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稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標(biāo)記檢測方法及其引物的制作方法

文檔序號:586336閱讀:321來源:國知局
專利名稱:稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標(biāo)記檢測方法及其引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種檢測稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標(biāo)記引物,以及利用所述 引物檢測稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標(biāo)記方法。
背景技術(shù)
水稻是重要的糧食作物之一,而稻瘟病是世界分布最廣、為害最嚴重的水稻病害 之一,己成為水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙因素(Ou S H. 1980,Pathogen variability and hostresistance in rice blast disease. Ann Rev Phytopathol. 18 :167-187.),它造成的 危害正嚴重威脅著人類的糧食安全。防治稻瘟病也同其他水稻病害一樣,是通過利用殺菌 劑,栽培措施與種植抗病品種相結(jié)合的方式進行的,而種植抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟 有效的辦法之一。然而要卓有成效地開展抗病育種工作,除了必須尋找優(yōu)良的抗源外,還必 須深入研究稻瘟病菌的致病機制以及水稻與稻瘟病菌之間的互作機理等,而且在病原菌與 寄主協(xié)同進化過程中,病原菌毒力基因組成會隨著寄主抗病基因組成的變化而改變,最終
ijiifi^lmfΨiiliiWiS^c (Zeigler R S. 1998, Recombination in Magnaporthe grisea. AnnuRev Phytopathol,36 :249_275.)。在分子水平上研究這種互作關(guān)系,不僅要不斷發(fā)現(xiàn) 和利用新的抗病基因,進行水稻品種抗病基因分析,將多個抗病基因混合使用外,同時也必 須對稻瘟病菌群體中的無毒基因進行分析。對無毒基因產(chǎn)物的研究是進一步了解特異性的 分子遺傳機制的重要手段,無毒基因可以作為一種分子探針用于研究稻瘟病菌的毒性群體 結(jié)構(gòu)特征,揭示其變異規(guī)律及動態(tài),也可為抗病品種的合理布局和培育抗病品種及病害防 治提供理論依據(jù),從而達到長期、有效地控制該病害的目的(石軍等,稻瘟病菌無毒基因研 究進展.中國生物工程雜志,2006,26 (12) :112 116)。按照傳統(tǒng)稻瘟病菌毒性組成(生理小種)鑒定的方法是通過鑒別品種的致病型鑒 定劃分生理小種來研究稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu),通過這種方法可了解稻瘟病菌群體中的生理 小種組成和優(yōu)勢種群的變化,從而掌握稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)和遺傳變異動態(tài),但劃分的生 理小種常因鑒別品種而異,且工作量大,結(jié)果易受季節(jié)限制,環(huán)境條件人為因素的影響,難 以準確反映稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)(陳慶河,稻瘟病菌群體遺傳多樣性及其無毒基因的遺傳 分析與分子標(biāo)記定位.2005.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文)。隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展,DNA水平上的指紋分析技術(shù)(如,SSR, RAPD, CAPS)為研究稻瘟病菌群體無毒基因的組成提供了高效、快速的方法,避免了通過鑒 別品種的致病型鑒定的大量工作,因此國內(nèi)外都非常重視稻瘟病菌無毒基因的分子標(biāo)記篩 選工作。目前利用DNA分子標(biāo)記已鑒定了 40多個稻瘟病菌的無毒基因(Ma,J. H.,Wang, L. , Feng, S. J. , Lin, F. , Xiao, Y. , and Pan, Q. H. 2006. Identification and fine mapping of AvrPi15, a novel avirulence gene of Magnaporthe grisea. Theor Appl Genet 113 :875-883.),并已經(jīng)克隆到了 9 個無毒基因(PwlU Pwl2、Avr_C039、Avr-Pita、ACEU Avr-Pia、Avr-Pii, AvrPiz-t和Avr-Pik),這就為通過分子標(biāo)記來鑒定毒性組成創(chuàng)造了便 捷條件。一些無毒基因連鎖的分子標(biāo)記(尤其是早期定位所用的分子標(biāo)記)大多是RFLP標(biāo)記,但由于這類標(biāo)記需要復(fù)雜的操作程序、昂貴的生化試劑和大量樣本的DNA,不便于無 毒基因的毒性組成分析。近年來,越來越多種類的生物基因組序列公布出來,使得分子標(biāo)記 的發(fā)展迅速。本研究采用的CAPS標(biāo)記(酶切擴增多態(tài)性序列,Cleaved Amplified PolymorphismSequences)是基于RFLP標(biāo)記發(fā)展而來,由特異引物PCR與限制性酶切相結(jié)合 而產(chǎn)生。當(dāng)SCAR或STS的特異擴增產(chǎn)物的電泳譜帶不表現(xiàn)多態(tài)性時,可以用限制性內(nèi)切酶 對擴增產(chǎn)物進行酶切,然后再通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其多態(tài)性。它揭示的 是特異PCR產(chǎn)物DNA序列內(nèi)限制性酶切位點變異的信息,目前已經(jīng)在分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、 育種學(xué)等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。CAPS是一種基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記,具有共顯性、位點 特異性、重復(fù)性好、操作簡單和成本低等特點,是一種值得推廣的標(biāo)記手段,有助于揭示大 田中無毒基因的變異規(guī)律及動態(tài),能大大增加目標(biāo)染色體區(qū)段的PCR標(biāo)記飽和度,加快無 毒基因的克隆工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用分子標(biāo)記快速、準確檢測稻瘟病菌無 毒基因Avr-Pit的方法,篩選獲得與無毒基因Avr-Pit緊密連鎖且不受環(huán)境影響的分子標(biāo) 記并進行染色體定位,將分子標(biāo)記與病菌的毒性組成緊密地聯(lián)系起來。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種檢測稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標(biāo)記引 物,其上游引物序列如SEQ ID No. 1所述,下游引物序列如SEQ ID No. 2所述。一種稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標(biāo)記檢測方法利用上述的引物擴增待測 稻瘟病菌基因組DNA,取擴增產(chǎn)物用酶EarI進行酶切,然后對酶切片段進行凝膠電泳,若出 現(xiàn)兩條長度分別為268bp和IOlbp的片段,則待測稻瘟病菌基因組含有無毒基因Avr-Pit。上述的檢測方法,其中EarI酶切體系為10X4buffer 2. 0μ 1,DNA 0. 5 μ g, EarI 酶0. 5 μ 1,加無菌超純水至20 μ 1。本發(fā)明提供另一種檢測稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標(biāo)記引物,其上游引物 序列如SEQ ID No. 3所述,下游引物序列如SEQ ID No. 4所述。本發(fā)明提供另一種稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標(biāo)記檢測方法利用上述的 引物擴增待測稻瘟病菌基因組DNA,取擴增產(chǎn)物用酶PciI進行酶切,然后對酶切片段進行 凝膠電泳,若出現(xiàn)兩條長度分別為472bp和382bp的片段,則待測稻瘟病菌基因組含有無毒 基因 Avr-Pit。上述的檢測方法,其PciI酶切體系為10X3buffer 2. 0μ 1, DNA 0. 5 μ g, 100 X BSA 0. 2 μ 1,PciI 酶 0. 5 μ 1,加無菌超純水至 20 μ L·上述的檢測方法,擴增待測稻瘟病菌基因組DNA的PCR反應(yīng)體系為10ΧΕχ Taqbuffer 5. 0 μ 1,MgCl22mM,dNTPs 0. 2mM, Ex Taq DNA 聚合酶 1. 25U,上、下引物各為 0. 5 μ Μ,模板DNA 2. 5ng,加無菌超純水至50 μ 1 ;PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性5min ;94°C 變性30S, 57°C退火30S, 72°C延伸Imin, 31個循環(huán);72°C延伸8min。本發(fā)明具有以下有益效果與現(xiàn)有的分子標(biāo)記技術(shù)相比,其優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在(1)標(biāo)記穩(wěn)定本發(fā)明獲得的無毒基因分子標(biāo)記為CAPS標(biāo)記,兩個連鎖的分子標(biāo)記穩(wěn)定,不易受反應(yīng)體系、條件、DNA濃度的影響,而且操作簡單,結(jié)果明確。(2)節(jié)約時間和成本稻瘟病菌群體毒性組成監(jiān)測的傳統(tǒng)方法是通過鑒別品種的 致病型鑒定劃分生理小種來研究稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu),通過這種方法可了解稻瘟病菌群體 中的生理小種組成和優(yōu)勢種群的變化,從而掌握稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)和遺傳變異動態(tài),但 鑒定受季節(jié)的限制、劃分的生理小種常因鑒別品種而異,且結(jié)果易受環(huán)境條件人為因素的 影響,準確性低,難以準確反映稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)。通過本發(fā)明篩選出的與無毒基因緊密 連鎖的分子標(biāo)記不受環(huán)境影響,可以準確地靶定無毒基因,節(jié)約大量時間和成本,快速分析 田間稻瘟病菌無毒基因的組成、分布及演變規(guī)律。本發(fā)明通過對稻瘟菌株交配產(chǎn)生的子囊孢子后代群體進行遺傳分析,運用CAPS 標(biāo)記技術(shù),可以構(gòu)建并定位稻瘟菌無毒基因Avr-Pit的遺傳圖譜,獲得了與無毒基因緊密 連鎖的分子標(biāo)記。通過獲得與稻瘟病菌無毒基因緊密連鎖的分子標(biāo)記,不僅可利用該無毒 基因的標(biāo)記作探針,研究該無毒基因在自然群體中的分布情況,揭示病菌群體毒性組成和 變異特點,且為進一步物理作圖法克隆該無毒基因奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明用分子標(biāo)記技術(shù),定位 了稻瘟病菌的無毒基因Avr-Pit。


圖Ia為電泳檢測由CAPS標(biāo)記引物CAPS77擴增稻瘟病菌親本菌株基因組DNA產(chǎn) 物的酶切結(jié)果;圖Ib為電泳檢測由CAPS標(biāo)記引物CAPS77擴增稻瘟病菌部分雜交后代基因 組DNA產(chǎn)物的酶切結(jié)果;A 無毒菌株,V 毒性菌株;M :2kb plus marker。圖2為電泳檢測由CAPS標(biāo)記引物CAPS88擴增稻瘟病菌親本菌株及部分雜交后代 基因組DNA產(chǎn)物的酶切結(jié)果;A 無毒菌株,V 毒性菌株;M :2kb plus marker0圖3為無毒基因Avr-Pit的部分連鎖遺傳圖。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明,但并不是對本發(fā)明的限 制,僅僅作示例說明。實施例1 稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit連鎖的分子標(biāo)記、定位,是通過以下方法獲得的1)利用親本Guyll與JS153(親本菌株為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植病系保存菌株)以 及雜交獲得的有性后代(陳慶河等鑒定),在初步得到的與無毒基因Avr-Pit連鎖遺傳 的 SSR 標(biāo)記 m355-356 基礎(chǔ)上(Chen QH, Wang YC, Li AN, Zhang ZG, Zheng XB. 2007. Molecularmapping of two cultivar-specific avirulence genes in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Mol Genet Genomics. 277 (2) : 139—48. ),十 CAPS 豐示i己弓| 物,引物序列如表1 表 權(quán)利要求
一種檢測稻瘟病菌無毒基因Avr Pit的分子標(biāo)記引物,其特征在于其上游引物序列如SEQ ID No.1所述,下游引物序列如SEQ ID No.2所述。
2.一種檢測稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標(biāo)記引物,其特征在于其上游引物序 列如SEQ ID No. 3所述,下游引物序列如SEQ ID No. 4所述。
3.—種稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標(biāo)記檢測方法,其特征在于利用權(quán)利要求 1所述的引物擴增待測稻瘟病菌基因組DNA,取擴增產(chǎn)物用酶EarI進行酶切,然后對酶切片 段進行凝膠電泳,若出現(xiàn)兩條長度分別為268bp和IOlbp的片段,則待測稻瘟病菌基因組含 有無毒基因Avr-Pit。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法,其特征在于EarI酶切體系為10X4buffer 2. 0μ 1,DNA 0. 5μ g, EarI 酶 0· 5 μ 1,加無菌超純水至 20 μ 1。
5.一種稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標(biāo)記檢測方法,其特征在于利用權(quán)利要求 2所述的引物擴增待測稻瘟病菌基因組DNA,取擴增產(chǎn)物用酶PciI進行酶切,然后對酶切片 段進行凝膠電泳,若出現(xiàn)兩條長度分別為472bp和382bp的片段,則待測稻瘟病菌基因組含 有無毒基因Avr-Pit。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法,其特征在于PciI酶切體系為10X3buffer 2. 0μ 1,DNA 0. 5μ g, 100XBSA 0. 2 μ 1,PciI 酶 0· 5 μ 1,加無菌超純水至 20 μ 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6任一項所述的檢測方法,其特征在于擴增待測稻瘟病菌基因 組 DNA 的 PCR 反應(yīng)體系為10 X Ex Taq buffer 5. 0 μ 1,MgCl22mM, dNTPs 0. 2mM, Ex Taq DNA聚合酶1. 25U,上、下引物各為0. 5μΜ,模板DNA 2. 5ng,加無菌超純水至50 μ 1 ;PCR反 應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30S,57°C退火30S,72°C延伸Imin, 31個循環(huán);72°C 延伸8min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用分子標(biāo)記快速、準確檢測稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的方法,其利用兩對特異性引物,其中一對引物的上游引物為ACCGCGATCAGTGGAAAACT,下游引物為ATTGGCAGAGCCAGCTACTC;另一對引物的上游引物為TTGTGTTCCTGTCAATCGCG,下游引物為CGCAGCTTATATCTCGGATAG。本發(fā)明方法操作簡單,結(jié)果明確,節(jié)約時間和成本。
文檔編號C12N15/11GK101942521SQ20101050616
公開日2011年1月12日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者張正光, 王源超, 董妍涵, 董莎萌, 鄭小波 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
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