至離心柱中，14，OOOrpm離心15s，棄去收集管中濾液，重復(fù)至樣本 均過(guò)柱；加入700 μ 1洗液1,14, OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；加入500 μ 1洗液2， 14，OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；再加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm離心2min，棄收集 管中濾液；將離心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm離心aiiin以干燥離心管；將離心管放入 新的1. 5ml管中，加入50 μ 1無(wú)核酸酶水，10, OOOrpm離心Imin ；將管中的液體倒回離心柱 中，14，OOOrpm離心lmin，棄離心柱，將管中的液體作為RNA樣品；
cel-39 正向引物ACACTCCAGCTGGGTCACCGGGTGTAAATC，反向引物CTCAACTGGTGTC GTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAAGCTGA。
(2)探針?lè)ㄊ褂肁BI試劑盒。
a)通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。探針?lè)ǖ哪孓D(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括0. 15 μ 1 IOOmMdNTPs混合物、1 μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/ μ L)、1. 5 μ 1 IOX逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0. 19 μ 1 RNA抑 制劑以及3 μ 1 5Χ逆轉(zhuǎn)錄引物(即表3中的反向引物)一種或幾種的混合物。加入9. 16 μ 1 的總RNA。反應(yīng)步驟為16°C孵育30分鐘，42°C反應(yīng)30分鐘，85°C孵育5分鐘；
b) q-PCR 將cDNA力卩入5μ 1水稀釋?zhuān)?μ 1稀釋后的cDNA，力Π入 0. 25μ 120 XMicroRNA檢測(cè)探針、2· 5μ 1 2 X 基因表達(dá) Master Mix、1. 25 μ 1 雙蒸水，5 μ 1 體系進(jìn)行q-PCR。儀器使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀，PCR的反應(yīng)條件是95°C、 5分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)一950C、15秒，60°C、1分鐘進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。
(3)染料法
a)通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。染料法的逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4 μ 1 5 X AMV 緩沖液、2 μ 1 IOmM dNTP 混合物(Takara 公司)、0. 5 μ 1 RNase 抑制劑(Takara 公司)、 2 μ lAMV(Takara公司)以及1. 5 μ 1 miRNA特異性反向引物一種或幾種的混合物。反應(yīng)步 驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應(yīng)1小時(shí)，85°C孵育5分鐘；
b) q-PCR 將cDNA按1/5體積稀釋?zhuān)?. 5 μ 1稀釋后的cDNA，加入0. 15 μ 1 Taq酶 (Takara 公司)，0. 5μ 1 20 X EVA GREEN, 0. 1 μ 1 10 μ M 正向引物一種，0. 1 μ 1 ΙΟμΜ 通用 反向引物(URP :TGGTGTCGTGGAGTCG, SEQ ID No. 25) ,0. 6 μ 1 25mM MgCl2,0. 8 μ 1 2. 5mMdNTP 混合物(Takara公司)，1 μ 1 10XPCR緩沖液，6. 75 μ 1雙蒸水，10 μ 1體系進(jìn)行q-PCR。儀 器使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀，PCR的反應(yīng)條件是95°C、5分鐘進(jìn)行1個(gè)循 環(huán)一950C、15秒，60°C、1分鐘進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。
(4)數(shù)據(jù)處理與分析
兩組樣品血清miRNAs的表達(dá)量比值可用方程2_Δα表示，其中Δ Ct =參,我們?cè)诿恳粋€(gè)樣本提取時(shí)加入cel-39的RNA作為參照，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量(cel-39 =SEQIDNo. 7 和 SEQ ID No. 8)。
探針?lè)ê腿玖戏╭RT-PCR結(jié)果均發(fā)現(xiàn)在48例樣本中，有3種miRNAs (miR-132、 miR-29a和miR-22》在兩組間的表達(dá)情況存在顯著性差異，探針?lè)ńY(jié)果見(jiàn)表1、表2、圖1， 染料法結(jié)果與探針?lè)?lèi)似未列出。
實(shí)施例4血清中微小核糖核酸qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究
根據(jù)上述結(jié)果，將這3種與妊娠期糖尿病發(fā)病相關(guān)的miRNAs在另外36例GDM病 例與36例匹配的健康對(duì)照中進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)miR-132、miR-29a和miR-222在 GDM病例組血清中的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組，探針?lè)ㄅc染料法結(jié)果同樣一致。
實(shí)施例5用于GDM輔助早期診斷的miRNA試劑盒的制作
miRNA試劑盒的制作和操作流程是基于TLDA芯片檢測(cè)，RT-PCR和real-time PCR 等技術(shù)。試劑盒包括血清/血漿miRNA引物(包括下列引物miR-132的引物為SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 ；miR-29a 的引物為 SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8 ；miR-222 的引物為 SEQ IDNo. 11和SEQ ID No. 12)，還可以有相應(yīng)PCR反應(yīng)所需的常用酶和/或試劑，如逆 轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs, MgC12，去核酸酶水，熒光染料或探針、Taq酶、通用反向引物(URP TGGTGTCGTGGAGTCG)等，可根據(jù)具體采用的實(shí)驗(yàn)方法選用，這些常用酶和/或試劑是本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟知的，另外還可以有標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照(如定量標(biāo)化的線蟲(chóng)mir-39樣本等)及正常 參考值。此試劑盒的價(jià)值在于只需要血清/血漿而不需要其它組織樣品，通過(guò)最精簡(jiǎn)的熒 光或探針?lè)z測(cè)miRNA的變化趨勢(shì)，再通過(guò)該趨勢(shì)輔助早期診斷GDM，不僅穩(wěn)定，檢測(cè)方便， 且定量精確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實(shí)踐，可以幫助指 導(dǎo)臨床準(zhǔn)確做出診斷。
表1.病例組和對(duì)照組TLDA芯片檢測(cè)結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.一種與妊娠期糖尿病相關(guān)的血清/血漿HiiRNA標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志物為 miR-132,miR-29a 和 miR-222 的組合。
2.權(quán)利要求1所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物，其特征在于該引物為 miR-132 的引物為 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 ;miR_29a 的引物為 SEQ ID No. 7 和SEQID No. 8 ；miR-222 的引物為 SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12。
3.權(quán)利要求1所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物在制備妊娠期糖尿病輔助早期診斷試劑 盒中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物在制備妊娠期糖尿病輔助早期診 斷試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種妊娠期糖尿病輔助早期診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測(cè)血清/血漿 中 miR-132、miR-29a 和 miR-222。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有血清/血漿miRNA中 miR-132, miR-29a 和 miR-222 的引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述的血 清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常 用的酶和試劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與妊娠期糖尿病相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為miR-132、miR-29a和miR-222的組合。該標(biāo)志物及其引物可用于制備診斷試劑盒，用于妊娠期糖尿病的輔助早期診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102031261SQ20101052092
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者沙家豪, 潘世揚(yáng), 石中華, 胡志斌, 董靜, 趙純, 霍然 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)