專利名稱：一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明目的是提供一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養(yǎng)方法。 背景技術：
隨著科學技術的快速進步和工業(yè)化的飛速發(fā)展，人民的生活水平日益提高，但同 時大量產(chǎn)生含氮廢水，帶來了一系列的環(huán)境問題。國內(nèi)外目前處理含氮廢水的處理方法，主要有吹脫法、氣提回收法、化學沉淀法、 離子交換法、電化學氧化法和折點加氯法等。各種方法都存在一些問題，諸如處理效果不 佳，工藝復雜，工況難以掌握和處理成本偏高。相比之下，生物脫氮法較為經(jīng)濟有效。生物脫 氮劑是專門用于出去水中氨氮的一種生物強化制劑，為了能降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率， 該專利突破性的將高密度發(fā)酵技術應用于混合脫氮微生物，達到良好的效果。自然環(huán)境或者生物處理體系中，微生物通過自身的生命活動降解污染物，將有害 物質分解為穩(wěn)定無害的小分子物質，如CO2和H2O。隨著工業(yè)的發(fā)展，一些有毒有害物質的 排放會對環(huán)境微生物產(chǎn)生一定的毒害作用，使得生物降解體系中缺乏足夠的微生物降解相 應的污染物，或抑制具有降解復雜污染物性能的微生物生長，需要很長一段時間才能通過 酶的誘導、遺傳物質轉移等方式使微生物逐漸適應。有效微生物的數(shù)量化技術是向傳統(tǒng)的 生物處理系統(tǒng)中引入具有特定功能的微生物，提高有效微生物的濃度，增強對難降解污染 物的降解能力，提高其降解速率，并改善原有生物處理體系對目標污染物的去除效能。目前采用的比較傳統(tǒng)的脫氮技術，有一個技術瓶頸，硝化菌群增殖速度慢且難以 維持較高的生物濃度，造成總水力停留時間較長，有機負荷較低，從而增加了投資和運行成 本。而且，生物脫氮技術抗沖擊能力弱，高濃度氨氮和亞硝酸鹽進水會抑制硝化菌的生長。專利號CN200510094737. 5的中國發(fā)明專利提供一種高密度細胞培養(yǎng)方法及其生 物反應裝置，描述了一種細胞培養(yǎng)方法及其生物反應裝置，尤其涉及一種細胞高密度循環(huán) 式或連續(xù)式培養(yǎng)方法及其生物反應裝置，其特征是在生物反應器上加裝無機膜過濾組件及 補料罐，并通過一定的控制回路將三者連接為一個可用于細胞循環(huán)式高密度培養(yǎng)或高密度 連續(xù)式培養(yǎng)的生物反應器系統(tǒng)。但是結構過于復雜，且關鍵的培養(yǎng)基差異，而且其運轉工藝 流程并不適用于本發(fā)明中針對混合培養(yǎng)脫氮微生物的培育。專利申請?zhí)枮镃N200610039750. 5中國專利申請?zhí)峁┮环N泡菜用乳酸菌的高密度 培養(yǎng)方法，提及了采用常規(guī)植物乳酸菌為菌種，經(jīng)常規(guī)方法活化、擴大培養(yǎng)，接種于按常規(guī) 配方配置的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于將發(fā)酵培養(yǎng)基用含0. 2% 0. 3%檸檬酸鈉、0. 2% 0.3%磷酸氫二鈉、0. 0.2%磷酸二氫鈉的緩沖鹽溶液調(diào)pH值為6. 3 6.6 ；在整個培 養(yǎng)過程中，流加氨水以保持PH值穩(wěn)定在5. 8 6. 2 ；菌液培養(yǎng)20h后，補加500ml 700ml 新鮮培養(yǎng)基；菌液培養(yǎng)結束后離心，加入由10% 15%脫脂乳、5% 7%谷氨酸鈉、2% 3%甘油和7% 8%麥芽糖組成的復合保護劑，真空冷凍干燥。雖然也是采用高密度培養(yǎng) 方法，但是與培養(yǎng)脫氮微生物的各項技術指標都由明顯差異?！痘旌厦摰⑸锞旱母呙芏扰囵B(yǎng)》(耿金菊劉登如等)等相關文獻中提到了高密度發(fā)酵培養(yǎng)混合脫氮微生物，利用微生物的混合培養(yǎng)技術，研究了好氧條件下同時硝 化_反硝化的生物脫氮過程?；旌厦摰⑸锞荷L的適宜pH范圍為7 10，在5L 發(fā)酵罐上探索了實現(xiàn)混合脫氮微生物菌群高密度培養(yǎng)的pH控制策略發(fā)酵前期補酸控制 PH ^ 8,發(fā)酵中后期不控制pH值，可縮短菌體的生長周期，提高菌體的氨氮降解速率，細胞 質量濃度達3. 9g/L，比自然pH條件下提高了 62. 5%。并在IOL發(fā)酵罐上作進一步的培養(yǎng)， 驗證了其PH控制策略的可行性。通過分批補加(NH4)2SO4使菌濃進一步提高了 15.4%，最 終細胞干重為4. 5g/L。但其菌體濃度仍然較低，遠達不到高濃度培養(yǎng)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養(yǎng)方法，通過連續(xù)流加硫酸 銨、琥珀酸鈉，并維持磷酸緩沖液PH值為8，菌群培養(yǎng)時間24小時后，得到的脫氮菌群的細 胞干重即可達到20g/L。本發(fā)明采用的技術方案是一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)為好氧脫氮微生物菌群的 混合培養(yǎng)，本發(fā)明要點在于培養(yǎng)過程中維持PH為7. 0 8. 5，并在培養(yǎng)第5 10小時起 (優(yōu)選從第5 7小時起)開始連續(xù)流加葡萄糖、硫酸銨和琥珀酸鈉，維持培養(yǎng)基中葡萄糖 濃度為10 30g/L、硫酸銨濃度為5 25g/L、琥珀酸鈉濃度為0. 5 5g/L，于28 32°C 下進行好氧培養(yǎng)獲得混合脫氮微生物菌群。補料分批培養(yǎng)(又稱流加培養(yǎng))是根據(jù)菌株生長和初始培養(yǎng)基的特點，在分批培 養(yǎng)的某些階段以某種方式間歇或連續(xù)補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體及其代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時間延 長的培養(yǎng)方式。補料方式可分為反饋補料和非反饋補料兩類反饋補料包括pH-stat法、 DO-stat法、菌體濃度反饋法、呼吸商法等，非反饋補料可分為恒速流加培養(yǎng)、變速流加培養(yǎng) 和指數(shù)流加培養(yǎng)。由于硝化微生物在硝化過程中產(chǎn)生酸，而反硝化微生物進行反硝化作用時則產(chǎn)生 堿，而且硝化微生物和反硝化微生物的最適生長PH值亦不同，此外混合菌群對一定范圍的 初始PH具有強大的自我調(diào)節(jié)功能。因此，必須將培養(yǎng)過程中的pH控制在合理范圍才能實 現(xiàn)混合菌群的協(xié)調(diào)生長，共同維持較高的菌體生長速率和氨氮降解速率。高密度培養(yǎng)是一個相對概念，用以描述的單位是干細胞重/升(DCW/L)。廣義來 說，凡是細胞密度比較高，以至接近其理論值的培養(yǎng)均可成為高密度培養(yǎng)。高密度培養(yǎng)有提 高菌體的發(fā)酵密度或單位體積培養(yǎng)液中菌體的濃度，進而提高體積產(chǎn)率；縮小生物反應器 體積，減少生產(chǎn)設備投資；強化下游分離提取，并減少廢水量等優(yōu)點。其綜合效果達到提高 比生產(chǎn)率(單位體積、單位時間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量)，降低生產(chǎn)成本，加速產(chǎn)品的商品化進程，提 高產(chǎn)品在市場上的競爭力。高密度發(fā)酵過程中，營養(yǎng)控制是關鍵，發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源和無機鹽會造成溶 液滲透壓過高，細胞脫水死亡，往往會抑制菌體的生長，使目的產(chǎn)物得率下降，而且過量的 碳源會使細胞迅速生長，導致溶解氧急劇下降。高密度培養(yǎng)通常采用補料培養(yǎng)，使各種培養(yǎng) 基成分低于抑制濃度。廣義來講，凡是細胞密度比較高，以至接近其理論值的培養(yǎng)均可稱為高密度培養(yǎng)， 一般認為其上限值為150 200g(DCW/L)，下限值為20 30g(DCW/L)。由于本發(fā)明中的硝酸菌與亞硝酸菌作為生長較緩慢的細菌，因此在48小時菌體干重能夠達到20g/L已經(jīng)可以 將其定義為高密度發(fā)酵。用于培養(yǎng)所述好氧脫氮微生物菌群的培養(yǎng)基可按本領域常規(guī)進行配置，比如參 照《混合脫氮微生物菌群的高密度培養(yǎng)》中的培養(yǎng)基組成，優(yōu)選的，本發(fā)明所述培養(yǎng)基初 始濃度組成如下=NaHCO3L 0 5. Og/L,琥珀酸鈉 0. 5 2. Og/L, (NH4)2SO4O. 5 2. Og/L, KH2PO4O. 01 0. 15g/L, K2HPO4O. 5 2. Og/L, NaCl 0. 1 1. Og/L, FeSO4O. 1 1. 0g/L, MgSO4O. 05 0. 5g/L, MnSO4O. 01 0. 2g/L，溶劑為水，ρΗ7· 0 8. 5。更為優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基初始濃度組成如下=NaHCO3L 85g/L，琥珀酸鈉0. 954g/L， (NH4)2SO4L 0g/L, KH2PO4O. 06g/L, K2HPO4L 0g/L, NaCl 0. 5g/L, FeSO4O. 4g/L, MgSO4O. 25g/L, MnSO4O. 08/L，溶劑為水，pH8. 0。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)在pH8. 0、30°C下進行，總培養(yǎng)時間為24 48h。所述好氧脫氮微生物菌群可為本領域常規(guī)菌群，比如硝化菌、反硝化菌、亞硝化菌 等，可從土壤或水中按常規(guī)方法篩選獲得，也可采用市購復合菌粉。優(yōu)選的，所述好氧脫氮 微生物菌群為硝化菌和亞硝化菌的混合，例如本發(fā)明申請人在在先申請CN201010107453. 6 中篩選獲得的硝化菌CCTCC No =M 2010001和亞硝化菌CCTCC No =M 2010002的組合。硝化 菌和亞硝化菌的混合比例可不受限制，實際上，由于不同微生物菌群之間的相互影響和制 約，在污水處理系統(tǒng)中初始投入的硝化菌和亞硝化菌比值不確定的情況下，經(jīng)過馴化培養(yǎng)， 最終處理系統(tǒng)中兩種菌群會達到一定的平衡。優(yōu)選的，硝化菌和亞硝化菌初始接種菌體比 例為0. 5 2 1。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)第5小時起開始連續(xù)流加開始連續(xù)流加葡萄糖、硫酸銨和琥珀 酸鈉，維持培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為20g/L、硫酸銨濃度為15g/L、琥珀酸鈉濃度為2. 2g/L，于 30°C下進行好氧培養(yǎng)，總培養(yǎng)時間24h，即可獲得所述混合脫氮微生物菌群。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明通過連續(xù)流加硫酸銨、琥珀酸鈉，使得脫氮 菌群得率顯著提高，脫氮菌群的細胞干重可達到20g/L及其以上；在保證菌體質量的前提 下，維持磷酸緩沖液PH為8，將菌群培養(yǎng)時間從48小時縮短為24小時，大大提高了效率。


圖1為實施例1混合菌生長曲線圖；圖2為實施例2不同pH值下混合菌生長曲線圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此實施例1 培養(yǎng)基初始濃度組成如下=NaHCO3L 85g/L，琥珀酸鈉0. 954g/L，(NH4) 2S041. 0g/L, KH2PO4O. 06g/L, K2HPO4L Og/L, NaCl 0. 5g/L, FeSO4O. 4g/L, MgSO4O. 25g/L, MnSO4O. 08/L,溶劑 為水，ρΗ8· 0。上述培養(yǎng)基250mL/瓶接種市購硝化菌和反硝化菌復合菌粉IOg (滄州旺發(fā)生物技 術研究所生產(chǎn)，活菌總數(shù)> 80億個/克)，一瓶在培養(yǎng)開始第10小時起流加葡萄糖、硫酸
5銨和琥珀酸鈉，使培養(yǎng)基中維持葡萄糖濃度為20g/L、硫酸銨濃度為15g/L、琥珀酸鈉濃度 為2. 2g/L，30°C、250r/min、通氣量Ivvm空氣條件下培養(yǎng)48h ；另一瓶培養(yǎng)過程中不添加任 何物質，在相同條件下培養(yǎng)，測得混合菌生長曲線如圖1所示。由圖1可知，混合菌群在未流加任何營養(yǎng)物質時，48h后僅能達到13g/L的菌體干 重，而連續(xù)補料維持2%葡萄糖、1.5%硫酸銨、0. 22%琥珀酸鈉(培養(yǎng)過程中未控制pH值) 后，菌體濃度能在48h后達到20g/L。實施例2 培養(yǎng)基初始濃度組成如下:NaHC032. Og/L,琥珀酸鈉0. 8g/L，(NH4)2SO4L 2g/L， KH2PO4O. 05g/L, K2HPO4L 2g/L, NaCl 0. 8g/L, FeSO4O. 5g/L, MgSO4O. lg/L, MnSO4O. 1/L,溶劑為 水，ρΗ7· 0 9· 0。上述不同pH值(ρΗ6. 0、ρΗ7. 0、ρΗ8. 0、ρΗ9. 0)的培養(yǎng)基250mL/瓶接種市購硝化 細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌的混合菌液12g(河北益微生物技術有限公司，型號XH01)， 在培養(yǎng)開始第5小時起均流加葡萄糖、硫酸銨和琥珀酸鈉，使培養(yǎng)基中維持葡萄糖濃度為 18g/L、硫酸銨濃度為16g/L、琥珀酸鈉濃度為2. 5g/L，30°C、250r/min、通氣量Ivvm空氣條 件下培養(yǎng)24h，獲得混合菌生長曲線見圖2。由圖2可知，pH為8時，菌體的凈生長速率，在培養(yǎng)時間僅為24h時就能達到 18. 5g/L的效果。實施例3 培養(yǎng)基初始濃度組成如下=NaHCO3L 85g/L，琥珀酸鈉0. 954g/L，(NH4) 2S041. Og/L, KH2PO4O. 06g/L, K2HPO4L Og/L, NaCl 0. 5g/L, FeSO4O. 4g/L, MgSO4O. 25g/L, MnSO4O. 08/L,溶劑 為水，ρΗ8· 0。上述培養(yǎng)基接種適量硝化菌CCTCC No =M 2010001和亞硝化菌CCTCC No =M 2010002，菌體初始比例為1 1，培養(yǎng)條件發(fā)酵過程控制溫度30°C，攪拌轉速為350r/ min,通氣量為lvvm。結果參數(shù)菌群培養(yǎng)時間為24小時，細胞干重達到20. 7g/L。污泥馴化過程將上述發(fā)酵得到的微生物發(fā)酵液按照5% (ν/ν)(每IOOml的待處理污水中加入 5ml的微生物發(fā)酵混合液)的投加量加入生化池，維持7天，得到馴化后的活性污泥。實施例4 按照實施例3方案進行高密度發(fā)酵混合脫氮微生物培養(yǎng)后，制成生物脫氮劑該生物脫氮劑其工藝流程為
種子液培養(yǎng)-發(fā)酵罐培養(yǎng)-離心-稀釋-噴淋-干燥 生物脫氮劑制作工藝流程首先將硝酸菌與亞硝酸菌混合接種于搖瓶中種子培養(yǎng) 基進行種子培養(yǎng)24小時獲得種子液；種子液以10%體積比接種發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)第5小時 開始中流加葡萄糖、硫酸銨和和琥珀酸鈉，使培養(yǎng)基中維持葡萄糖濃度為20g/L、硫酸銨濃 度為15g/L、琥珀酸鈉濃度為2. 2g/L，在30°C、250r/min、通空氣量Ivvm條件下培養(yǎng)24h。離 心收集菌體，然后將菌體稀釋至固體制劑的最終含水量控制在8%左右，加入適量的脫脂乳作保護劑，均勻噴霧于麩皮載體上，自然密閉保藏或冷藏。該生物脫氮劑經(jīng)第三方檢測，得出結果如下表 實施例5 燕京啤酒(浙江仙都)有限公司，使用本發(fā)明高密度發(fā)酵混合脫氮微生物，能夠 保持穩(wěn)定達標。原水水質為BOD5 (五日生物耗氧量BiologyOxygen Demmand) 155mg/L, COD 310mg/L，總氮33mg/L，氨氮13mg/L各取1000ml，置于玻璃容器中，分別用該污水處理站污 泥與按實施例3方法馴化后的污泥進行好氧階段處理，曝氣量均為lvvm。反應18h后，原污 水站污泥處理的水樣水質B0D515mg/L，COD 20mg/L,總氮16mg/L，氨氮5mg/L ；利用本發(fā)明 馴化污泥處理的水樣水質為B0D550mg/L，COD 17mg/L,總氮4mg/L，氨氮2mg/L ；因此采用本 發(fā)明技術發(fā)酵的混合菌劑，總體效率可提高約50%。實施例6 紹興污水處理發(fā)展有限公司，使用本專利技術高密度發(fā)酵混合脫氮微生物， COD (化學耗氧量，chemical oxygen demand) 400mg/L,總氮 30mg/L，氨氮 10mg/L 各取 1000ml，置于玻璃容器中，分別用該公司污水處理站污泥與按實施例3方法馴化后的污 泥進行好氧階段處理，曝氣量均為lvvm。反應18h后，原污水站污泥處理的水樣水質 B0D520mg/L, COD 40mg/L,總氮20mg/L，氨氮6mg/L ；利用本專利馴化污泥處理的水樣水質為 B0D56mg/L,C0D 20mg/L，總氮7mg/L，氨氮3mg/L ；因此采用本發(fā)明技術高密度發(fā)酵的混合菌 劑，總體效率可提高約50%。
權利要求
一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)為好氧脫氮微生物菌群的混合培養(yǎng)，其特征在于所述培養(yǎng)過程中維持pH為7.0～8.5，并在培養(yǎng)第5～10小時起開始連續(xù)流加葡萄糖、硫酸銨和琥珀酸鈉，維持培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為10～30g/L、硫酸銨濃度為5～25g/L、琥珀酸鈉濃度為0.5～5g/L，于28～32℃下進行好氧培養(yǎng)獲得混合脫氮微生物菌群。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基初始濃度組成如下=NaHCO3L0 5. Og/L,琥珀酸鈉 0. 5 2. Og/L, (NH4)2SO4O. 5 2. Og/L, KH2PO4O. 01 0. 15g/L, K2HPO4O. 5 2. Og/L, NaCl 0. 1 1. Og/L, FeSO4O. 1 1. 0g/L, MgSO4O. 05 0. 5g/L, MnSO4O. 01 0. 2g/L，溶劑為水，pH7. 0 8. 5。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基初始濃度組成如下 NaHCO3L 85g/L,琥珀酸鈉 0. 954g/L, (NH4)2SO4L 0g/L, KH2PO4O. 06g/L, K2HPO4L 0g/L, NaCl 0. 5g/L, FeSO4O. 4g/L, MgSO4O. 25g/L, MnSO4O. 08/L,溶劑為水，pH8. 0。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)在pH8.0、30°C下進行，總培養(yǎng)時間 為24 48h。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述好氧脫氮微生物菌群為硝化菌和亞硝化 菌的混合。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)第5小時起開始連續(xù)流加葡萄糖、硫 酸銨和琥珀酸鈉，維持培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為20g/L、硫酸銨濃度為15g/L、琥珀酸鈉濃度 為2. 2g/L，于30°C下進行好氧培養(yǎng)，總培養(yǎng)時間24h，即可獲得所述混合脫氮微生物菌群。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)為好氧脫氮微生物菌群的混合培養(yǎng)，本發(fā)明要點在于培養(yǎng)過程中維持pH為7.0～8.5，并在培養(yǎng)過程開始第5～10小時起連續(xù)流加葡萄糖、硫酸銨和琥珀酸鈉，維持培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為10～30g/L、硫酸銨濃度為5～25g/L、琥珀酸鈉濃度為0.5～5g/L，于28～32℃下進行好氧培養(yǎng)獲得混合脫氮微生物菌群。本發(fā)明通過連續(xù)流加硫酸銨、琥珀酸鈉，使得脫氮菌群得率顯著提高，脫氮菌群的細胞干重可達到20g/L及其以上；在保證菌體質量的前提下，維持磷酸緩沖液pH為8，將菌群培養(yǎng)時間從48小時縮短為24小時，大大提高了效率。
文檔編號C12N1/00GK101921708SQ20101024494
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月4日 優(yōu)先權日2010年8月4日
發(fā)明者丁青松, 何志明, 何歡, 周黎明, 堵國成, 鄭展望, 陳堅 申請人:浙江商達水務有限公司