專利名稱：Hiv-1前體蛋白早成熟化誘導(dǎo)劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種篩選Hiv-I前體蛋白早成熟化誘導(dǎo)劑的 篩選方法。
背景技術(shù)：
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是由人免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)感染導(dǎo)致人體免疫機(jī)能缺陷，而易于發(fā)生機(jī)會(huì)性感 染和腫瘤的臨床綜合征。在過去的20多年里造成2000多萬人死亡，目前全世界艾滋病病 毒感染者已達(dá)4000萬左右。艾滋病不僅成為我國嚴(yán)重的衛(wèi)生健康問題，同時(shí)每年造成了上 千億的直接經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)中國衛(wèi)生部2008年通報(bào)，全國累計(jì)報(bào)告HIV感染者達(dá)25萬多人， 預(yù)計(jì)則高達(dá)約70萬人。目前臨床使用的傳統(tǒng)的抗艾滋病藥物雖在抗HIV-I方面起到了很大的作用，但仍 存在一些問題，如在人體內(nèi)活性不高、口服生物利用度低、易產(chǎn)生耐藥性或交叉耐藥性及生 產(chǎn)成本高等。耐藥是病毒的藥物作用靶位蛋白變異的結(jié)果。因?yàn)槟退幹杲?jīng)常對(duì)一組抗病毒 藥物耐藥，并且同一類藥物之間交叉耐藥非常常見。因此，急需尋找作用于新靶點(diǎn)的高效低 毒的抗艾滋病藥物。21世紀(jì)以來，研究人員的視線已集中到很多的新的靶點(diǎn)上。HIV-I基因組由兩條單鏈正鏈RNA組成，每個(gè)基因組約為9. 71Λ。結(jié)構(gòu)上包括 LTR，結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(gag)，多種酶活性的蛋白編碼區(qū)(pol)，外膜蛋白(erw)編碼區(qū)以 及6個(gè)調(diào)節(jié)基因。gag基因編碼病毒的核心蛋白，翻譯時(shí)先形成一個(gè)分子量大約是55kD 的前體蛋白(P55)，然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成matrix(MA)、Capsid(CA)、p2、 nucleocapsid(NC)、pl和p6g#。pol基因產(chǎn)物與各種酶的功能相關(guān)，如HIV-1蛋白酶(PR)， 逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、整合酶(IN)等。Pol基因不能單獨(dú)翻譯，gag基因翻譯過程中，會(huì)有5% 10%的幾率發(fā)生特定的移碼，使翻譯繼續(xù)下去，得到160kD的feig-Pol。Gag-Pol在HIV蛋 白酶的作用下裂解成MA、CA、p2、NC、移碼蛋白(TF)、PR、RT、IN。HIV-I蛋白酶(protease，PR)是由HIV-lpol基因5，端所編碼。該酶含99個(gè)氨 基酸，屬天冬氨酸蛋白酶。全酶為旋光對(duì)稱的同源二聚體，而二者界面形成酶活性中心。 HIV-II3R作為前體蛋白(precursor)Gag-Pol的一部分被翻譯出來，前體蛋白形式的I3R處于 無活性狀態(tài)。Gag-Pol通過與HIV-I另一前體蛋白Gag相互結(jié)合，形成未成熟的病毒顆粒。 病毒顆粒裝配完成后，在病毒出芽或者出芽后的瞬間，Gag-Pol中的I3R被激活，將feg-Pol 和(iag剪切成為較小的成熟結(jié)構(gòu)蛋白和酶(包括逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶)，這個(gè)過程稱為病毒的 成熟化。只有經(jīng)過PR酶切加工形成的成熟病毒顆粒才具有感染性。目前，針對(duì)HIV-IPR的藥物研究集中在抑制其活性上，使前體蛋白Gag和(iag-Pol 不能被酶切成為結(jié)構(gòu)蛋白和酶，不能形成成熟的病毒顆粒，從而可達(dá)到抗病毒的效果。HIV 蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitor，PI)自1995年應(yīng)用于臨床以來已取得了顯著成果，但 易產(chǎn)生耐藥及交叉耐藥，且不能徹底治愈艾滋病。HIV-II3R活性的嚴(yán)格調(diào)控對(duì)于病毒的生存至關(guān)重要。研究表明，如果feig-Pol中的3I3R在裝配完成前被激活，會(huì)導(dǎo)致前體蛋白(iag-Pol和Gag被提前酶切加工，這一過程被統(tǒng)稱 為前體蛋白早成熟化(premature)。一旦發(fā)生前體蛋白早成熟化，病毒顆粒便無法裝配，因 此病毒顆粒的產(chǎn)量將顯著減少，甚至無病毒顆粒產(chǎn)生。目前，HIV-I病毒裝配完成前，細(xì)胞 內(nèi)Gag-Pol中I3R活性的抑制機(jī)制，以及裝配完成后，I3R被迅速激活的機(jī)制尚不清除。盡管 如此，如果能干擾HIV-PR活性的調(diào)控機(jī)制，特異性的激活前體蛋白中的PR，誘導(dǎo)前體蛋白 早成熟化，就可以直接抑制病毒的復(fù)制。然而，到目前還沒有一種能夠用于篩選這種誘導(dǎo)劑 的方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述不足，本發(fā)明提供一種HIV-I前體蛋白早成熟化誘導(dǎo)劑的篩選方法。本發(fā)明提供的HIV-I前體蛋白早成熟化誘導(dǎo)劑的篩選方法，包括步驟將表達(dá) Gag/Gag-Pol的質(zhì)粒與表達(dá)融合蛋白A的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，添加待檢樣品至共轉(zhuǎn)染后 的宿主細(xì)胞，檢測細(xì)胞BRETl ratio的變化，BRETl ratio下降，則待檢樣品為早成熟化誘 導(dǎo)劑。所述融合蛋白A為由p2/p7連接的，一端為熒光素酶，另一端為熒光素酶激發(fā)受體的 融合蛋白。上述熒光素酶與熒光素酶激發(fā)受體之間能夠產(chǎn)生生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移 1 (Bioluminescence resonance energy transferl，BRET1)0上述熒光酶可選自海腎熒光素酶。相應(yīng)的熒光酶激發(fā)受體可選自EYFP、EGFP、YFP、GFP。在發(fā)明實(shí)例中，一種優(yōu)選的融合蛋白為EYFP-p2/p7-Rluc。所述表達(dá)feig/feig-Pol 的質(zhì)粒為PVRC4200質(zhì)粒。所述表達(dá)融合蛋白A的質(zhì)粒為pEYFP-p2/p7-Rluc。所述宿主細(xì) 胞為細(xì)胞。具體地首先構(gòu)建表達(dá)融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc的質(zhì)粒pEYFP-p2/p7-Rluc，將其 與表達(dá)feig/feig-Pol的質(zhì)粒pVRC4200質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，添加樣品至轉(zhuǎn)染 后的細(xì)胞，再培養(yǎng)16h，檢測細(xì)胞BRETl ratio的變化。如樣品對(duì)該模型有效，即能夠 提前激活Gag-Pol中的PR,則BRETl ratio下降。本發(fā)明運(yùn)用生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移l(Bioluminescence resonanceenergy transferl,BRETl)技術(shù)，建立了細(xì)胞水平的HIV-I前體蛋白早成熟化激活劑篩選模型。這 一模型的原理為在增強(qiáng)的黃色熒光蛋白(EYFP)和海腎熒光素酶(Renilla luciferase, Rluc)之間插入HIV-I PR的識(shí)別序列p2/p7 (ATI匪QRG)，表達(dá)為融合蛋白EYFP_p2/ p7-Rluc,力口 入 Rluc 底物 coelenterazine h ( λ em 475nm)，在 Rluc 與 EYFP 距離小于 IOOA時(shí)，催化產(chǎn)生的光波能量轉(zhuǎn)移，激發(fā)受體EYFP (λ em 535nm)。生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn) 移比例(BRET1 ratio) = 535nm發(fā)射光強(qiáng)度/475nm發(fā)射光強(qiáng)度(表達(dá)融合蛋白EYFP_p2/ p7-RluC)-535nm發(fā)射光強(qiáng)度/475nm發(fā)射光強(qiáng)度(只表達(dá)蛋白IUuc)。同HIV-1基因組 相似，PVRC4200表達(dá)Gag和feig-Pol，兩者比例20 1，可形成病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs)。將 pEYFP-p2/p7_Rluc 質(zhì)粒與 pVRC4200 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 細(xì)胞，如加入 的化合物能夠提前激活feig-Pol中的PR，細(xì)胞內(nèi)的HIV-II3R活性升高，HIV-IPR識(shí)別EYFP 和Rluc之間的p2/p7序列，酶切融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc，使得EYFP和Rluc分開，距離 大于100A,將無生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，BRETl ratio將下降。4
本發(fā)明方法提供了一種用于HIV-I前體蛋白早成熟化誘導(dǎo)劑篩選的方法，利用該 方法能夠方便、快速地篩選早成熟化誘導(dǎo)劑，對(duì)HIV的治療藥物的篩選提供了新途徑。


圖1 是 pEYFP-p2/p7_Rluc 的質(zhì)粒圖譜；圖2是pVRC4200的質(zhì)粒圖譜。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例11構(gòu)建表達(dá)載體應(yīng)用PCR擴(kuò)增pEYFP-Nl (Clontech公司)質(zhì)粒中的EYFP基因片段。所用引物 上游引物 5' -TAG TAC AAG CTT C GCC ACCATG GTG AGC AAG-3 ‘，下游引物 5' -TGA TTA GGA TCC CTTGTA CAG CTC GTC CAT GC-3'。反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.HIV-I前體蛋白早成熟化誘導(dǎo)劑的篩選方法，其特征在于將表達(dá)feig/feig-Pol的質(zhì) 粒與表達(dá)融合蛋白A的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，添加待檢樣品至共轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，檢測 細(xì)胞BRETl ratio的變化，BRETl ratio下降，則待檢樣品為早成熟化誘導(dǎo)劑，所述融合蛋白A為由p2/p7連接的，一端為熒光素酶，另一端為熒光素酶激發(fā)受體的融 合蛋白，該熒光素酶與熒光素酶激發(fā)受體之間能夠產(chǎn)生生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移1。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光酶選自海腎熒光素酶。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述熒光酶激發(fā)受體選自EYFP、EGFP、 YFP, GFP0
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白為EYFP-p2/p7-RluC。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)(iag/feig-Pol的質(zhì)粒為 PVRC4200 質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)融合蛋白A的質(zhì)粒為 pEYFP-p2/p7-Rluc。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟構(gòu)建表達(dá)融合蛋白 EYFP-p2/p7-Rluc 的質(zhì)粒 pEYFP_p2/p7_Rluc，將其與表達(dá) Gag/Gag-Pol 的質(zhì)粒 pVRC4200 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，添加樣品至轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，再培養(yǎng)16h，檢測細(xì)胞 BRETl ratio 的變化。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于HIV-1前體蛋白早成熟化誘導(dǎo)劑的篩選方法，其將表達(dá)Gag/Gag-Pol的質(zhì)粒與表達(dá)融合蛋白A的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，添加待檢樣品至共轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，檢測細(xì)胞BRET1ratio的變化，BRET1 ratio下降，則待檢樣品為早成熟化誘導(dǎo)劑，所述融合蛋白A為由p2/p7連接的，一端為熒光素酶，另一端為熒光素酶激發(fā)受體的融合蛋白，該熒光素酶與熒光素酶激發(fā)受體之間能夠產(chǎn)生生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移1。利用本發(fā)明方法能夠方便、快速地篩選早成熟化誘導(dǎo)劑，對(duì)HIV的治療藥物的篩選提供了新途徑。
文檔編號(hào)C12Q1/66GK102051407SQ200910237160
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月9日
發(fā)明者劉振龍, 岑山, 張全, 李曉宇, 楊亮, 賈平平, 魏曉露 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所