專利名稱：一種選育高效抗鎘微生物原生質體多親本融合的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物育種方法，具體說涉及建立一種基于基因組改組技術進行原生 質體多親本融合的方法。
背景技術：
鎘(Cd)是生物毒性極強的重金屬元素，與Pb、Cr、As和Hg合稱為“五毒”，位列第 二。近年來，現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展以及鎘在冶煉、化工、造紙和電子工業(yè)等方面的廣泛應用，使得 Cd污染日趨嚴重。因此，如何修復環(huán)境中的鎘污染，成為國內外研究的熱點。目前，關于微 生物修復鎘污染的研究主要集中于對耐鎘微生物的選擇策略上。2002年，美國加州Maxgen公司的Cardayr6等人提出了 Genome Shuffling技術 (國內翻譯成“基因組改組”)的概念，它把傳統(tǒng)微生物誘變育種技術與細胞融合技術結合， 在微生物菌株誘變的基礎上，通過細胞融合，使多個親本雜交，產生新的復合子代。其具體 操作過程是通過對出發(fā)菌株進行誘變，然后在模擬DNA重組的條件下對原生質體進行多親 本遞推式多次融合(recursive protoplast)，最后篩選出具有多重正向進化標記的目標菌 株。此技術的育種效果十分顯著，在提高微生物對有毒物質的耐受性和降解能力方面也有 成功的例子。Dai等通過三輪基因組改組將Sphingobilum chlorophenolicum對劇毒殺蟲 劑五氯苯酚的耐受濃度提高了 10倍以上，并可將培養(yǎng)基中所含的3mmol/L五氯苯酚完全降 解。但是，在微生物處理重金屬污染物方面，還沒有采用該技術獲取優(yōu)良微生物報道。2009年，王婷、姜春曉、孫紅文等首次將基因組改組技術用于研究抗鎘微生物育 種，改組得到的融合菌與原出發(fā)菌株相比抗鎘性能有大幅度的提高。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是以真核微生物和原核微生物為出發(fā)菌株，通過建立一種原生質體 多親本融合方法，對菌株的抗鎘性能進行改造，提高其對鎘的耐受性。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的采用的技術方案是以人工誘變的突變菌株為出發(fā)菌株，采 用細胞原生質體多親本融合方法，經培養(yǎng)斜面孢子、菌株誘變、基因組改組、篩選、遞推式多 次融合，獲得具有較好性狀優(yōu)勢的抗鎘融合菌株。具體通過以下步驟實現(xiàn)第一步培養(yǎng)誘變用斜面孢子將菌株接種于斜面培養(yǎng)基中，一段時間后，加磷酸緩沖液制備懸浮孢子，孢子量在
lX106^/mLo第二步菌株誘變取5mL孢子懸液轉移至培養(yǎng)皿中，于15W紫外線燈下照射 l-5min或者于終濃度為0. lmol/L的亞硝酸溶液處理10-20min。將孢子懸液涂布于瓊脂發(fā) 酵培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)約24h，肉眼可見微小的菌落。用含鎘濃度梯度瓊脂平板初篩抗 鎘突變菌株，接種至斜面培養(yǎng)，進一步搖瓶培養(yǎng)復篩，最終獲得6株遺傳穩(wěn)定的高效抗鎘突 變菌株，并測定其抗鎘性能。第三步基因組改組
原生質體的制備將誘變后獲得的6株優(yōu)良抗鎘菌株，接種于斜面培養(yǎng)基，在30°C的溫度下培養(yǎng)24h 后，加磷酸緩沖液制備懸浮孢子，孢子量在1 X IO6個/mL。在9cm培養(yǎng)皿中倒入菌絲生長培養(yǎng)基，冷卻后，將以上孢子懸液涂布其上.誘變后 獲得的優(yōu)良抗鎘菌株子30°C培養(yǎng)24h。將預培養(yǎng)的菌株置于盛有二硫蘇糖醇(DTT)溶液的培養(yǎng)皿中(4mL/皿)室溫預處 理半小時(DTT溶液以高滲溶液配制，終濃度為0. Olmol/L)，離心。將菌絲轉移到盛有溶菌酶(芽孢桿菌突變菌酶解)或者蝸牛酶液(熱帶假絲酵母 菌酶解)的培養(yǎng)皿(4mL酶液/皿)中，30°C處理2個小時。從0. 5個小時起每隔0. 5個小 時用顯微鏡觀察原生質體的形成。當大部分細胞轉化成球形的原生質體時，3500r/min離心 約lOmin，棄去上清液，終止酶解，用高滲磷酸緩沖液洗滌2次，重新將原生質體懸浮于高滲 磷酸緩沖液中，原生質體供以下融合試驗。原生質體融合用高滲溶液配制的40%聚乙二醇(PEG)溶液加入到原生質體沉淀中，吹勻，將6株 原生質體集中到一個皿內，進行融合，融合30min，以高滲溶液稀釋PEG處理后的原生質體 融合液，取一定的稀釋液分離到事先制備好的雙層高滲再生培養(yǎng)基上.于30°C培養(yǎng)約48h， 菌落上長出一定量孢子，供以下初篩。第四步篩選初篩濃度梯度篩選法制備固體營養(yǎng)培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)皿一半不含鎘，一半含有一定濃 度梯度的鎘。將以上分離在雙層平板上單菌落的孢子用涂抹棒在平板上均勻涂抹，于30°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，讓其充分生長，然后挑選含鎘平板部分生長旺盛的菌株，將這些菌落移接到 斜面培養(yǎng)基中。復篩搖瓶發(fā)酵復篩對第一次誘變成功的能耐受鎘的初篩菌和出發(fā)菌進行預培養(yǎng)。將 菌落數(shù)為IXio6個/ml的初篩菌ImL接種于IOOmL的液體培養(yǎng)基中，接種兩份，一份含鎘， 另一份不含鎘。分別放入250mL三角瓶中，200r/min振蕩培養(yǎng)。在分光光度計上測定兩份搖 瓶中微生物的0D_值，計算鎘對初篩菌的致死率，其中致死率=(ODck-ODcd)/ODck, ODck 代表菌株在不含鎘培養(yǎng)基中的0D_值，ODcd代表菌株在含鎘培養(yǎng)基中的OD6tltl值。按照上 述步驟將出發(fā)菌接種后，也進行搖瓶培養(yǎng)10小時后，計算鎘對出發(fā)菌的致死率。比較初篩 菌和出發(fā)菌的致死率大小，挑選致死率小于出發(fā)菌的初篩菌，即為高效耐鎘菌。第五步遞推式多次融合將第四步得到的穩(wěn)定性良好的耐鎘菌株重復第三步和第四步的方法處理，進行第 二次融合以及第三次融合，獲得了抗鎘性能大幅度提高的F185和F178融合菌。本發(fā)明所用的作為出發(fā)菌株的枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母菌，購買自國家普通 微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)，現(xiàn)均為南開大學環(huán)境科學與工程學院菌種室保藏菌種。本發(fā)明所用的融菌酶和蝸牛酶均購買自北京經科宏達生物技術公司。本發(fā)明所用的高滲溶液配制的40% PEG溶液中PEG 6000購自中國醫(yī)藥集團上海 化學試劑公司。
具體實施例方式為了對本發(fā)明有充分明確的理解?，F(xiàn)結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。第一步培養(yǎng)菌種初級誘變將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis或者熱帶假絲酵母菌Candida tropicalis 接種于菌種斜面培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)一段時間后，加入適量的磷酸緩沖液，制備懸浮孢 子，使孢子量在1 X IO6個/mL。第二步菌株誘變誘變處理如下取5mL熱帶假絲酵母菌孢子懸液轉移至滅菌培養(yǎng)皿中，于15W紫外 線燈下照射5min ；取5mL枯草芽孢桿菌孢子懸液照射Imin和5min ；取5mL熱帶假絲酵母菌 孢子懸液于終濃度為0. lmol/L的亞硝酸溶液處理IOmin ；取5mL枯草芽孢桿菌孢子懸液于 終濃度為0. lmol/L的亞硝酸溶液處理IOmin和20min。將上述處理后孢子懸液稀釋，取一定稀釋度，涂布于含鎘濃度梯度培養(yǎng)基平板上， 30°C培養(yǎng)約24h，肉眼可見微小菌落，進行初篩。將初篩突變菌接種至斜面中，進行搖瓶發(fā)酵 復篩，獲得抗鎘性能較高的突變菌C14，C44，B42, B41, B310和B65。第三步基因組改組制作由菌種誘變得到的抗鎘突變株C14，C44，B42, B41, B310和B65的斜面，30°C 下培養(yǎng)一段時間。加入適量的磷酸緩沖液，制備懸浮抱子，使飽子量在lX106f/mL。第四步篩選倒新鮮菌絲生長培養(yǎng)基于數(shù)個9cm培養(yǎng)皿中，將孢子懸液(一定的稀釋度)分別 涂布其上，突變菌在30°C培養(yǎng)24h。置于盛有DTT溶液的培養(yǎng)皿中(4mL/皿)室溫預處理0. 5h。將6株菌種的菌絲混合后轉移到盛有酶液的培養(yǎng)皿(4mL酶液/皿)中，室溫處理 2h。從0. 5h起每隔0. 5h用顯微鏡觀察原生質體的形成。當大部分細胞轉化成球形的原生質體時，3500r/min離心約lOmin，棄去上清液，
終止酶解，用高滲磷酸緩沖液洗滌2次，重新將原生質體懸浮于高滲磷酸緩沖液中。倒入含2%瓊脂的高滲再生培養(yǎng)基IOmL于培養(yǎng)基下層，將含0. 8%瓊脂的高滲再 生培養(yǎng)基置于50°C的水浴中保溫，保證其溫度為50°C。用PEG和微量移液器將離心管中的每株原生質體沉淀洗至滅菌培養(yǎng)皿。洗滌時就 開始計時，共30min后以9mL高滲液稀釋PEG處理的原生質體液，稀釋KT1-IiT7共7個梯度。先向已凝固的含2%瓊脂的下層培養(yǎng)基上加入0. ImL稀釋液(滴加10_3_10_7共5 個稀釋度的稀釋液，每個稀釋度至少倒10皿，再向每皿倒入6mL含0. 8%瓊脂的上層培養(yǎng) 基，迅速在臺面上搖開，使上層培養(yǎng)基和稀釋液混勻。將培養(yǎng)皿正置30°C培養(yǎng)。篩選制備固體營養(yǎng)培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)皿一半不含鎘，一半含有一定濃度梯度的鎘。將以 上分離在雙層平板上單菌落的孢子用涂抹棒在平板上均勻涂抹，于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，讓 其充分生長，然后挑選含鎘平板部分生長旺盛的菌株，將這些菌落移接到斜面培養(yǎng)基中。對第一次誘變成功的能耐受鎘的初篩菌和出發(fā)菌進行預培養(yǎng)。將菌落數(shù)為1 X IO6個/ml的初篩菌ImL接種于IOOmL的液體培養(yǎng)基中，接種兩份，一份含鎘，另一份不含鎘。 分別放入250mL三角瓶中，200r/min振蕩培養(yǎng)。在分光光度計上測定兩份搖瓶中微生物的 0D_值，計算鎘對初篩菌的致死率，其中致死率=(ODck-ODcd)/ODck, ODck代表菌株在不 含鎘培養(yǎng)基中的0D_值，ODcd代表菌株在含鎘培養(yǎng)基中的0D_值。按照上述步驟將出發(fā) 菌接種后，也進行搖瓶培養(yǎng)10小時后，計算鎘對出發(fā)菌的致死率。比較初篩菌和出發(fā)菌的 致死率大小，挑選致死率小于出發(fā)菌的初篩菌，即為高效耐鎘菌。通過以上篩選得到F35， F36, F37, F38, F39 共 5 株菌株。第五步遞推式多次融合將F35，F(xiàn)36，F(xiàn)37，F(xiàn)38，F(xiàn)39共5株菌株重復上述的“基因組改組”和“篩選”步驟， 得到F20，F(xiàn)21和F23。將F20，F(xiàn)21和F23共3株菌株進行第三次融合，篩選獲得F178和 F185融合菌。
權利要求
一種選育高效抗鎘菌株原生質體多親本融合的方法，包含有培養(yǎng)斜面孢子、菌株誘變、篩選的方法，其特征首先對微生物進行人工誘變，經篩選獲得對鎘具有高效抗鎘性能的突變微生物；接下來以具有高效抗鎘性能的突變微生物為出發(fā)菌株，經過原生體制備和原生體融合為主的基因組改組、遞推式多次融合，獲得具有較好性狀優(yōu)勢的高效抗鎘融合菌株。
2.根據(jù)權利要求1所述的選育抗鎘菌株原生質體多親本融合的方法，其特征是所述的 基因組改組中原生質體的制備時(1)將野生型菌株枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母菌，分別在30°C的溫度下培養(yǎng)24h后， 然后按1-2%的接種量轉接到新鮮液體培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)IOh和14h。(2)將(1)中的菌懸液置于盛有4mL/皿二硫蘇糖醇(DTT)溶液的培養(yǎng)皿中，室溫預處 理0. 5h，離心。(3)將(2)中獲得的菌株，3500r/min離心15min收獲菌體。用高滲緩沖液洗滌2次。(4)將10mL(3)中獲得的菌株置于含酶的培養(yǎng)皿中，對于枯草芽孢桿菌的細胞壁用2% 溶菌酶來酶解2h，熱帶假絲酵母菌的細胞壁用2%蝸牛酶來酶解2h。(5)對枯草芽孢桿菌以及熱帶假絲酵母菌的原生質體進行誘變，獲得的優(yōu)良抗鎘突變 菌株，在30°C的溫度下培養(yǎng)24h后，加磷酸緩沖液制備懸浮孢子，孢子量在IX 106/mL。
3.根據(jù)權利要求1所述選育抗鎘菌株原生質體多親本融合的方法，其特征是原生質體 融合時1)將高滲溶液加入到制備好的原生質體沉淀中，吹勻；2)取6株原生質體集中到一個培養(yǎng)皿內，進行融合，融合30min，以高滲溶液稀釋；3)取一定的稀釋液分離到事先制備好的雙層高滲再生培養(yǎng)基上，于30°C培養(yǎng)48h，菌 落上長出一定量孢子，供初篩。
4.根據(jù)權利要求1所述的選育抗鎘菌株原生質體多親本融合的方法，其特征是所述的 DTT溶液是用高滲溶液進行配制，終濃度為0. 01mol/Lo
5.根據(jù)權利要求1所述的選育抗鎘菌株原生質體多親本融合的方法，其特征是所述的 遞推式多次融合是指在第一次基因組改組、篩選的基礎上的再次改組與篩選，經過3次基 因組改組獲得高效抗鎘融合菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過誘變提高芽孢桿菌對鎘的耐受性的方法，包括以下步驟(1)以枯草芽孢桿菌作為出發(fā)菌，將芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上預培養(yǎng)10h(2)預培養(yǎng)后的活菌落進行紫外線誘變用15W功率的紫外燈管和固定距離為30cm的條件下照射5min進行誘變，誘變后在濃度梯度培養(yǎng)基平板和搖瓶發(fā)酵方法篩選，所得活菌落即為對鎘具高耐受性的突變桿菌。通過本方法，得到對高濃度鎘充分耐受的突變桿菌B38，其對鎘的耐受濃度達到3mmol/L。
文檔編號C12N15/03GK101955926SQ20091006971
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月14日 優(yōu)先權日2009年7月14日
發(fā)明者姜春曉, 孫紅文, 王婷 申請人:南開大學