專利名稱：：進(jìn)境植物檢疫性有害生物蔗扁蛾的快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體指一種進(jìn)境植物檢疫性有害生物蔗扁蛾的快速鑒定方法。
背景技術(shù)：
：蔗扁蛾0pogonasacchari(Bojer，1856)為我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物(見2007版的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》)。主要危害巴西木、發(fā)財(cái)樹以及棕?cái)R科植物為主的觀賞園林植物和香蕉、甘蔗等傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)作物。例如在北京，受害嚴(yán)重的溫室每年巴西木的淘汰率達(dá)50%以上，造成經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)幾百萬元。目前，我國(guó)通用的檢測(cè)鑒定蔗扁蛾的方法仍然是實(shí)驗(yàn)室形態(tài)學(xué)鑒定方法，該法須經(jīng)飼養(yǎng)、解剖、鏡檢等繁瑣的步驟，其鑒定時(shí)間一般至少需要l周。在貿(mào)易全球化加速發(fā)展的今天，此方法顯然已不再適用于當(dāng)今植物及其產(chǎn)品的進(jìn)出境檢疫，這就迫切要求我們建立一種能快速、準(zhǔn)確、高效檢測(cè)鑒定植物及其產(chǎn)品中是否存在該檢疫性有害生物的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種進(jìn)境植物檢疫性有害生物蔗扁蛾的快速鑒定方法，是以分子生物學(xué)檢測(cè)方法-PCR法為基礎(chǔ)，建立一種針對(duì)蔗扁蛾的特異性基因片段進(jìn)行檢測(cè)鑒定的方法，可幫助出入境檢疫部門、海關(guān)等相關(guān)單位在口岸進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)鑒定。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種進(jìn)境植物檢疫性有害生物蔗扁蛾的快速鑒定方法，其特點(diǎn)是以蔗扁蛾特異性引物CF720/CR1113對(duì)待測(cè)樣品基因組DNA提取液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取PCR擴(kuò)增液于0.5XTBE電泳緩沖液中在5V/cm電壓下電泳后，置于溴化乙錠染色盒中染色，在紫外凝膠成像儀上觀察擴(kuò)增條帶，判斷該待測(cè)樣品是否為檢疫性有害生物蔗扁蛾；其中上述PCR擴(kuò)增液為PCR反應(yīng)體系經(jīng)PCR反應(yīng)參數(shù)后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，總反應(yīng)體系為25iil，各成分組成如下10XPCRBuffer2.5ii1、各2.5mM的dNTPMixture2iU、10pM的蔗扁蛾特異性引物CF720/CR1113各liil、5U/ii1的TaqDNA聚合酶O.13iU、50ng/y1的DNA提取液2ii1、滅菌雙蒸水16.37y1;PCR反應(yīng)參數(shù)是94。C預(yù)變性4min;94。C變性20s，62。C退火20s，72。C延伸30s共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸5min;最后4。C保存;上述蔗扁蛾特異性引物為正向引物CF720:5'-ATATATTTTAATTTTACCAGGATTCGGT-3'反向引物CR1113:5'-TACTACATAGTAAGTATCGTGGAGAGAT-3'。本發(fā)明的鑒定檢測(cè)方法的具體步驟如下1、待測(cè)樣品(蔗扁蛾)基因組DNA提取(主要針對(duì)新鮮材料，取其足部等)1.1.取1克待測(cè)樣品(蔗扁蛾)肌肉組織(檢驗(yàn)檢疫現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的幼蟲、蛹或成蟲等樣品)于滅菌雙蒸水中漂洗，吸水紙吸干，解剖鏡下剔除附著物、內(nèi)容物等雜質(zhì)，以免其他非樣品物質(zhì)污染。1.2.將處理后的樣品置于1.5ml離心管，加入30ill勻漿緩沖液(STE:5%SDS:2mg/ml蛋白酶K二8:1:1)，充分研磨成勻漿后加入勻漿緩沖液補(bǔ)充至600ii1，置于37t:水浴lh直至混合液消化變清亮為止。(注STE為0.05mol/LTris_HCl、0.lmol/LNaCl、0.lmol/LEDTA、PH值為7.0-8.0)1.3.在混合液中加入等體積的酚氯仿(酚氯仿異戊醇=25:24:i)，上下緩慢顛倒十次、混勻，12000r/min離心15min取上清液。1.4.重復(fù)前一步驟一次，取上清液。1.5.加入0.8倍體積的異丙醇置-2(TC冰箱中30min，沉淀DNA。1.6.12000r/min離心15min棄上清液，用無水冰乙醇500洗滌沉淀，12000r/min離心15min棄上清液。1.7.用600iU75%乙醇重復(fù)洗滌一次沉淀，棄上清液。1.8.自然干燥或55。C溫箱干燥約10min，加入50TE(或滅菌雙蒸水)溶解DNA，用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度后將樣品置于-201:保存?zhèn)溆谩?、樣品(蔗扁蛾)基因組DNA濃度、純度測(cè)定2.1超微量紫外分光光度計(jì)(NanoDropND-1000)開機(jī)自檢。2.2將2的滅菌雙蒸水點(diǎn)在檢測(cè)眼里，將信號(hào)接收器歸位，點(diǎn)擊操作軟件，儀器進(jìn)入檢測(cè)狀態(tài)，隨后用吸水紙吸干。2.3TE(或滅菌雙蒸水)(同溶解DNA用溶劑)上樣，重復(fù)前一步驟的操作、校零，隨后用吸水紙吸干。2.4吸取1.0ill待檢樣品(蔗扁蛾)基因組DNA樣品，點(diǎn)擊軟件按鈕，分別測(cè)定260nm、280nm波長(zhǎng)時(shí)的0D值并記錄，分析DNA提取液的純度、濃度。2.5依據(jù)測(cè)定的濃度，以TE(或滅菌雙蒸水)(同溶解DNA用溶劑)作為溶劑配制出50ng/iiL的DNA提取液作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。3、PCR擴(kuò)增3.1計(jì)算PCR反應(yīng)體系(參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系計(jì)算)PCR反應(yīng)體系(總25iiL)如下10XPCRBuffer2.5ii1dNTPMixture(各2.5mM)2ii1蔗扁蛾特異性引物CF720、CR1113(10pM)各1ylTaqDNA聚合酶(5U/ii1)0.13ii150ng/ii1的DNA提取液2ii1滅菌雙蒸水16.37ii1注上述10XPCRBuffer、dNTPMixture、TaqDNA聚合酶均購(gòu)置于寶生物工程有限公司(大連)，蔗扁蛾特異性引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。[OO37]3.2配制PCR反應(yīng)體系(冰上操作)按計(jì)算的量分別先后加入ddH20、10XPCRBuffer、dNTPMixture(各2.5mM)、蔗扁蛾特異性引物、DNA提取液及T叫DNA聚合酶。3.3配制好的反應(yīng)體系移入PCR儀，設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)PCR反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性94°C，4min;(94t:變性，20s;62。C退火，20s;72。C延伸，30s)30個(gè)循環(huán)；72。C延伸5min;最后4。C保存。4、電泳檢測(cè)4.1用滅菌雙蒸水將凝膠模具和梳子沖洗干凈，把凝膠模具放在水平桌面上，并架好梳子。4.2稱取0.4g的瓊脂糖粉放入三角瓶中，用lxTBE緩沖液(或lxTAE緩沖液)配成1.5%濃度的瓊脂糖，蓋上封口膜，微波爐內(nèi)加熱熔化，冷卻至60°C，倒入凝膠模具中，待凝固。(注瓊脂糖的量具體依凝膠模具的大小而定)4.3瓊脂糖凝膠凝固后，將凝膠模具移入電泳槽中，再向電泳槽中加0.5xTBE緩沖液至淹沒凝膠l-2mm，小心移去梳子；取10iUPCR擴(kuò)增反應(yīng)液及2yl6x上樣緩沖液混勻后加入樣品孔內(nèi)(6x上樣緩沖液為0.25%溴酚藍(lán)、40%蔗糖溶液)。4.4接通電源，一般紅色為正極，黑色為負(fù)極，DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)，調(diào)電壓至5V/cm。4.5根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳。4.6凝膠放入溴化乙錠(EB)染色盒中染色10min(5ylEB母液加入100ml水中)，在紫外凝膠成像儀上觀察擴(kuò)增DNA條帶及其位置，并與DNAMark(購(gòu)置于寶生物工程(大連)有限公司)比較擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。5、結(jié)果判定通過紫外凝膠成像儀觀察，若樣品能擴(kuò)增出1條約400bp(目標(biāo)片段長(zhǎng)度理論上為394bp)的DNA條帶，則說明該樣品為檢疫性有害生物蔗扁蛾；若樣品在400bp左右未能擴(kuò)增出明顯條帶，則說明該樣品不是檢疫性有害生物蔗扁蛾。關(guān)于蔗扁蛾特異性引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置具體步驟如下下述實(shí)驗(yàn)中主要材料、試劑和儀器來源本實(shí)驗(yàn)所用的蔗扁蛾中國(guó)種群的成蟲、幼蟲、蛹等標(biāo)本來自實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，其DNA樣品均分個(gè)體編號(hào)單獨(dú)提取、保存(蟲源2008年9月18日，揚(yáng)州)；蔗扁蛾中國(guó)種群H001及其近緣屬種444、445、446，同屬近緣種447、448、449和檢疫性有害生物美國(guó)白蛾中國(guó)種群018標(biāo)本由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)研究所提供；蔗扁蛾日本種群486及其近緣種472由大阪府立大學(xué)昆蟲學(xué)研究室提供；檢疫性有害生物美國(guó)白蛾美國(guó)種群H056、檢疫性有害生物美國(guó)白蛾日本種群H057、H058標(biāo)本由日本國(guó)立科學(xué)博物館提供。10XPCRBuffer、dNTPMixture、TaqDNA聚合酶、DNAMarker、克隆載體pMDTMl9-TVector試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)置于寶生物工程(大連)有限公司(Takara公司)；Agarose-H瓊脂糖購(gòu)置于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其他試劑按普通分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作規(guī)定。梯度PCR儀(Bio-RADC-1000);凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RADGelDocXR);高速冷凍離心機(jī)(Ependorf5415R);電泳儀(Bio-RADP0WERPac300);超純水處理器(MILLI-QPlus);超微量紫外分光光度計(jì)(NanoDropND-1000)。1、DNA樣品的獲得所有材料的基因組DNA提取方法同檢測(cè)方法的樣品基因組DNA提取。2、DNA樣品的濃度、純度測(cè)定同檢測(cè)方法的樣品基因組DNA濃度、純度測(cè)定。3、COI基因的擴(kuò)增、純化以及測(cè)序3.1.在NCBI中查找與鱗翅目昆蟲COI基因序列及其相關(guān)的基因序列，并以此為基礎(chǔ)結(jié)合MEGA4.0.2專業(yè)軟件進(jìn)行序列排列比對(duì)，從中找出適合鱗翅目昆蟲COI基因PCR擴(kuò)增的通用引物C0I-CF1TATCGCYTAWAHCTCAGCCAC0I-CR1TCAWGTTGCCATTTCTA3.2.用通用引物將蔗扁蛾及其近緣種群線粒體DNA中COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(總25iU)組份為10XPCRBuffer2.5ii1d證Mixture(各2.5mM)2.0ii1通用引物C0I-CF1/C0I-CR1(10pM)各0.5ii1TaqDNA聚合酶(5U/ii1)0.5ii150ng/ii1的DNA提取液2.0滅菌雙蒸水17.0ill按計(jì)算的量分別先后加入ddH20、10XPCRBuffer、dNTPMixture(各2.5mM)、通用引物、模板DNA及T叫DNA聚合酶(冰上操作)。將配制好的反應(yīng)體系移入PCR儀，設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性94t:，5min;(94t:變性，45s;5rC退火，45s;72。C延伸，lmin30s)34個(gè)循環(huán)；72t:延伸7min;最后4"保存。3.3.將PCR擴(kuò)增成功的COI基因，用寶生物工程有限公司(大連)生產(chǎn)的。1"19_丁Vector試劑盒進(jìn)行克隆，具體步驟基于試劑盒說明書步驟略有改動(dòng)，如下3.3.1.將載體和感受態(tài)細(xì)胞(-7(TC保存)置于冰中融化，約30min。3.3.2.在PCR管中配制DNA溶液，總體積為5yl(載體1y1、DNA擴(kuò)增產(chǎn)物3yl、滅菌雙蒸水1Pl)。3.3.3.加入5iil的SolutionI，柔和地混勻。3.3.4.16。C反應(yīng)過夜。3.3.5.將全量(lOiil)加入50iU感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min。3.3.6.42t:加熱90s后，再放入冰中2min。3.3.7.加入940y1LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，37。C震蕩培養(yǎng)約60min。3.3.8.取培養(yǎng)好的菌液12000r/min離心lmin，棄上清液800yl。剩余培養(yǎng)液用槍頭懸垂打勻。超凈工作臺(tái)中，在新的1.5ml離心管中加入20mg/ml的IPTG(異丙基-P-D半乳糖苷)誘導(dǎo)劑5iil、20mg/ml的X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D半乳糖苷)20yl以及175iU培養(yǎng)后的感受態(tài)細(xì)胞配制成混合液。3.3.9.將LB固體培養(yǎng)基融化，待其冷卻至6(TC左右，加入Amp使其終濃度為100iig/ml，倒入平皿冷卻。3.3.10.將3.3.8中的混合液均勻涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基中，風(fēng)干后平皿倒置37t:溫箱培養(yǎng)培養(yǎng)過夜。3.3.11.用滅菌后的牙簽挑取白色菌落在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中(Amp終濃度為100g/ml)培養(yǎng)5-10h左右，再用其做PCR擴(kuò)增確認(rèn)目的片段是否克隆成功，并將基因克隆成功的菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。4、特異性引物的設(shè)計(jì)4.1.將COI基因測(cè)序結(jié)果用MEGA4.0.2專業(yè)軟件進(jìn)行序列排列比對(duì)，人工設(shè)計(jì)特異性引物，并用PrimerPrimer5.0檢查引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)配情況。設(shè)計(jì)的引物輸入GeneBank，用Blast程序驗(yàn)證引物的特異性。初步設(shè)計(jì)正向引物12條、反向引物5條(見下表1)，表1初步設(shè)計(jì)的正向、反向引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>用蔗扁蛾及其近緣種群COI基因克隆成功的樣品做初步篩選。初篩包括引物的最適退火溫度、引物特異性、引物的最適濃度等，最后篩選出一對(duì)最適合的特異性引物(引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)，見表2。表2特異性引物(5'-3')<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>5、PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)的設(shè)定計(jì)算PCR反應(yīng)體系針對(duì)篩選出來的特異性引物CF720/CR1113參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系、基于特異性引物自身的要求計(jì)算PCR反應(yīng)體系(總25iiL)如下10XPCRBuffer2.5ii1dNTPMixture(各2.5mM)2ii1蔗扁蛾特異性引物CF720、CR1113(10pM)各1ylTaqDNA聚合酶(5U/ii1)0.13ii150ng/ii1的DNA提取液2y1滅菌雙蒸水16.37ii1(經(jīng)過溫度梯度實(shí)驗(yàn)比對(duì)，選擇最佳退火溫度，依據(jù)引物條件需求，設(shè)定程序)最佳退火溫度的選擇1.根據(jù)引物合成報(bào)告單中每條引物的Tm值，計(jì)算引物的平均Tm值。2.用重組質(zhì)粒pMDTM19-T-C01為模板，對(duì)篩選出的特異性引物進(jìn)行梯度PCR反應(yīng)以摸索該對(duì)引物的最佳退火溫度，退火溫度范圍上限為平均Tm值高4t:、下限為平均Tm值低5°C(以CF720/CR1113為例，其平均Tm值約為61°C，則退火溫度范圍設(shè)定為65°C-56°C)，搜索出最佳退火溫度，最終確定PCR反應(yīng)參數(shù)為94t:預(yù)變性4min;(94。C變性20s;62。C退火20s;72。C延伸30s)30個(gè)循環(huán)；72。C延伸5min;最后4。C保存。特異性驗(yàn)證用所建立的PCR檢測(cè)體系，對(duì)蔗扁蛾2個(gè)不同地理(中國(guó)和日本)種群及其近緣種群進(jìn)行特異性檢測(cè)。為確保結(jié)果的可靠性，每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。結(jié)果顯示，蔗扁蛾的2個(gè)種群均能擴(kuò)增出1條約400bp左右的DNA片段(見圖1)，其他近緣種群均未擴(kuò)增出特異性條帶，表明該體系具有良好的特異性。靈敏度驗(yàn)證用所建立的PCR檢測(cè)體系，以蔗扁蛾重組質(zhì)粒pMDTM19-T-C01的6個(gè)不同濃度的DNA模板來確定PCR反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度，重復(fù)三次。結(jié)果顯示(見圖2)，模板濃度在100-10ng/iU時(shí)，均能擴(kuò)增出強(qiáng)烈的檢測(cè)信號(hào)；對(duì)于lng/iU的DNA模板，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物明顯降低，檢測(cè)信號(hào)較弱；當(dāng)DNA模板濃度為0.5ng/iU時(shí)，由于無擴(kuò)增產(chǎn)物或檢測(cè)信號(hào)太弱而無法檢出。表明該方法的檢測(cè)限度為lng/iU，最適檢測(cè)濃度為100-10ng/iU。若原始的50ng/mlDNA提取液的量未達(dá)到該檢測(cè)方法的最低限量將導(dǎo)致PCR反應(yīng)不能完成擴(kuò)增作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是鑒定時(shí)間由原來的一周以上縮至一天以內(nèi)；鑒定準(zhǔn)確性由原來的70%提高至99%;對(duì)檢測(cè)樣品要求由原來的形態(tài)學(xué)特征完整降低到1克以上的昆蟲組織；對(duì)專家要求由原來的專業(yè)人士降低非專業(yè)人士。圖1是用PCR反應(yīng)體系進(jìn)行特異性檢測(cè)結(jié)果圖。圖中1表示444(蔗扁蛾近緣屬種1);2:445(蔗扁蛾近緣屬種2);3:446(蔗扁蛾近緣屬種3);4:447(蔗扁蛾同屬近緣種種1);5:448(蔗扁蛾同屬近緣種種2);6:449(蔗扁蛾同屬近緣種種3);7:472(蔗扁蛾同屬近緣種種4);8:018(檢疫性有害生物美國(guó)白蛾中國(guó)種群)；9:H056(檢疫性有害生物美國(guó)白蛾美國(guó)種群)；10:H057(檢疫性有害生物日本白蛾日本種群)；11:H058(檢疫性有害生物美國(guó)白蛾日本種群)；12:H001(蔗扁蛾中國(guó)種群);13:486(蔗扁蛾日本種群);14:CK(空白對(duì)照);15:Mark(DNAMark)圖2是以蔗扁蛾中國(guó)種群重組質(zhì)粒的6個(gè)不同濃度為擴(kuò)增模板DNA，運(yùn)用PCR反應(yīng)體系檢測(cè)特異性的靈敏度圖。圖中1表示Mark;2-7分別表示模板DNA的不同濃度2:100ng/iU、3:50ng/li1、4:25ng/ii1、5:10ng/u1、6:lng/u1、7:0.5ng/u1。圖3是本發(fā)明的實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果圖。圖中M表示Mark;1_3分別表示三個(gè)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)施例方式以即將入境待檢植物上的生物為樣品，進(jìn)行樣品基因組DNA的提取、基因組DNA提取液的濃度和純度測(cè)定，基于本發(fā)明創(chuàng)建的蔗扁蛾特異性引物CF720/CF1113、設(shè)置的PCR反應(yīng)體系(總反應(yīng)體系為25iU，各成分組成如下10XPCRBuffer2.5iU、各2.5mMdNTPMixture2ii1、10pM蔗扁蛾特異性引物CF720/CF1113各1ii1、5U/ii1TaqDNA聚合酶0.13iil、50ng/iilDNA提取液2iU、滅菌雙蒸水16.37yl)和設(shè)定的PCR反應(yīng)參數(shù)(94°C預(yù)變性4min;94。C變性20s，62。C退火20s，72。C延伸30s共30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5min，4t:保存)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；特異性擴(kuò)增完成后，取10y1PCR擴(kuò)增液和2ill6x上樣緩沖液混合，混合液在1.5%瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后置凝膠于含溴化乙錠的溶液中染色10min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，得知，能擴(kuò)增出1條約400bp左右的DNA片段(見圖3中的l)，說明該樣品生物為檢疫性有害生物蔗扁蛾。為檢測(cè)測(cè)定結(jié)果的可靠性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果見圖3，表明該檢測(cè)方法的穩(wěn)定性良好。權(quán)利要求一種進(jìn)境植物檢疫性有害生物蔗扁蛾的快速鑒定方法，其特征在于該鑒定方法為以蔗扁蛾特異性引物CF720/CR1113對(duì)待測(cè)樣品基因組DNA提取液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取PCR擴(kuò)增液于0.5×TBE電泳緩沖液中在5V/cm電壓下電泳后，置于溴化乙錠染色盒中染色，在紫外凝膠成像儀上觀察擴(kuò)增條帶，判斷該待測(cè)樣品是否為檢疫性有害生物蔗扁蛾；其中上述PCR擴(kuò)增液為PCR反應(yīng)體系經(jīng)PCR反應(yīng)參數(shù)后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，總反應(yīng)體系為25μl，各成分組成如下10×PCRBuffer2.5μl、各2.5mM的dNTPMixture2μl、10pM的蔗扁蛾特異性引物CF720/CR1113各1μl、5U/μl的TaqDNA聚合酶0.13μl、50ng/μl的DNA提取液2μl、滅菌雙蒸水16.37μl；PCR反應(yīng)參數(shù)是94℃預(yù)變性4min；94℃變性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；最后4℃保存；上述蔗扁蛾特異性引物為正向引物CF7205‘-ATATATTTTAATTTTACCAGGATTCGGT-3’反向引物CR11135‘-TACTACATAGTAAGTATCGTGGAGAGAT-3’。2.如權(quán)利要求1所述的進(jìn)境植物檢疫性有害生物蔗扁蛾的快速鑒定方法，其特征在于所述特異性引物是以蔗扁蛾及其近緣種基因組DNA為模板，運(yùn)用分子生物學(xué)檢測(cè)方法-PCR法及基因分析軟件擴(kuò)增蔗扁蛾線粒體基因組中的COI基因，并將其導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行克隆純化，將克隆純化的基因進(jìn)行測(cè)序，運(yùn)用基因分析軟件篩選出其中高效表達(dá)蔗扁蛾的特征、蔗扁蛾復(fù)合種的種間差異的基因或基因片段，而設(shè)計(jì)并篩選出針對(duì)蔗扁蛾的基因或基因片段的特異性引物。全文摘要一種進(jìn)境植物檢疫性有害生物蔗扁蛾的快速鑒定方法，以蔗扁蛾特異性引物CF720/CR1113對(duì)待測(cè)樣品基因組DNA提取液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取PCR擴(kuò)增液于0.5×TBE電泳緩沖液中在5V/cm電壓下電泳后，置于溴化乙錠染色盒中染色，在紫外凝膠成像儀上觀察擴(kuò)增條帶，判斷該待測(cè)樣品是否為檢疫性有害生物蔗扁蛾；該方法的鑒定時(shí)間由原來的一周以上縮至一天以內(nèi)，鑒定準(zhǔn)確性由原來的70％提高至99％，可幫助出入境檢疫部門、海關(guān)等相關(guān)單位在口岸進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)鑒定。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101787394SQ20091024616公開日2010年7月28日申請(qǐng)日期2009年11月27日優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日發(fā)明者廖力,徐淼鋒,李杰,王星,盛夏冰,黃國(guó)華申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)