專利名稱：產(chǎn)纖維素酶的菌劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)纖維素酶的菌劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的纖維素酶生產(chǎn)方法主要是在自然界中篩選優(yōu)良產(chǎn)酶菌株，再通過(guò)一定的誘 變手段，獲得工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)酶菌種。但自然環(huán)境中纖維素的降解是多種微生物協(xié) 同完成的，這些微生物相互共生，形成一個(gè)降解纖維素的微生態(tài)體系。在特定的生態(tài)系統(tǒng) 中，微生物之間互相協(xié)同作用，也互相制約，使得產(chǎn)生的水解纖維素的酶之間的比例處于一 種最適降解纖維素的狀態(tài)，而產(chǎn)生纖維素酶的微生物一旦從其小生態(tài)中分離出來(lái)，就會(huì)破 壞這個(gè)最佳比例。篩選優(yōu)良菌株時(shí)無(wú)疑是將其從其生態(tài)環(huán)境中分離出來(lái)，所以其產(chǎn)酶能力 很難有所突破。目前工業(yè)用纖維素酶的來(lái)源主要是好氧絲狀真菌木霉，如里氏木霉、綠色 木霉、康寧木霉，但木霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中存在多種真菌毒素，有毒性嫌疑；另一方面木霉產(chǎn)的 β “葡萄糖苷酶活力很低，致使纖維二糖在反應(yīng)體系中積累，最終影響酶解效率。微生物合 成纖維素酶受誘導(dǎo)和葡萄糖阻遏這兩種機(jī)制調(diào)控，β “葡萄糖苷酶分解纖維二糖產(chǎn)生寡糖， 產(chǎn)生的寡糖屬于微生物易利用的碳源，其又會(huì)阻遏纖維素酶的合成。真菌雖然可以分泌大 量纖維素酶，其產(chǎn)酶能力較高，酶系較全，但真菌發(fā)酵周期長(zhǎng)，易染細(xì)菌且不易擴(kuò)大生產(chǎn)；細(xì) 菌生產(chǎn)速度雖然快，但產(chǎn)酶水平低。微生物自身會(huì)分泌大量非目的酶蛋白，而纖維素酶又難 于純化，因此不利于工業(yè)化的生產(chǎn)及應(yīng)用。傳統(tǒng)的纖維素酶生產(chǎn)方法已經(jīng)達(dá)到了一個(gè)瓶頸。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的纖維素酶編碼基因得到克隆，并成功的在 大腸桿菌及畢赤酵母等多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。但由于纖維素的完全水解需要三種酶成分的 協(xié)同作用，而常規(guī)的基因工程手段通常可以高效表達(dá)一種酶，所以基因工程纖維素酶功能 略顯單薄?，F(xiàn)有的重組纖維素酶的生產(chǎn)主要有兩種方式，其一是將上述三種纖維素酶單獨(dú) 生產(chǎn)，應(yīng)用時(shí)再進(jìn)行組合，其二是構(gòu)建雞尾式表達(dá)體系直接生產(chǎn)復(fù)合纖維素酶，不過(guò)這兩種 方法都有一定的局限性。前一種方法需要將三種酶分別單獨(dú)生產(chǎn)，其整個(gè)發(fā)酵周期長(zhǎng)，儀器 設(shè)備及占地面積都有較高的要求。而第二種方法同時(shí)在一個(gè)畢赤酵母中表達(dá)三種不同的酶 蛋白，其表達(dá)量及產(chǎn)量得不到保證，僅有理論研究?jī)r(jià)值而無(wú)實(shí)際應(yīng)用意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)纖維素酶的菌劑及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的產(chǎn)纖維素酶的菌劑，其活性成分為畢赤酵母1413、畢赤酵母1515 和畢赤酵母2526 ；所述畢赤酵母1413是將內(nèi)切葡聚糖酶基因?qū)氘叧嘟湍钢蝎@得的重組 菌，所述畢赤酵母1515是將外切葡聚糖酶基因?qū)氘叧嘟湍钢蝎@得的重組菌，所述畢赤酵 母2526是將β -葡萄糖苷酶基因?qū)氘叧嘟湍钢蝎@得的重組菌。其中，所述內(nèi)切葡聚糖酶可是如下1)或2)的蛋白；所述外切葡聚糖酶可是如下 3)或4)的蛋白；所述β _葡萄糖苷酶可是如下5)或6)的蛋白；1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
2)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸且能水解多糖的由1)衍生的蛋白質(zhì)；3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；4)在序列表中序列4的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸且能水解多糖的由3)衍生的蛋白質(zhì)；5)由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；6)在序列表中序列6的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸且能水解多糖的由5)衍生的蛋白質(zhì)。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過(guò)10個(gè)氨基 酸的取代和/或缺失和/或添加。為了使序列表中序列2、4或6所示的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2、4或 6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2_10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-my c10EQKLISEEDL上述帶有標(biāo)簽的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得 到。上述帶有標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1、3或5所示的DNA分子中 缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在 其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。所述內(nèi)切葡聚糖酶基因可是如下a)或b)或c)的DNA分子；所述外切葡聚糖酶基 因可是如下d)或e)或f)的DNA分子；所述β -葡萄糖苷酶基因可是如下g)或h)或i) 的DNA分子；a)其核苷酸序列是序列表中序列1 ；b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA片段雜交且編碼能水解多糖的蛋白的DNA分子；c)與a)或b)的基因具有90%以上的同源性，且編碼能水解多糖的蛋白的DNA分 子；d)其核苷酸序列是序列表中序列3 ；e)在嚴(yán)格條件下與d)限定的DNA片段雜交且編碼能水解多糖的蛋白的DNA分子；
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f)與d)或e)的基因具有90%以上的同源性，且編碼能水解多糖的蛋白的DNA分 子；g)其核苷酸序列是序列表中序列5 ；h)在嚴(yán)格條件下與g)限定的DNA片段雜交且編碼能水解多糖的蛋白的DNA分子；i)與g)或h)的基因具有90%以上的同源性，且編碼能水解多糖的蛋白的DNA分子。所述c)、f)或i)中的基因，與a)、d)或g)的基因最好有95%以上的同源性。上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC，0. 5% SDS的溶液中，在68°C下雜交，然后用2 X SSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。所述菌劑中，所述畢赤酵母1413、所述畢赤酵母1515和所述畢赤酵母2526的集落 形成單位數(shù)目比為(3-10) (1-5) (1-3)。所述菌劑中，所述畢赤酵母1413、所述畢赤酵母1515和所述畢赤酵母2526可分別
獨(dú)立包裝，也可混合在一起。本發(fā)明的產(chǎn)纖維素酶的菌劑可為液體制劑，也可為固體制劑。在液體制劑中加入 吸附劑即可獲得固體制劑，如加入輕質(zhì)碳酸鈣或草炭等。所述畢赤酵母1413具體可為將內(nèi)切葡聚糖酶基因?qū)氚退沟庐叧嘟湍窯S115 中獲得的重組菌，所述畢赤酵母1515具體可為將外切葡聚糖酶基因?qū)氚退沟庐叧嘟湍?GS115中獲得的重組菌，所述畢赤酵母2526具體可為將葡萄糖苷酶基因?qū)氚退沟庐?赤酵母GS115中獲得的重組菌。本發(fā)明的產(chǎn)纖維素酶的菌劑可用來(lái)生產(chǎn)纖維素酶。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)纖維素酶的方法。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)纖維素酶的方法，是發(fā)酵所述的菌劑生產(chǎn)纖維素酶。本發(fā)明的產(chǎn)纖維素酶的菌劑的活性成分為表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的畢赤酵母、表達(dá)外 切葡聚糖酶的畢赤酵母和表達(dá)葡萄糖苷酶的畢赤酵母。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)采用甲醇 作為誘導(dǎo)物，不會(huì)阻遏畢赤酵母產(chǎn)纖維素酶的能力。本發(fā)明的產(chǎn)纖維素酶的菌劑的活性均 為畢赤酵母生物，彼此間不存在競(jìng)爭(zhēng)，且其表達(dá)的酶之間也無(wú)抑制作用，彼此之間不存在影 響。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明所用方法均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用試劑均可從商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例所用到的生物材料如 下解淀粉芽孢桿菌CICC 22947于2008年1月，獲取自保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)工業(yè)微生物菌 種保藏管理中心(CICC)。解淀粉芽孢桿菌CICC 22947的原始來(lái)源不清楚。產(chǎn)黃青霉CICC 40209于2008年1月，獲取自保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏 管理中心(CICC)。產(chǎn)黃青霉CICC 40209的原始來(lái)源不清楚。黑曲霉CICC 40613于2008年1月，獲取自保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管 理中心(CICC)。黑曲霉CICC 40613的原始來(lái)源不清楚。中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的聯(lián)系方式如下北京市朝陽(yáng)區(qū)霄云路32號(hào)郵編100027 ；電話010-64666552 ；傳真:010_64616613實(shí)施例1、產(chǎn)纖維素酶的菌劑一、內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆解淀粉芽孢桿菌CICC 22947在LB培養(yǎng)基(0. 5g/100ml酵母提取物，1. 0g/100ml 蛋白胨，1.0g/100ml NaCl, pH7. 0)中培養(yǎng)12h，獲得解淀粉芽孢桿菌新鮮菌液，用該菌液進(jìn) 行菌液PCR擴(kuò)增內(nèi)切葡聚糖酶基因，所用引物的核苷酸序列如下5，引物 Pl GAATTCGCAGGGACAAAAACGCCA(下劃線是 EcoR I 識(shí)別位點(diǎn))；3'引物 P2 GCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCC (下劃線是 Not I 識(shí)別位點(diǎn)，斜體是 終止密碼子)。PCR反應(yīng)體系如下解淀粉芽孢桿菌CICC 22947菌液 IulPlIulP2Iul10XPCR buffer2. 5 μ LTaq Plus (北京天根)IuldNTP mix(2. 5mmol/L)4μ LddH2014. 5μ L_總體積25 μ LPCR 擴(kuò)增條件94°C 3min ；94°C 30s、53. 5°C 30s,72°C lmin30s，共 28 個(gè)循環(huán)； 72°C IOmin。PCR擴(kuò)增得到1413bp的片段，將該片段克隆到pEASY_T3載體(北京全式金生物技 術(shù)有限公司)上，得到重組載體PEASY-T3-1413，pEASY-T3-1413送北京奧科進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序 結(jié)果表明1413bp的片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，編碼序列表中序列2所示的蛋白。二、外切葡聚糖酶基因的克隆產(chǎn)黃青霉CICC 40209(中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)在察氏培養(yǎng)基 (3g/100ml NaNO3, lg/100ml K2HPO4,0. 5g/100ml MgSO4 ·7Η20，0. 5g/100ml KC1，0. Olg/lOOml FeSO4, 30g/100ml蔗糖)中培養(yǎng)5天，收集菌體，用超純水洗滌菌體后在液氮中研磨成粉 末，加入冰預(yù)冷的 0. 4mL 提取液(pH8. 0 的 50mmol/LTris-HCl，150mmol/L NaCl，pH8. 0 的 1 OOmmo 1/L EDTA)，振蕩混勻，加入 50 μ L 10g/100ml SDS，37°C保溫 lh，再加入 75 μ L 5mol/ L NaCl，輕輕混勻，再加入 65 μ LCTAB/NaCl 混合液(10g/100ml CTAB, 0. 7mol/L NaCl)，65°C 下保溫20min，用等體積的酚氯仿混合物抽提，吸取上清液，用終濃度75%的異丙醇沉 淀，沉淀用200μ1 75%乙醇洗滌2次后，真空干燥，得到產(chǎn)黃青霉CICC 40209基因組DNA。設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增外切葡聚糖酶基因，所用引物的核苷酸序列如下5，引物 Ρ3 GAATTCCAGCAGGTTGGCACAAGCAC (下劃線是 EcoR I 識(shí)別位點(diǎn))；3，引物 Ρ4 GCGGCCGCCTACAGGCACTGCGAGTAGT (下劃線是 Not I 識(shí)別位點(diǎn)，斜體是 終止密碼子)。PCR反應(yīng)體系如下
產(chǎn)黃青霉 CICC 40209 基因組 DNA (0. 25 μ g/ul) IulP3IulP4Iul10XPCR buffer2. 5 μ LTaq Plus (北京天根)IuldNTP mix(2. 5mmol/L)4μ LddH2014. 5 μ L_總體積25 μ LPCR 擴(kuò)增條件94°C 3min ；94°C 30s、57. 5°C 30s,72°C lmin30s，共 28 個(gè)循環(huán)； 72°C IOmin。PCR擴(kuò)增得到1515bp的片段，將該片段克隆到pEASY_T3載體(北京全式金生物技 術(shù)有限公司)上，得到重組載體pEASY-T3-1515，pEASY-T3-1515送北京奧科進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序 結(jié)果表明1515bp的片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示，編碼序列表中序列4所示的蛋白。三、β -葡萄糖苷酶基因的克隆用Promega總RNA提取試劑盒提取黑曲霉CICC 40613 (中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏 管理中心)的總RNA。將在麩皮培養(yǎng)基(IOg麩皮/L去離子水)中培養(yǎng)54h的菌體離心，稱取IOOmg 濕菌體，用lmmol/L的磷酸緩沖液(pH7. 0)洗三次，在液氮中研磨成粉末，加入到冰預(yù)冷的 600uL 變性液(26mmol/L 醋酸鈉，pH4. 0 的 0. 5g/100ml 十二烷基肌氨酸，0. 125mol/L β -巰 基乙醇，4mol/L硫氰酸胍)中，然后依次加入60uL 2mol/L醋酸鈉(pH4. 0)，混勻，加入 600uL酚氯仿異戊醇(體積比為25 24 1，pH4. 7)，劇烈振蕩，在冰上放置15min， 4 °C下10000 X g離心20min，將上清吸出，加入等體積的異丙醇，-20 V放置30min，4 °C下 IOOOOXg離心lOmin，棄去上清，沉淀加入ImL冰預(yù)冷的75%乙醇洗滌后，沉淀RNA自然干 燥，用無(wú)RNA酶的水溶解，得到黑曲霉CICC 40613的總RNA。然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將黑曲霉 CICC 40613的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板PCR擴(kuò)增β -葡萄糖苷酶基因。該 PCR擴(kuò)增中所采用的引物的核苷酸序列如下5，引物 Ρ5 GAATTCGATGAATTGGCCTACTCC (下劃線是 EcoR I 識(shí)別位點(diǎn))3，引物 Ρ6 GCGGCCGCTTAGTGAACAGTAGGCAGAG (下劃線是 Not I 識(shí)別位點(diǎn)，斜體是
終止密碼子)。PCR反應(yīng)體系10XPCR buffer2. 5 μ LdNTP mix(2. 5mmol/L)3μ LMgSO4 (50mmol/L)0. 5 μ LGIBCO Pfx polymerase (2. 5U)0. 5 μ LP5(10ymol/L)1 μ LP6(10ymol/L)1 μ L模板(0·125μ g/μ L)2μ L
ddH2014. 5 μ L_總體積25 μ LPCR 擴(kuò)增條件94°C 3min ；94°C 30s、56°C 30s,72 °C 2min30s，共 28 個(gè)循環(huán)； 72°C IOmin。PCR擴(kuò)增得到2526bp的片段，將該片段克隆到pEASY_T3載體(北京全式金生物技 術(shù)有限公司)上，得到重組載體pEASY-T3-2526，pEASY-T3-2526送北京奧科進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序 結(jié)果表明2526bp的片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示，編碼序列表中序列6所示的蛋白。四、畢赤酵母1413、畢赤酵母1515和畢赤酵母2526的構(gòu)建畢赤酵母1413、畢赤酵母1515和畢赤酵母2526的構(gòu)建過(guò)程中所用試劑如下下述百分含量均為質(zhì)量百分含量。RDB固體培養(yǎng)基lmol/L山梨醇，1 %葡萄糖，1. 34 % YNB，0. 00004 %生物素， 0. 005%谷氨酸，0. 005%甲硫氨酸，0. 005%賴氨酸，0. 005%亮氨酸，0. 005%異亮氨酸， 1.5%瓊脂。LB 培養(yǎng)基0. 5%酵母提取物，1. 0%蛋白胨，1. 0% NaCl, ρΗ7· 0。LB固體培養(yǎng)基0. 5%酵母提取物，1. 0%蛋白胨，1. 0% NaCl ^P 1. 5%瓊脂，ρΗ7. 0。YPD培養(yǎng)基酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖。MM 固體培養(yǎng)基1. 34% YNB, 0. 00004%生物素，0. 5% 甲醇，1. 5%瓊脂。MD固體培養(yǎng)基1. 34% YNB, 0. 00004%生物素，2%葡萄糖，1. 5%瓊脂。BMGY培養(yǎng)基酵母提取物，2%蛋白胨，lOOmmol/L磷酸緩沖液(pH6. 0)，1. 34% YNB,0. 00004%生物素，lml/100ml 甘油。BMMY培養(yǎng)基除以0. 5ml/100ml甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同。分別用EcoR I 和 Not I 雙酶切 pEASY_T3-1413、pEASY-T3_1515 和 pEASY_T3_2526， 然后分別與用同樣酶雙酶切的載體pPICWinvitrogen公司)連接，獲得含有內(nèi)切葡聚糖酶 基因的重組表達(dá)載體PPIC9-1413、含有外切葡聚糖酶基因的重組表達(dá)載體pPIC9-1515和 含有β-葡萄糖苷酶基因的重組表達(dá)載體PPIC9-2526。按照如下方法制備畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞挑取巴斯德畢赤酵母GS115(inVitrogen公司)的單菌落接種于IOmlYPD培養(yǎng)基 中，30°C搖床過(guò)夜。以lml/lOOml接種量轉(zhuǎn)接IOOmlYPD液體培養(yǎng)基，30°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜至 OD600 = 1. 3。4°C離心5000rpm離心5min，棄上清。用100ml冰預(yù)冷無(wú)菌水將菌體重懸。4°C 離心5000rpm離心lOmin，棄上清。用50ml冰預(yù)冷無(wú)菌水將菌體重懸。4°C離心5000rpm離 心lOmin，棄上清。再用20ml lmol/L的山梨醇洗滌1次。溶于200ul lmol/L的預(yù)冷的山 梨醇中，獲得畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。80 μ 1上述獲得的畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中分別加入用BglII酶切線性化的 PPIC9-1413、pPIC9-1515和pPIC9_2526 1 μ g冰上放置15分鐘，迅速加入到冰預(yù)冷0. 2cm 電擊杯(MicroPulser Bio-Rad 165-2100)中，電擊轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞(2. 5KV，5ms)，立 即向電擊杯中加入Iml冰冷的lmol/L山梨醇，混勻后，以每板200 μ 1菌液涂布到RDB平板 上，30°C培養(yǎng)至長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子。以轉(zhuǎn)入載體pPIC9的畢赤酵母GS115作為對(duì)照。
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將RDB平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化菌落按先后順序分別點(diǎn)種于酵母選擇培養(yǎng)基MM和MD平 板的相應(yīng)位置，篩選在匪平板上生長(zhǎng)緩慢而在MD平板上生長(zhǎng)良好且經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的 轉(zhuǎn)化子作為陽(yáng)性重組子。將在匪平板上生長(zhǎng)緩慢而在MD平板上生長(zhǎng)良好、并以Pl、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增得到1413bp片段的轉(zhuǎn)pPIC9-1413的畢赤酵母命名為畢赤酵母1413 ；將在MM平板上生 長(zhǎng)緩慢而在MD平板上生長(zhǎng)良好、并以P3、P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到1515bp片段的轉(zhuǎn) PPIC9-1515的畢赤酵母命名為畢赤酵母1515 ；將在MM平板上生長(zhǎng)緩慢而在MD平板上生長(zhǎng) 良好、并以P5、P6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到2526bp片段的轉(zhuǎn)pPIC9_2526的畢赤酵母命名 為畢赤酵母2526。五、產(chǎn)纖維素酶的菌劑A)產(chǎn)纖維素酶的菌劑的制備畢赤酵母1413、畢赤酵母1515和畢赤酵母2526分別接種于YPD培養(yǎng)基中在28°C 培養(yǎng)48小時(shí)，獲得畢赤酵母1413菌液、畢赤酵母1515菌液和畢赤酵母2526菌液。將畢赤酵母1413菌液、畢赤酵母1515菌液和畢赤酵母2526菌液混合，獲得產(chǎn)纖 維素酶的菌劑1，產(chǎn)纖維素酶的菌劑1中畢赤酵母1413、畢赤酵母1515和畢赤酵母2526集 落形成單位數(shù)目比為3 1 1。將畢赤酵母1413菌液、畢赤酵母1515菌液和畢赤酵母2526菌液混合，獲得產(chǎn)纖 維素酶的菌劑2，產(chǎn)纖維素酶的菌劑2中畢赤酵母1413、畢赤酵母1515和畢赤酵母2526集 落形成單位數(shù)目比為10 5 3。B)產(chǎn)纖維素酶的菌劑的活性取制備好的產(chǎn)纖維素酶的菌劑1 400μ 1(畢赤酵母1413、畢赤酵母1515和畢赤酵 母2526的數(shù)目分別為3. 7 X 106cfu、1. 2 X IO6Cfu和1. 0 X 106cfu)接種于40mlYPD培養(yǎng)基中 在28°C培養(yǎng)48小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接于200ml新鮮的YPD培養(yǎng)基中再在28°C培養(yǎng)12h作為發(fā)酵 種子液。轉(zhuǎn)接入5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，接種量為5-10%，溫度28-30°C，pH5.0-6.0，溶氧(DO) 控制在30% -60%,并用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵132小時(shí)，每隔12小時(shí)取樣(發(fā)酵上清液)，按 照如下方法測(cè)定酶活。內(nèi)切葡聚糖酶活性測(cè)定方法采用CMCNa-DNS方法測(cè)定，吸取2ml適當(dāng)稀釋的酶液 加入試管中，再加入2ml 0. 8%的羧甲基纖維素鈉溶液(0. 8g CMC-Na溶于100mlpH5. 2乙 酸_乙酸鈉緩沖溶液)，電磁振蕩3s，37°C精確保溫30min。加入5ml DNS試劑，沸水浴加熱 5min，用自來(lái)水冷卻至室溫，加水定容至25ml，測(cè)定其產(chǎn)生的還原糖量。一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘水解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生Iyg葡萄糖所需酶 量。外切葡聚糖酶活性測(cè)定方法采用微晶纖維素法測(cè)定，吸取2ml適當(dāng)稀釋的酶液 加入試管中，再加入2ml 0.8%的微晶纖維素溶液(0.8g微晶纖維素溶于100mlpH5. 2乙 酸_乙酸鈉緩沖溶液)，電磁振蕩3s，37°C精確保溫30min。加入5ml DNS試劑，沸水浴加熱 5min，用自來(lái)水冷卻至室溫，加水定容至25ml，測(cè)定其產(chǎn)生的還原糖量。一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘水解微晶纖維素產(chǎn)生1 μ g葡萄糖所需酶量。β -葡萄糖苷酶活性測(cè)定方法采用β -水楊苷法測(cè)定，吸取2ml適當(dāng)稀釋的酶 液加入試管中，再加入2ml 0. 8%的β -水楊苷溶液(0. 8g β -水楊苷溶于100mlpH5. 2乙酸_乙酸鈉緩沖溶液)，電磁振蕩3s，37°C精確保溫30min。加入5ml DNS試劑，沸水浴加熱 5min，用自來(lái)水冷卻至室溫，加水定容至25ml，測(cè)定其產(chǎn)生的還原糖量。一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘水解0 -水楊苷產(chǎn)生1 ii g葡萄糖所需酶量。上述方法重復(fù)五次，結(jié)果如表1所示。表1中的數(shù)據(jù)為每ml發(fā)酵培養(yǎng)基所產(chǎn)生的 酶活的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。表1.產(chǎn)纖維素酶的菌劑1的纖維素酶酶活 按照上述相同的方法測(cè)定產(chǎn)纖維素酶的菌劑2的生產(chǎn)纖維素酶的能力，制備好的 產(chǎn)纖維素酶的菌劑2 400 yl菌劑2中含畢赤酵母1413、畢赤酵母1515和畢赤酵母2526的 數(shù)目分別為3. 6X 106cfu、1.8X106cfu和1.0X106cfu,五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表2所示。 表2中的數(shù)據(jù)為每ml發(fā)酵培養(yǎng)基所產(chǎn)生的酶活的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。表2.產(chǎn)纖維素酶的菌劑2的纖維素酶酶活
序列表
<110>北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司
<120>產(chǎn)纖維素酶的菌劑及其應(yīng)用
<130>CGGNARW92020
<160>6
<210>1
<211>1413
<212>DNA
<213>芽孢桿菌屬解淀粉芽孢桿菌(Bacillus. Amyloliquefaciens)
<400>1
gcagggacaaaaacgccagtagccaagaatgggcagcttagcataaaaggaacacagctc60
gtaaaccgggacggcaaagcggtacaattgaaagggatcagttcacatggattgcaatgg120
tatggcgattttgtcaataaagacagcttaaaatggctgagagacgattggggcataacc180
gttttccgcgcggcgatgtatacggcagacggcggttatattgataatccgtccgtgaaa240
aataaagtaaaagaagcggttgaagcggcaaaagaacttgggatatatgtcatcattgac300
tggcatatcttaaatgacggCSLSLCCCSLSLSLCcaaaataaagagaaggcaaaagattttttt3600150]aaggaaatgtcaagtctttacggaaacacgccaaacgtcatttatgaaattgcaaacgaa4200151]ccaaacggtgatgtgaactggaagcgtgatattaaaccgtatgcggaagaagtgatttcc4800152]gttatccgcaaaaatgatccagacaacatcatcattgtcggaaccggtacatggagccaa5400153]gatgtgaatgatgcagccgatgatcagctaaaagatgcaaacgtcatgtacgcgcttcat6000154]ttttatgccggcacacacggccaatctttacgggataaagcaaactatgcactcagtaaa6600155]ggagcgcctattttcgtgacggaatggggaacaagcgacgcgtctggaaatggcggtgta7200156]ttccttgaccagtcgcgggaatggctgaattatctcgacagcaagaacatcagctgggtg7800157]aactggaatctttctgataagcaggaatcatcctcagcgttaaagccgggagcatctaaa8400158]acaggcggctggccgcttac3.3.3. taac gcttcaggaacattcgtaagagaaaacatt9000159]cacggcagcaaagattcaacgaaagaacgccctgaaacgccagcacaagataaccccgca9600160]caggaaaacggcatttctgtacaatacaaagcaggggatgggggtgtgaacagcaaccaa10200161]atccgcccgcagcttcacatQ-Q-Q-Q-Q-OX Q-Q-Cggcaatgcgacggttgatttaaaagatgtc10800162]actgcccgttactggtataacgcgaaaaacaaaggccaaaactttgactgtgactacgcg11400163]cagattggatgcggcaatctgacccacaaatttgtgacgctgcataaacctaagcaaggt12000164]gcagatacctatctggaactgggttttaaaacaggaacgctgtcaccgggagcaagcaca12600165]gggaatattcagcttcgtcttcacaatgatgactggagtaattatgcacaaagcggcgat13200166]tattccttttttcaatcaaatacgtttaaaacaacgaaaaatatcatcaa13800167]ggaaaacagatttggggaacagaaccaaattag1413
0168]
0169]
0170]
0171]
0172]
0173]
0174]
0175]
0176]
0177]
0178]
0179]
0180] 0181] 0182]
0183]
0184]
0185]
0186]
0187]
0188]
<210>2
<211>470
<212>PRT
<213>芽孢桿菌屬解淀粉芽孢桿菌(Bacillus <400>2
Gly Thr Lys Thr Pro Val Ala Lys
Ala 1
Gly Thr Gln
Amyloliquefaciens) Gly Gln Leu Ser
Leu 20 His
5
Val
Asn Arg Asp
lie Ser Ser 35
Lys Trp Leu Arg
Ser Leu 50 Met
Gly Leu Gln Trp 40 Asp
Gly
25
Tyr
Asn 10
Lys Ala Val Gln
Ala
65
Asn
Tyr Thr Ala Asp 70 Ala
Asp
55
Gly
Gly Asp Phe Trp Gly lie
Lys Val Lys
Val lie lie
Lys Glu
Lys 115
Asp 100 Ala
Glu 85
Trp His lie Leu
Gly Tyr lie Asp 75 Lys
Thr
60
Asn
Val
45
Val
Leu
30
Asn
lie
15
Lys
Lys
Gly Lys Asp
Phe Arg Ala
Pro Ser Val
Glu Leu Gly
Val Glu Ala Ala 90
Asp Gly Asn Pro
Lys
80
Tyr
Lys Asp Phe
Phe 120
Asn 105
Lys Glu Met Ser
Ser 125
Asn 110 Leu
lie 95
Gln Asn Tyr Gly
13
435440445Phe Lys Thr Thr Lys Lys lie Thr Leu Tyr His Gln Gly Lys Gln Ile450455460Trp Gly Thr Glu Pro Asn465470<210>3<211>1515<212>DNA<213> 青霉屬產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)<400>3cagcaggttggcacaagcactgccgaagttcatccatccttgacttggcaaaagtgtacc60
gcggggggcagctgcacttcccaaagcggcaaggttgtcatcgattccaactggcgctgg120
gttcacaacactggcggctacaccaattgctatactggcaatgactgggatagaactctc180
tgcccggacgatgtcacatgtgccaccaactgcgccctggatggtgccgactacaagggc240
acctatggtgttaccgccagcggcagctctttgcggctgaacttcgtcactcaagcatct300
caaaagaacatcggctcacgtctctacctgatggcggacgatagcaagtacgaaatgttc360
cagctgctcaaccaggagttcaccttcgatgtcgatgtctcgaacctaccctgtggcttg420
aacggtgcgctgtactttgtggctatggacgaagatggtggcatggcacggtatcctacc480
aacaaagctggtgcgaaatacggtaccggttactgcgacgcgcaatgcccgcgcgatctc540
aagttcatcaacggccaggccaacgtggaaggctgggagccgtcttccagcgatgttaac600
ggtggtactggcaattatggttcttgctgtgctgagatggatatttgggaggccaactcc660
atctccaccgcattcacaccccatccctgcgatgacccagcccagacccggtgcactgga720
gattcctgtggcggcacatacagcagtgaccgctatggtggtacttgtgaccccgatgga780
tgtgatttcaacccttatcgcatgggcaaccagtccttctatggcccgagcaagatcgtt840
gataccgaatcccctttcactgtggtgactcagtttatcaccaacgatgg cacgtccacc900
ggcaccctctcggaaatcaagcgcttctacgtgcagaatggcaaggttatcccccagtct960
gtgtccaccatcagcgctgtgactggcaattccatcaccgactccttctg ctccgctcag1020
aagactgcatttaaggacacggacgtattcgccaaacacggcggtatggcgggcatgggg1080
gccggtcttgcagagggcatggttctggtcatgagtctctgggatgatca cgcggccaac1140
atgctgtggctcgacagcacctacccaaccagcgcctcttcgactactcccggtgctgct1200
cgtggtagctgcgacatttcctctggcgagccttcagatgttgaagctaa ccattcgaac1260
gcctacgttgtctattcgaacatcaaggtcggtcctctcggctcgactttcggctcgacc1320
gactcaggctccggcaccaccaccaccaaggtgaccaccactactgcgaccaagaccacc1380
accacaactggaccaagcaccaccggcgctgctcactatgcgcagtgtgg tggacagaac1440
tggaccggtccaaccacttgcgccagcccatacacctgccagaagcagggtgattactac1500
tcgcagtgcc tgtag1515<210>4<211>504<212>PRT
<213> 青霉屬產(chǎn)黃青霉(PeniciIlium chrysogenum)
<400>4
GinGinValGlyThrSerThrAlaGluValHisProSerLeuThrTrp
151015
GinLysCysThrAlaGlyGlySerCysThrSerGinSerGlyLysVal
202530
VallieAspSerAsnTrpArgTrpValHisAsnThrGlyGlyTyrThr
354045
AsnCysTyrThrGlyAsnAspTrpAspArgThrLeuCysProAspAsp
505560
ValThrCysAlaThrAsnCysAlaLeuAspGlyAlaAspTyrLysGly
65707580
ThrTyrGlyValThrAlaSerGlySerSerLeuArgLeuAsnPheVal
859095
ThrGinAlaSerGinLysAsnlieGlySerArgLeuTyrLeuMetAla
100105110
AspAspSerLysTyrGluMetPheGinLeuLeuAsnGinGluPheThr
115120125
PheAspValAspValSerAsnLeuProCysGlyLeuAsnGlyAlaLeu
130135140
TyrPheValAlaMetAspGluAspGlyGlyMetAlaArgTyrProThr
145150155160
AsnLysAlaGlyAlaLysTyrGlyThrGlyTyrCysAspAlaGinCys
165170175
ProArgAspLeuLysPhelieAsnGlyGinAlaAsnValGluGlyTrp
180185190
GluProSerSerSerAspValAsnGlyGlyThrGlyAsnTyrGlySer
195200205
CysCysAlaGluMetAsplieTrpGluAlaAsnSerlieSerThrAla
210215220
PheThrProHisProCysAspAspProAlaGinThrArgCysThrGly
225230235240
AspSerCysGlyGlyThrTyrSerSerAspArgTyrGlyGlyThrCys
245250255
AspProAspGlyCysAspPheAsnProTyrArgMetGlyAsnGinSer
260265270
PheTyrGlyProSerLyslieValAspThrGluSerProPheThrVal
275280285
ValThrGinPhelieThrAsnAspGlyThrSerThrGlyThrLeuSerGlu 305 Val
290
Ile
Lys
Ser Thr
Cys Ser Ala
His Gly Gly 355 Met
Arg Phe
lie Ser 325 Lys
Leu
Asp 385 Arg
Val 370
Ser
Leu Gly
Thr
Pro 465 Trp
Lys 450 Ser
Ser 435 Val
Thr Gly Asp
Tyr 310 Ala
Gln 340
Met Ala
Thr Tyr Pro Gly Ser Cys
Asn His Ser Asn 420 Thr
Thr Thr
Thr
Gly Pro
Tyr Tyr 500
Asp 405 Ala
Phe
Thr
Gly
Thr 485 Ser
Ala 470 Thr
295 Val
Val
Ala
Thr
Gly Met Ser Leu Trp
Gln
Thr
Phe
Gly 360 Asp
Asn Gly Gly
Lys 345 Ala
Thr 390 lie
Asp 375
Ser Ala Ser Ser
Ser Ser Gly
Tyr Val Val Gly Ser Thr
Thr 455 Ala
Thr 440 Ala
Tyr 425 Asp
Glu 410
Ser
Thr Lys His Tyr Ala
Cys Ala Ser Gln Cys Leu
Lys 315 Ser
300
Val
Asn 330
Asp Thr
Gly His Ala Ala
lie Asp Leu Ala
lie Pro Gln Thr Asp Val
Ser 335 Ala
Thr 395 Pro
Asn 380 Thr
Glu 365 Met
Phe 350
Gly Met
Ser 320 Phe
Lys
Val
Asn Ser Gly Ser Thr
Ser Asp lie Lys
Pro Gly Val
Leu Trp Leu Ala
Pro 490
Thr 460 Gln Cys 475
Tyr Thr
Gly 445 Thr
Gly
Cys
Val 430 Thr
Thr
Gly
Gln
Ala 400 Glu Ala 415
Gly Pro
Thr
Thr
Gln
Lys 495
Thr
Gly
Asn 480 Gln
<210>5
<211>2526
<212>DNA
<213> 曲霉屬黑曲霉(Aspergillus niger) <400>5
gatgaattgg cctactcccc tccgtattac ccctcccctt tgggcggaag cataccagcg cgctgttgat atcgtctcgc gtcaatttga ctacgggaac tggatgggaa ttggaattat gttccccgat tgggagttcc gggaatgtgt gcacaggata tccgactaca actctgcgtt ccccgccggt gtcaacgtgg ctggcttacc tgcgtggcca ggctatgggt caggagttta caattgggtc cagctgccgg ccctctcggt agaagtcccg
gggccaatgg ccagggtgac60
agatgacatt ggctgagaag120
gtgttggtca gactggaggt180
gccctctggg tgttcgtgac240
ccgcaacctg ggacaagaat300
gtgacaaggg tgctgatatc360
acggcggtcg taactgggag420
<213> 曲霄屬黑曲霉(Aspergillus niger)
<400>6
AspGluLeuAlaTyrSerProProTyrTyrProSerProTrpAlaAsn
151015
GlyGlnGlyAspTrpAlaGluAlaTyrGlnArgAlaValAsplieVal
202530
SerGlnMetThrLeuAlaGluLysValAsnLeuThrThrGlyThrGly
354045
TrpGluLeuGluLeuCysValGlyGlnThrGlyGlyValProArgLeu
505560
GlyValProGlyMetCysAlaGlnAspSerProLeuGlyValArgAsp
65707580
SerAspTyrAsnSerAlaPheProAlaGlyValAsnValAlaAlaThr
859095
TrpAspLysAsnLeuAlaTyrLeuArgGlyGlnAlaMetGlyGlnGlu
100105110
PheSerAspLysGlyAlaAsplieGlnLeuGlyProAlaAlaGlyPro
115120125
LeuGlyArgSerProAspGlyGlyArgAsnTrpGluGlyPheSerPro
130135140
AspProAlaLeuSerGlyValLeuPheAlaGluThrlieLysGlylie
145150155160
GlnAspAlaGlyValValAlaThrAlaLysHisTyrlieAlaTyrGlu
165170175
GlnGluHisPheArgGlnAlaProGluAlaGlnGlyTyrGlyPheAsn
180185190
IleThrGluSerGlySerAlaAsnLeuAspAspLysThrMetHisGlu
195200205
LeuTyrLeuTrpProPheAlaAspAlalieArgAlaGlyAlaGlyAla
210215220
ValMetCysSerTyrAsnGlnlieAsnAsnSerTyrGlyCysGlnAsn
225230235240
SerTyrThrLeuAsnLysLeuLeuLysAlaGluLeuGlyPheGlnGly
245250255
PheValMetSerAspTrpAlaAlaHisHisAlaGlyValSerGlyAla
260265270
LeuAlaGlyLeuAspMetSerMetProGlyAspValAspTyrAspSer
275280285
GlyThrSerTyrTrpGlyThrAsnLeuThrlieSerValLeuAsnGly
290295300
ThrValProGinTrpArgValAspAspMetAlaValArglieMetAla
305310315320
AlaTyrTyrLysValGlyArgAspArgLeuTrpThrProProAsnPhe
325330335
SerSerTrpThrArgAspGluTyrGlyPheLysTyrTyrTyrValSer
340345350
GlyGlyProTyrGluLysValAsnGinPheValAsnValGinArgAsn
355360365
HisSerGluLeulieArgArglieGlyAlaAspSerThrValLeuLeu
370375380
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385390395400
LeulieGlyGluAspAlaGlySerAsnProTyrGlyAlaAsnGlyCys
405410415
SerAspArgGlyCysAspAsnGlyThrLeuAlaMetGlyTrpGlySer
420425430
GlyThrAlaAsnPheProTyrLeuValThrProGluGinAlalieSer
435440445
AsnGluValLeuLysAsnLysAsnGlyValPheThrAlaThrAspAsn
450455460
TrpAlalieAspGinlieGluAlaLeuAlaLysThrAlaSerValSer
465470475480
LeuValPheValAsnAlaAspSerGlyGluGlyTyrlieAsnValAsp
485490495
GlyAsnLeuGlyAspArgArgAsnLeuThrLeuTrpArgAsnGlyAsp
500505510
AsnVallieLysAlaAlaAlaSerAsnCysAsnAsnThrlieVallie
515520525
lieHisSerValGlyProValLeuValAsnGluTrpTyrAspAsnPro
530535540
AsnValThrAlalieLeuTrpGlyGlyLeuProGlyGinGluSerGly
545550555560
AsnSerLeuAlaAspValLeuTyrGlyArgValAsnProGlyAlaLys
565570575
SerProPheThrTrpGlyLysThrArgGluAlaTyrGinAspTyrLeu
580585590
TyrThrGluProAsnAsnGlyAsnGlyAlaProGinGluAspPheVal
595600605[0462GluGlyValPhelieAspTyrArgGlyPheAspLysArgAsnGluThr[0463610615620[0464ProlieTyrGluPheGlyTyrGlyLeuSerTyrThrThrPheAsnTyr[0465625630635640[0466SerAsnLeuGlnValGluValLeuSerAlaProAlaTyrGluProAla[0467645650655[0468SerGlyGluThrGluAlaAlaProThrPheGlyGluValGlyAsnAla[0469660665670[0470SerAspTyrLeuTyrProAspGlyLeuGlnArglieThrLysPhelie[0471675680685[0472TyrProTrpLeuAsnSerThrAspLeuGluAlaSerSerGlyAspAla[0473690695700[0474SerTyrGlyGlnAspAlaSerAspTyrLeuProGluGlyAlaThrAsp[0475705710715720[0476GlySerAlaGlnProlieLeuProAlaGlyGlyGlyAlaGlyGlyAsn[0477725730735[0478ProArgLeuTyrAspGluLeulieArgValThrValThrlieLysAsn[0479740745750[0480ThrGlyLysValAlaGlyAspLysValProGlnLeuTyrValSerLeu[0481755760765[0482GlyGlyProAsnGluProLyslieValLeuArgGlnPheGluArglie[0483770775780[0484ThrLeuGlnProSerGluGluThrGlnTrpSerThrThrLeuThrArg[0485785790795800[0486ArgAspLeuAlaAsnTrpAsnValGluThrGlnAspTrpGlulieThr[0487805810815[0488SerTyrProLysMetValPheValGlySerSerSerArgLysLeuPro[0489820825830[0490LeuArgAlaSerLeuProThrValHis[0491835840
權(quán)利要求
產(chǎn)纖維素酶的菌劑，其活性成分為畢赤酵母1413、畢赤酵母1515和畢赤酵母2526；所述畢赤酵母1413是將內(nèi)切葡聚糖酶基因?qū)氘叧嘟湍钢蝎@得的重組菌，所述畢赤酵母1515是將外切葡聚糖酶基因?qū)氘叧嘟湍钢蝎@得的重組菌，所述畢赤酵母2526是將β-葡萄糖苷酶基因?qū)氘叧嘟湍钢蝎@得的重組菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌劑，其特征在于所述內(nèi)切葡聚糖酶是如下1)或2)的蛋 白；所述外切葡聚糖酶是如下3)或4)的蛋白；所述葡萄糖苷酶是如下5)或6)的蛋 白；1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸 且能水解多糖的由1)衍生的蛋白質(zhì)；3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；4)在序列表中序列4的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸 且能水解多糖的由3)衍生的蛋白質(zhì)；5)由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；6)在序列表中序列6的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸 且能水解多糖的由5)衍生的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的菌劑，其特征在于所述內(nèi)切葡聚糖酶基因是如下a)或 b)或c)的DNA分子；所述外切葡聚糖酶基因是如下d)或e)或f)的DNA分子；所述0 -葡 萄糖苷酶基因是如下g)或h)或i)的DNA分子；a)其核苷酸序列是序列表中序列1；b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA片段雜交且編碼能水解多糖的蛋白的DNA分子；c)與a)或b)的基因具有90%以上的同源性，且編碼能水解多糖的蛋白的DNA分子；d)其核苷酸序列是序列表中序列3；e)在嚴(yán)格條件下與d)限定的DNA片段雜交且編碼能水解多糖的蛋白的DNA分子；f)與d)或e)的基因具有90%以上的同源性，且編碼能水解多糖的蛋白的DNA分子；g)其核苷酸序列是序列表中序列5；h)在嚴(yán)格條件下與g)限定的DNA片段雜交且編碼能水解多糖的蛋白的DNA分子；i)與g)或h)的基因具有90%以上的同源性，且編碼能水解多糖的蛋白的DNA分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌劑，其特征在于所述菌劑中，所述畢赤酵母1413、所述畢 赤酵母1515和所述畢赤酵母2526的集落形成單位數(shù)目比為(3-10) (1-5) (1-3) 0
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌劑，其特征在于所述菌劑中，所述畢赤酵母1413、所述畢 赤酵母1515和所述畢赤酵母2526的集落形成單位數(shù)目比為3 1 1或10 5 3。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的菌劑，其特征在于所述菌劑中，所述畢赤酵母1413、所述畢 赤酵母1515和所述畢赤酵母2526分別獨(dú)立包裝。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一所述的菌劑，其特征在于所述畢赤酵母1413是將內(nèi)切 葡聚糖酶基因?qū)氚退沟庐叧嘟湍窯S115中獲得的重組菌，所述畢赤酵母1515是將外切葡 聚糖酶基因?qū)氚退沟庐叧嘟湍窯S115中獲得的重組菌，所述畢赤酵母2526是將葡萄 糖苷酶基因?qū)氚退沟庐叧嘟湍窯S115中獲得的重組菌。
8.權(quán)利要求1至7中任一所述菌劑在生產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。
9. 一種生產(chǎn)纖維素酶的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1至8中任一所述的菌劑生產(chǎn)纖維素酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)纖維素酶的菌劑及其應(yīng)用。該產(chǎn)纖維素酶的菌劑，其活性成分為畢赤酵母1413、畢赤酵母1515和畢赤酵母2526；所述畢赤酵母1413是將內(nèi)切葡聚糖酶基因?qū)氘叧嘟湍钢蝎@得的重組菌，所述畢赤酵母1515是將外切葡聚糖酶基因?qū)氘叧嘟湍钢蝎@得的重組菌，所述畢赤酵母2526是將β-葡萄糖苷酶基因?qū)氘叧嘟湍钢蝎@得的重組菌。發(fā)酵本發(fā)明的產(chǎn)纖維素酶的菌劑可生產(chǎn)纖維素酶。
文檔編號(hào)C12R1/84GK101870956SQ200910252180
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月12日
發(fā)明者吳培均, 李卓夫, 李富偉, 段文娟 申請(qǐng)人:北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司