專利名稱：一種用生物酶提取石榴皮渣中鞣花酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域，具體涉及一種用生物酶提取石榴皮渣中鞣花酸
的方法。
背景技術(shù)：
革柔 花 酸 (2， 3， 7， 8-tet rahydroxy benzopyrano [5， 4， 3cde]benzopyran-5， 10-dione)是沒食子酸的二聚衍生物，是一種廣泛存在于各種軟果、堅果等植物組織中的天 然多酚物質(zhì)。在自然界，它不僅能以游離的形式存在，而且更多的是以易水解的鞣花單寧的 形式存在。鞣花酸的分子式是(:1411608，微溶于水、醇，溶于堿、吡啶，不溶于醚。純鞣花酸是 一種黃色針狀晶體，熔點(diǎn)(吡啶)大于36(TC。 鞣花酸的多羥基結(jié)構(gòu)決定了它具有多種生理活性。研究表明，鞣花酸具有良好的
抑制腫瘤、抗氧化、凝血、抑制細(xì)菌和病毒、鎮(zhèn)定、降壓等作用。因而，它在食品、醫(yī)藥、化工等
領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。但受鞣花酸理化性質(zhì)的限制，它的提取、純化一直沒有良好的技術(shù)突破，
限制了植物來源的鞣花酸的生產(chǎn)和應(yīng)用。 根據(jù)文獻(xiàn)報道鞣花酸的制備方法主要有以下幾種 —種是從植物組織中利用化學(xué)溶劑進(jìn)行提取，通過這種方法可以利用石榴、草莓 等原料生產(chǎn)純度比較高的產(chǎn)品，目前國際上約有四五家工廠以草莓、石榴為原料可生產(chǎn)出 含量約為5%的天然鞣花酸提取物。但由于受到原料中鞣花酸含量的限制，無法進(jìn)行大規(guī)模 的生產(chǎn)，且化學(xué)溶劑會對環(huán)境造成不良影響，故實(shí)際應(yīng)用價值不大。 —種是通過酸解鞣花單寧得到鞣花酸。將鞣花單寧在酸性條件下加熱和葡萄糖反 應(yīng)可以得到鞣花酸，這種方法產(chǎn)率相對較高，但酸解過程需要在高溫下進(jìn)行，且耐酸設(shè)備價 格昂貴，尚未展開工業(yè)化生產(chǎn)。 微生物降解法是利用能夠產(chǎn)生單寧酶的微生物主要有黑曲霉、木曲霉、黃青霉、木 青霉、白腐菌和假絲酵母等作用于單寧分子中的酯鍵，將鞣花單寧降解為鞣花酸。但是鞣花 酸不溶于水，發(fā)酵過程也有大量菌絲體產(chǎn)生，并且這種方法反應(yīng)時間長，為后續(xù)的分離純化 帶來了很大困難，不易得到高純度的鞣花酸。 另外，還可以通過化學(xué)合成的方法獲得鞣花酸。鞣花酸是沒食子酸的二聚衍生物， 以沒食子酸為主要原料，選用適當(dāng)?shù)难趸瘎刂埔欢ǖ臈l件進(jìn)行氧化偶合可以得到鞣花 酸，此過程中，鞣花酸的產(chǎn)率約為20% _30%。在沒食子酸甲酯的甲醇溶液中加入飽和氫氧 化鋇溶液，通空氣2. 5h后用稀酸酸化，即可得到鞣花酸。產(chǎn)率約為30%;將沒食子酸甲酯溶 于10%的氨水中，持續(xù)導(dǎo)入空氣對其進(jìn)行氧化，也能得到鞣花酸。但由于使用了有機(jī)試劑， 對環(huán)境會造成不良影響。 所以，發(fā)明一種簡單可行、不造成環(huán)境污染的鞣花酸的提取方法具有很好的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用生物酶提取石榴皮渣中鞣花酸的方法。本發(fā)明方法的CN 101701234 A 原理為以石榴皮渣為原料，以水為提取溶劑，采用生物復(fù)合酶酶解鞣花單寧后，用堿液終止 酶解反應(yīng)，同時形成堿水體系提取鞣花酸。實(shí)現(xiàn)降低成本，廢物利用，環(huán)境友好，提高鞣花酸 產(chǎn)量的目的。 —種用生物酶提取石榴皮渣中鞣花酸的方法，按照如下操作步驟進(jìn)行
(1)鞣花單寧的提取 將烘干并粉碎的石榴皮渣置于水中，其中，石榴皮渣與水的質(zhì)量比為 1 : 15-1 : 30，然后將其在功率為300-350W的超聲波作用下超聲處理2-3次，每次20-45 分鐘，得到鞣花單寧水溶液；
(2)酶解反應(yīng) 調(diào)節(jié)步驟(1)得到的鞣花單寧水溶液的pH至5. 0-5. 5，然后將生物復(fù)合酶加入到 上述鞣花單寧水溶液中，在40-5(TC下酶解反應(yīng)1-2小時；
(3)鞣花酸的提取 酶解反應(yīng)后，調(diào)節(jié)步驟(2)的酶解液pH至10-14，然后進(jìn)行離心，得到的上清液即 為鞣花酸粗產(chǎn)品。 所述生物復(fù)合酶用量以降解上述鞣花單寧水溶液中每克鞣花單寧需要的酶量計， 其組分和用量為:纖維素酶A :1. 56-15. 6U/g，纖維素酶B :0. 05-0. 5U/g，水解酶0. 2-2U/ g。 所述纖維素酶A為木聚糖酶。 所述纖維素酶B為戊聚糖酶或/和植物精提復(fù)合酶SPE-007。
所述水解酶為單寧酶和/或復(fù)合植物水解酶。
所述步驟(2)和(3)中均使用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值。 使用步驟(1)的方法得到的鞣花單寧水溶液的鞣花單寧含量為5. 62-13. 28g/L。
所述步驟(3)得到的鞣花酸粗產(chǎn)品中，以步驟(1)中得到的鞣花單寧含量計，鞣花 酸含量為12. 69-24%。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括如下三個方面(1)生物復(fù)合酶的催化效率高，選擇性強(qiáng)，縮短 了生產(chǎn)時間；(2)用堿液終止酶解反應(yīng)，同時形成堿水體系提取鞣花酸，過程連續(xù)，工藝簡 單；(3)提取過程完全以水為溶劑，實(shí)現(xiàn)了生產(chǎn)過程的環(huán)境友好，三廢排放少，適合大規(guī)模 工業(yè)生產(chǎn)。 我國是石榴種植大國，其果皮除部分用于中藥藥材外，大部分被人們拋棄，造成很 大的浪費(fèi)。本發(fā)明以石榴皮渣為原料，原料成本低，可提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明以石榴皮渣為原料，用生物復(fù)合酶制備鞣花酸 的方法，但并不將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍中。
以下實(shí)施例中使用的生物復(fù)合酶中各酶用量以降解步驟(1)得到的鞣花單寧水
溶液中每克鞣花單寧需要的量計。原料石榴皮渣采用超聲儀進(jìn)行超聲波處理。
實(shí)施例1 : (1)鞣花單寧的提取 將烘干的石榴皮粉碎后，加入到水中，其中石榴皮渣與水的質(zhì)量比為1 : 15，置于功率為300W的超聲波作用下超聲處理3次，每次45分鐘，得到鞣花單寧的水溶液。采用福 林-酚比色法(Foline-Phenol)測定上述鞣花單寧水溶液中鞣花單寧含量。得到的鞣花單 寧水溶液中鞣花單寧的含量為10. 19g/L。 [OO32] (2)酶解反應(yīng) 將步驟(1)得到的鞣花單寧水溶液，用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至5. 0，然后依次向其 中加入木聚糖酶158. 96U(即降解每克鞣花單寧的酶用量為15. 6U)、戊聚糖酶5. 1U(即降解 每克鞣花單寧的酶用量為0. 5U)和單寧酶20. 4U(即降解每克鞣花單寧的酶用量為2U)，在 5(TC下水浴震蕩，酶解反應(yīng)2小時。
(3)鞣花酸的提取 將步驟(2)得到的酶解液用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至10，進(jìn)行離心，5000r/min離心
20分鐘，得到的上清液即為鞣花酸粗產(chǎn)品，經(jīng)高效液相色譜測定鞣花酸含量，得到鞣花酸的
提取率為7.89% (以步驟(1)中得到的鞣花單寧水溶液中鞣花單寧含量計)。 實(shí)施例2 : (1)鞣花單寧的提取 將烘干的石榴皮粉碎后，加入到水中，其中石榴皮渣的質(zhì)量與水的體積比為 1 : 20，置于功率為330W的超聲波作用下超聲處理3次，每次35分鐘，得到鞣花單寧的水 溶液。采用福林-酚比色法(Foline-Phenol)測定上述鞣花單寧水溶液中鞣花單寧含量。 得到的鞣花單寧水溶液中鞣花單寧的含量為8. 90g/L。 [OO39] (2)酶解反應(yīng) 將步驟(1)得到的鞣花單寧水溶液，用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至5. 3，然后依次向其 中加入木聚糖酶92. 56U(即降解每克鞣花單寧的酶用量為10. 4U) 、SPE-007 0. 89U(即降解 每克鞣花單寧的酶用量為O. 1U)和復(fù)合植物水解酶2. 848U(即降解每克鞣花單寧的酶用量 為0. 32U)，在45t:下水浴震蕩，酶解反應(yīng)1小時。
(3)鞣花酸的提取 將步驟(2)得到的酶解液用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至13，進(jìn)行離心，5000r/min離心
20分鐘，得到的上清液即為鞣花酸粗產(chǎn)品，經(jīng)高效液相色譜測定鞣花酸含量，得到鞣花酸的
提取率為15.76% (以步驟(1)中得到的鞣花單寧水溶液中鞣花單寧含量計)。 實(shí)施例3 : (1)鞣花單寧的提取 將烘干的石榴皮粉碎后，加入到水中，其中石榴皮渣的質(zhì)量與水的體積比為 1 : 30，置于功率為350W的超聲波作用下超聲處理2次，每次30分鐘，得到鞣花單寧的水 溶液。采用福林-酚比色法(Foline-Phenol)測定上述鞣花單寧水溶液中鞣花單寧含量。 得到的鞣花單寧水溶液中鞣花單寧的含量為5. 62g/L。 [OO46] (2)酶解反應(yīng) 將步驟(1)得到的鞣花單寧水溶液，用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至5. 5，然后依次向 其中加入木聚糖酶8. 767U(即降解每克鞣花單寧的酶用量為1. 56U) 、 SPE-0070. 281U(即 降解每克鞣花單寧的酶用量為0. 05U)和單寧酶1. 124U(即降解每克鞣花單寧的酶用量為 0. 2U)，在4(TC下水浴震蕩，酶解反應(yīng)1小時。 [OO48] (3)鞣花酸的提取
將步驟(2)得到的酶解液用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至14，進(jìn)行離心，5000r/min離心
20分鐘，得到的上清液即為鞣花酸粗產(chǎn)品，經(jīng)高效液相色譜測定鞣花酸含量，得到鞣花酸的
提取率為24% (以步驟(1)中得到的鞣花單寧水溶液中鞣花單寧含量計)。 以上實(shí)施例所用酶，木聚糖酶購自北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司，酶活為13000U/g，
SPE-007和復(fù)合植物水解酶購自諾維信公司，酶活為100U/g，單寧酶購自南寧東恒華道生
物科技有限責(zé)任公司，酶活為200U/g。
權(quán)利要求
一種用生物酶提取石榴皮渣中鞣花酸的方法，其特征在于，按照如下操作步驟進(jìn)行(1)鞣花單寧的提取將烘干并粉碎的石榴皮渣置于水中，其中，石榴皮渣與水的質(zhì)量比為1∶15-1∶30，然后將其在功率為300-350W的超聲波作用下超聲處理2-3次，每次20-45分鐘，得到鞣花單寧水溶液；(2)酶解反應(yīng)調(diào)節(jié)步驟(1)得到的鞣花單寧水溶液的pH至5.0-5.5，然后將生物復(fù)合酶加入到上述鞣花單寧水溶液中，在40-50℃下酶解反應(yīng)1-2小時；(3)鞣花酸的提取酶解反應(yīng)后，調(diào)節(jié)步驟(2)的酶解液pH至10-14，然后進(jìn)行離心，得到的上清液即為鞣花酸粗產(chǎn)品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用生物酶提取石榴皮渣中鞣花酸的方法，其特征在于，所述 生物復(fù)合酶的用量以降解上述鞣花單寧水溶液中每克鞣花單寧需要的酶量計，其組分和用 量為:纖維素酶A :1. 56-15. 6U/g，纖維素酶B :0. 05-0. 5U/g，水解酶0. 2-2U/g。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用生物酶提取石榴皮渣中鞣花酸的方法，其特征在于，所述 纖維素酶A為木聚糖酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用生物酶提取石榴皮渣中鞣花酸的方法，其特征在于，所述 纖維素酶B為戊聚糖酶和/或植物精提復(fù)合酶SPE-007。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用生物酶提取石榴皮渣中鞣花酸的方法，其特征在于，所述 水解酶為單寧酶和/或復(fù)合植物水解酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于食品、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域的一種用生物酶提取石榴皮渣中鞣花酸的方法，該方法以石榴皮渣為原料，以水為溶劑，用生物酶制備鞣花酸的方法。通過可降解鞣花單寧的生物復(fù)合酶對鞣花單寧進(jìn)行酶解反應(yīng)，用堿液終止酶解反應(yīng)，同時形成堿水體系提取鞣花酸，得到鞣花酸粗產(chǎn)品，鞣花酸提取率達(dá)到12.69-24％，以步驟(1)得到的鞣花單寧含量計。本發(fā)明工藝簡單、連續(xù)，制作過程綠色化，對環(huán)境友好，三廢排放少，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P17/18GK101701234SQ20091023694
公開日2010年5月5日 申請日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者姜斌, 廖小軍, 張燕, 胡小松 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)