專利名稱：抗人表皮生長因子受體單鏈抗體-鐵蛋白重鏈亞基蛋白、構(gòu)建方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域靶向成像和給藥的制備技術(shù)，具體涉及抗人表皮生長因 子受體單鏈抗體-鐵蛋白重鏈亞基蛋白、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
納米材料因其具有獨特的性質(zhì)使其在癌癥診斷分析中展示了許多優(yōu)勢。將納米技 術(shù)與生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相結(jié)合(納米生物醫(yī)學(xué))已成為納米技術(shù)領(lǐng)域中發(fā)展最為迅速的研究領(lǐng) 域之一。生物籠狀蛋白材料(Protein cages)，本身就是天然生物大分子，因而具有良好的 生物兼容性。它們通常是由多個多肽亞基結(jié)合而形成中空的結(jié)構(gòu)，外部直徑與中間空穴直 徑均在納米尺度范圍內(nèi)。近來隨著基因工程、蛋白化學(xué)修飾技術(shù)與納米技術(shù)的融合，這類生 物納米材料在蛋白的表面、內(nèi)部以及各蛋白亞基界面易于修飾的特性決定了它們能有效地 組裝各種功能分子以構(gòu)建多功能納米器件，因此引起了的普遍關(guān)注和興趣。因為人們可以 根據(jù)需要賦予這類生物納米材料各種各樣新的功能。表皮生長因子受體(以下簡稱EGFR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中在細(xì)胞的增殖分化過程中 起著很重要的作用，同時也在癌癥的發(fā)生發(fā)展起著十分重要的促進(jìn)作用。大量的研究表明， 腫瘤細(xì)胞中的EGFR表達(dá)量過高，這使得EGFR成為治療腫瘤或者是腫瘤成像非常好的一個 靶點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的可用于腫瘤早期診斷和藥物傳輸系統(tǒng)的載體蛋 白——抗人表皮生長因子單鏈抗體_鐵蛋白重鏈亞基蛋白、構(gòu)建方法及其用途。為實現(xiàn)以 上技術(shù)目的及成本考慮，本發(fā)明采用基于PET原核表達(dá)制備活性蛋白的方法。本發(fā)明的抗人表皮生長因子受體單鏈抗體-鐵蛋白重鏈亞基蛋白，即anti EGFRscFv: :FTH1目標(biāo)融合蛋白具有序列如下MGEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAIGWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFQGR VTITADESTSSAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEGPYCSSTSCYAAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSV LTQDPAVSVALGQTVKITCQ⑶SLRSYFASWYQQKPGQAPTLVMYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQPE DEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVLEFMTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDV ALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATD KNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKEL⑶HVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTL⑶SDNES。本發(fā)明以鐵蛋白重鏈亞基為載體構(gòu)建以EGFR為靶點的功能化鐵蛋白納米粒子， 方法涉及采用原核表達(dá)PET系統(tǒng)制備抗人表皮生長因子受體單鏈抗體-鐵蛋白重鏈亞基蛋 白(antiEGFR scFv: :FTH1 或者 anti EGFR scFv: :FTH1/FTH1)。單鏈抗體是一種新型基因 工程抗體。通常它是將抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)(Fv)基因之間，用一段約25個氨基酸的短肽 基因?qū)⑵溥B接成的，其表達(dá)產(chǎn)物可折疊成具有抗原結(jié)合能力的，由單一肽鏈組成的小分子抗體。它具有比完整抗體更小的特點，因而也更易于實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)化。從而使得其在 腫瘤導(dǎo)向治療和體內(nèi)顯像，以及其他免疫診斷和防治中，具有有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明是 以J. D. Marks構(gòu)建的抗EGFR單鏈抗體為基礎(chǔ)(J. Mol. Biol，2007，371 =934-947)，構(gòu)建新的 蛋白納米粒子——抗人表皮生長因子受體單鏈抗體_鐵蛋白重鏈亞基納米粒子，使得該納 米粒子具有EGFR靶向性。所采用的方法包括以Ecoil.BL21(DE3)構(gòu)建工程菌株，表達(dá)FTH1 蛋白及anti EGFRscFv: :FTH1融合蛋白包涵體、包涵體分離與純化、包涵體的變復(fù)性制備活 性融合蛋白等步驟。此外，發(fā)明中所構(gòu)建的蛋白可以應(yīng)用于表皮生長因子受體表達(dá)過量的 腫瘤，如乳腺癌的早期診斷和藥物的傳輸系統(tǒng)。本發(fā)明的制備方法，包括兩大階段，即表達(dá)工程菌的構(gòu)建和目標(biāo)融合蛋白的制 備。本發(fā)明的第一部分為工程菌的構(gòu)建。該工程菌的構(gòu)建的核心是pET28a(+)/anti EGFR scFv::FTHl的構(gòu)建。其中融合方式不影響活性蛋白的制備，兩種方式均可實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的 靶向結(jié)合，但是考慮到蛋白折疊的效率問題，在本發(fā)明中優(yōu)先選擇N端融合方式，即將anti EGFR scFv融合于FTH1的N端。本發(fā)明的第二部分目標(biāo)蛋白的制備與純化。出于成本的考慮，本發(fā)明優(yōu)先采用原 核表達(dá)系統(tǒng)中的常規(guī)包涵體變復(fù)性法制備活性anti EGFR scFv: :FTH1融合蛋白或者是 anti EGFRscFV::FTHl/FTHl。本部分的發(fā)明的典型特性之一是通過鐵蛋白重鏈亞基之間 可以相互自組裝的特性，將更多的鐵蛋白重鏈亞基摻雜于蛋白內(nèi)，以實現(xiàn)目標(biāo)蛋白表面的 anti EGFR scFv可調(diào)性。本發(fā)明還通過蛋白的電鏡和細(xì)胞的活性實驗證明了該目標(biāo)蛋白的 活性，可以實現(xiàn)EGFR受體介導(dǎo)的乳腺癌MCF-7等多種細(xì)胞的靶向，可以用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 的靶向成像和靶向給藥。本發(fā)明制備方法包括以下⑴ ⑷步驟，或者⑴ (3)和(5) ⑶的步驟(1)構(gòu)建 pET28a(+)/anti EGFR scFv: :FTH 1 表達(dá)工程菌采用重疊PCR技術(shù)擴增anti EGFR scFv: :FTH1的基因，并將片段插于pET28a(+) 載體上。片段和載體連接后，轉(zhuǎn)化入DH5 a感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)之后，將序列正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 入Ecoil. BL21 (DE3)表達(dá)菌株，以獲得目標(biāo)表達(dá)工程菌；(2)誘導(dǎo) pET28a(+)/anti EGFR scFv: :FTH 1 表達(dá)菌表達(dá) anti EGFR scFv: :FTH 1目標(biāo)蛋白將表達(dá)工程菌以1 100的接種比例接種于LB培養(yǎng)基中，加入IPTG培養(yǎng)，離心洗 滌，收集菌體；(3)分離與純化包涵體破碎菌體，離心后回收沉淀；(4)變復(fù)性制備活性anti EGFR scFv: :FTH1目標(biāo)蛋白以8M尿素溶液溶解以上步驟獲得的包涵體。之后透析復(fù)性制備anti EGFRscFv: :FTH1 目標(biāo)蛋白(5)構(gòu)建 pET28a (+) /FTH1 表達(dá)工程菌采用PCR技術(shù)擴增FTH 1的基因插于pET28a(+)載體上，轉(zhuǎn)化入DH5 a感受態(tài)細(xì) 胞內(nèi)之后，將序列正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入Ecoil. BL21 (DE3)表達(dá)菌株，以獲得目標(biāo)表達(dá)工 程菌；(6)誘導(dǎo)pET28a (+) /FTH1表達(dá)菌表達(dá)FTH1目標(biāo)蛋白將表達(dá)工程菌以1 100的接種比例接種于LB培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)，離心收集菌體；
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(7)分離FTH1目標(biāo)蛋白:破碎菌體，收集上清溶液，采用凝膠色譜法分離FTH1目標(biāo)蛋白；(8)變復(fù)性制備活性anti EGFR scFv: :FTH1/FTH1目標(biāo)蛋白以8M尿素尿素溶液溶解以上步驟獲得的anti EGFR scFv: :FTH1包涵體及FTH1 目標(biāo)蛋白，之后透析復(fù)性制備anti EGFR scFv: :FTH1/FTH1目標(biāo)蛋白。


圖 lanti EGFR scFv: :FTH1 融合蛋白序列；圖2實施例1中所制備的anti EGFR scFv: :FTH1/FTH1目標(biāo)蛋白的透射電鏡圖；圖3用流式細(xì)胞術(shù)研究實施例2中所制備的anti EGFR scFv: :FTH1/FTH1目標(biāo)蛋 白對乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞EGFR受體的靶向效果圖。其中，(A)FTH1_F5M與細(xì)胞 MCF-7 的結(jié)合(陰性對照)，geo. mean 3. 73 ； (B)FTH1-F5M 與細(xì)胞 MDA-MB-231 的結(jié)合(陰性對照)，geo. mean 7. 06 ； (C) anti EGFRscFv::FTH1/FTH1-F5M 與細(xì)胞 MCF-7 的結(jié)合，geo. mean 18. 98 ； (D)anti EGFRscFv: :FTH1/FTH1-F5M 與細(xì)胞 MDA-MB-231 的結(jié)合，geo. mean 31. 08
具體實施例方式通過下述實施例將有助于理解本發(fā)明，但不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。實施例1步驟1)構(gòu)建 pET28a(+)/a ntiEGFR scFv: :FTH1 表達(dá)工程菌采用重疊PCR技術(shù)擴增anti EGFR scFv: :FTH1的基因，使片斷在5’端帶有Nco I 酶切位點，在3’端帶有Not I酶切位點。酶切后并將片段插于pET28a(+)載體的Ncol和 NotI之間。片段和載體連接后，轉(zhuǎn)化入DH5 a感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，以菌落PCR、酶切鑒定法篩選 陽性克隆。之后，通過測序?qū)⑿蛄姓_的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入Ecoil.BL21(DE3)表達(dá)菌株，以獲 得目標(biāo)工程表達(dá)菌。anti EGFR scFv: :FTH1目標(biāo)融合蛋白序列如下MGEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAIGWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFQGR VTITADESTSSAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEGPYCSSTSCYAAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSV LTQDPAVSVALGQTVKITCQ⑶SLRSYFASWYQQKPGQAPTLVMYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQPE DEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVLEFMTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDV ALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATD KNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKEL⑶HVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTL⑶SDNES步驟2)anti EGFR scFv: :FTH1目標(biāo)蛋白的制備(1)誘導(dǎo) pET28a(+)/anti EGFR scFv: :FTH1 表達(dá)菌表達(dá)anti EGFR scFv: :FTH1 目 標(biāo)蛋白從平板上挑取單克隆工程表達(dá)菌落，至于25ml LB液體培養(yǎng)基中(40%NaCl，40% Tryptone, 20% Yeast Extract, kanamycin 50 ii g/ml)，置于 37°C恒溫?fù)u床內(nèi)，200rpm，過夜 培養(yǎng)。于次日按接種量接種至200ml LB液體培養(yǎng)基中(成分及抗生素濃度同上)。置 于37°C恒溫?fù)u床內(nèi)，培養(yǎng)至0D為0. 5-0. 6時，加入終濃度為ImM異丙基-0 -D-硫代半乳糖 苷(IPTG)，37°C，誘導(dǎo)過夜。最后在4°C、5000rpm條件下經(jīng)30min離心收集菌體，菌體存放 于-20°C。
實施例2構(gòu)建pET28a(+)/FTHl表達(dá)工程菌，并誘導(dǎo)表達(dá)FTH1蛋白，步驟如實施例1。實施例3anti EGFR scFv: :FTH1 目標(biāo)蛋白的制備(1)誘導(dǎo) pET28a(+)/anti EGFR scFv: :FTH 1 表達(dá)菌表達(dá) anti EGFR scFv: :FTH 1目標(biāo)蛋白從平板上挑取單克隆工程表達(dá)菌落，至于25ml LB液體培養(yǎng)基中(40%NaCl， 40 % Tryptone, 20 % Yeast Extract, kanamycin 50 y g/ml),置于 37 °C fl 溫?fù)u床內(nèi)， 200rpm，過夜培養(yǎng)。于次日按接種量接種至200ml LB液體培養(yǎng)基中(成分及抗生素濃度 同上)。置于37°C恒溫?fù)u床內(nèi)，培養(yǎng)至0D為0. 5-0. 6時，加入終濃度為ImM異丙基-0 -D-硫 代半乳糖苷(IPTG)，37°C，誘導(dǎo)過夜。最后在4°C、5000rpm條件下經(jīng)30min離心收集菌體， 菌體存放于-20°C。(2)分離與純化 anti EGFR scFv: :FTH1 包涵體取出經(jīng)過反復(fù)凍融的菌體，加入10ml的重懸液重懸菌體[50mM tris (三羥甲基 氨基甲烷)，PH7. 9]。在功率為300W的超聲破碎儀中破碎菌體150個周期(每個周期工作 3s，間隙7s)。在4°C，5000rpm條件下30min離心，除去上清，收集沉淀。加入洗滌液[50mM Tris,50mM NaCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸)，1 % tritonX-100 (C34H620n)，pH7. 9]，洗滌所得 的沉淀4次，得到較純的包涵體。(3)變復(fù)性制備活性anti EGFR scFv: :FTH1目標(biāo)蛋白向洗滌液中加入 25ml 變性液[50mM Tris_HCl，8M Urea(尿素)，ImM EDTA, lOmM DTT(二硫蘇糖醇)，pH7. 9]重懸洗滌后的包涵體。置于28°C的恒溫?fù)u床中過夜，使包涵體 溶解。次日，用變性液對溶解的包涵體進(jìn)行稀釋，使蛋白最終的濃度為0. lmg/ml，體積為 50ml。隨后置于透析帶中，在4°C下浸沒于復(fù)性液中透析，每隔6h，更換一次復(fù)性液(每次 更換的復(fù)性液見下表)。待透析復(fù)性結(jié)束后，過濾收集復(fù)性后的蛋白溶液，用50KD的超濾管 超濾濃縮目標(biāo)蛋白。復(fù)性液的配方如下
Step 150 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% PEG(聚乙二醇)，10% Glycerol(甘油)，6 M Urea, 0.5 mM CuS04, pH 7.9；Step 250 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% PEG, 10% Glycerol, 4 M Urea, 0.5 mM CuS04, pH 7.9；
權(quán)利要求
一種抗人表皮生長因子受體單鏈抗體 鐵蛋白重鏈亞基蛋白，其特征在于，所述的抗人表皮生長因子受體單鏈抗體 鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白具有如下的的序列MGEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAIGWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADESTSSAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEGPYCSSTSCYAAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQDPAVSVALGQTVKITCQGDSLRSYFASWYQQKPGQAPTLVMYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQPEDEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVLEFMTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES。
2.—種構(gòu)建如權(quán)利要求1所述的抗人表皮生長因子受體單鏈抗體-鐵蛋白重鏈亞基蛋 白的方法，其特征在于，包括⑴ ⑷步驟，或者⑴ ⑶和(5) ⑶的步驟(1)構(gòu)建pET28a(+)/a ntiEGFR scFv: :FTH1 表達(dá)工程菌采用重疊PCR技術(shù)擴增anti EGFR scFv: :FTH1的基因，并將片段插于pET28a(+)載 體上，片段和載體連接后，轉(zhuǎn)化入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)之后，將序列正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入 Ecoil. BL21 (DE3)表達(dá)菌株，以獲得目標(biāo)表達(dá)工程菌；(2)誘導(dǎo)pET28a(+)/anti EGFR scFv: FTHl 表達(dá)菌表達(dá) anti EGFR scFv: :FTH1 目標(biāo) 蛋白將表達(dá)工程菌以1 100的接種比例接種于LB培養(yǎng)基中，加入IPTG培養(yǎng)，離心洗滌， 收集菌體；(3)分離與純化包涵體破碎菌體，離心后回收沉淀；(4)變復(fù)性制備活性antiEGFR scFv: :FTH1目標(biāo)蛋白以8M尿素溶液溶解以上步驟獲得的包涵體。之后透析復(fù)性制備anti EGFRscFv: :FTH1 目標(biāo)蛋白(5)構(gòu)建pET28a(+)/FTHl表達(dá)工程菌采用PCR技術(shù)擴增FTHl的基因插于pET28a(+)載體上，轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)之 后，將序列正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入Ecoil. BL21 (DE3)表達(dá)菌株，以獲得目標(biāo)表達(dá)工程菌；(6)誘導(dǎo)pET28a(+)/FTHl表達(dá)菌表達(dá)FTHl目標(biāo)蛋白將表達(dá)工程菌以1 100的接種比例接種于LB培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)，離心收集菌體；(7)分離FTHl目標(biāo)蛋白破碎菌體，收集上清溶液，采用凝膠色譜法分離FTHl目標(biāo)蛋白；(8)變復(fù)性制備活性antiEGFR scFv: :FTH1/FTH1目標(biāo)蛋白以8M尿素尿素溶液溶解以上步驟獲得的anti EGFR scFv: :FTH1包涵體及FTHl目標(biāo)蛋白，之后透析復(fù)性制備anti EGFR scFv: :FTH1/FTH1目標(biāo)蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中的洗滌，以含有tritonX-100溶 液進(jìn)行洗滌沉淀。
4.一種如權(quán)利要求1所述抗人表皮生長因子受體單鏈抗體_鐵蛋白重鏈亞基蛋白的用 途，其特征在于，作為靶向成像試劑或靶向藥物載體。
全文摘要
本發(fā)明提供一類新的可用于腫瘤早期診斷和藥物傳輸系統(tǒng)的載體蛋白——抗人表皮生長因子受體單鏈抗體-鐵蛋白重鏈亞基蛋白、構(gòu)建方法及其用途。該融合蛋白是將抗人表皮生長因子受體通過基因工程的方法外接于鐵蛋白重鏈亞基蛋白的表面上。本發(fā)明的目標(biāo)蛋白具有很好的人表皮生長因子受體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞靶向性，可以用于靶向成像試劑和靶向給藥載體。
文檔編號C12N1/21GK101942022SQ201010239499
公開日2011年1月12日 申請日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者葉邦策, 曹旭妮, 朱培, 李旭 申請人:華東理工大學(xué)