專利名稱：一種dl-丙氨酸的酶法生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于氨基酸的生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種DL-丙氨酸的酶法生產(chǎn)
工藝。
背景技術(shù)：
DL-丙氨酸是一種非天然氨基酸，是重要的有機(jī)手性源。主要應(yīng)用于手性藥 物、手性添加劑、手性助劑等領(lǐng)域，在制藥及食品行業(yè)作為手性合成的手性源。 目前主要用于生產(chǎn)新型農(nóng)藥、氨基丙醇、化工中間體、食品添加劑。
目前DL-丙氨酸的制備包括Streck法、a-鹵代酸法、相轉(zhuǎn)移催化合成和冰 醋酸消旋法四種工藝。其中
Streck法為乙醛與氰化氫形成氰醇，除去其中過量氰化氫后，加入氨溶 液內(nèi)，生成氨基腈，加堿水解得到丙氨酸的鈉鹽，經(jīng)離子交換樹脂處理得到DL-丙氨酸，盡管原料價(jià)格便宜，但卻存在著氨基腈水解后分離比較困難，特別是 DL-丙氨酸與副產(chǎn)物分離比較復(fù)雜，稍有不當(dāng)即影響產(chǎn)品質(zhì)量，氨解反應(yīng)條件苛 刻，氰化氫的運(yùn)輸比氨更為困難。
a-鹵代酸法為以a-鹵丙酸為原料，以烏洛托品位催化劑，與氨水進(jìn)行氨 化，制成a-丙氨酸和氯化銨混合物，粗制品進(jìn)入醇溶液中進(jìn)行醇析、離心、干燥 得到工業(yè)級產(chǎn)品，再經(jīng)離子交換樹脂法或重結(jié)晶法得到DL-ci-丙氨酸，盡管連連 易得，對設(shè)備要求不高，但在生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物氯化銨，分離困難， 精制成本高；要采用大量甲醇醇析，造成甲醇嚴(yán)重?fù)]發(fā)排放，污染嚴(yán)重，且甲醇 貯存場地和生產(chǎn)場地易燃易爆，生成安全性不高；催化劑用量很大，不能回收而 造成浪費(fèi)，未反應(yīng)完原料不能回用，反映終點(diǎn)難以判斷，難于降低原來的消耗。
冰醋酸消旋法為以L-丙氨酸為原料，加入催化劑，在冰醋酸溶液中加熱 80~110°C、溶解；溫度保持在95 10(TC進(jìn)行蒸發(fā)濃縮得到消旋的DL-丙氨酸；將 消旋的DL-丙氨酸母液降溫至20 5(TC冷卻后，含雜質(zhì)的DL-丙氨酸結(jié)晶析出， 將該結(jié)晶進(jìn)行離心甩干后，加熱至100 12(TC的溫度下烘干再得粗品DL-丙氨酸; 然后脫色、重結(jié)晶精制。該工藝能耗高，污染量大，冰醋酸易揮發(fā)、運(yùn)輸困難。國內(nèi)現(xiàn)有與DL-丙氨酸的生產(chǎn)方法相關(guān)的研究，研究單位有冀州市華陽化 工有限責(zé)任公司、廣東工業(yè)大學(xué)化工系、新旗氨基酸有限公司。冀州市華陽化工 有限責(zé)任公司的專利"一種DL-丙氨酸的制備工藝"，申請(專利)號 200610012947. X。其主要技術(shù)方案為以L-丙氨酸為原料,加入催化劑，在冰醋酸 溶液中加熱、溶解、蒸發(fā)濃縮得到消旋的DL-丙氨酸;后再經(jīng)降溫、結(jié)晶、離心 甩干和烘干等工序即可得到高含量的DL-丙氨酸。
(《廣東化工》1999年26巻2期-23-24頁)發(fā)表了 "DL—丙氨酸合成方 法的研究"，此文研究了以乙醛為原料，在相轉(zhuǎn)移催化劑在下與氯仿，氨水作用， 一步合成DL—丙氨酸的實(shí)驗(yàn)新方法，并對合成產(chǎn)物的熔點(diǎn)，紅外光譜等進(jìn)行了 分析、鑒定。
上述現(xiàn)有技術(shù)中的工藝，其產(chǎn)品制備成本相對較高，轉(zhuǎn)化效率較低，難以 達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種DL-丙氨酸的 酶法生產(chǎn)工藝，該工藝可適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)且能顯著降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)其目的所采取的技術(shù)方案 一種DL-丙氨酸的酶法生產(chǎn)工藝， 包括搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵，采用大腸桿菌在下述條件下培養(yǎng)和發(fā)酵
a、 種子培養(yǎng)基(質(zhì)量百分比)和培養(yǎng)條件蛋白胨0. 6 0. 8%，氯化鈉0. 4 0.6%，硫酸鎂0.01 0.02%,磷酸二氫鉀O. 1 0.2%， L-丙氨酸1X，玉米漿 1.5 1.8%，余量為純凈水，氨水調(diào)pH7. 0 7. 2。 35 8。C培養(yǎng)24小時(shí)；搖 床頻率為105 110r /min;
b、 發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨0.8 1.2%，玉米漿1.8 2.2%，硫酸鎂0.01 0.02%，磷酸二氫鉀0.05 0.2%，氯化鈉O. 1 0.2%，卜丙氨酸1%，余量為 純凈水，配料完畢用氨水調(diào)pH至7.0 7.2。
c、發(fā)酵培養(yǎng)條件罐溫3(TC土5X:，通風(fēng)比l: 0.2。培養(yǎng)終點(diǎn)pH值7.0 8.5。
本發(fā)明從自然界篩選產(chǎn)對L-丙氨酸有消旋作用的微生物——大腸桿菌，通 過物理或化學(xué)的方法誘變，提高其氨基酸消旋酶的生產(chǎn)能力和活性。培養(yǎng)上述微生物，產(chǎn)生氨基酸消旋酶，生產(chǎn)原料是L-丙氨酸，L-丙氨酸直接作為酶轉(zhuǎn)化 的底物，而不是培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化過程是把L-丙氨酸流加進(jìn)預(yù)先培養(yǎng)好的含有氨基 酸消旋酶的細(xì)胞懸液中。生產(chǎn)條件利用的是生物催化劑，生產(chǎn)過程無高溫高壓反 應(yīng)，無有毒化學(xué)品，常溫、常壓操作。通過轉(zhuǎn)化過程不斷流加L-丙氨酸。L-丙 氨酸積累濃度增加，累積到一定程度可以以結(jié)晶體的形式與反應(yīng)液分離，只需要 經(jīng)過簡單的溶解、脫色、重結(jié)晶就可以得到精制品，生產(chǎn)效率高。
本發(fā)明的有益效果采用微生物酶法轉(zhuǎn)化L-丙氨酸規(guī)?；a(chǎn)DL-丙氨酸， 轉(zhuǎn)化效率達(dá)到99. 6%以上，產(chǎn)品純度99.0%以上，大大降低生產(chǎn)成本，適合大規(guī) 模工業(yè)化生產(chǎn)。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
參見圖1，對本發(fā)明工藝過程描述如下
1、 菌種培養(yǎng)
將斜面菌種接種到搖瓶液體培養(yǎng)基中，在震蕩培養(yǎng)器上連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)左 右后，轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐通風(fēng)培養(yǎng)。在特定工藝條件下發(fā)酵20小時(shí)左右后，檢測發(fā)
酵液OD值、pH值、酶活力等參數(shù)。培養(yǎng)結(jié)束，把上述含有氨基酸消旋酶的細(xì)胞 懸液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)罐。
2、 酶促反應(yīng)
細(xì)胞懸液在反應(yīng)罐升到一定溫度后，通入無菌空氣，流加底物L(fēng)-丙氨酸， 反應(yīng)體系中的L-丙氨酸消旋酶消旋L-丙氨酸。隨著底物流加量的不斷增加，DL-丙氨酸的濃度不斷增加，積累到一定程度，DL-丙氨酸從反應(yīng)體系中結(jié)晶出來， 通過離心分離得到粗品。離心后的酶反應(yīng)液可以回收反復(fù)套用多次，直到酶活力 降低到?jīng)]有利用價(jià)值。喪失酶活力的酶反應(yīng)液中含有一定濃度的DL-丙氨酸，這 部分產(chǎn)品可以通過濃縮的方式結(jié)晶出來。
3、產(chǎn)品精制粗品DL-丙氨酸，含有一定量的色素、蛋白質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)，投入脫色罐中加 水升溫溶解，加入活性碳脫色，溶液經(jīng)活性碳過濾機(jī)、50Wn膜過濾機(jī)過濾，凈 化后的過濾清液經(jīng)真空濃縮結(jié)晶，可以得到化學(xué)純度超過98.5%，光學(xué)純度超過 99%的產(chǎn)品。 主要技術(shù)參數(shù)
本發(fā)明利用現(xiàn)有L-丙氨酸生產(chǎn)裝置，適當(dāng)增加設(shè)備。進(jìn)行了多個(gè)批次的工
業(yè)化實(shí)驗(yàn)，取得了系列適合工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)參數(shù)。
1、 一級種子工藝技術(shù)參數(shù)
硫酸鎂0.02% ，蛋白胨0.7%,氯化鈉0.5%，牛肉膏1%， 瓊脂2% ,
磷酸二氫鉀0.1%，反丁烯二酸1%,余量為純凈水，氨水調(diào)pH 7. 0~7. 2。
試管空消120。C，滅菌3o分鐘，實(shí)消i2o。c，滅菌30分鐘。37^恒溫培養(yǎng)
24~36小時(shí)。
一級種子培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件
蛋白胨0.7%，氯化鈉0.5%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.1%，反丁烯 二酸1%，玉米槳l. 8%，余量為純凈水，氨水調(diào)pH7. 0 7. 2。
1000ml三角瓶裝液量200ml， 0. lMPa滅菌20分鐘，37。C培養(yǎng)24小時(shí)。搖 床條件沖程6. 5 7cm，頻率為105 110r/min。
2、 發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶工藝技術(shù)參數(shù)
(1) OD值凈長大于O. 35;
(2) 培養(yǎng)周期不超過20小時(shí)；
(3) 培養(yǎng)條件
罐溫30。C土rC，通風(fēng)比l: 0.2。培養(yǎng)終點(diǎn)pH值8.0; (4)發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方
種子罐定容500L，其中加蛋白胨1. 0% ，玉米漿1. 8-2. 2%，七水硫酸鎂0. 02 %，磷酸二氫鉀O. 1%，氯化鈉0.145%，反丁烯二酸1%，泡敵150ml左右， 配料完畢用氨水調(diào)pH至7. 0 7. 2。
3、 轉(zhuǎn)化工藝技術(shù)參數(shù)
(1) 對L-丙氨酸消旋率99. 5%以上；
(2) 轉(zhuǎn)化時(shí)間小于12小時(shí)；
(3) 轉(zhuǎn)化溫度控制在37。C 4(TC之間，含酶發(fā)酵液體加入量0. 4%。(4)轉(zhuǎn)化體系配方硫酸鎂2.2kg， L-丙氨酸(含量》99%) 1200kg，含酶 發(fā)酵液0.4%,水定容10m3,用液氨調(diào)pH值為8.0左右。 4、提取過程工藝技術(shù)參數(shù)
(1) 脫色溫度80'C;
(2) 活性炭加量30 50kg;
(3) 靜止20 30分鐘；
(4) 濾液澄清無雜質(zhì)，透光率》99%;
(5) 脫色液濃縮溫度《6(TC，真空度《0.07MPa;
(6) 濃縮比》1/0.3有大量晶體出現(xiàn)，pH值5 .5~6.5;
(7) 結(jié)晶溫度《2(TC;
(8) 離心終點(diǎn)出水成滴不成線；
(9) 干燥溫度60~70 。C，干燥失重《0.2%。
本發(fā)明主要技術(shù)指標(biāo)酶活力2800nmol/g.h;操作穩(wěn)定性7天；轉(zhuǎn)化率》 98.5%;產(chǎn)品對底物質(zhì)量收率》95%;化學(xué)純度》98.5%;光學(xué)純度》99%。以上幾 項(xiàng)要求，在本發(fā)明生物酶生產(chǎn)DL-丙氨酸技術(shù)生產(chǎn)中都得到了良好的體現(xiàn)。
實(shí)施例1
配種子液2000ml，種子液配比為蛋白胨0. 7%，氯化鈉0. 5%，硫酸鎂0. 02 %，磷酸二氫鉀O. 1%， L-丙氨酸1%，玉米漿l. 8%，余量為純凈水，氨水調(diào) pH7. 0。分裝在5只1000ml三角瓶滅菌后，37°C接種斜面，搖床培養(yǎng)24h，搖 床轉(zhuǎn)速為105r/min，接種100L發(fā)酵液，發(fā)酵液配比為蛋白胨1.0%，玉米漿 1.8~2.2%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.1%，氯化鈉0.145%， L-丙氨酸1 %，泡敵30ml，配料完畢用氨水調(diào)pH至7. 0。發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度3(yC， 通風(fēng)比l: 0.2，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)18h。 OD值凈長大于0. 35后，取發(fā)酵液配 制500L轉(zhuǎn)化液，L-丙氨酸60kg，酶液2000ml，余量為純凈水，用液氨調(diào)pH 值為8.0左右。轉(zhuǎn)化溫度38"C,轉(zhuǎn)化12h。 80"C脫色，活性炭加量lkg，過濾后濃 縮，65。C干燥。得到產(chǎn)品59. 6kg，產(chǎn)品含量99. 5%，比旋光度[a ]DJ°為0，透 光率99. 8%。實(shí)施例2
配種子液1000ml，種子液配比為蛋白胨0.6X，氯化鈉0.6%，硫酸鎂0.03 %，磷酸二氫鉀0.2%，卜丙氨酸1%，玉米漿2.0%，余量為純凈水，氨水調(diào) pH7. 5.分裝在10只1000ml三角瓶滅菌后，37°C接種斜面，搖床培養(yǎng)20h，搖 床轉(zhuǎn)速為110r/min，接種IOOL發(fā)酵液，發(fā)酵液配比為蛋白胨1. 2% ，玉米漿2. 4 % ，硫酸鎂0. 03 % ，磷酸二氫鉀0.2%，氯化鈉0. 2 % ， L-丙氨酸1 % ，泡敵30ml ， 配料完畢用氨水調(diào)pH至7.5。發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度32"C，通風(fēng)比l: 0.2， 罐壓0.05MPa，培養(yǎng)20h。 OD值凈長大于0. 35后，取發(fā)酵液配制500L轉(zhuǎn)化液， 硫酸鎂0.2kg， L-丙氨酸60kg，酶液1000ml，用液氨調(diào)pH值為8.5。轉(zhuǎn)化溫度 40flC，轉(zhuǎn)化12h。 85t脫色，活性炭加量1.2kg，過濾后濃縮，70"C干燥。得到產(chǎn) 品59. 4kg，產(chǎn)品含量99. 3%，比旋光度[a ]0,為0，透光率99. 2%。
實(shí)施例3
配種子液800ml，種子液配比為蛋白胨0.6%，氯化鈉0.4%，七水硫酸鎂 0.01%，磷酸二氫鉀0.05%，卜丙氨酸1%，玉米漿1. 5%，余量為純凈水， 氨水調(diào)p朋.5。分裝在4只1000ml三角瓶滅菌后，37°C接種斜面，搖床培養(yǎng)24h， 搖床轉(zhuǎn)速為100r/min，接種100L發(fā)酵液，發(fā)酵液配比為蛋白胨0. 8%，玉米漿 1.8%,硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀0.05%，氯化鈉O. 1%， L-丙氨酸1%，泡 敵20ml，配料完畢用氨水調(diào)pH至6.5。發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30°C，通風(fēng)比 1: 0.2，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)18h。 OD值凈長大于0. 35后，取發(fā)酵液配制500L 轉(zhuǎn)化液，硫酸鎂O. lkg， L-丙氨酸60kg，酶液800ml，用液氨調(diào)pH值為7.5。轉(zhuǎn) 化溫度35"C，轉(zhuǎn)化12h。 70"C脫色，活性炭加量0.8kg,過濾后濃縮，60eC千燥。 得到產(chǎn)品59. 2kg，產(chǎn)品含量99. 4%，比旋光度[a ]此2。為0，透光率99. 4%。
本發(fā)明采用的"生物酶"，直接利用含有氨基酸消旋酶的細(xì)胞培養(yǎng)液，只通 過一步反應(yīng)即可生產(chǎn)出DL-丙氨酸，生產(chǎn)成本大幅度下降，可以做到3萬元以下。 按目前產(chǎn)品市場價(jià)格3.75萬元，有很大的獲利空間。
自然界中多數(shù)微生物具有分解氨基酸的能力，本發(fā)明利用的微生物是大腸桿 菌，通過發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生L-丙氨酸消旋酶生產(chǎn)DL-丙氨酸。
權(quán)利要求
1、一種DL-丙氨酸的酶法生產(chǎn)工藝，包括搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵，其特征在于采用大腸桿菌在下述條件下培養(yǎng)和發(fā)酵a、種子培養(yǎng)基(質(zhì)量百分比)和培養(yǎng)條件蛋白胨0.6～0.8％，氯化鈉0.4～0.6％，硫酸鎂0.01～0.02％，磷酸二氫鉀0.1～0.2％，L-丙氨酸1％，玉米漿1.5～1.8％，余量為純凈水，氨水調(diào)pH7.0～7.2。35～38℃培養(yǎng)24小時(shí)；搖床頻率為105～110r/min；b、發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨0.8～1.2％，玉米漿1.8～2.2％，硫酸鎂0.01～0.02％，磷酸二氫鉀0.05～0.2％，氯化鈉0.1～0.2％，L-丙氨酸1％，余量為純凈水，配料完畢用氨水調(diào)pH至7.0～7.2。c、發(fā)酵培養(yǎng)條件罐溫30℃±5℃，通風(fēng)比1∶0.2。培養(yǎng)終點(diǎn)pH值7.0～8.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DL-丙氨酸的酶法生產(chǎn)工藝，包括搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵，采用大腸桿菌，對其進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生氨基酸消旋酶，直接利用含有氨基酸消旋酶的細(xì)胞培養(yǎng)液，只通過一步反應(yīng)即可生產(chǎn)出DL-丙氨酸。用本發(fā)明工藝生產(chǎn)DL-丙氨酸，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到99.6％以上，產(chǎn)品純度99.0％以上，大大降低生產(chǎn)成本，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P13/00GK101580858SQ200910117049
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者唐思青, 張曉斌, 蔣光玉, 鄭向輝 申請人:安徽華恒生物工程有限公司