專利名稱：一種泛素連接酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種新的泛素連接酶及其應(yīng)用，本發(fā)明還涉及該泛素連接酶的制備方法，還涉及該泛素連接酶的編碼基因及含有該基因的載體、宿主細(xì)胞，該泛素連接酶的抗體，以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白降解過程(ER associated degradation, ERAD)是細(xì)胞內(nèi)重要的質(zhì)量控制過程，對(duì)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持非常重要。在此過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一些分子伴侶首先識(shí)別錯(cuò)誤折疊的蛋白或者其它需要降解的蛋白，然后在泛素-蛋白酶體的參與下完成這種蛋白的降解。泛素-蛋白酶體是真核細(xì)胞靶向性降解正常、錯(cuò)誤折疊胞漿或膜蛋白的主要途徑。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)包括泛素⑴b)、泛素活化酶(El)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶 (E3)、26S蛋白酶體和泛素解離酶(DUB)。蛋白酶體具有精確降解細(xì)胞內(nèi)各種目的靶蛋白的功能，進(jìn)而參與基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，以及受體胞吞、抗原提呈、細(xì)胞防御和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等各種細(xì)胞生理過程。因此泛素-蛋白酶體也在治療疾病特別是癌癥和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用。例如，一種泛素-蛋白酶體抑制劑萬珂(硼替佐米)已被用于多發(fā)性骨髓瘤的治療。2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了三位科學(xué)家，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)泛素化引起的細(xì)胞蛋白質(zhì)降解。蛋白質(zhì)的泛素化過程是一個(gè)依賴ATP的酶促反應(yīng)首先在El的催化下，泛素C末端甘氨酸殘基與El的半胱氨酸殘基間形成高能硫酯鍵而獲得活性；El-泛素結(jié)合的中間體再將泛素轉(zhuǎn)移給E2，形成E2-泛素中間體；最后靶蛋白的泛素化還需要另一個(gè)特異的泛素蛋白連接酶E3。E3可以直接或間接與底物結(jié)合，促使泛素從與E2形成的硫酯中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到靶蛋白賴氨酸殘基的ε氨基基團(tuán)上，形成異肽鍵。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)泛素分子連接到靶蛋白上后，另外一些泛素分子在Ε3的催化下相繼與底物相連的泛素分子的第48位賴氨酸殘基相連，形成一條多聚泛素鏈，作為底物被蛋白酶體識(shí)別和降解的靶向性信號(hào)。完成泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被展平進(jìn)入26S蛋白酶體，在20S催化中心中被降解，泛素分子可被DUBs從底物上水解下來而被重復(fù)利用。因?yàn)榉核?蛋白酶體對(duì)蛋白質(zhì)的選擇性降解是通過泛素連接酶來實(shí)現(xiàn)的，所以泛素連接酶就在這個(gè)過程中起到最為關(guān)鍵性的作用。泛素連接酶從結(jié)構(gòu)域上主要分為三類，其中一種類型是含RING finger (指環(huán)) 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。RING finger結(jié)構(gòu)域是由40到60個(gè)氨基酸組成的一種鋅指結(jié)構(gòu)，能夠結(jié)合兩個(gè)鋅原子，這個(gè)結(jié)構(gòu)域可能參與蛋白與蛋白之間的相互作用，其基本組成是 CX2CX(9-39) C(1-3)HX(2-3) C/HX2C(4-48) CX2C，其中 C 是半胱氨酸，H是組氨酸，X代表任意氨基酸，括號(hào)中的數(shù)字代表任意氨基酸的個(gè)數(shù)。RING finger結(jié)構(gòu)域最基本的組成是其中的幾個(gè)最為保守的半胱氨酸和組氨酸，根據(jù)這些保守的氨基酸，這個(gè)結(jié)構(gòu)域可以分為兩種 C3HC4和C3H2C3，后面的這種通常被命名為RING-H2型。含有RING finger結(jié)構(gòu)域的分子參與到各種生命活動(dòng)中。RING finger結(jié)構(gòu)域的發(fā)現(xiàn)為了解泛素-蛋白酶體這個(gè)降解途徑提供了更廣泛的思路，且部分RING蛋白質(zhì)還是潛在的靶點(diǎn)，有可能為治療疾病提供幫助。然而，是不是所有的RING蛋白質(zhì)均同泛素-蛋白酶體相關(guān)，并沒有得到驗(yàn)證或證實(shí)，對(duì)于這方面的驗(yàn)證還需要進(jìn)行更進(jìn)一步的大量實(shí)驗(yàn)研究。另外，凋亡是所有多細(xì)胞生物的一個(gè)最基本的生理過程，是細(xì)胞的一種主動(dòng)死亡行為，以維持機(jī)體細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡的平衡。它對(duì)于植物和動(dòng)物的發(fā)育、昆蟲和兩棲類動(dòng)物的變形、胚胎生長(zhǎng)及器官的形態(tài)發(fā)生、組織的自穩(wěn)、老化及感染和壞死細(xì)胞的清除等方面具有非常重要的意義。根據(jù)凋亡信號(hào)的來源可以將細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分成兩條外源性通路(死亡受體通路)和內(nèi)源性通路(線粒體通路)。兩條信號(hào)通路匯集于下游的效應(yīng) Caspase0效應(yīng)Caspase在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段能夠直接引起重要蛋白質(zhì)的降解和染色體 DNA的斷裂并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種新的泛素連接酶。本發(fā)明的另一目的在于提供一種分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明所述的泛素連接酶蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明的另一目的在于提供一種基因工程載體，其包含本發(fā)明所述的多核苷酸。本發(fā)明的另一目的在于提供一種經(jīng)所述的基因工程載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)得到的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的在于提供一種與本發(fā)明所述泛素連接酶特應(yīng)性結(jié)合的抗體。本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備所述泛素連接酶的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供所述泛素連接酶、所述多核苷酸、所述載體、所述抗體的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于診斷腫瘤、治療腫瘤、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/ 或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物組合物。一方面，本發(fā)明提供了一種泛素連接酶，該泛素連接酶為如下a)或b)所述的蛋白a)由SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列組成的蛋白；或b)在a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與 a)限定的氨基酸序列具有相同泛素連接酶活性的由a)衍生的蛋白。另一方面，本發(fā)明還提供了一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼如上述a)或b) 所述的蛋白；所述的多核苷酸優(yōu)選為具有以下核苷酸序列a) SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或c)與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90 %同源性、且編碼與由SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列組成的蛋白具有相同泛素連接酶活性的蛋白的核苷酸序列。另一方面，本發(fā)明還提供了一種基因工程載體，其包含如上所述的多核苷酸；所述的載體優(yōu)選選自細(xì)菌質(zhì)粒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。另一方面，本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞經(jīng)所述的基因工程載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)得到；所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選選自大腸桿菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明還提供了一種抗體，其與由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列組成的蛋白或其保守變異多肽或片段特異性結(jié)合；所述抗體優(yōu)選為單克隆抗體或多克隆抗體。另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備所述泛素連接酶的方法，該方法包括在適于表達(dá)的條件下，培養(yǎng)含有所述多核苷酸的宿主細(xì)胞；所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選為上述的宿主細(xì)胞；從所述細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得多核苷酸編碼的蛋白，制備得到泛素連接酶。另一方面，本發(fā)明還提供了如下a)或b)所述的蛋白作為泛素連接酶的應(yīng)用a)由SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列組成的蛋白；或b)在a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與 a)限定的氨基酸序列具有相同泛素連接酶活性的由a)衍生的蛋白。另一方面，本發(fā)明還提供了所述的泛素連接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程載體、或所述的宿主細(xì)胞在制備用于抑制ERK磷酸化的制劑中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明還提供了所述的泛素連接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程載體、所述的宿主細(xì)胞、或所述的抗體在制備用于腫瘤的診斷、基因治療和/或療效評(píng)價(jià)的藥物組合物中的應(yīng)用；優(yōu)選所述的藥物組合物為用于治療腫瘤和/或抑制腫瘤細(xì)胞增殖和 /或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物組合物；優(yōu)選所述的腫瘤為未分化甲狀腺癌、胃癌、直腸癌、 食道癌或肺癌腫瘤。另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于診斷腫瘤、治療腫瘤、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/ 或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物組合物，該組合物含有所述的泛素連接酶，或所述的多核苷酸， 或所述的載體，或所述的宿主細(xì)胞，或所述的抗體；以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。優(yōu)選所述的腫瘤為未分化甲狀腺癌、胃癌、直腸癌、食道癌或肺癌腫瘤。


圖1為本發(fā)明中人類RNF122基因的核苷酸序列，其中，方框標(biāo)記的為起始密碼子和終止密碼子。圖2為本發(fā)明中人類RNF122基因編碼的氨基酸序列，其中，方框標(biāo)記的為 RINGfinger結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸。圖3為pEGFP-Nl-RNF122的構(gòu)建流程示意圖。圖4為pEGFP-Nl-RNF122- Δ TM的構(gòu)建流程示意圖。圖5為真核表達(dá)質(zhì)粒RNF122C92A-myc的構(gòu)建流程示意圖。圖6為pGEX4T-l-RNF122 Δ TM的構(gòu)建流程示意圖。圖7顯示RNF122 Δ TM和mut_RNF122 Δ TM原核表達(dá)結(jié)果。其中，左圖片為 GST-RNF122ATM和突變型GST-RNF122ATM原核表達(dá)蛋白SDS-PAGE圖，右圖片為Western blot驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用GST抗體證實(shí)所表達(dá)蛋白。圖8顯示RNF122經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解實(shí)施例中檢測(cè)RNF122的表達(dá)結(jié)果。 其中，從左向右數(shù)第1、2、3道為HEK293T細(xì)胞，第4、5道為HeLa細(xì)胞。圖9顯示RNF122降解經(jīng)RING finger結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)的實(shí)施例中的檢測(cè)結(jié)果。圖10顯示體內(nèi)RNF122的泛素化實(shí)驗(yàn)中的檢測(cè)結(jié)果。
圖11顯示RNF122重組蛋白自身泛素化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，左圖片為RNF122泛素化， 右圖片中是使用突變型RNF122重組蛋白。圖12為RNF122-ATM的亞細(xì)胞定位。圖13顯示RNF122跨膜區(qū)和RING finger結(jié)構(gòu)域?qū)?xì)胞凋亡的影響。圖14顯示RNF122抑制ERK通路的活化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖15顯示RNF122對(duì)EGF刺激產(chǎn)生信號(hào)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖16顯示RNF122與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖17為Wfestern blot鑒定RNF122多克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種泛素連接酶，來源于人，其具有如 SEQID NO :2所示的氨基酸序列；或者，該泛素連接酶為在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有相同泛素連接酶活性的蛋白。如SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列為本發(fā)明的泛素連接酶的蛋白序列，稱為 RNF122蛋白，其由155個(gè)氨基酸殘基組成，蛋白分子量為17. 5kD，等電點(diǎn)為8. 21，其具有泛素連接酶活性。根據(jù)本發(fā)明，可以對(duì)如SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列進(jìn)行取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，而獲得與如SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列組成的蛋白具有相同泛素連接酶活性的衍生序列。所述取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(一般不超過10個(gè))氨基酸而獲得具有相同功能的衍生物的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，例如可以是進(jìn)行非極性氨基酸間或是極性氨基酸間(特別是不帶電荷的極性氨基酸間或帶相同電荷(帶正電荷或負(fù)電荷)的極性氨基酸間)的取代。本發(fā)明還提供了一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼本發(fā)明的泛素連接酶。所述的多核苷酸優(yōu)選為具有以下核苷酸序列a) SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；所述的嚴(yán)格條件例如為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜；c)與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90 %同源性、且編碼與由SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列組成的蛋白具有相同泛素連接酶活性的蛋白的核苷酸序列。RNF122基因?yàn)榫幋a本發(fā)明的SEQ ID NO :2的多核苷酸，其核苷酸序列可以為 SEQID NO 2所示氨基酸的編碼序列，除了上述氨基酸序列的編碼序列之外，還可以包括非編碼序列，例如內(nèi)含子、編碼序列5'或3'端的非編碼序列等。所述多核苷酸可以是DNA或 RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及人工合成的DNA，可以是單鏈的或雙鏈的，可以是編碼鏈或非編碼鏈。其中優(yōu)選的基因?yàn)榫哂蠸EQ ID NO :1所示的核苷酸序列，該序列全長(zhǎng) 1868個(gè)核苷酸，其包含編碼RNF122蛋白的序列(例如編碼序列(⑶S 核苷酸第403 870 位)和5'的非編碼區(qū)(核苷酸第1 402位)和3'的非編碼區(qū)(核苷酸第871 1868 位))?；蛘?，更優(yōu)選一種分離的核苷酸序列，其只包含RNF122蛋白的編碼序列。RNF122的基因組基因染色體定位8pl2，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明RNF122的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ
6IDNO :1所示的編碼序列，也可以由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不完全等同于上述核苷酸的編碼序列。例如，根據(jù)每個(gè)具體的原核宿主或者真核宿主所使用的密碼子的頻率不同，可以選擇相應(yīng)的密碼子，從而提高所述的多核苷酸在相應(yīng)的宿主中表達(dá)效率。也可以為了獲得比天然的核苷酸序列具有更好性能的多核苷酸(如更長(zhǎng)的半衰期)而轉(zhuǎn)換密碼子。本發(fā)明的多核苷酸能用本領(lǐng)域已有的方法獲得。這些技術(shù)包括但不局限于(1) 通過雜交技術(shù)分離DNA序列；( 人工化學(xué)合成DNA序列；C3)通過構(gòu)建cDNA文庫大規(guī)模獲得所需的多核苷酸；G)PCR擴(kuò)增技術(shù)。例如，本發(fā)明的RNF122的核苷酸序列或其免疫性片段可以依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)將cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，并選取合適的寡核苷酸引物擴(kuò)增得到。這樣得到核苷酸可以克隆進(jìn)合適的載體中，然后利用在所述載體中的復(fù)制得到。也可以通過標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)得到，例如使用可以按本領(lǐng)域熟知的固相亞磷酸酰胺三酯法在DNA合成儀上合成。本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等核苷酸序列的測(cè)定可用常規(guī)方法，如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al. PNAS, 1977, 74 =5463-5467)；也可用商業(yè)測(cè)序試劑盒等。為了獲得全長(zhǎng)的cDNA序列，測(cè)序需要反復(fù)進(jìn)行。有時(shí)需要測(cè)定多個(gè)克隆的cDNA序列，才能拼接成全長(zhǎng)的cDNA序列。本發(fā)明的RNF122蛋白可以是重組蛋白、天然蛋白、合成蛋白、半合成蛋白，優(yōu)選重組蛋白。本發(fā)明的蛋白可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主中產(chǎn)生。本發(fā)明的RNF122蛋白可以通過常規(guī)方法獲得，例如可按照Meward和 Young (Steward, J. Μ.禾口 Young, J. D. , Solid PhasePeptide Synthesis,2nd Ed., Pierce ChemicalCompany, Rockford, 111. , (1984))描述的方法用 Applied Biosystem 合成儀或 PioneerTM合成儀按固相化學(xué)技術(shù)合成，或者可使用衍生于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的mRNA，在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生所需的蛋白或多肽。也可按常規(guī)的生物工程方法由宿主細(xì)胞中的重組DNA序列編碼產(chǎn)生蛋白或多肽產(chǎn)物(Science, 1984 ；224 :1431)，例如包括以下步驟(1) 用本發(fā)明的多核苷酸(或其變異體)，或用含有此多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；( 在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(1)得到的宿主細(xì)胞；C3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化所需的蛋白或多肽。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供一種含有本發(fā)明的多核苷酸的載體。本發(fā)明中的多核苷酸可以插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒，如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，或者其它載體。在本發(fā)明中適宜的載體可以是選自細(xì)菌質(zhì)粒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等。本發(fā)明還涉及用上述載體或者本發(fā)明的多核苷酸經(jīng)基因工程產(chǎn)生的適于表達(dá)本發(fā)明泛素連接酶的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的載體和多核苷酸可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，如大腸桿菌，酵母菌，昆蟲細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，以使其能夠表達(dá)RNF122蛋白。本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)所述泛素連接酶的方法在適于表達(dá)的條件下，培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明的多核苷酸或其片段的宿主細(xì)胞；從所述細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得多核苷酸編碼的蛋白，即制備得到本發(fā)明的泛素連接酶。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組蛋白。具體地說，在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用適當(dāng)?shù)姆椒?如溫度變動(dòng)或化學(xué)特質(zhì)誘導(dǎo))誘導(dǎo)啟動(dòng)子，然后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，可用離心法收集細(xì)胞，并用任何已知的方法，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，如凍融法、超聲處理法、滲透破菌、溶菌酶溶解法或機(jī)械破碎法破碎細(xì)胞?？梢杂酶鞣N已知的方法從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的蛋白或融合蛋白，這些方法包括硫酸鐵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超離心、超濾法、離子交換層析法、磷酸纖維層析法、 疏水相互作用層析法、凝膠過濾法、親和層析法、高效液相層析和其它各種液相層析技術(shù)或這些方法的結(jié)合。本發(fā)明還提供針對(duì)所述的RNF122蛋白的抗體。所述抗體包括單克隆抗體或多克隆抗體，優(yōu)選中和性抗體。所述的抗體優(yōu)選為與SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成的蛋白或其保守變異多肽或片段特異性結(jié)合的多克隆抗體或單克隆抗體。所述“特異性結(jié)合”是指多克隆抗體或單克隆抗體特異性識(shí)別靶抗原并與靶抗原的不同抗原表位或抗原決定簇結(jié)合的特性。上述抗體不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab片段和Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的抗體；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No. 4，946，778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的多肽蛋白或其免疫性片段的抗體可用本領(lǐng)域公知的抗體制備方法來生產(chǎn)。例子有單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)(Kohler and Milstein. Nature, 1975, 256 :495-497)。多克隆抗體的生產(chǎn)可用本發(fā)明的蛋白或其免疫性片段免疫動(dòng)物，如家兔、小鼠、大鼠等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中(參見實(shí)施例14)，以本發(fā)明制備的純化的RNF122N蛋白為例，制備了多克隆抗體，經(jīng)Western blot鑒定抗體特異性， 證實(shí)得到特異性好的抗體，該抗體可以用于檢測(cè)本發(fā)明RNF122的存在或水平，或用于檢測(cè) RNF122基因，可將該抗體進(jìn)一步用于RNF122的表達(dá)譜分析和功能研究。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)產(chǎn)生(Morrison et al. PNAS，1985，81 :6851)。單鏈抗體也可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(U.S.Pat No. 4946778)。本發(fā)明的各類抗體可以利用本發(fā)明的蛋白或其免疫性片段、衍生物、類似物或表達(dá)它們的細(xì)胞作為抗原，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得，這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明證實(shí)了所述的RNF122蛋白為一種泛素連接酶(參見實(shí)施例5、6、7、8)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了所述的泛素連接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程載體、或所述的宿主細(xì)胞在制備用于抑制ERK磷酸化的制劑中的應(yīng)用(參見實(shí)施例11)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了所述的泛素連接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程載體、所述的宿主細(xì)胞、或所述的抗體在制備用于腫瘤的診斷、基因治療和/ 或療效評(píng)價(jià)的藥物組合物中的應(yīng)用；優(yōu)選所述的藥物組合物為用于治療腫瘤和/或抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物組合物；優(yōu)選所述的腫瘤為未分化甲狀腺癌、 胃癌、直腸癌、食道癌或肺癌腫瘤。本發(fā)明的RNF122的基因和蛋白可以以基因和蛋白的形式直接包含在用于治療相關(guān)疾病的藥物組合物中利用其瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行治療，也可以以包含在表達(dá)載體中的形式包含在用于治療相關(guān)疾病的藥物組合物中利用瞬時(shí)和穩(wěn)定的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行治療。本發(fā)明還提供了一種用于診斷腫瘤、治療腫瘤、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物組合物，該組合物含有所述的泛素連接酶，或所述的多核苷酸，或所述的載體，或所述的宿主細(xì)胞，或所述的抗體；以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。藥用賦形劑或藥用載體指無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他制劑輔料。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)研究表明，本發(fā)明的泛素連接酶相關(guān)蛋白R(shí)NF122為一個(gè)新的泛素連接酶，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在大多數(shù)細(xì)胞中廣譜表達(dá)，但在多數(shù)腫瘤組織中低表達(dá)或表達(dá)缺失。其過表達(dá)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，N端跨膜區(qū)和RING finger結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄浒l(fā)揮凋亡發(fā)揮重要作用。RNF122通過抑制ERK磷酸化參與調(diào)控ERK MAPK通路，并調(diào)節(jié)EGFR介導(dǎo)的信號(hào)通路，及在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路發(fā)揮功能。本發(fā)明為進(jìn)一步研究RNF122與細(xì)胞凋亡之間的調(diào)控關(guān)系，以及開發(fā)治療腫瘤新藥物，開創(chuàng)新的臨床診斷、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后指標(biāo)提供了一個(gè)新的基礎(chǔ)。
實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(2002年第三版[美]薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中未標(biāo)明來源的試劑和材料均可商購獲得。實(shí)施例1、RNF122基因的cDNA的克隆通過生物信息學(xué)分析，利用兩步法RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。(1)對(duì)NCBI的refseq數(shù)據(jù)庫進(jìn)行人功能未知預(yù)測(cè)基因檢索，獲得人未知功能基因序列，并利用Humaruest數(shù)據(jù)庫通過BLASTn方法進(jìn)行序列校正，最終得到的序列=SEQID N0:1(RNF122基因，請(qǐng)參見圖1所示，其所編碼的氨基酸序列請(qǐng)參見SEQ ID NO :2及圖2所示)。根據(jù)此類序列設(shè)計(jì)基因RNF122的特異引物上游引物(5'-3' ) :CATTGATGCACCCATTCCAGTG(SEQ ID NO 3)；下游引物(5'-3' ) :TCTCCAGGTCTCGGTGTAGCG(SEQ ID NO :4)。(2)用上述引物，按目的基因的表達(dá)譜在現(xiàn)有的cDNA文庫和腫瘤文庫中選擇模板，進(jìn)行初擴(kuò)?，F(xiàn)有的文庫包括12種人體正常組織(心、胰、睪丸、卵巢、前列腺、結(jié)腸、小腸、 骨骼肌、胸腺、淋巴結(jié)、扁桃體、白細(xì)胞)；6種人腫瘤組織(肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、 結(jié)腸癌、乳腺癌)；和8種胎兒組積(胎肺、胎心、胎肝、胎脾、胎腎、胎腦、胎骨骼肌、胎胸腺) 的cDNA文庫(Clonetch，K1420-1，1241-1)。初擴(kuò)反應(yīng)條件如下50 μ 1 PCR 反應(yīng)
權(quán)利要求
1.一種泛素連接酶，該泛素連接酶為如下a)或b)所述的蛋白a)由SEQID NO :2所示的氨基酸序列組成的蛋白；或b)在a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與a)限定的氨基酸序列具有相同泛素連接酶活性的由a)衍生的蛋白。
2.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼如權(quán)利要求1中a)或b)所述的蛋白；所述的多核苷酸優(yōu)選為具有以下核苷酸序列a)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或c)與SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%同源性、且編碼與由SEQID NO 2 所示的氨基酸序列組成的蛋白具有相同泛素連接酶活性的蛋白的核苷酸序列。
3.一種基因工程載體，其包含如權(quán)利要求2所述的多核苷酸；所述的載體優(yōu)選選自細(xì)菌質(zhì)粒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。
4.一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞經(jīng)權(quán)利要求3所述的基因工程載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)得到；所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選選自大腸桿菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
5.一種抗體，其與由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列組成的蛋白或其保守變異多肽或片段特異性結(jié)合；所述的抗體優(yōu)選為單克隆抗體或多克隆抗體。
6.一種制備權(quán)利要求1所述泛素連接酶的方法，該方法包括在適于表達(dá)的條件下，培養(yǎng)含有權(quán)利要求2所述多核苷酸的宿主細(xì)胞；所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選為權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞；從所述細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得多核苷酸編碼的蛋白，制備得到泛素連接酶。
7.如權(quán)利要求1中a)或b)所述的蛋白作為泛素連接酶的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的泛素連接酶、或權(quán)利要求2所述的多核苷酸、或權(quán)利要求3所述的基因工程載體、或權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞在制備用于抑制ERK磷酸化的制劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的泛素連接酶、或權(quán)利要求2所述的多核苷酸、或權(quán)利要求3所述的基因工程載體、或權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞、或權(quán)利要求5所述的抗體在制備用于腫瘤的診斷、基因治療和/或療效評(píng)價(jià)的藥物組合物中的應(yīng)用；優(yōu)選所述的藥物組合物為用于治療腫瘤和/或抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物組合物；優(yōu)選所述的腫瘤為未分化甲狀腺癌、胃癌、直腸癌、食道癌或肺癌腫瘤。
10.一種用于診斷腫瘤、治療腫瘤、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物組合物，該組合物含有權(quán)利要求1所述的泛素連接酶，或權(quán)利要求2所述的多核苷酸，或權(quán)利要求3所述的載體，或權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，或權(quán)利要求5所述的抗體；以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體；優(yōu)選所述的腫瘤為未分化甲狀腺癌、胃癌、直腸癌、食道癌或肺癌腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種泛素連接酶及其應(yīng)用，所述泛素連接酶為如下所述的蛋白由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的蛋白；或在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有相同泛素連接酶活性的蛋白。本發(fā)明還提供了制備所述泛素連接酶的方法，還提供了編碼所述的泛素連接酶蛋白的氨基酸序列的多核苷酸、包含所述多核苷酸的基因工程載體、宿主細(xì)胞，還提供了與所述泛素連接酶特應(yīng)性結(jié)合的抗體，還提供了所述泛素連接酶、所述多核苷酸、所述載體以及所述抗體的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/52GK102168076SQ20101011462
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月25日
發(fā)明者彭智, 李娜, 石太平, 鄧唯唯, 郭帥, 馬大龍 申請(qǐng)人:北京諾賽基因組研究中心有限公司