專利名稱：眼蟲藻Δ⁸脫氫酶的核苷酸序列及其應(yīng)用的制作方法
眼蟲藻^8脫氫酶的核苷酸序列及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物和遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及從一種眼蟲藻 (E. gracilis)中克隆A 8脫氫酶基因，具體講是眼蟲藻A 8脫氫酶的核苷酸序列及其應(yīng)用。 將該基因直接或與不同表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)入到細(xì)菌、酵母、植物或動(dòng)物中，利用其編碼A8 脫氫酶產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法和應(yīng)用。背景技術(shù)：
:多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFAs)是指含有兩 個(gè)或兩個(gè)以上順式雙鍵、碳原子數(shù)為16至22的直鏈脂肪酸。多不飽和脂肪酸是以多種形 式存在于細(xì)胞中如細(xì)胞膜、儲(chǔ)存脂、甘油三酯磷脂、鞘脂和脂蛋白等。作為生物膜結(jié)構(gòu)中磷 脂的重要成分之一，PUFAs的種類、數(shù)量、飽和度的改變會(huì)直接影響生物膜的剛性結(jié)構(gòu)，因此 影響了與剛性結(jié)構(gòu)相關(guān)的各種生理功能。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)PUFAs與包括心血管疾病，糖尿病、 關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、潰瘍性結(jié)腸炎在內(nèi)的多種慢性疾病相關(guān)，并且可以通過(guò)影響細(xì)胞的增殖和 信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展情況。最近的研究表明，PUFAs還能影響骨骼的生 長(zhǎng)與修復(fù)過(guò)程。不僅如此PUFAs還能作為一種重要的生理活性物質(zhì)影響胎兒的發(fā)育。因此 PUFAs的生物合成以及合成途徑中的一些關(guān)鍵酶受到廣泛的關(guān)注。 PUFAs的合成主要是由碳鏈的延長(zhǎng)和脫氫兩個(gè)主要反應(yīng)組成，合成的最初底物 是飽和脂肪酸軟脂酸和硬脂酸。為了適應(yīng)不同的自然界環(huán)境，不同的物種在基本的合成 途徑基礎(chǔ)之上又衍生出了各種不同PUFAs合成機(jī)制。除了傳統(tǒng)的n-6和n-3兩類不同的 多不飽和脂肪酸途徑外，在藻類等微生物中又發(fā)現(xiàn)了第三種分支合成途徑，即八9延長(zhǎng)酶 途徑亞油酸(LinoleicAcid， LA， C18:2n-6， A9，12)或a亞麻酸(a-LinolenicAcid， ALA， C18:3n-3， ) A 9， 12， 15) A 9延長(zhǎng)酶的催化下生成EDA (EicosadienoicAcid， EDA， C20:2n-6， A11，14)和EtrA(EicosatrienoicAcid， EtrA， C20:3n-3， A 11， 14， 17)，然后 通過(guò)A8脫氫酶生成DGLA(Dihomo-Y-LinolenicAcid， DGLA， C20:3n-6， A8，11，14)和 ETA(EicosatetraenoicAcid， C20:4n-3， A 8， 11， 14， 17)，再進(jìn)入n_6和n_3合成途徑，經(jīng)一 系列的碳鏈延長(zhǎng)和脫氫反應(yīng)合成花生四烯酸(Arachidonic acid，AA. C20:4n-6， A 5， 8， 11， 14) 、二十碳五烯酸(Eicos即entaenoic acid，EPA. C20:5n-3， A5，8， 11， 14， 17)和二十二碳 六烯酸(Docosahexaenoic acid， DHA. C22: 6n_3， A 4， 5， 8， 11， 14， 17)等有生物活性的長(zhǎng)鏈 多不飽禾口月旨肪酸(Xong-chain polyunsaturated fatty acids， 1X-PUFAs)。包括a _亞麻 酸在內(nèi)的多不飽和脂肪酸在保健和醫(yī)療方面有很廣闊的應(yīng)用前景。研究不飽和脂肪酸的合 成和它的生理作用成為當(dāng)前的熱點(diǎn)之一。A8脫氫酶的克隆對(duì)于PUFAs的合成和應(yīng)用研究 具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供從眼蟲藻中分離的編碼A8脫氫酶的核苷 酸序列或其核苷酸序列的片段、類似物或衍生物。從一種眼蟲藻中克隆A8脫氫酶基因，具 體講是眼蟲藻A8脫氫酶的核苷酸序列及其應(yīng)用。 本發(fā)明的目的之二是提供該核苷酸序列所編碼的A8脫氫酶多肽、或其片段、類 似物或衍生物。 本發(fā)明的目的之三是提供含有該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接，進(jìn)行功能 性表達(dá)的重組表達(dá)載體。
3
本發(fā)明的目的之四是提供含有該基因核苷酸序列或該基因核苷酸序列與異源調(diào) 節(jié)序列連接的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代。 本發(fā)明的目的之五是提供一種用含有該基因核苷酸序列、或該基因核苷酸序列與
異源調(diào)節(jié)序列連接的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞、或該核苷酸序列
所編碼的A8脫氫酶多肽制備多不飽和脂肪酸的方法。 本發(fā)明第一方面提供的是SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。 分離的A8脫氫酶基因的核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選 自下組的一種核苷酸序列相同或相似(l)具有編碼SEQ ID N0:2氨基酸序列的活性多肽 的核苷酸序列；(2)與核苷酸序列(1)互補(bǔ)的核苷酸序列。準(zhǔn)確地，該核苷酸序列具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。 本發(fā)明的第二方面，提供分離的上述核苷酸序列所編碼的多肽，該多肽是具有SEQ ID N0:2氨基酸序列的多肽。 編碼SEQ ID NO :2活性多肽的核苷酸序列包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟 多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以 及非編碼序列。 本發(fā)明的核苷酸序列可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組 DNA或人工合成的DNA。 DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編 碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID N0:2所示的編碼區(qū)序列相同或是簡(jiǎn)并的變異體。
本發(fā)明還提供了一種新的多肽序列_眼蟲藻A8脫氫酶的氨基酸序列，其基本上 是由SEQ IDN0:2所示的氨基酸序列組成。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成 多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用 重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物)細(xì)胞中產(chǎn)生。
本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述核苷酸序列的質(zhì)粒或病毒重組表達(dá)載體，特 別是pYES2. O-EFD或其他重組表達(dá)載體。 本發(fā)明的第四方面，提供了被上述核苷酸序列或質(zhì)?；虿《局亟M表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，以 及酵母細(xì)胞、霉菌細(xì)胞及這些宿主細(xì)胞的后代。 本發(fā)明的第五方面，提供了一種用含有該基因的核苷酸序列、或該基因核苷酸序 列與異源調(diào)節(jié)序列連接的質(zhì)?；虿《局亟M表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞、或 用該核苷酸序列所編碼的A8脫氫酶多肽制備不飽和脂肪酸的方法。 本發(fā)明的其他方面由于本文技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。 本發(fā)明所涉及的技術(shù)術(shù)語(yǔ)的含義"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是 天然環(huán)境)。例如，活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的核苷酸序列和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同 樣的核苷酸序列或多肽如從天然狀態(tài)中與同存在的其它物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
"分離的核苷酸序列"是指基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其 它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的DNA純化技術(shù)純化的。"眼蟲藻A 8脫氫酶的核苷酸序列"是指包括編碼眼蟲藻A 8脫氫酶多肽的核苷酸
4序列和包括附加編碼和/或非編碼的核苷酸序列。"簡(jiǎn)并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID N0:2的蛋白質(zhì)或多肽，但與SEQID NO:l所示的編碼區(qū)序列有差別的核苷酸序列。 非編碼的衍生物還表示可用于抑制所述新型蛋白生物合成的反義DNA。所述的反義DNA屬于本發(fā)明的無(wú)功能衍生物。如不具備酶促活性的衍生物?？捎帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員熟知生產(chǎn)無(wú)功能衍生物的其它方法有共抑制，核糖酶和內(nèi)含子的使用。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，"核酸片段"的長(zhǎng)度至少含10個(gè)核苷酸，優(yōu)選是至少20-30個(gè)核苷酸，特別優(yōu)選是至少50-60個(gè)核苷酸，非常特別的優(yōu)選是至少IOO個(gè)核苷酸以上。核苷酸片段也可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼的核苷酸序列。 本發(fā)明中的多肽和核苷酸序列優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明中特異核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離核苷酸序列。這些技術(shù)包括但不局限于(l)用探針與基因組或cDNA文庫(kù)雜交以檢出同源的核苷酸序列；和(2)表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的核苷酸序列片段。 本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得(l)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；(2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。 本發(fā)明還提供了一種新的多肽序列_眼蟲藻A8脫氫酶多肽的氨基酸序列，是由
SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成。發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，
優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技
術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。 本發(fā)明也涉及含有編碼眼蟲藻A8脫氫酶的核苷酸序列和外源性調(diào)節(jié)序列元件
結(jié)合進(jìn)行功能性表達(dá)的重組表達(dá)載體。術(shù)語(yǔ)"載體"指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵
母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。能夠影響基
因表達(dá)產(chǎn)物的序列元件包括有復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯調(diào)控元件。 可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來(lái)構(gòu)建含編碼眼蟲藻A8脫氫酶的核苷酸序
列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括本外重組DNA技術(shù)、DNA合成技
術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的編碼眼蟲藻A8脫氫酶的核苷酸序列可有效連接到表達(dá)載體
的恰當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp
啟動(dòng)子；A噬菌體的PL啟動(dòng)子真核啟動(dòng)子包括CMV早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早
期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞或真
核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終
止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會(huì)使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是
DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10-300bp，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。如腺病
毒增強(qiáng)子。 本發(fā)明還涉及用含有本發(fā)明編碼眼蟲藻A8脫氫酶的核苷酸序列的重組載體或直接用編碼眼蟲藻A8脫氫酶的核苷酸序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。本發(fā)明中，編碼眼蟲藻A8脫氫酶的核苷酸序列或含有該核苷酸序列的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該核苷酸序列或重組載體的基因工程化宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。宿主細(xì)胞的代表性例子有大腸桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞如油菜、煙草、大豆；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2或Sf9 ;動(dòng)物細(xì)胞如CH0、 COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。 用本發(fā)明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期收集菌體，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域是眾所周知的。也可用MgC^，電穿孔等方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用DNA轉(zhuǎn)染法、顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等方法。 本發(fā)明還涉及用上述轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞生產(chǎn)，根據(jù)宿主細(xì)胞，用本領(lǐng)域技術(shù)人員所共知的方法生長(zhǎng)或培養(yǎng)。比如微生物細(xì)胞通常是在0-10(TC，優(yōu)選10-60°C，同時(shí)還要氧氣。培養(yǎng)基中含有碳源，如葡萄糖，氮源，通常是有機(jī)氮的形式，如酵母提取物、氨基酸，或鹽，如硫酸銨，微量元素，如鐵、鎂鹽，如果需要的話還有維生素。在此期間培養(yǎng)基的PH可以保持固定的值，就是說(shuō)，在培養(yǎng)期間進(jìn)行控制或不控制。培養(yǎng)可以分批培養(yǎng)、半不連續(xù)培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)形式進(jìn)行。在培養(yǎng)之后，收集細(xì)胞，搗碎或直接使用，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法從細(xì)胞中提取脂肪酸。 本發(fā)明還涉及一種制備不飽和脂肪酸的方法，該方法是這樣實(shí)現(xiàn)的，將具有飽和或不飽和脂肪酸甘油三酯與SEQ ID N0:2—起培養(yǎng)。該方法優(yōu)選是在由能夠攝取或釋放還原性等同物的化合物存在條件下進(jìn)行的。然后，可以從甘油三酯中釋放脂肪酸。上述方法優(yōu)選可以合成通過(guò)9位延長(zhǎng)、8位脫氫合成具有8位雙鍵的脂肪酸。 本發(fā)明還涉及用上述方法制備不飽和脂肪酸，以及將其應(yīng)用于生產(chǎn)人類食品、動(dòng)
物飼料、化妝品或藥品用途。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果 本發(fā)明獲得了眼蟲藻A8脫氫酶基因，通過(guò)與其它合成PFUAs相關(guān)基因組合并將其克隆表達(dá)特定的表達(dá)宿主中，通過(guò)基因重組和表達(dá)技術(shù)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)PUFAs和/或提高食品PUFAs的含量。


圖1是顯示所構(gòu)建的釀酒酵母重組表達(dá)載體pYEFD圖。
圖2A是顯示EDA、 EtrA、 DGLA和ETA標(biāo)準(zhǔn)物的GC圖。
圖2B是含pYES2空載體的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的GC圖。
圖2C是含重組質(zhì)粒pYEFD的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的GC圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例l從眼蟲藻中分離A8脫氫酶的核苷酸序列 采用Trizol方法從培養(yǎng)3d的眼蟲藻中提取總的RNA，以2 y L總RNA為模板，以Qligo(dT16)作為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，擴(kuò)增獲得cDNA。取2iiL cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。根據(jù)所發(fā)表的A8脫氫酶N端和C端核苷酸序列設(shè)計(jì)引物(弓l物l和引物2)，以上述cDNA為模板在T-GradientPCR儀(Biometra公司)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)所用引物、 組分和擴(kuò)增條件如下 引物1 :5-ATGAAGTCAAAGCGCCAAGC-3， (SEQ ID NO :3)
引物2 :5-TTATAGAGCCTTCCCCGCG-3， (SEQ ID NO :4) 擴(kuò)增條件94。C變性5min，再用94°C lmin ;50。C lmin — 72°C 1. 5min進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到大小約1300bp的片段，用DNA凝膠回 收試劑盒(鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)回收，把回收片段亞克隆到測(cè)序載體PGEM-T easy (Promega公司產(chǎn)品)中；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用CaCl2法處理的大腸桿菌DH5 a ，在含氨 芐青霉素(終濃度為100ii g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜；挑取平板上生長(zhǎng)的白色菌 落，接入含氨芐青霉素(終濃度為60iig/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體 按減裂角牟法[S咖broook， et al. ，1989， Molecular Cloning， a laboratory Maruml， cold Spring Harbor Laboratory,New York，pl9-21]提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I酶切和PCR擴(kuò)增鑒定 正確，測(cè)序(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。測(cè)序結(jié)果顯示所擴(kuò)增得到的片段大小 為1263bp，通過(guò)其核苷酸序列和其編碼的氨基酸序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中用Blast程序進(jìn) 行同源檢索，檢索結(jié)果表明與該片段已報(bào)道的A8脫氫酶序列十分相似，但并不完全相同， 證明所擴(kuò)增片段為潛在A8脫氫酶基因的片段。
實(shí)施例2 :所分離核苷酸序列的同源性搜索 將推測(cè)A 8脫氫酶的氨基酸序列在Genbank上進(jìn)行同源性搜索，與已經(jīng)報(bào)道的A 8 脫氫酶(AF139720)的氨基酸相似性最高，達(dá)92X，的氨基酸序列同源性比較圖，EFD2 :本發(fā) 明的眼蟲藻的A8脫氫酶，EFD1 :已經(jīng)報(bào)道的眼蟲藻的A8脫氫酶。(陰影的部分表示兩個(gè) 序列之間相同的氨基酸)。這說(shuō)明本發(fā)明的新的核苷酸序列所編碼的酶具有A8脫氫酶的 功能。 實(shí)施例3 :釀酒酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)SEQ ID NO :1所示編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物(引物3和 引物4)分離其潛在開放閱讀框序列 引物3 :5-TTCGGATCCGCCACCATGAAGTCAAAGCGCCAAGCGC-3— (SEQ ID NO :5);
引物4 :5—-ATCCTCGAGTTATAGAGCCTTCCCCGCGGGTTG-3— (SEQ ID NO :6);
此兩個(gè)引物的5—端黑體分別含有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)。所用的擴(kuò)增條件和 反應(yīng)組分同實(shí)施例l，擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示和SEQ ID N0:1所示的序列一致。然后取








反應(yīng)組分 模板cDNA 緩沖液(10 X)
終濃度50 L PCR產(chǎn)物和1 LpYES2. 0分別進(jìn)行雙酶切，回收酶切大片段，并用T4連接酶在16°C 水浴鍋中過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a ，通過(guò)質(zhì)粒提取和PCR篩選陽(yáng)性克隆，并 進(jìn)行測(cè)序鑒定。質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果見附圖2，所構(gòu)建的含有A8脫氫酶基因的酵母表達(dá)質(zhì)粒命名 為pYEFD。該質(zhì)粒是由pYES2. O(Invitrogen公司)和引物5和引物6的PCR產(chǎn)物構(gòu)建而 成。 實(shí)施例4 :重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞 挑取釀酒酵母菌株INVScl單菌落于10ml YEPD液體培養(yǎng)基中、3(TC搖床過(guò) 夜培養(yǎng)，檢測(cè)菌液的0D6。。值，取適量菌液稀釋于50ml，使0D6。。為0. 4 ;繼續(xù)培養(yǎng)2到 4h后，2500rpm離心沉淀細(xì)胞，以40ml 1 XTE重懸菌體，2500rpm離心沉淀細(xì)胞，以2ml lXLiAc/O. 5XTE懸浮細(xì)胞，并在室溫下放置10min，此細(xì)胞即為感受態(tài)細(xì)胞；取100 yl制 備好的酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入1 P g重組質(zhì)粒pYA和100ii g變性鮭精DNA，混勻，加入700ii1 lXLiAc/40% (w/v)PEG-4000/lXTE并混勻，于30。C溫育30min ;然后，加入88ii 1 DMSO混 勻，于42t:水浴中熱激7min ;離心10s沉淀細(xì)胞，加入lml 1 XTE懸浮細(xì)胞并再次離心沉淀 細(xì)胞，最后加入100 iU重懸細(xì)胞，全鋪于SC-Ura (無(wú)尿嘧啶)選擇培養(yǎng)基平板，置30°C培養(yǎng) 48-72h，篩選出重組細(xì)胞。
實(shí)施例5 :酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取SC-Ura(無(wú)尿嘧啶)選擇培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化，接種于10ml SC-Ura 選擇培養(yǎng)基(含2% (w/v)的葡萄糖)，281:搖菌過(guò)夜培養(yǎng)，以適宜的接種量加入含有2% (w/v)半乳糖的50ml SC-Ura培養(yǎng)基，使其0D600約0. 4，并加入EDA和EtrA作為底物，并 加入NP-40促進(jìn)底物的吸收，2(TC繼續(xù)培養(yǎng)72h ;2500rpm收集菌體，用去離子水洗滌三次， 5(TC烘干，研碎，取100mg加入5ml 5% (w/v)的KOH_CH3OH溶液，70°C反應(yīng)2_3h ;反應(yīng)結(jié) 束，冷卻到室溫，用6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值到2. O，加入4ml 14% (v/v)BF3_CH3OH， 70°C反應(yīng)1. 5h，合成脂肪酸甲酯；再加入飽和的NaCl溶液10ml，劇烈震蕩混勻，并轉(zhuǎn)移到分 液漏斗中，用8ml 1 : 4的氯仿己烷抽提兩次，合并提取液；加入適量無(wú)水化2504干燥提 取液，靜置lh，去掉Na^04，把含有脂肪酸甲酯的上清液用氮?dú)獯蹈?，?00iiL的正己烷回 溶樣品，后用0. 45mm的微孔濾膜過(guò)濾，得到甲酯化的不飽和脂肪酸。
實(shí)施例6 :脂肪酸氣相色譜分析
按如下條件進(jìn)行 儀器為島津GC-7A，柱子彈性石英毛細(xì)管柱，O. 32X30m，固相支持物聚二乙二 醇丁二酸酯(Poly-diethylene glycol succinate, DEGS)鍍膜物聚酰亞胺。載氣^，線 速8cm/s。分流比IOO : l，氣化室溫度280。C，柱溫180。C，尾吹50ml/min，檢測(cè)器氫 火焰離子化檢測(cè)器。以CAYMAN CHEMICAL公司生產(chǎn)的PUFAs甲酯化后為為標(biāo)準(zhǔn)品，把上述實(shí) 施例5中制備的脂肪酸甲酯化的樣品，進(jìn)行GC分析，上樣量為li!L ;分析軟件Anstar，分 析之星色譜工作站。色譜分析結(jié)果見附圖2，附圖2顯示EDA、EtrA標(biāo)準(zhǔn)物(2A)、含pYES2. 0 空載體的轉(zhuǎn)基因酵母(2B)和含重組質(zhì)粒pYEFD的轉(zhuǎn)基因酵母(2C)的氣相色譜圖。通過(guò) 與已知的脂肪酸甲基酯標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間進(jìn)行比較鑒別出各個(gè)峰。圖3C中保留時(shí)間為 22. 329min、24. 705min對(duì)應(yīng)的峰即為A 8脫氫酶催化產(chǎn)生的DGLA和ETA。
序列表
SEQUENCE LISTING
〈110>南開大學(xué) 〈120〉眼蟲藻A 8脫氫酶的核苷酸序列及其應(yīng)用 〈130>20091201 〈160>6 〈170>PatentIn version 3. 5 〈210>1 〈211>1266 〈212>DNA 〈213〉眼蟲藻(E. gracilis) 〈400〉 1agcgcc皿gcgcttccccttac^ttgatgg^c^cate tgatgtgtct60gcctgggtcaatttccaccctggtggtgcgga皿tteteg3g皿ttecca郷皿gggat120gccactgatgccttcatggttatgcactctc皿g皿gccttcgacaagctc皿gcgcatg180atcccagttctgagttgccaccccaggctgagctc皿gag240gatttccgga3gCtCCg3g3agagttgatcgc皿ctggcatgtttgatgcctcccccctc300tggtectcatcaccacactgggccttggagtgctgggttetttcctgatg360gttcagtatcagatgtatttgtgttgcttgggatgcactetc^cagatg420ggctggctttctcatgacatttgccaccaccagactttca3g皿CCgg皿Ctgg33C皿C480ctcgtgggactggtetctggcaatggtccgcaaggtttttccgtgacatggtgg皿ggac540cacatcattcggC33CC皿tgtt咖gggcacgaccctgatettgacaac600ctccccctcttegcctggtcgtcaracgggcgtcaccgatttcccgcaag660ctcattcagttccagcagtectetttcttggtcatctgtetcttgttgcggttcatttgg720tgtttccagagcgtgttgaccgtgcgcagtgagateaccaattctatcgc780tctcagtatecattggcctcgccctgcactggaccttg皿ggccctgttc840cacttettctttetgcccagcatcctcacatcgctgttggtgtttttcgtttcggagctg■gttggcggcttcggcattgcgatcgtggtgttcatgaaccactecccactggag皿gatc960 ggggactcag tctgggatgg ccatggattc tcggttggcc agatccatga gaccatgaac 1020 attcggcgag ggattatcac agattggttt ttcggaggct tgaattecca gattgagcac 1080 catttgtggc cgaccctccc tcgccacaac ctgacagcgg ttagctecca ggtggaacag 1140 ctgtgccaga agcacaacct gccgtatcgg aacccgctgc cccatgaagg gttggtcatc 1200 ctgctgcgct atctggcggt gttcgcccgg atggcggaga agcaacccgc ggggaaggct 1260 ctataa 1266 〈210>2 〈211>421 〈212>PRT 〈213〉眼蟲藻(E. gracilis) [O川]〈400>2 Met Lys Ser Lys Arg Gin Ala Leu Pro Leu Thr lie Asp Gly Thr Thr 15 10 15
TyrAspValSerAlaTrpValAsnPheHis ProGlyGlyAlaGlulie202530lieGluAsnTyrGinGlyArgAspAlaThr AspAlaPheMetValMet354045HisSerGinGluAlaPheAspLysLeuLys ArgMetProLyslieAsn505560ProSerSerGluLeuProProGinAlaAla ValAsnGluAlaGinGlu65707580AspPheArgLysLeuArgGluGluLeulie AlaThrGlyMetPheAsp859095AlaSerProLeuTrpTyrSerTyrLyslie SerThrThrLeuGlyLeu100105110GlyValLeuGlyTyrPheLeuMetValGin TyrGinMetTyrPhelie115120125GlyAlaValLeuLeuGlyMetHisTyrGin GinMetGlyTrpLeuSer130135140HisAsplieCysHisHisGinThrPheLys AsnArgAsnTrpAsnAsn145150155
L60LeuValGlyLeuValSerGlyAsnGlyPro GinGlyPheSerBalThr165170175TrpTrpLysAspArgHisAsnAlaHisHis SerAlaThrAsnValGin180185190GlyHisAspProAsplieAspAsnLeuPro LeuLeuAlaTrpSerGlu195200205AspAspValThrArgAlaSerProlieSer ArgLysLeulieGinPhe210215220GinGinTyrTyrPheLeuVallieCyslie LeuLeuArgPhelieTrp225230235240CysPheGinSerValLeuThrValArgSer LeuLysAspArgAspAsn245250255GinPheTyrArgSerGinTyrLysLysGlu AlalieGlyLeuAlaLeu260265270HisTrpThrLeuLysAlaLeuPheHisLeu PhePheMetProSerlie275280285LeuThrSerLeuLeuValPhePheValSer GluLeuValGlyGlyPhe290295300GlylieAlalieValValPheMetAsnHis TyrProLeuGluLyslie305310315320
10
Gly Asp Ser Val Trp Asp Gly His Gly Phe Ser Val Gly Gin lie His 325 330
335 Glu Thr Met Asn lie Arg Arg Gly lie lie Thr Asp Trp Phe Phe Gly 340 345 350 Gly Leu Asn Tyr Gin lie Glu His His Leu Trp Pro Thr Leu Pro Arg 355 360 365 His Asn Leu Thr Ala Val Ser Tyr Gin Val Glu Gin Leu Cys Gin Lys 370 375 380 His Asn Leu Pro Tyr Arg Asn Pro Leu Pro His Glu Gly Leu Val lie 385 390 395 400 Leu Leu Arg Tyr Leu Ala Val Phe Ala Arg Met Ala Glu Lys Gin Pro 405 410 415 Ala Gly Lys Ala Leu 420 〈210>3 〈211>20 <212>DNA 〈213〉眼蟲藻(E. gracilis) 〈400>3 atgaagtcaa agcgccaagc 20 <210>4 〈211>19 〈212>DNA 〈213>眼蟲藻(E. gracilis) <400>4 ttatagagcc ttccccgcg 19 〈210>5 〈211>37 <212>DNA 〈213〉眼蟲藻(E. gracilis) 〈400>5 ttcggatccg ccaccatgaa gtcaaagcgc caagcgc 37 〈210>6 〈211>33 〈212>DNA 〈213〉眼蟲藻(E. gracilis) 〈400>6 atcctcgagt tatagagcct tccccgcggg ttg 3權(quán)利要求
一種Δ8脫氫酶的核苷酸序列，其特征在于它是SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或與SEQID NO1所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
2. 按照權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是選自下組(a) 編碼具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列多肽的核苷酸序列；(b) 與核苷酸序列(a)互補(bǔ)的核苷酸序列；(c) 核苷酸序列(a)的核苷酸突變序列。
3. —種多肽，其特征在于它是SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的多肽。
4. 一種重組表達(dá)載體，其特征在于它是由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列與質(zhì)?；虿《?所構(gòu)建的重組表達(dá)載體。
5. 按照權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于它是pYES2. O-EFD。
6. —種基因工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于它是選自于下列一種宿主細(xì)胞(a) 它是用權(quán)利要求1所述的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞；(b) 它是用權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞。
7. 按照權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì) 胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，或這些宿主細(xì)胞的后代。
8. 權(quán)利要求1所述的核苷酸序列、權(quán)利要求3所述的氨基酸序列或權(quán)利要求4所述的 重組表達(dá)載體應(yīng)用于多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從眼蟲藻中分離的編碼Δ8脫氫酶的核苷酸序列及其應(yīng)用。它是SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列及其多肽。本發(fā)明包括編碼Δ8脫氫酶的核苷酸序列與表達(dá)載體連接而成的進(jìn)行功能性表達(dá)的重組表達(dá)載體以及含有本發(fā)明重組表達(dá)載體的酵母細(xì)胞、霉菌細(xì)胞及其后代細(xì)胞。用上述的核苷酸序列或多肽序列或含有本發(fā)明重組表達(dá)載體的酵母細(xì)胞、霉菌細(xì)胞及其后代生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法以及用上述的核苷酸序列或多肽序列用于轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101724638SQ20091024503
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日 公開號(hào)200910245035.0
發(fā)明者李明春, 歐秀元, 邢來(lái)君, 魏東盛, 黎明 申請(qǐng)人:南開大學(xué)