專利名稱：：表達亞洲1型口蹄疫病毒vlp的重組腺病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重組腺病毒，尤其涉及一種表達亞洲1型口蹄疫病毒VLP的重組腺病毒，本發(fā)明還涉及該重組腺病毒的構(gòu)建方法以及該重組腺病毒在預(yù)防口蹄疫中的應(yīng)用，屬于口蹄疫的預(yù)防領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：口蹄疫(FMD)是偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，其病原為口蹄疫病毒(FMDV)。鑒于口蹄疫對世界經(jīng)濟造成的嚴(yán)重危害，國際獸疫局(OIE)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)將其列為A類傳染病之首，我國也將其列在一類動物傳染病的第一位。疫苗接種是特異性預(yù)防FMD的有效手段，安全有效的疫苗是成功地預(yù)防、控制乃至最終消滅FMD的先決條件。雖然OIE推薦的FMD滅活疫苗在消滅歐洲的口蹄疫以及控制世界其他國家的口蹄疫過程中發(fā)揮了重要作用，但是目前的口蹄疫疫苗主要存在如下一些致命性缺點，需要更新?lián)Q代1)生產(chǎn)疫苗用種毒均為強毒株在歐洲曾經(jīng)發(fā)生多起活病毒在生產(chǎn)中逃逸疫苗加工廠、病毒滅活不徹底導(dǎo)致FMD暴發(fā)的案例；2)在中國，制備FMD滅活疫苗的抗原未經(jīng)提純，因此免疫期較短、副作用較大、對于感染動物和免疫動物的鑒別診斷也存在干擾；3)制備疫苗的抗原需要提純，會大幅提高疫苗的制作成本，這在發(fā)展中國家難以承受；4)由美國聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)，2008年在中國上市的FMD合成肽疫苗，克服了FMD滅活疫苗的上述缺點，但短肽受MHC種屬限制，目前只能用于豬而對牛無效，而且時刻面對因流行毒株發(fā)生抗原變異而失效或效力降低的危險?；谏鲜鲈颍壳皣鴥?nèi)外研究者都在尋求一種更加安全和有效的FMD疫苗，以克服常規(guī)疫苗和合成肽疫苗存在的缺點和不足，其中，利用缺損型腺病毒活載體構(gòu)建的口蹄疫病毒樣顆粒疫苗已成為研究的熱點，最有希望成為第二代口蹄疫疫苗。迄今為止，還沒有Asia1型口蹄疫病毒樣顆粒的報道。由于FMDV是高變異的病毒，不同血清型的病毒如0型和Asial型口蹄疫的核苷酸序列差異在15%以上，另外，F(xiàn)MDV的基因組結(jié)構(gòu)獨特，正確地克隆和組裝十分困難，因此構(gòu)建正確表達的FMD病毒樣顆粒并能夠在動物體內(nèi)誘導(dǎo)出高水平的中和抗體在技術(shù)上是十分困難的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種由FMDV衣殼蛋白前體P1-2A基因和3C基因拼接在一起而得到的一種融合基因；本發(fā)明的目的之二是提供一種能夠高效表達亞洲1型口蹄疫病毒VLP的重組腺病毒；本發(fā)明目的之三是將上述重組腺病毒應(yīng)用于預(yù)防或治療口蹄疫；本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種由口蹄疫病毒(FMDV)衣殼蛋白前體P1-2A基因和3C基因拼接在一起而得到的一種融合基因，其堿基序列為SEQIDN0:1所示。將SEQIDNO:1所示的堿基序列與腺病毒穿梭載體相連接，得到重組腺病毒穿梭載體；將重組腺病毒穿梭載體重組進入人缺損腺病毒5型，篩選得到能夠高效表達亞洲1型口蹄疫病毒VLP的重組腺病毒；優(yōu)選的，本發(fā)明所述的能夠高效表達亞洲1型口蹄疫病毒VLP的重組腺病毒(rAdV-AsialP12A3C)的微生物保藏號是CGMCCNo.3467；分類命名是腺病毒；保藏時間是2009年11月27日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。將本發(fā)明所構(gòu)建的重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C在293細胞上培養(yǎng)，用FMDV共享表位單克隆抗體進行免疫熒光檢測為陽性，而且培養(yǎng)上清用Westernblot檢測呈現(xiàn)中等強度的陽性反應(yīng)，表明Asial型口蹄疫VLP在哺乳類293細胞中實現(xiàn)了高效表達。一步生長曲線測定重組腺病毒在293細胞中的復(fù)制能力，表明在接種后60h，重組腺病毒的復(fù)制水平達到高峰；外源基因在病毒傳代過程中穩(wěn)定表達，并能夠形成FMDV病毒樣顆粒，當(dāng)重組腺病毒傳至第8代時毒價可達7.9X108PFU/ml。rAdV_AsialP12A3C接種小鼠在5周內(nèi)產(chǎn)生口蹄疫特異性中和抗體，在首次免疫后9周(二免后3周)中和抗體達到峰值；而且二次免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平明顯高于一次免疫組，由此誘導(dǎo)的具有保護水平的中和抗體可持續(xù)21周。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明所構(gòu)建的用缺損腺病毒表達的亞洲1型口蹄疫病毒VLP，在小鼠體內(nèi)可持續(xù)誘導(dǎo)高水平的中和抗體，可作為預(yù)防Asial型口蹄疫的疫苗。圖1重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C感染293細胞引起的細胞病變；(A)正常293細胞；(B)感染rAdV-AsialP12A3C的293細胞。圖2重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C在293細胞中的PCR鑒定；L:DL15000DNALadder；1=H2O；2=WtAdV；3-6第2，4，6禾口8代rAdV-AsialP12A3C。圖3用間接免疫熒光試驗檢測重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C感染的293細胞；(A)rAdV-AsialP12A3C感染的293細胞；(B)wtAdV感染的293細胞。圖4用Westernblot分析FMD病毒樣顆粒在重組腺病毒rAdV_AsialP12A3C感染細胞中的表達；1.野生型腺病毒感染的293細胞；2-4.rAdV-AsialP12A3C感染的293細胞；5.預(yù)染的蛋白Marker；6.FMDV146S蛋白。圖5重組腺病毒rAdV_AsialP12A3C的一步生長曲線。圖6重組腺病毒rAdV_AsialP12A3C接種BALB/c小鼠IgG抗體的動態(tài)變化；a.重組腺病毒一次免疫組小鼠IgG抗體的動態(tài)；b.重組腺病毒二次免疫組小鼠IgG抗體的動態(tài)。圖7重組腺病毒rAdV_AsialP12A3C接種BALB/c小鼠中和抗體的動態(tài)變化；a重組腺病毒一次免疫組小鼠中和抗體的動態(tài)；b重組腺病毒二次免疫組小鼠中和抗體的動態(tài)。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。質(zhì)粒、載體和生化試劑腺病毒骨架載體pAdEasy-1、腺病毒穿梭載體pShut11e-CMV、大腸桿菌BJ5183感受態(tài)菌以及AD-293細胞均購自Stratagene公司。大腸桿菌JM109、DH5α感受態(tài)細胞和pBluescript質(zhì)粒由本試驗室保存。PmeI和PacI均為NEBBioLabs產(chǎn)品。轉(zhuǎn)染試劑EffecteneTransfectionReagent購自QIAGEN公司?？谔阋卟《綱P2單克隆抗體4B2由微生物保藏號是CGMCCNo.3103的雜交瘤細胞系所分泌；(中國發(fā)明專利申請?zhí)?00910161346.9)。無外源基因表達的野生型腺病毒(wtAd)由本實驗室構(gòu)建并保存，wtAd的構(gòu)建方法與本發(fā)明中重組腺病毒的構(gòu)建方法相同。實施例1重組腺病毒的構(gòu)建、純化和鑒定1、Asial型FMDV基因組Pl、2A基因和3C基因的拼接根據(jù)本發(fā)明人實驗室成功拯救的Asial型FMDV的感染性克隆(王海偉，涂亞斌，周國輝等.Asial型口蹄疫病毒感染性克隆的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008,30(12)915-919)(于力等，Asial型口蹄疫病毒感染性cDNA及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，中國發(fā)明專利申請?zhí)?00810171258.2)的Asial/YS/CHA/05株基因組，分別設(shè)計上下游引物(表1)采用RT-PCR方法分別擴增P1-2A基因和3C基因，將pBluescriptIISK(+)和P1-2A的PCR擴增產(chǎn)物分別進行KpnI和XhoI酶切，連接后轉(zhuǎn)化并且篩選陽性克隆，酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pBlue-AsialP12A。將pBlue_AsialP12A與3C基因的PCR產(chǎn)物分別進行XhoI和SphI酶切，連接后轉(zhuǎn)化并且篩選陽性克隆，進行酶切和測序鑒定，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pBlue-AsialP12A3C。表1用于Asial型FMDVPl、2A基因和3C基因拼接的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2、重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建根據(jù)質(zhì)粒pBlue-ASialP12A3C的基因序列設(shè)計引物Pl和P2(表1)，用于擴增pBlue-AsialP12A3C質(zhì)粒上的P12A3C基因。Pl含有kpnl酶切位點、kozke序列和起始密碼子ATG，P2含有Notl酶切位點和終止密碼子TAG。以質(zhì)粒pBlue_AsialP12A3C為模板，P1、P2為引物進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物膠回收，然后將回收的PCR產(chǎn)物和腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV進行KpnI和Notl雙酶切，膠回收純化酶切后的產(chǎn)物，與穿梭載體連接，并轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)菌，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取菌落接種至5mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，進行PCR、酶切和測序鑒定。測序正確的質(zhì)粒命名pShuttle-AsialP12A3C。3、重組腺病毒質(zhì)粒的獲得將pShuttle-ASialP12A3C用限制性內(nèi)切酶PmeI線性化，電轉(zhuǎn)化至含有腺病毒骨架載體AdEasy-I的BJ5183感受態(tài)菌(AdEasy-l-BJ5183)中。經(jīng)卡那霉素抗性篩選，提取質(zhì)粒，用PacI酶切鑒定，將陽性重組腺病毒質(zhì)粒進行測序，正確的命名為pAdV-AsialP12A3C。4、轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒pAdV_AsialP12A3C轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌，大量增殖重組質(zhì)粒。用中量質(zhì)粒提取試劑盒提取重組腺病毒質(zhì)粒，用PacI酶切，乙醇沉淀滅菌，超凈工作臺無菌吹干，用無菌超純水溶解沉淀，使質(zhì)粒的終濃度為0.1-0.2g/L。用QIAGEN公司轉(zhuǎn)染試劑EffecteneTransfectionReagent進行轉(zhuǎn)染，具體操作按說明書進行。5、重組腺病毒的純化與鑒定將獲得的初代重組腺病毒(命名為rAdV-AsialP12A3C)反復(fù)凍融后，離心取上清，接種293細胞，連續(xù)傳8代，觀察細胞病變情況；取2、4、6和8代病毒，用蛋白酶K處理后，用PCR檢測目的基因。同時取4、6和8代重組腺病毒感染的293細胞，用口蹄疫病毒VP2單抗4B2進行間接免疫熒光試驗及Westernblot分析，以檢測目的基因的表達情況。轉(zhuǎn)染后7天細胞開始出現(xiàn)病變，細胞變圓、變大、脫落。第9天收獲病毒進行傳代，傳至第5代時，細胞于接種病毒后24-48h完全出現(xiàn)CPE(圖IB)。取第2、4、6和8代重組腺病毒，用DNA提取試劑盒提取重組病毒DNA，PCR均能檢出3.5kb的目的基因(圖2)。6、間接免疫熒光試驗將293細胞鋪于96孔板中，當(dāng)長到90%單層時，接種15M0I(Multiplicitiesofinfection)rAdV-AsialP12A3C，24h后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，將rAdV-AsialP12A3C感染的293細胞用預(yù)冷的無水乙醇固定15min，加入抗FMDVVP2的單克隆抗體4B2，37°C作用lh，用PBST洗滌后，加入熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG(Sigma)于37°C作用40min,PBST洗滌后自然干燥，加入緩沖甘油，于熒光顯微鏡下觀察。用針對FMDVVP2蛋白的單克隆抗體4B2進行IFA檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組腺病毒感染的細胞均出現(xiàn)明顯的熒光，而對照組則檢測不到熒光(圖3)，表明rAdV-AsialP12A3C能正確地表達FMDV-VP2蛋白。7、Westernblot試驗將感染rAdV-AsialP12A3C的293細胞進行SDS-PAGE分析，同時設(shè)立口蹄疫全病毒蛋白作為陽性對照，野生型腺病毒感染的293細胞作為陰性對照，之后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用脫脂牛奶封閉后，加入抗VP2的單克隆抗體4B2(11000稀釋)，37°C作用lh，用PBST洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG(Sigma，110000稀釋)，37°C作用Ih,洗滌后加入DAB溶液顯色。對4、6、8代的重組腺病毒進行Westernblot分析(圖4)，結(jié)果表明，rAdV-AsialP12A3C在感染的293細胞中復(fù)制、產(chǎn)生病毒樣顆粒、并且穩(wěn)定地表達。與單克隆抗體4B2發(fā)生免疫反應(yīng)的條帶與FMDV衣殼蛋白VPO、VP3的分子量大小相當(dāng)，表明rAdV-AsialP12A3C感染293細胞后形成FMDV多聚蛋白，并組裝成FMDV病毒樣顆粒。這與Mayr等的結(jié)果相似，他們構(gòu)建了一株表達A型FMDVP1-2A-3C基因重組腺病毒，同時也將3C基因單點突變失活作為對照，發(fā)現(xiàn)失活的3C蛋白不能有效裂解FMDV多聚蛋白，從而使表達A型FMDVP1-2A-3C基因的重組腺病毒在293細胞中不能正確地組裝完整的FMDV病毒樣顆粒，在Westernblot檢測中也就沒有VP0、VP3和VPl條帶的形成。8、重組腺病毒增殖滴度的測定分別用10M0I劑量的第8代重組腺病毒(rAdV-AsialP12A3C)和野生型腺病毒(wtAdV)接種293細胞，在接種后12、24、36、48、60和72h收取病毒并進行毒價測定(KleinaLG.,GrubmanMJ.1992.AntiviralEffectsofaThiolProteaseInhibitoronFoot-and-MouthDiseaseVirus.J.Virol.66:7168_7175.)，建立重組腺病毒與野生型腺病毒的一步生長曲線。分別用10M0I劑量的第4、6、8和10代重組腺病毒接種293細胞，在接種后60h收取病毒并進行毒價測定，檢測不同代次重組病毒的病毒滴度。隨著病毒傳代代次的升高，重組病毒的毒價也呈上升的趨勢，第4、6、8、和10代的毒價分別為104、105、108和IO8PFU,說明重組病毒的復(fù)制水平和滴度在第6代以后趨于穩(wěn)定，第8代達到峰值。經(jīng)病毒滴度測定，繪制出第8代重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C與其親本病毒的一步生長曲線，即病毒增殖滴度與生長時間的相關(guān)性曲線，反映病毒生長繁殖的規(guī)律，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，隨著重組腺病毒感染293細胞時間的延長，病毒滴度逐漸升高，在60h時，病毒的滴度達到峰值，隨后開始下降。試驗例1重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C的保護效力試驗1、BALB/c鼠的免疫接種9周齡BALB/c鼠50只，購自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心，用免疫熒光方法檢測人腺病毒5型抗體為陰性。實驗動物隨機分成9組，第1A、1B、1C和ID組為本發(fā)明實施例1所構(gòu)建的重組腺病毒(rAdV-AsialP12A3C)—次免疫組，每組5只，重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C免疫劑量分別為每只鼠1X108、5X107、5XIO6和5XIO5PFU；第2A、2B、2C和2D組為重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C兩次免疫組，每組6只，免疫劑量分別為每只鼠1X108、5X107、5XIO6和5XIO5PFU,在第一次免疫后第6周以相同劑量加強免疫；第9組接種wtAdV。重組腺病毒rAdV_AsialP12A3C用PBS稀釋，后腿肌肉注射。2.間接ELISA檢測用包被液將FMDV146S抗原稀釋至20μg/mL,每孔100μL，加入酶標(biāo)板，4°C過夜包被。用PBS洗3次，5%脫脂乳封閉，37°C孵育lh。PBS洗3次，加入待檢小鼠血清，同時設(shè)立鼠陽性和陰性血清為對照。37°C孵育lh。洗滌后加入15000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗，OPD顯色后于492nm處讀取OD值。3.微量細胞中和試驗(1)病毒毒價的測定將重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C接種于單層細胞，37°C吸附Ih后加入維持液，置溫箱培養(yǎng)；逐日觀察，待細胞病變(CPE)達75%以上，收獲病毒懸液凍融3次，以3OOOr/min離心lOmin，取上清液，定量分裝成Iml小瓶置-70°C保存?zhèn)溆茫x用的病毒對細胞有較穩(wěn)定的致病力。取從_70°C冰箱保存的病毒一安瓶，將病毒在96孔培養(yǎng)板上作10倍遞進稀釋即ICT1，ΙΟ"2,10_3……，每孔病毒懸液量為50μ1，每個稀釋度作8孔，每孔加入100細胞懸液，每塊板的最后一行設(shè)8孔細胞對照，制備細胞懸液的濃度以使細胞在24h內(nèi)長滿單層為度。把培養(yǎng)板置5%C02溫箱37°C培養(yǎng)，從48-72h逐日觀察細胞病變，記錄結(jié)果。按Reed和Muench兩氏法計算TTCID5tlt5(殷震，劉景華，動物病毒學(xué)[M].第2版，北京科學(xué)出版社，1997，336340.)舉例說明TCID50計算(接種劑量50μ1)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>距離比例=56%-50%、56%-33%IgTCID50=高于50%病毒稀釋度的對數(shù)-距離比例X稀釋系數(shù)的對數(shù)高于50%病毒稀釋度的對數(shù)為-6，距離比例為0.26，稀釋系數(shù)的對數(shù)為_1。IgTCID50=-6+0.26X(_1)=-6.3則TCID5tl=10_63，50即病毒作10_6_3稀釋，每孔接種50μ1，可使半數(shù)組織細胞管發(fā)生病變。(2)中和試驗動物血清中含有多種蛋白質(zhì)成分對抗體中和病毒有輔助作用，如補體、免疫球蛋白和抗補體抗體等。為排除這些不耐熱的非特異性反應(yīng)因素，用于中和試驗的血清或腹水須經(jīng)加熱56°C、30min滅活處理。取已滅活處理的血清，在96孔微量細胞培養(yǎng)板上，用不含血清的DMEM作一系列倍比稀釋，使其稀釋度分別為原血清的14、18、116、132、164等等，每孔含量為50μ1，每個稀釋度作4孔。取_70°C冰箱保存的病毒液，按經(jīng)測定的毒價作200TCID5(I0稀釋(與等量血清混合，其毒價為IOOTCID5ci)。如病毒價為10_63，50μ1。所以應(yīng)將病毒作2Χ10_43稀釋。每孔加入50μ1病毒液，封好蓋，置于37°C溫箱中和lh。在制備細胞懸液時，其濃度以在24h內(nèi)長滿單層為度血清病毒中和Ih后取出，每孔加入100μ1細胞懸液。置5%C0237°C溫箱培養(yǎng)，自培養(yǎng)48h開始逐日觀察記錄，120h終判。為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，每次試驗都必須設(shè)置下列對照。陽性和陰性(sp2/0)腹水與待檢腹水進行平行試驗，陽性腹水對照應(yīng)不出現(xiàn)細胞病變，而陰性腹水對照應(yīng)出現(xiàn)細胞病變。每次試驗每一塊板上都設(shè)立病毒對照，先將病毒作0.1、1、10、100、ioootcid5ci稀釋，每個稀釋度作4孔，每孔加50μ1。然后每孔ιοομι細胞懸液。o.itcidtcid5tl應(yīng)不引起細胞病變，而且IOOTCID5q必須引起細胞病變，否則該試驗不能成立。為檢查被檢腹水本身對細胞有無任何毒性作用，設(shè)立被檢腹水毒性對照是必要的。即在組織細胞中加入低倍稀釋的待檢腹水(相當(dāng)于中和試驗中被檢腹水的最低稀釋度)。即不接種病毒和待檢腹水的細胞懸液孔。正常細胞對照應(yīng)在整個中和試驗中一直保持良好的形態(tài)和生活特征，為避免培養(yǎng)板本身引起試驗誤差，應(yīng)在每塊板上都設(shè)立這一對照。當(dāng)病毒回歸試驗，陽性、陰性、正常細胞對照相，賦稅毒性對照全部成立時，才能進行判定，被檢腹水孔出現(xiàn)100%cpe判為陰性，50%以上細胞出現(xiàn)保護者為陽性；固定病毒稀釋腹水中和試驗的結(jié)果計算，是計算出能保護50%細胞孔不產(chǎn)生細胞病變的腹水稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價。用Reed和Muench兩氏法(或Karber法)計算結(jié)果。舉例說明固定病毒_稀釋血清法中和抗體效價計算<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>用Reed和Muench兩氏法(或Karber法)計算結(jié)果<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>lgPD50=高于50%血清稀釋度的對數(shù)-距離比例X稀釋系數(shù)的對數(shù)lgPD50=-1.5-0.5X(-0.3)=-1.35則PD50=1(Γ136，50μ1因10_135=1/22，即122的血清可保護50%細胞不產(chǎn)生病變，122就是該份血清的中和抗體效價。試驗結(jié)果重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C—次免疫接種的4組BALB/c鼠(1A/1XIO8PFU,IB/5X107PFU、lC/5XIO6PFUJPID/5XIO5PFU)和間隔6周同樣劑量第二次免疫接種的4組BALB/c鼠(2A、2B、2C、和2D)，在接種后24周期間內(nèi)采集血清，分別用ELISA和微量中和試驗檢測血清抗體的動態(tài)水平，野生型腺病毒W(wǎng)tAdV免疫組作為對照，結(jié)果見圖6和圖7。從圖6a可見，一次免疫組的小鼠，IA/1XIO8PFU組和IB/5XIO7PFU組在接種后3周已出現(xiàn)口蹄疫特異性IgG抗體，隨后抗體水平逐漸升高，第8周IB/5XIO7PFU組的IgG抗體達到高峰，而1A/1XIO8PFU組在第9周IgG抗體達到峰值，之后抗體水平逐漸下降，到第24周這兩組接種鼠的抗體水平接近陰性；1C/5XIO6PFU組小鼠只產(chǎn)生很低水平的抗體，而1D/5XIO5PFU組的小鼠與WtAdV對照組同樣一直沒有產(chǎn)生口蹄疫特異性抗體。兩次免疫接種小鼠的免疫應(yīng)答見圖6b，與一次免疫組小鼠的共同點是，IgG抗體也在8-9周達到峰值、1D/5XIO5PFU組在二次接種后同樣沒有產(chǎn)生抗體，可是兩次免疫組具有如下明顯特征1)兩次免疫的抗體水平要明顯高于同劑量的一次免疫組，這種抗體水平的差別在免疫組IC(很低的免疫應(yīng)答)和2C(免疫應(yīng)答高于IA組)之間尤其明顯；2A組比IA組的抗體水平也有明顯提升；尤為重要的是，2B組不但比IB組的抗體水平明顯提升，而且該劑量(5XIO7)的二次接種可使免疫應(yīng)答最大化至2A免疫組(1X108)的水平，這更加顯示出加強免疫的重要性；2)同時，抗體應(yīng)答水平隨著免疫劑量的升高而上升，一次免疫鼠和二次免疫鼠的最低劑量組(1D、2D)始終沒有產(chǎn)生特異性IgG抗體；而在高劑量免疫組(1A、1B、2A、2B)，不但抗體水平高持續(xù)時間也長，直至實驗結(jié)束仍能夠檢測到口蹄疫特異性抗體的存在。用ELISA檢測IgG抗體可以反映rAdV-AsialP12A3C在免疫接種鼠體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的整體水平，而更直觀的保護性免疫指標(biāo)是中和抗體水平。因此，在檢測血清IgG抗體的同時，本發(fā)明也測定了上述各實驗組的中和抗體水平及其動態(tài)變化，結(jié)果見圖7。一次免疫組的小鼠(圖7a)，IA/1XIO8PFU組和IB/5XIO7PFU組在接種后3_5周出現(xiàn)口蹄疫特異性中和抗體，隨后抗體水平逐漸升高，第5周1B/5X107PFU組的中和抗體達到高峰(89)，而1A/1XIO8PFU組在第9周中和抗體才達到峰值(89)，之后抗體水平逐漸下降，到第9、11周這兩組接種鼠的中和抗體水平分別接近陰性；1C/5X106PFU組和1D/5XIO5PFU組的小鼠不能檢出中和抗體。兩次免疫接種小鼠產(chǎn)生的中和抗體，見圖7b。2A和2B組的中和抗體水平(最高達178和251)比一次免疫的IA組和IB組(最高達89和89)明顯升高，2C組也產(chǎn)生了較高水平的中和抗體(最高達126)，這些二次免疫鼠的中和抗體水平均在初次免疫后第9周、二次免疫后第3周達到峰值；1D/5XIO5PFU組在二次接種后同樣沒有產(chǎn)生中和抗體。概括起來，重組腺病毒rAdV-AsialP12A3C—次免疫小鼠以及兩次免疫小鼠誘導(dǎo)中和抗體具有如下明顯特征。其一，兩次免疫產(chǎn)生的中和抗體水平要明顯高于同劑量的一次免疫組，這種差別在免疫組IC(無中和抗體免疫應(yīng)答)和2C(免疫應(yīng)答明顯高于1A、1B組)之間尤其明顯，2A、2B組比1A、1B組中和抗體水平的提升更為明顯。其二，從總體趨勢看，中和抗體的應(yīng)答水平隨著免疫劑量的增加而上升，低劑量的1C、1D和2D組均不產(chǎn)生中和抗體，2C組產(chǎn)生中和抗體的水平比較高劑量的2A、2B組低；然而，在1A、2A組與較低劑量的1B、2B組，情形卻有不同。在一次免疫鼠IB可誘導(dǎo)與IA同樣水平的中和抗體，而且IB誘導(dǎo)中和抗體的高峰期(第5周)明顯早于IA(第9周)；類似的情況也見于二次免疫鼠，較低劑量的2B組誘導(dǎo)的中和抗體不但早于2A組，而且誘導(dǎo)中和抗體的水平也明顯高于2A組。這表明，經(jīng)PBS稀釋的病毒液IB/5XIO7PFU組比未稀釋的病毒液1A/1XIO8PFU組更快速更有效地激發(fā)中和抗體的產(chǎn)生，其機理尚不清楚。其三，在小鼠模型的研究結(jié)果表明，在5XIO7PFU劑量下兩次免疫接種誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的滴度高(最高達251)、持續(xù)時間長(在一免后21周中和抗體滴度仍為63)，依據(jù)保護性中和抗體滴度(中和抗體滴度為55)確定的保護性免疫持續(xù)期為5個月，根據(jù)美國Moraes等的研究(MoraesMP，MayrGA,MasonPW,etal.EarlyprotectionagainsthomologouschallengeafterasingledoseofrepIication-defectivehumanadenovirustype^expressingcapsidproteinsoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)strainA24.Vaccine2002；201631-9.其它免疫保護因素(細胞介導(dǎo)免疫、黏膜免疫和天然免疫)推斷的完全保護性免疫的持續(xù)期為6個月，由此推斷的臨床保護性免疫的持續(xù)期為8個月。權(quán)利要求一種由口蹄疫病毒衣殼蛋白前體P1-2A基因和3C基因拼接在一起而得到的一種融合基因，其堿基序列為SEQIDNO1所示。2.一種重組腺病毒，包括以下方法構(gòu)建得到將權(quán)利要求ISEQIDNO1所示的堿基序列與腺病毒穿梭載體相連接，得到重組腺病毒穿梭載體；將重組腺病毒穿梭載體重組進入人缺損腺病毒5型，篩選，鑒定，即得。3.按照權(quán)利要求1的重組腺病毒，其微生物保藏號是CGMCCNo.3467。4.權(quán)利要求1所述的融合基因在制備預(yù)防或治療口蹄疫藥物中的用途。5.權(quán)利要求2或3所述的重組腺病毒在制備預(yù)防或治療口蹄疫疫苗中的用途。6.一種預(yù)防口蹄疫的疫苗組合物，其特征在于含有有效量的權(quán)利要求2或3所述的重組腺病毒。全文摘要本發(fā)明公開了表達亞洲1型口蹄疫病毒VLP的重組腺病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明將FMDV衣殼蛋白前體P1-2A基因和3C基因拼接在一起而得到一種融合基因，其堿基序列為SEQIDNO1所示。將SEQIDNO1所示的堿基序列與腺病毒穿梭載體相連接，得到重組腺病毒穿梭載體；將重組腺病毒穿梭載體重組進入人缺損腺病毒5型，篩選，鑒定，得到一種高效表達亞洲1型口蹄疫病毒VLP的重組腺病毒，其微生物保藏號是CGMCCNo.3467。本發(fā)明所構(gòu)建的用缺損腺病毒表達的亞洲1型口蹄疫病毒VLP，在小鼠體內(nèi)可持續(xù)誘導(dǎo)高水平的中和抗體，可作為預(yù)防Asia1型口蹄疫的疫苗。文檔編號C12N7/01GK101818163SQ20101011453公開日2010年9月1日申請日期2010年2月26日優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日發(fā)明者于力,周國輝,王海偉,王芳申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所