專利名稱：抑制犬p53基因表達(dá)的siRNA和p53基因沉默的犬細(xì)胞模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種抑制犬p53基因表達(dá)的SiRNA和一種p53 基因沉默的犬細(xì)胞模型及它們的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤抑制蛋白p53是分子量為53KD的磷酸化蛋白，具有轉(zhuǎn)錄激活功能。p53蛋白 在細(xì)胞周期調(diào)控、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生和細(xì)胞分化等方面起到非常重要的作用。在正常 細(xì)胞中P53蛋白的半衰期很短，含量極微。當(dāng)細(xì)胞受到紫外線照射，基因毒試劑以及病毒感 染等應(yīng)激時(shí)，特別是細(xì)胞的DNA受到損傷時(shí)，p53蛋白的表達(dá)迅速增加，通過磷酸化、乙?；?等方式被激活。激活的P53蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄激活與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，使 DNA受到損傷的細(xì)胞周期停止在Gl期，等待細(xì)胞修復(fù)受到損傷的DNA。當(dāng)DNA的損傷嚴(yán)重 時(shí)，細(xì)胞不能完成修復(fù)。為了防止不正常的細(xì)胞進(jìn)行分裂，P53蛋白轉(zhuǎn)錄激活能促進(jìn)細(xì)胞凋 亡的基因，誘導(dǎo)不正常的細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)P53蛋白發(fā)生突變或腫瘤蛋白與p53蛋白結(jié)合 影響了 P53蛋白的正常功能時(shí)，細(xì)胞就可能發(fā)生癌變，使細(xì)胞永生化。在當(dāng)今，癌癥成為人 們健康越來越嚴(yán)重的威脅。如何治愈癌癥，或者延長病者的生存期，提高生存質(zhì)量是醫(yī)者迫 切解決的問題。近年來研究發(fā)現(xiàn)，p53蛋白在細(xì)胞先天性免疫中也發(fā)揮重要的作用。水泡性口 炎病毒在P53基因缺失細(xì)胞(p53-/_)里復(fù)制的病毒滴度是正常細(xì)胞的30倍，在感染的 P53-/-小鼠血清里的滴度比正常小鼠的高100倍；而在p53基因多拷貝細(xì)胞(super p53細(xì) 胞)里，水泡性口炎病毒的滴度比正常細(xì)胞低10倍。在p53基因沉默細(xì)胞(p53knoCk down 細(xì)胞)中丙型肝炎病毒RNA的復(fù)制和病毒蛋白的表達(dá)顯著提高，而用IFN(Interferon，干 擾素)處理p53knoCk down細(xì)胞卻不能有效地抑制丙型肝炎病毒(HCV)RNA的復(fù)制。這些 都表明P53分子在細(xì)胞先天性抗病毒免疫中也發(fā)揮重要作用。但是這些作用機(jī)制都未能明 了，大量的免疫性疾病還沒有有效的治療方法。P53的作用機(jī)制亟待闡明，但是目前還沒有 一個(gè)可以用于研究P53的細(xì)胞模型，限制了研究的開展和深入。近年來研究發(fā)現(xiàn)，將與mRNA對(duì)應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA) 導(dǎo)入細(xì)胞后，被裂解成siRNA(Small interfering RNA，小分子干擾RNA)，siRNA的雙鏈解 開變成單鏈并和某些蛋白形成復(fù)合物，此復(fù)合物同與siRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，使mRNA發(fā)生 特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制被稱為RNA干擾(RNAi)。 RNA干擾技術(shù)已經(jīng)發(fā)展為高效、特異性阻斷細(xì)胞內(nèi)目的基因表達(dá)的有效工具。是目前研究基 因功能的一種重要的方法和手段。而且RNA干擾被廣泛應(yīng)用于病毒感染、癌癥治療。dsRNA 的導(dǎo)入細(xì)胞有多種方法。根據(jù)不同的細(xì)胞和研究對(duì)象可以選擇電穿孔法、微量注射法、浸泡 法、磷酸鈣共沉淀法、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法等方法。但是由于RNAi在細(xì)胞內(nèi)的半衰期很短，這些方法得到的RNAi效應(yīng)不能持久。 也有用腺病毒載體導(dǎo)入dsRNA片段，但也不能實(shí)現(xiàn)目的基因穩(wěn)定地長期表達(dá)。慢病毒(Lentivirus)載體不但可以感染非分裂細(xì)胞，還具有容納外源性目的基因片段大、能夠整 合到細(xì)胞基因組中、表達(dá)持久等優(yōu)點(diǎn)。目前，已有利用RNA干擾技術(shù)抑制人p53基因表達(dá)的 報(bào)道。但是，還沒有利用RNA干擾技術(shù)抑制犬p53基因表達(dá)的文獻(xiàn)資料。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)在還未有p53基因沉默的犬細(xì)胞模 型，對(duì)于與犬P53有關(guān)的腫瘤研究造成一定的影響，而且進(jìn)一步限制了 p53作用機(jī)制的深入 研究，而提供一種抑制犬P53基因表達(dá)的siRNA和一種p53基因沉默的犬細(xì)胞模型及它們 的用途，該siRNA能夠有效抑制犬p53基因表達(dá)，從而能夠應(yīng)用于治療或預(yù)防犬p53基因相 關(guān)的疾病，該P(yáng)53基因沉默的犬細(xì)胞模型對(duì)于研究p53基因及其表達(dá)在腫瘤治療、細(xì)胞分 化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)以及P53蛋白參與細(xì)胞先天性免疫的機(jī)制具有重要意義，從而為腫瘤、疾 病的有效治療提供了可能性。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是一種抑制犬p53基因表達(dá)的 siRNA，其序列如序列表中SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是一種編碼如上所述的抑制犬 p53基因表達(dá)的siRNA的DNA，其序列如序列表中SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4所示。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之三是含有如上所述的抑制犬P53 基因表達(dá)的siRNA的DNA的重組載體。根據(jù)本發(fā)明，所述的重組載體所用的載體可以是本領(lǐng)域常規(guī)的質(zhì)粒，優(yōu)選PGC-LV 質(zhì)粒。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之四是含有如上所述的抑制犬p53 基因表達(dá)的siRNA的重組載體。根據(jù)本發(fā)明，所述的重組載體所用的載體可以是常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄病毒衍生的載體。 所述的病毒衍生的載體可以是慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體或 痘苗病毒載體等，本發(fā)明優(yōu)選慢病毒載體。慢病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是它們能使編碼siRNA的DNA 整合到宿主細(xì)胞的基因組中，得以產(chǎn)生特定基因受特異性阻抑的細(xì)胞系，某些病毒載體可 用于體內(nèi)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從而可直接操縱體內(nèi)和整個(gè)生物的基因表達(dá)。所述的慢性病毒載體，可 以是常規(guī)的市售慢病毒載體。慢病毒載體主要是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎(chǔ)，通過去除env、vif、vpr、 vpu等毒性基因改造而來，用水泡口炎病毒G糖蛋白來代替HIV-I的包膜進(jìn)行包裝，宿主范 圍廣，能增加病毒的滴度。慢病毒載體的毒性基因已被刪除并被外源基因取代，屬于假型病 毒，并且該病毒感染細(xì)胞后不能再感染其它細(xì)胞，生物安全性高。慢病毒載體對(duì)分裂細(xì)胞和 非分裂細(xì)胞均具有感染能力，并可以在體內(nèi)較長期的表達(dá)。本發(fā)明所用的慢病毒載體系統(tǒng) 較佳的包括PGC-LV質(zhì)粒、pHelper 1. 0質(zhì)粒和pHelper 2.0質(zhì)粒三種載體。pGC_LV載體中 含有HIV的基本元件5，LTR(long terminal repeat, LTR，長末端重復(fù)序列)和3，LTR以 及其他輔助兀件，例如WRE(woodchuck hepatitis virusposttranscriptional regulatory element)。pHelper 1. 0載體中含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol 基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。pHelper 2.0載體中含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。較佳的將DNA片段連接到pGC-LV質(zhì)粒，然后將所得的pGC-LV重組質(zhì)粒和兩種輔助包裝原件載體 PHelper 1. 0質(zhì)粒、pHelper 2. 0質(zhì)粒三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，包裝成慢病毒。收集培養(yǎng)后 細(xì)胞上清液中的慢病毒顆粒，即得到含有本發(fā)明siRNA的重組慢病毒載體。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之五是一種ρ53基因沉默的犬細(xì)胞 模型，含有如上所述的重組載體。根據(jù)本發(fā)明，所述的犬細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，可以選自各種不同種類的犬細(xì)胞。本發(fā) 明優(yōu)選犬腎細(xì)胞。所述的犬腎細(xì)胞較佳的是指來源于犬腎上皮細(xì)胞的MDCK細(xì)胞，其英文名 為Madin-Darby canine kidney。MDCK細(xì)胞對(duì)于多種病毒感染比較敏感，利用本發(fā)明建立 的細(xì)胞模型有利用開展P53的先天性抗病毒的研究。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之六是一種如上所述的p53基因沉 默的犬細(xì)胞模型的制備方法，包括以下步驟將如上所述的含有如上所述的抑制犬P53基 因表達(dá)的siRNA的重組載體感染犬細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，所述的重組載體感染犬細(xì)胞后，編碼犬p53 siRNA的DNA重組到犬細(xì) 胞基因組中，轉(zhuǎn)錄出來的siRNA，降解了 p53的mRNA，使犬細(xì)胞內(nèi)源的p53基因沉默。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之七是一種如上所述的SiRNA的用 途，用于制備犬P53抑制劑，或者用于制備治療或預(yù)防犬p53基因相關(guān)疾病的藥物組合物。 所述的犬P53基因相關(guān)疾病如犬細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的治療。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之八是一種藥物組合物，至少包括 一種如上所述的抑制犬p53基因表達(dá)的siRNA為活性成分和一種藥用載體。所述的siRNA 較佳的如序列表中SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示。所述的載體是常規(guī)的藥用載體，如 填充劑、稀釋劑和賦形劑等。本發(fā)明還提供如上所述的細(xì)胞模型的用途，用于研究p53蛋白在腫瘤治療、細(xì)胞 分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)以及細(xì)胞先天性免疫中的作用或其具體機(jī)制。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明的犬P53基因siRNA序列能夠 有效降解P53基因的mRNA，從而抑制p53基因的表達(dá)。利用本發(fā)明提供的siRNA序列干擾 犬P53基因的表達(dá)，一方面可用于制備與p53基因相關(guān)疾病的治療藥物，如細(xì)胞凋亡相關(guān)疾 病，另一方面，通過本發(fā)明建立p53knoCk down細(xì)胞模型，對(duì)于研究p53蛋白在細(xì)胞先天性 免疫中的作用及其可能的具體機(jī)制具有重要的意義。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1顯示在Genbank的登錄號(hào)為AF060514. 1的犬p53基因序列及本發(fā)明的siRNA 的定位。圖2顯示含犬p53 siRNA序列的不同MDCK細(xì)胞克隆p53基因的表達(dá)情況。1 含 對(duì)照序列的MDCK細(xì)胞樣品。2 12 含本發(fā)明siRNA序列的不同MDCK細(xì)胞克隆樣品。圖3顯示犬p53 siRNA序列對(duì)MDCK細(xì)胞中p53 mRNA的降解情況。圖4顯示犬p53 siRNA抑制p53基因表達(dá)的穩(wěn)定性檢測(cè)。圖5顯示5-Fu對(duì)含犬p53siRNA序列MDCK細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞中p53基因表達(dá)的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人希望通過建立一個(gè)p53基因沉默的細(xì)胞模型，以研究p53在腫瘤治療、細(xì) 胞分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)以及P53蛋白參與細(xì)胞先天性免疫的可能機(jī)制，為進(jìn)一步闡明p53的 生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，從而有利于發(fā)現(xiàn)癌癥或先天免疫性疾病的治療藥物。因此，本發(fā)明人 經(jīng)過廣泛研究和反復(fù)試驗(yàn)，通過RNA干擾的方法，終于建立了 p53基因沉默的犬細(xì)胞模型。 本發(fā)明人先尋找高效的犬P53基因的siRNA，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其人工 合成后引入siRNA表達(dá)載體，再將該重組載體導(dǎo)入犬細(xì)胞，經(jīng)過篩選和鑒定，證明獲得的重 組細(xì)胞中P53基因的表達(dá)被有效抑制，從而完成了本發(fā)明。具體的，本發(fā)明的基本方案如下根據(jù)P53基因的mRNA設(shè)計(jì)了 RNA干擾的序列， 然后化學(xué)全合成了 DNA，將該DNA插入質(zhì)粒中，和其它兩個(gè)載體共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，包裝成 重組慢病毒。該重組慢病毒的shRNA(sh0rthairpin RNA, shRNA)表達(dá)框中含有本發(fā)明的 siRNA編碼序列。然后用于轉(zhuǎn)染犬腎細(xì)胞MDCK。重組慢病毒進(jìn)入細(xì)胞后，利用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn) 錄出cDNA，然后將含有本發(fā)明的cDNA重組到細(xì)胞基因組中，利用宿主細(xì)胞的酶系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄 出本發(fā)明的p53shRNA，本發(fā)明的p53shRNA與RNaseIII核酶家族的Dicer結(jié)合，并將其剪 切成本發(fā)明的siRNA。隨后siRNA與若干個(gè)蛋白組成的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)結(jié)合，解旋成單鏈，并由該復(fù)合體主導(dǎo)RNAi效應(yīng)。RISC被活 化后，活化型RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)，序列特異性地結(jié)合在犬p53mRNA上并切斷犬 p53mRNA，引發(fā)犬p53mRNA的特異性分解。 尋找高效的siRNA序列本發(fā)明中，siRNA序列是犬p53基因的mRNA序列中的片段及其互補(bǔ)片段。具體包 括19個(gè)核苷酸，位于犬p53mRNA全長序列的927-945位。圖1顯示了本發(fā)明的犬p53DNA 序列及本發(fā)明的siRNA的定位。利用siRNA設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，可以加快獲得符合要求的siRNA序列。將化學(xué)合成的編碼犬p53 siRNA的DNA包裝入載體，載體優(yōu)選慢病毒載體。該慢 病毒載體系統(tǒng)較佳的包括PGC-LV質(zhì)粒、pHelper 1. 0質(zhì)粒和pHelper 2. 0質(zhì)粒三種載體。 將DNA片段連接到pGC-LV質(zhì)粒。PCR、測(cè)序鑒定陽性克隆。然后將陽性pGC_LV重組質(zhì)粒和 pHelper 1. 0質(zhì)粒、pHelper 2. 0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，包裝成慢病毒。培養(yǎng)后，在細(xì)胞上 清液含有本發(fā)明siRNA的慢病毒顆粒，收集這些慢病毒顆粒即得本發(fā)明的重組慢病毒。ρ53基因沉默的細(xì)胞模型的建立本發(fā)明中，所述的ρ53基因沉默的細(xì)胞模型，又稱p53 knock down細(xì)胞模型，其基 因組中的P53基因的表達(dá)受到抑制。將包裝成功的重組慢病毒感染MDCK細(xì)胞(犬腎細(xì)胞)，然后用puromycin進(jìn)行篩 選，挑取11個(gè)篩選的MDCK細(xì)胞克隆，用western-blot方法檢測(cè)不同的MDCK細(xì)胞克隆的 P53蛋白量的情況。結(jié)果表明編碼本發(fā)明siRNA的DNA序列序列成功重組到MDCK細(xì)胞基因 組中，而且初步證實(shí)本發(fā)明的siRNA序列能夠抑制犬p53基因的表達(dá)。然后挑取p53蛋白量較低的MDCK細(xì)胞克隆，連續(xù)傳代2代、4代、6代、8代后，用 Trizol提取MDCK細(xì)胞mRNA，半定量RT-PCR方法分析MDCK細(xì)胞中p53mRNA的降解情況。表明本發(fā)明的p53siRNA序列能夠有效降解MDCK細(xì)胞p53基因的mRNA。提取傳代6次和8次 的3號(hào)MDCK細(xì)胞克隆中的蛋白，用western-blot方面檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的含量，表明本 發(fā)明的siRNA序列能夠穩(wěn)定的抑制p53基因的表達(dá)。利用5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)p53蛋白增加的特性， 將含本發(fā)明siRNA序列的MDCK細(xì)胞和含對(duì)照序列的MDCK細(xì)胞，用IOuM 5_Fu處理Mh，收 集細(xì)胞，提取蛋白，用western-blot方法分析細(xì)胞中p53蛋白量的情況。進(jìn)一步證實(shí)了本 發(fā)明的siRNA序列能夠有效抑制犬p53基因的表達(dá)。上述一系列研究結(jié)果表明，本發(fā)明的犬p53基因siRNA序列能夠有效降解犬p53 基因的mRNA，從而抑制犬p53基因的表達(dá)。本發(fā)明已經(jīng)成功的用RNA干擾技術(shù)來抑制犬p53 基因的表達(dá)，獲得了 P53基因沉默的細(xì)胞模型。本發(fā)明的細(xì)胞模型與正常的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)方法、保存、活化、傳代一樣，通常用 10%血清的DMEM培養(yǎng)基，在37°C、含5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，用含20%血清、 10% DMSO的DMEM培養(yǎng)基作為凍存液凍存細(xì)胞。用含0. 25%胰酶和0. 02% EDTA的細(xì)胞消 化液進(jìn)行消化。下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
及效果，但本發(fā)明并不受其限 制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議 的條件。實(shí)施例中所述的“室溫”是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。本發(fā)明中， 所述的百分比未特別指明的是指質(zhì)量百分比。實(shí)施例1犬p53siRNA的序列設(shè)計(jì)從GenBank中獲得犬p53基因的基因序列(登錄號(hào)為AF060514. 1)。設(shè)計(jì)可能可 以抑制犬P53基因表達(dá)的siRNA序列如下5，-GCCACUAGAUGGAGAAUAU-3，(SEQ ID No. 1)；3，-CG⑶GAUCUACCUCUUAUA-5，(SEQ ID No. 2)。該犬p53siRNA干擾的靶序列位于犬p53基因序列的927 945位(見圖1)。該 犬p53 siRNA的靶序列(編碼本發(fā)明siRNA的DNA)如下正義鏈5，-GCCACTAGATGGAGAATAT-3，(SEQID No. 3)；反義鏈3，-CGGTGATCTACCTCTTATA-5，(SEQID No. 4)。并選用一條隨機(jī)序列作為對(duì)照。對(duì)照序列如下正義鏈5，-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3，；反義鏈3，-AAGAGGCTTGCACAGTGCA-5，。上述正義鏈和反義鏈由吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司化學(xué)合成。實(shí)施例2含犬p53 siRNA慢病毒的包裝上述合成的編碼本發(fā)明siRNA的DNA片段及對(duì)照序列，由吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司 包裝入慢病毒載體。將DNA片段連接到pGC-LV質(zhì)粒。PCR篩選陽性克隆，測(cè)序鑒定。然后 將所得的PGC-LV重組質(zhì)粒和pHelper 1. 0質(zhì)粒、pHelper 2. 0質(zhì)粒三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì) 胞，培養(yǎng)48小時(shí)，包裝產(chǎn)生慢病毒，收集細(xì)胞上清液。細(xì)胞上清液含有包裝了本發(fā)明siRNA 片段的慢病毒顆粒，對(duì)其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液。用細(xì)胞測(cè)定重組慢病毒的病毒滴度。含本發(fā)明siRNA序列的慢病毒的病毒 滴度為108TU/mL，含對(duì)照序列的慢病毒的病毒滴度為108TU/mL。
實(shí)施例3含犬p53siRNA的MDCK細(xì)胞克隆的篩選及其p53基因表達(dá)情況分析A、在試驗(yàn)前一天將5 X IO4個(gè)MDCK細(xì)胞(美國ATCC)接種三個(gè)35mmdish(細(xì)胞培
養(yǎng)皿)中。B、當(dāng)細(xì)胞生長到30 50%細(xì)胞密度左右時(shí)，吸去上清，用PBS洗兩次。分別用含 本發(fā)明siRNA序列的慢病毒和含對(duì)照序列的慢病毒感染MDCK細(xì)胞，病毒感染量為20M0I。 并設(shè)未用慢病毒感染的MDCK細(xì)胞作為對(duì)照組。加入含10% (ν/ν)血清的DMEM培養(yǎng)基，在 37°C,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。C、培養(yǎng)M小時(shí)后，去掉培養(yǎng)基，加入含10 μ g/ml Puromycin (嘌呤霉素)、10%血 清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)未用慢病毒感染的MDCK細(xì)胞的對(duì)照 組中細(xì)胞全部死亡時(shí)，用慢病毒感染的MDCK細(xì)胞試驗(yàn)組中未死亡的細(xì)胞就是重組成功的 MDCK細(xì)胞。D、將用Puromycin篩選的含本發(fā)明的siRNA序列的MDCK細(xì)胞及含對(duì)照序列的 MDCK細(xì)胞用胰酶消化，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋消化的細(xì)胞到IO7倍，然后在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入消化的細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，保證96孔板中每孔只有一個(gè)細(xì)胞。在 37°C,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。E、當(dāng)細(xì)胞生長到30%細(xì)胞密度時(shí)，加入含10μ g/ml Riromycin、10%血清的DMEM
培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。F、將在含10 μ g/ml Puromycin、10 %血清的DMEM培養(yǎng)基成功生長的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 48孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。然后將細(xì)胞又轉(zhuǎn)移到M孔板中培養(yǎng)，直到用10yg/ml Puromycin篩 選到陽性細(xì)胞克隆。E、將用puromycin篩選的11個(gè)含本發(fā)明的siRNA序列的MDCK細(xì)胞克隆和含對(duì)照 序列的MDCK細(xì)胞IXlO6個(gè)接種到IOOmrn細(xì)胞培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞生長到80%細(xì)胞密度左右 時(shí)，去掉培養(yǎng)基，用冰冷的PBS洗細(xì)胞兩次。然后在冰上用細(xì)胞刮鏟刮取細(xì)胞。用冷凍離心 機(jī)在4°C、3000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。去掉上清，收集細(xì)胞沉淀。然后在細(xì)胞沉淀中加入 100 μ 1細(xì)胞裂解液，用槍頭反復(fù)吹打細(xì)胞數(shù)次，使細(xì)胞充分裂解。然后再用細(xì)胞超聲儀破碎 細(xì)胞2秒。最后，將細(xì)胞煮沸5分鐘。12000轉(zhuǎn)/min離心5min，取上清。用BCA蛋白濃度 測(cè)定方法測(cè)定上清中蛋白的濃度。然后加入IX上樣緩沖液，在沸水中煮沸5min中，室溫 12000r/min 離心 5min。F、將等量的蛋白提取物上樣到丙烯酰胺12% (wt) SDS-PAGE凝膠上，然后轉(zhuǎn)印到 硝酸酸纖維膜上，5% (wt)脫脂乳封閉過夜，倒掉封閉液，用1 1000稀釋的兔多克隆抗體 p53 (FL-393)(生產(chǎn)商Sant Cruz，用p53全長的393個(gè)氨基酸進(jìn)行免疫兔制備的抗體)反 應(yīng)池，TBST洗三次，每次10分鐘，然后加入1 10000稀釋的羊抗兔IgG-HRP (辣根過氧化 物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，生產(chǎn)商SantCruz)，室溫反應(yīng)池，TBST洗三次，每次10分鐘，最后用 ECL(增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒，生產(chǎn)商Pierce)顯示p53蛋白條帶。G、用ECL發(fā)光試劑盒顯示p53蛋白完成后，將NC膜(硝酸纖維膜)置于Mripping Buffer (抗體剝離緩沖液)中，55°C溫育30min。完成后用TBST洗3次，每次lOmin，然后用 5% (wt)的脫脂奶粉封閉過夜。封閉完成后，用鼠源肌動(dòng)蛋白(Actin) —抗(1 1000稀 釋)和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠二抗(1 5000稀釋)進(jìn)行ffestern-blot分析Actin 蛋白。然后用ECL發(fā)光試劑盒顯示Actin條帶。
結(jié)果如圖2所示，在含對(duì)照序列的MDCK細(xì)胞中，p53蛋白量較高。在含本發(fā)明 siRNA序列的11個(gè)MDCK細(xì)胞克隆中，p53蛋白的表達(dá)不一致，有的細(xì)胞克隆的p53蛋白表達(dá) 比較高，有的細(xì)胞克隆中的P53蛋白量明顯降低。這可能與本發(fā)明的siRNA序列插入MDCK 細(xì)胞基因組的位置有關(guān)。這些結(jié)果表明本發(fā)明的siRNA序列成功重組到MDCK細(xì)胞基因組 中，而且初步證實(shí)本發(fā)明的siRNA序列能夠抑制犬p53基因的表達(dá)。實(shí)施例4含本發(fā)明siRNA序列的MDCK細(xì)胞中p53mRNA的降解情況1、細(xì)胞總RNA的提取細(xì)胞總RNA的提取按照Trizol試劑(invitrogen公司)的說明書進(jìn)行操作。A、選擇在實(shí)施例3中用puromycin篩選的含本發(fā)明siRNA序列的3號(hào)MDCK細(xì)胞克 隆和含對(duì)照序列的MDCK細(xì)胞連續(xù)傳2、4、6、8代，然后將MDCK細(xì)胞IX IO6個(gè)接種到IOOmm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分布均勻。用含10% (ν/ν)血清的DMEM培養(yǎng) 基在37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。B、當(dāng)細(xì)胞生長到80%細(xì)胞密度左右時(shí)，去掉培養(yǎng)基，用冰冷的PBS洗細(xì)胞兩次。然 后在冰上用細(xì)胞刮鏟刮取細(xì)胞。用冷凍離心機(jī)在4°C、3000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。去掉上 清，收集細(xì)胞沉淀。C、向EP管(離心管)中加入ImL Trizol試劑，用槍頭反復(fù)輕輕吹打細(xì)胞，在室溫 中放置5min，使核蛋白復(fù)合物充分分離。D、加入0.2mL氯仿，用手振蕩混勻，在室溫中放置2 ;3min。然后，4°C，12000g/ min離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的滅活核糖核酸酶離心管中。E、加入0. 5mL異丙醇到轉(zhuǎn)移的水相中，混勻，室溫放置lOmin。4°C, 12000g/min離 心lOmin，去上清，RNA沉于管底。F、用ImL 75% (ν/ν)乙醇(DEPC水配制)洗RNA沉淀，溫和振蕩，懸浮沉淀。6、4°〇，750(^/1^11離心51^11，去上清。沉淀在室溫中干燥101^11，在1 離沉淀還沒有 完全干燥前加入40 μ L滅活RNA酶的水，在55 60°C溫育lOmin，使RNA溶解。放置_70°C 保存?zhèn)溆?。H、測(cè)定總RNA的濃度。2、cDNA 的制備將提取的細(xì)胞總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。具體的步驟如下A、在PCR管中加入如下試劑
權(quán)利要求
1.一種抑制犬p53基因表達(dá)的SiRNA，其特征在于，其序列如序列表中SEQ ID N0:1或 SEQ ID NO 2 所示。
2.一種編碼如權(quán)利要求1所述的抑制犬p53基因表達(dá)的siRNA的DNA，其特征在于，其 序列如序列表中SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4所示。
3.含有如權(quán)利要求2所述的抑制犬p53基因表達(dá)的siRNA的DNA的重組載體。
4.含有如權(quán)利要求1所述的抑制犬p53基因表達(dá)的siRNA的重組載體。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體所用的載體是慢病毒 載體。
6.一種p53基因沉默的犬細(xì)胞模型，其特征在于，含有如權(quán)利要求4或5所述的重組載體。
7.如權(quán)利要求6所述的犬細(xì)胞模型，其特征在于，所述的犬細(xì)胞是犬腎細(xì)胞MDCK。
8.—種如權(quán)利要求6或7所述的p53基因沉默的犬細(xì)胞模型的制備方法，其特征在于， 包括以下步驟將如權(quán)利要求4或5所述的重組載體感染犬細(xì)胞。
9.一種如權(quán)利要求1所述的siRNA的用途，其特征在于，用于制備犬p53抑制劑或治療 或預(yù)防犬P53基因相關(guān)疾病的藥物組合物。
10.一種藥物組合物，其特征在于，至少包括一種如權(quán)利要求1所述的抑制犬p53基因 表達(dá)的siRNA為活性成分和一種藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制犬p53基因表達(dá)的siRNA，其序列如序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示。本發(fā)明還公開了編碼該siRNA的DNA，以及含有該siRNA或DNA的重組載體。較佳的該重組載體是慢病毒載體，用以感染犬細(xì)胞，即得到一種p53基因沉默的犬細(xì)胞模型。本發(fā)明的犬p53基因siRNA序列能夠有效降解p53基因的mRNA，從而抑制p53基因的表達(dá)。利用本發(fā)明提供的siRNA序列干擾犬p53基因的表達(dá)，一方面可用于制備與p53基因相關(guān)疾病的治療藥物，如細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病，另一方面，通過本發(fā)明建立p53 knock down細(xì)胞模型，對(duì)于研究p53蛋白在細(xì)胞先天性免疫中的作用及其可能的具體機(jī)制具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102071196SQ20091019926
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者史子學(xué), 沈陽, 邱亞峰, 馬志永 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所