專利名稱：檢測十種主要柑桔病害病原的基因芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于一種基因芯片，具體的說，涉及一種檢測主要的十種柑桔病害病原的 基因芯片。
背景技術：
柑桔是世界第一大水果，我國柑桔栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位，在國民經(jīng)濟中 占有十分重要的地位。近幾年來，隨著我國柑桔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)帶的確立，柑桔的種 植區(qū)域更趨集中，面積亦進一步擴大，而病害問題日益引起生產(chǎn)者的重視。隨著國際柑桔 貿(mào)易的持續(xù)增長及種質(zhì)資源交換的日益頻繁，各種檢疫性柑桔病害傳入我國的機率不斷加 大。柑桔麻風病是由柑桔麻風病毒(Citrus leprosis virus, CiLV)引起的一類重要 柑桔病毒病害，于20世紀20年代首次在巴拉圭發(fā)現(xiàn)，主要由短須螨(Brevipalpus spp.) 傳播。目前該病主要分布于巴西、阿根廷、巴拿馬、委內(nèi)瑞拉等南美洲國家，嚴重威脅到北美 和加勒比地區(qū)的柑桔產(chǎn)業(yè)，最近在美國佛羅里達州已檢測到該病。柑桔鱗皮病是由一種多 分體單鏈RNA病毒一柑桔鱗皮病毒(Citrus psorosis virus, CPV)引起的病害，主要分布 于阿根廷、巴西、意大利、西班牙以及美國等國家，對柑桔產(chǎn)業(yè)造成十分嚴重的為害。柑桔雜 色褪綠病是由木質(zhì)部難養(yǎng)菌(Xyllela fastidiosa)引起的一種細菌性病害，于1987年首 次在巴西的圣保羅和Minas Gerais地區(qū)發(fā)現(xiàn)，由帶病苗木和葉蟬、沫蟬等昆蟲介體傳播。 迄今，該病已蔓延到巴西的各個柑桔產(chǎn)區(qū)和阿根廷、巴拉圭等南美國家。檸檬枝枯病(Mal secco)是由桔莖點霉(Phoma tracheiphila)引起的是一種檢疫性真菌病害，主要分布在 地中海、黑海地區(qū)，對許多沿海周邊國家的柑桔生產(chǎn)尤其是檸檬生產(chǎn)造成了一定的經(jīng)濟損 失。目前以上四種病害在我國尚未發(fā)生，但我國存在傳播柑桔麻風病毒和木質(zhì)部難養(yǎng)菌的 的蟲媒，柑桔鱗片病毒和桔莖點霉亦在我國部分柑桔產(chǎn)區(qū)存在定殖擴展的生境，因此檢疫 是杜絕該類病害在我國發(fā)生的重要手段。柑桔黃龍病和潰瘍病是國內(nèi)重要的檢疫對象，柑 桔衰退病毒、柑桔碎葉病毒、柑桔裂皮病類病毒和溫州蜜柑萎縮病毒亦是我國發(fā)生的主要 病毒類病害。迄今為止，由于高特異性和靈敏性，PCR和RT-PCR是檢測以上柑桔病害最為高效 的方法，由于柑桔病害種類多，對每種病害進行檢測較費時費力，不宜在我國出入境檢驗檢 疫中推廣應用。因此建立新的檢驗檢疫技術手段已迫在眉睫?；蛐酒?0年代中期以來發(fā)展極為迅速和活躍的技術。其原理是將大量DNA探 針片段有序的固化于支持物表面，然后與標記的生物樣品中的DNA分子雜交，再對雜交信號 進行檢測分析?；蛐酒诤怂嵝蛄袦y定、基因圖片檢測、基因表達等領域中得到廣泛應用。

發(fā)明內(nèi)容
為解決以上技術問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測柑桔主要病害病原的基因芯片，達到快速、準確、高通量檢測10種主要柑桔病害病原，以及它們的混合感染，可用于 口岸檢驗檢疫。本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的
一種檢測十種主要柑桔病害病原的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的 特異性寡核苷酸探針，固相載體為光學級醛基基片，其關鍵在于固定在所述固相載體上的 特異性寡核苷酸探針具有SEQ ID NO 1- SEQ ID NO 10所示的寡核苷酸序列或者與SEQ ID NO 1- SEQ ID NO :10所示的寡核苷酸序列互補的DNA或RNA。上述固相載體上固定有陰性對照和作為熒光標記對照的SEQ ID N0:11所示的序 列?；蛐酒闹苽浞椒?br> 1.設計病原特異性探針選擇柑桔病原(病毒、細菌、真菌)保守序列基因為靶標序列， 及上述SEQ ID NO :1- SEQ ID NO: 11的特異性探針序列。從GenBank中公布的十種病原中選擇保守基因的為靶序列，從中選取特異性探 針，并通過Blast比對驗證。所述的探針見序列表所示。2.合成探針使用上海生物工程有限公司合成儀合成。3.探針處理5’端加T到40個堿基并在5’端氨基修飾，使它能夠固化在醛基基 片上；
4.基因芯片的制備使用點樣儀在基片上按預先設定好的順序進行電樣，將點好的基 片在紫外交聯(lián)儀下進行交聯(lián)，80°C干烤2小時備用。5、雜交及檢測取雜交液9 μ 1和加Cy3標記PCR產(chǎn)物混合物9 μ 1，42°C恒溫水浴 雜交2小時，洗片掃描觀察結果。檢測時
1)提取待檢柑桔樣品總核酸備用；
2)Cy3標記的PCR或RT-PCR擴增在PCR反應管中加入Cy3_dCTP，在擴增過程中滲 Λ Cy3-dCTP ；
3)雜交及檢測取雜交液9μ 1和加Cy3標記PCR產(chǎn)物混合物9 μ 1，42°C恒溫水浴雜交 2小時，洗片掃描觀察結果(有無熒光反應)。表1為基因芯片上所有探針及其檢測作用
權利要求
一種檢測十種主要柑桔病害病原的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的特異性寡核苷酸探針，其特征在于固定在所述固相載體上的特異性寡核苷酸探針具有SEQ ID NO1 SEQ ID NO10所示的寡核苷酸序列或者與SEQ ID NO1 SEQ ID NO10所示的寡核苷酸序列互補的DNA或RNA。
2.根據(jù)權利要求1所述檢測十種主要柑桔病害病原的基因芯片，其特征在于所述固 相載體上固定有陰性對照和作為熒光標記對照的SEQ ID N0:11所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測十種主要柑桔病害病原的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的特異性寡核苷酸探針，其特征在于固定在所述固相載體上的特異性寡核苷酸探針具有SEQIDNO1-SEQIDNO10所示的寡核苷酸序列或者與SEQIDNO1-SEQIDNO10所示的寡核苷酸序列互補的DNA或RNA。本發(fā)明方法設計合理，能夠提高檢測柑桔主要病害病原的敏感性、特異性及準確性；高通量，一次檢測即能檢出十種柑桔病害，十種病毒基本概括了柑桔主要病害病原；能夠發(fā)現(xiàn)各種柑桔病原物的混合感染。
文檔編號C12Q1/70GK101956023SQ20101028298
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月16日 優(yōu)先權日2010年9月16日
發(fā)明者劉科宏, 劉金香, 周常勇, 周彥, 唐科志, 宋震, 李中安, 楊方云, 王雪峰 申請人:西南大學