專利名稱：高通量篩選結(jié)核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選抗結(jié)核藥物的方法，尤其是一種高通量篩選結(jié)核分枝桿菌 α -D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結(jié)核病(tuberculosis) 的病原菌，據(jù)WHO報道，目前全球有近1/3的人已感染結(jié)核分枝桿菌，每年新發(fā)結(jié)核病人約 9000 力。(multi drug resistant, MDR) Μ^&Γ&ΜΜ (extensive drug resistant, XDR)菌株的出現(xiàn)，現(xiàn)有抗結(jié)核藥物都無法有效地治愈結(jié)核病，導(dǎo)致每年約有 200萬人死亡，結(jié)核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。目前，新藥研制已由過去大多數(shù)隨機、偶然和被動的藥物發(fā)現(xiàn)過程變?yōu)橹鲃拥囊?明確靶標為依據(jù)的新藥開發(fā)過程，以細菌代謝途徑中的酶或蛋白質(zhì)作為靶標來篩選先導(dǎo)化 合物，是目前研發(fā)新的抗生素的一種策略。研究表明，分枝桿菌與革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽 性菌相比，具有特殊的細胞壁結(jié)構(gòu)，其核心結(jié)構(gòu)由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖及肽聚糖三種 大分子所構(gòu)成。分枝菌酸由含70-90碳原子的脂類分子組成，形成致密的低通透性外層，肽 聚糖位于細胞壁的最內(nèi)層并與細胞質(zhì)膜相連。分枝菌酸與中層的聚阿拉伯糖(由呋喃型阿 拉伯糖殘基聚合而成)及聚半乳糖(由呋喃型半乳糖殘基聚合而成)連接后再通過銜接二 糖(L-鼠李糖-N-乙酰葡糖胺L-Rhamnose-N-GlcNAc)共價連接到肽聚糖大分子上。因此， 銜接二糖是維持分枝桿菌細胞壁完整性的重要結(jié)構(gòu)。dTDP-鼠李糖是鼠李糖的糖基供體，α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶(RmlA)、 dTDP-D-葡萄糖_4，6-脫氫酶(RmlB)、dTDP-4-酮基_6_脫氧-D-葡萄糖3，5表異構(gòu)酶 (RmlC)和dTDP-4-酮基-鼠李糖還原酶(RmlD)催化dTDP-鼠李糖的生物合成，其中RmlA催 化第一步反應(yīng)，使起始底物葡萄糖-1-磷酸和dTTP轉(zhuǎn)變?yōu)閐TDP-葡萄糖，其它三步反應(yīng)由 RmlBjRmlC和RmlD三種酶依次催化，最終形成dTDP-鼠李糖，鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶(WbbL)將鼠 李糖基轉(zhuǎn)移到N-乙酰葡糖胺上，形成二糖銜接分子。我們分別構(gòu)建了 rmlA、rmlB、rmlC和 rmlD基因敲除菌株，通過測定其在允許溫度和非允許溫度條件下的生長曲線，確定rmlA、 rmlB、rmlC和rmlD基因均為分枝桿菌生長必需基因[1’2’3]，上述四種酶均可作為研發(fā)抗結(jié)核 新藥的靶標，繼而篩選出抑制這四種酶的抑制劑，則抑制劑將成為高度專一而又無任何毒 副作用的抗結(jié)核新藥。中國發(fā)明專利申請?zhí)枮?3111037. 1、名稱為“一種以結(jié)核桿菌細胞壁為靶點的藥物篩選方法”的專利申請公開了 dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫氫酶(RmlB)抑制劑的篩選方法， 具體步驟是從結(jié)核分枝桿菌基因組文庫中調(diào)出rmlB基因，設(shè)計引物，PCR擴增rmlB，擴增產(chǎn) 物連接到PMD18-T載體上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化NovaBlue并篩選鑒定，純化rmlB基因片段，測序， 將rmlB與pET16b連接，連接產(chǎn)物rmlB_pET16b轉(zhuǎn)化DH5 α并鑒定，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿 菌BL21 ；將含有rmlB基因的大腸桿菌在25 37°C，用0. 1 5mM IPTG誘導(dǎo)表達2 6小時，超聲破碎細胞，離心，取上清夜，利用表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和 層析技術(shù)純化得到RmlB酶蛋白；在含有50 IOOmM HEPES (pH7. 6)、1 IOmM NAD+、100 500nmol dTDP_Glc、4 12ug/ml蛋白的RmlB酶蛋白溶液中加入中藥、藏藥、天然產(chǎn)物的有 效成分或組合化學(xué)產(chǎn)物，在25 37°C下培育1 5hr后，再加入Iml 0. ImM NaOH培育10 40min，取出后以石英比色杯空白(空氣)為對照，紫外分光光度計檢測318nm下吸光度值 的變化，根據(jù)體系吸光值的變化，確定所加入物質(zhì)是否是以結(jié)核分枝桿菌細胞壁為靶點的 藥物。但以RmlB酶蛋白為靶點的檢測方法存在如下缺點底物dTDP-葡萄糖(dTDP-Glc)價格昂貴且在溶液中不穩(wěn)定，因此篩選成本較高；酶促反應(yīng)時間較長，所以費 時費力；由于沒有商業(yè)化的反應(yīng)產(chǎn)物dTDP-4-酮基-6-脫氧葡萄糖標準品，只能在反應(yīng)體系 中添加NaOH使反應(yīng)產(chǎn)物進一步轉(zhuǎn)化為不穩(wěn)定的衍生物，在318nm處測定其吸光度值，因此 檢測結(jié)果不夠準確且重復(fù)性低；酶促反應(yīng)體系較大，不能在96孔板中完成，所以不能進行 高通量篩選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是以參與結(jié)核分枝桿菌細胞壁中關(guān)鍵組分生物合成的α -D-葡萄糖-1-磷 酸胸苷轉(zhuǎn)移酶(RmlA)為對象，提供一種高通量篩選結(jié)核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸 苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種高通量篩選結(jié)核分枝桿菌α -D-葡萄糖-1-磷酸 胸苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑的方法，其特征在于依次按如下步驟進行a.用分子克隆技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組中克隆rmlA基因；b.將rmlA基因克隆到pET載體，構(gòu)建出pET-rmlA表達載體；c.將pET-rmlA表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，構(gòu)建出表達結(jié)核分枝桿菌α _D_葡 萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶的工程菌株MTRA09 (Escherichia coli MTRA09)，保藏編號CGMCC 3420 ；d.將工程菌株MTRA09接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)4小時， 用濃度為0. 5mM的IPTG進行誘導(dǎo)；e.收獲細菌，破碎細胞，離心后取上清，采用組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)純化得到 RmlA蛋白；f.將 O.lyg RmlA 蛋白與 pH 7. 5 的 50mM Tris_HCl、5mM MgCl2、重量百分比 10% 甘油、ImM DTTUmM葡萄糖-1-磷酸、0. 2mM dTTP和0. 004U焦磷酸酶構(gòu)成50 μ 1的酶促反應(yīng) 體系，將被篩選物按0. 2-5ug/ml濃度加入酶促反應(yīng)體系中，在37°C孵育3分鐘；加入50 μ 1 孔雀石綠顯色液，在37°C顯色5分鐘；用酶標儀檢測在630nm處的吸光度值；g.將所測吸光度值與反應(yīng)條件同f步驟、酶促反應(yīng)體系中無被篩選物時測得的 RmlA蛋白在630nm處的標準吸光度值進行對比，篩選結(jié)核分枝桿菌α -D-葡萄糖-1-磷酸 胸苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑。本發(fā)明是以結(jié)核分枝桿菌α -D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶為靶標所建立的篩選 新型抗結(jié)核藥物的方法，通過優(yōu)化的酶促反應(yīng)體系及化學(xué)顯色方法，可在小體積反應(yīng)體系 中對α -D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶的活性進行測定，因此，可在96孔板中同時完成96個酶促反應(yīng)，可靈敏、快速、準確地在現(xiàn)有組合化合物庫、中藥及天然物中篩選出α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑，制備抗結(jié)核藥物。因α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶 是dTDP-鼠李糖生物合成的必要物質(zhì)，即銜接二糖賴以存在的必要條件，亦是維持結(jié)核分 枝桿菌細胞壁完整性的關(guān)鍵，抑制α -D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶即抑制了銜接二糖的 生物合成途徑，從而破壞結(jié)核分枝桿菌細胞壁的完整性，導(dǎo)致細菌的死亡，具有高藥效性； 另外，在人體細胞中，不存在α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶，則結(jié)核分枝桿菌Ci-D-葡 萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶所催化的反應(yīng)在人體細胞中不存在，以α -D-葡萄糖-1-磷酸胸 苷轉(zhuǎn)移酶為靶酶所研發(fā)的抗結(jié)核藥物將對人體無害，克服了現(xiàn)有抗菌藥物也殺害正常細胞 的缺點。菌株MTRA09 保藏日期2009-11-06。保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。菌株保藏代號CGMCC 3420。
具體實施例方式a.用分子克隆技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組DNA(購自American Type Culture Collection，ATCC# 為 25618D-5)中克隆 rmlA 基因；b.將rmlA基因克隆到pET_16b載體(購自Novagen公司，產(chǎn)品號為69662)，構(gòu)建 出pET-rmlA表達載體；c.將pET-rmlA表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)(購自Novagen，產(chǎn)品號 為69450)中，構(gòu)建出表達結(jié)核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶的工程菌株 MTRA09 (Escherichia coli MTRA09)，保藏編號 CGMCC 3420 ；d.將工程菌株MTRA09接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)4小時， 用濃度為0. 5mM的IPTG進行誘導(dǎo)表達RmlA蛋白；e.收獲細菌，破碎細胞，離心后取上清，采用組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)純化得到 RmlA蛋白；f.將 O.lyg RmlA 蛋白與 pH 7. 5 的 50mM Tris_HCl、5mM MgCl2、重量百分比 10% 甘油、ImM DTTUmM葡萄糖-1-磷酸、0. 2mM dTTP和0. 004U焦磷酸酶構(gòu)成50 μ 1的酶促反應(yīng) 體系，將被篩選物按0. 2-5ug/ml濃度加入酶促反應(yīng)體系中，在37°C孵育3分鐘；加入50 μ 1 孔雀石綠顯色液(購自Alfa Aesar公司，產(chǎn)品號為69662)，在37°C顯色5分鐘；用酶標儀 檢測在630nm處的吸光度值；g.將所測吸光度值與反應(yīng)條件同f步驟、酶促反應(yīng)體系中無被篩選物時測得的 RmlA蛋白在630nm處的標準吸光度值(0. 326)進行對比，篩選結(jié)核分枝桿菌α-D-葡萄 糖-ι-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑。結(jié)核分枝桿菌α -D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑活性測定原理如下列反應(yīng)
式 由α -D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生的焦磷酸(PPi)，用焦磷酸酶水解焦 磷酸為磷酸，磷酸與鉬酸銨形成磷鉬藍(磷鉬酸復(fù)合物)后使孔雀石綠由黃綠色變?yōu)樗{綠 色，用酶標儀檢測在630nm處的吸光度值，以測定所生成磷酸的含量，即可測定α -D-葡萄 糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶的活性。如果酶促反應(yīng)體系中存在α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移 酶抑制劑，則α -D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶的活性降低或完全失活，則生成磷酸的含量 降低或不能產(chǎn)生磷酸，用酶標儀檢測在630nm處的吸光度值也隨之降低。參考文獻1. Hong Qu, Yi Xin, Xu Dong, and Yufang Ma. An rmlA gene encodingD-glucose-1-phosphate thymidylyltransferase is essential for mycobacterial growth. FEMS Microbiology Letters 2007,275:237-243.2. Wei Li, Yi Xin, Michael McNeil and Yufang Ma. rmlB and rmlC genes areessential for growth of mycobacteria.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 2006,342(1) 170-178.3. Yufang Ma,Fei Pan,and Michael McNeil. The formation of dTDP-rhamnoseis essential for growth of mycobacteria. Journal of Bacteriology 2002, 184(12) 3392-3395.
權(quán)利要求
一種高通量篩選結(jié)核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑的方法，其特征在于依次按如下步驟進行a.用分子克隆技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組中克隆rmlA基因；b.將rmlA基因克隆到pET載體，構(gòu)建出pET-rmlA表達載體；c.將pET-rmlA表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，構(gòu)建出表達結(jié)核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶的工程菌株MTRA09(Escherichia coli MTRA09)，保藏編號CGMCC 3420；d.將工程菌株MTRA09接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)4小時，用濃度為0.5mM的IPTG進行誘導(dǎo)；e.收獲細菌，破碎細胞，離心后取上清，采用組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)純化得到RmlA蛋白；f.將0.1μg RmlA蛋白與pH 7.5的50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、重量百分比10％甘油、1mM DTT、1mM葡萄糖-1-磷酸、0.2mM dTTP和0.004U焦磷酸酶構(gòu)成50μl的酶促反應(yīng)體系，將被篩選物按0.2～5ug/ml濃度加入酶促反應(yīng)體系中，在37℃孵育3分鐘；加入50μl孔雀石綠顯色液，在37℃顯色5分鐘；用酶標儀檢測在630nm處的吸光度值；g.將所測吸光度值與反應(yīng)條件同f步驟、酶促反應(yīng)體系中無被篩選物時測得的RmlA蛋白在630nm處的標準吸光度值進行對比，篩選結(jié)核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開一種高通量篩選結(jié)核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑的方法，是利用分子克隆技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組中克隆了rmlA基因，同時建立了高表達α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌工程菌株。利用親和層析技術(shù)從工程菌株中純化得到結(jié)核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶，建立了快速、準確測定結(jié)核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶活性的方法，該酶活性測定方法是篩選結(jié)核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷抑制劑的分子模型，用于高通量篩選組合化合物庫、中藥及天然產(chǎn)物的結(jié)核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
文檔編號C12R1/32GK101845480SQ200910220160
公開日2010年9月29日 申請日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日
發(fā)明者沙珊珊, 董旭, 辛毅, 馬郁芳 申請人:大連醫(yī)科大學(xué)