專利名稱：低溫堿性蛋白酶基因、含有該基因的工程菌及二者的構(gòu)建方法以及低溫堿性蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域,涉及基因的突變和重組技術(shù)，尤其是低溫堿性蛋白酶基因、 含有該基因的工程菌及二者的構(gòu)建方法以及低溫堿性蛋白酶。
背景技術(shù)：
堿性蛋白酶(EC3.4.21.62)是一種在堿性范圍內(nèi)水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類，其最適pH 一般為9.0-11.0，屬內(nèi)肽酶中的絲氨酸蛋白水解酶類，被廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品、化妝 品、水產(chǎn)飼料、制革、紡織以及醫(yī)藥等領(lǐng)域。
堿性蛋白酶在堿性條件下具有較好的催化蛋白質(zhì)肽鍵水解的能力，其堿性pH與通常洗 滌衣物的環(huán)境的pH9.0-12.0相似，因此，堿性蛋白酶己經(jīng)作為添加劑廣泛應(yīng)用于洗滌劑行 業(yè)。添加堿性蛋白酶后的洗滌劑具有更好的去污效果，能夠大大縮短洗滌時(shí)間，提高洗滌 效率，可防止蛋白質(zhì)污漬再次沉積在織物上，起到增白作用。Rohm于1913年最早提出將 堿性蛋白酶添加入洗滌劑中，在20世紀(jì)60年代，市場(chǎng)上出現(xiàn)了第一種添加了來(lái)源于^^7/w //dew/w7m;y蛋白酶的洗滌劑。目前，堿性蛋白酶的銷售額約占世界酶制劑市場(chǎng)的25%，在 歐洲加酶洗衣粉的比例則達(dá)到80%左右。
堿性蛋白酶廣泛存在于細(xì)菌、放線菌和真菌中，其中以芽孢桿菌屬的堿性蛋白酶研究 的最深入，幾乎所有的商業(yè)化堿性蛋白酶均來(lái)源于芽孢桿菌屬。芽孢桿菌堿性蛋白酶的最 適作用溫度為60 'C，歐洲人洗衣通常先用40-6(TC熱水浸泡，其中的堿性蛋白酶可充分發(fā) 揮作用，而40-6(TC的洗滌溫度需要給水加熱，會(huì)產(chǎn)生較大的能源浪費(fèi)，在亞洲特別是發(fā) 展中國(guó)家習(xí)慣用自來(lái)水洗衣，而堿性蛋白酶在較低的溫度下又無(wú)法發(fā)揮最大的酶活力，使 洗滌劑不能充分發(fā)揮其洗衣效力，因此有必要開(kāi)發(fā)一種最適溫度為低溫的堿性蛋白酶。
利用誘變劑對(duì)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行誘變處理等傳統(tǒng)的工業(yè)微生物育種方法，簡(jiǎn)單可行，但工 作量大，且很難篩選到符合工業(yè)生產(chǎn)要求的理想菌株。對(duì)酶蛋白從分子水平進(jìn)行定向改造 是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新方法，酶的定向進(jìn)化是從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本酶出發(fā)， 利用error-prone PCR、 DNA shuffling等技術(shù)，經(jīng)過(guò)基因的突變和重組，構(gòu)建一個(gè)突變酶 文庫(kù)，通過(guò)篩選最終獲得具有某些特性的酶基因。國(guó)內(nèi)外已有很多利用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)酶 進(jìn)行改造的相關(guān)報(bào)道。酶的定向進(jìn)化不需準(zhǔn)確的酶分子的結(jié)構(gòu)信息，而是通過(guò)隨機(jī)突變、 基因重組、定向篩選等方法對(duì)其進(jìn)行改造，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用error-prone PCR、 DNAshuffling方法對(duì)嗜堿芽孢桿菌成熟肽基因進(jìn)行定向改造獲得的一種低溫堿性蛋白酶基因、
采用該基因構(gòu)建和篩選得到了一種產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的工程菌以及含有該基因的低溫堿
性蛋白酶。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種低溫堿性蛋白酶基因，其基因序列描述如SEQ ID No.2，序列特征為810bp， 核酸，單鏈，線性，DNA。
而且，所述基因的源基因是從嗜堿芽孢桿菌(^"7/wa/ca/oi^^ ATCC 21522)中
獲得的。
一種低溫堿性蛋白酶基因的構(gòu)建方法，構(gòu)建的歩驟是
a)堿性蛋白酶成熟肽基因的獲得；
(2) 堿性蛋白酶成熟肽基因的定向改造，以獲得具有不同特性的堿性蛋白酶的基因文
庫(kù)；
(3) 表達(dá)載體構(gòu)建以及含有低溫堿性蛋白酶基因的工程菌的構(gòu)建以及篩選；
(4) 篩選得到目的菌株后進(jìn)行測(cè)序，得到該基因序列。
一種含有低溫堿性蛋白酶基因的工程菌，該工程菌具有產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的特性。 一種產(chǎn)低溫堿性蛋白酶工程菌的構(gòu)建方法，步驟包括
(1) 堿性蛋白酶成熟肽基因的獲得；
(2) 堿性蛋白酶成熟肽基因的定向改造，以獲得具有不同特性的堿性蛋白酶基因文庫(kù)；
(3) 表達(dá)載體構(gòu)建以及含有低溫堿性蛋白酶基因的工程菌的構(gòu)建以及篩選。
而且，所述歩驟(2)中堿性蛋白酶成熟肽基因的定向改造方法采用error-prone PCR和 DNA shuffling 。
而且，所述步驟(3)中表達(dá)載體為pBE2R， pBE2R是一種大腸-枯草穿梭分泌表達(dá)型載 體，含有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子P43啟動(dòng)蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄， 一個(gè)嗜堿芽孢桿菌堿性蛋白酶信號(hào) 肽用于指導(dǎo)菌體中合成的蛋白酶分泌至胞外。
而且，所述步驟(3)中構(gòu)建工程菌的宿主菌為枯草芽孢桿菌Sad//^ w^"fc WB600， 該菌為6種胞外蛋白酶缺失菌株。
一種產(chǎn)低溫堿性蛋白酶工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的低溫堿性蛋白酶，該酶的成熟肽堿基序列為 SEQIDNo.2,最適作用溫度為3(TC，最適作用pH為ll.O。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是
1、本發(fā)明涉及的工程菌所產(chǎn)堿性蛋白酶在25-35t:均具有較高活性，其最適溫度為 30°C，最適pH為ll.O，由此可知該酶在較低溫度的堿性條件下均具有較高活性，解決了現(xiàn)有技術(shù)中較高作用溫度引起的能源浪費(fèi)的問(wèn)題，使用該酶開(kāi)發(fā)的洗漆劑更加適合亞洲特 別是發(fā)展中國(guó)家的洗衣習(xí)慣，節(jié)約能源的同時(shí)減少溫室氣體排放量。
2、本發(fā)明利用error-prone PCR、 DNAshuffling對(duì)嗜堿芽孢桿菌成熟肽基因進(jìn)行改造， 與質(zhì)粒pBE2R連接，先轉(zhuǎn)化五.co// DH5a ,陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Sa"7/附w6rtto WB600構(gòu)建基因突變文庫(kù)，從中篩選出一株產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的基因工程菌；該菌株通 過(guò)發(fā)酵、分離得到的低溫堿性蛋白酶，為洗滌劑中添加使用的低溫堿性蛋白酶提供了理論 基礎(chǔ)，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。


圖l為本發(fā)明堿性蛋白酶成熟肽基因"p，N)的PCR電泳圖2為本發(fā)明error-prone PCR擴(kuò)增的堿性蛋白酶成熟肽基因(qprN)的電泳圖3為本發(fā)明重組表達(dá)載體pBE2R-a/^N的構(gòu)建及定向進(jìn)化示意圖4為本發(fā)明堿性蛋白酶成熟肽基因fl^N的DNA shuffling過(guò)程示意圖5為本發(fā)明堿性蛋白酶最適作用pH;
圖6為本發(fā)明野生型堿性蛋白酶、突變后堿性蛋白酶最適作用溫度示意圖，其中□
為野生型，A為突變型。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不 能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。 實(shí)施例
1、堿性蛋白酶成熟肽基因aprN的獲得
(1) 嗜堿芽孢桿菌(&a7/Ma/m/o/ Mw5ATCC 21522)的培養(yǎng)及染色體DNA的提取 挑取嗜堿芽孢桿菌單菌落接入LB液體試管中，培養(yǎng)溫度為37'C,搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，培 養(yǎng)時(shí)間為12h，用生工生物工程(上海)有限公司UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑 盒提取嗜堿芽孢桿菌的染色體基因組。
(2) 堿性蛋白酶成熟肽基因的獲得參照NCBI上報(bào)道的堿性蛋白酶成熟肽基因(a，N) 序列如SequenceNo.l，(序列號(hào)M65086)設(shè)計(jì)引物
上游引物P1: 5，-TCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTG -3，(下劃線部分引入7Vco I 酶切位點(diǎn))
下游引物P2: 5，-AAAAGGATCCTTAGCGTGTTGCCGCTTCTGCATTG-3，(下劃線部分 引入SflwHI酶切位點(diǎn))
以嗜堿芽孢桿菌染色體DNA(10ng)為模板，PCR反應(yīng)體系為ddH2O20(^l， 10xbuffer 2.5^1, dNTPlpl，上下游引物(lOpmol/pl)各0.5pl，模板10ng， Ta《酶0.25U。擴(kuò)增條件 為94。C預(yù)變性lmin; 94。C變性30s， 55。C退火30s， 72。C延伸lmin，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；72°C 延伸5min。 PCR產(chǎn)物(印rN)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約810bp處出現(xiàn)特異性條帶，結(jié) 果如附圖l所示，其大小與NCBI上報(bào)道的吻合。
52、采用error-prone PCR、 DNA shuffling對(duì)a; rN的定向改造
(1) error-prone PCR對(duì)a;7rN的隨機(jī)突變
將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，適當(dāng)稀釋作為error-pronePCR的模板。采 用50^1的反應(yīng)體系ddH204pl， 10xbuffer 5^x1， MgCl2 (25mM) 14pl， MnCl2 (10mM) 3pl' dATP(10mM)lpl， dGTP(10mM)1 pl， dCTP(10mM)5pl， dTTP(10mM)5nl，上游引物
(10pmol爾l) 0.5pl，下游引物(10pmolVl) 0.5W， DNA模板10ng， ra《酶0.5U。 PCR擴(kuò)增 條件94。C預(yù)變性lmin; 94。C變性30s， 5(TC退火30s， 72。C延伸lmin，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；72°C 延伸5min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約810bp處出現(xiàn)特異性條帶，結(jié)果如附圖2 所示。將error-prone PCR產(chǎn)物和大腸-枯草穿梭質(zhì)粒pBE2R分別用jVcoI和&mffl雙酶切，酶 切產(chǎn)物用DNA片段純化試劑盒Ver.2.0 (TaKaRa)純化回收，采用DNA連接試劑盒Ver.2.0
(TaKaRa) 16。C連接6h，形成連接質(zhì)粒pBE2R-aj^N。
(2) 五.co/ZDH5a的轉(zhuǎn)化
從Aa^'DH5a平板上挑取一個(gè)單菌落接于2ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37'C振蕩培養(yǎng) 過(guò)夜。取0.5ml菌液轉(zhuǎn)接到裝有50mlLB液體培養(yǎng)基三角瓶中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD6加約0.5， 將菌液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，冰浴10min。 4000r/min離心10min，回收細(xì)胞。倒出培養(yǎng)液， 用冰冷的0.1mol/LCaCl2l0ml懸浮細(xì)胞，冰浴30min。 4°C、 4000r/min離心10min，回收細(xì) 胞，用冰冷的0.1mol/LCaCl2lml懸浮細(xì)胞，每20(^1—份分裝細(xì)胞，此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。 向20(^1感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒DNA (即連接質(zhì)粒pBE2R-a/ rN)l貼，冰浴30min，然后42。C 水浴保溫90s,冰浴2min，加入80(^1 LB液體培養(yǎng)基，37'C慢搖lh，涂布含有氨芐青霉素 (100pg/ml)的LB平板，37。C培養(yǎng)12-16h。收集平板上長(zhǎng)出的菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基試 管中(含有100pg/ml氨芐青霉素)，37。C振蕩培養(yǎng)，采用生工生物工程(上海)有限公司 小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，得到大量擴(kuò)增的連接質(zhì)粒pBE2R-";^N，用于轉(zhuǎn)化枯草芽 孢桿菌Baci//^ WB600。
(3) 枯草芽孢桿菌萬(wàn)""7/附sw6"/h WB600的轉(zhuǎn)化
挑取新鮮的枯草芽孢桿菌S"c///^ WB600單菌落至3ml SPI培養(yǎng)基中，37°C、 250
r/min培養(yǎng)過(guò)夜。次日取100tU培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至5ml SPI培養(yǎng)基，37°C、 250 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)末期(OD,約為0.9)，再轉(zhuǎn)接0.2m塘養(yǎng)液至2mlSPII培養(yǎng)基中，37°C、 150r/min培養(yǎng)90 min。分裝成0.5ml每管，加入l嗎質(zhì)粒(即連接質(zhì)粒pBE2R-"j^N)，再于37。C、 100r/min 振蕩培養(yǎng)30min，然后250r/min培養(yǎng)90min，得到轉(zhuǎn)化子，離心傾去部分上清液，保留100pl 上清液與菌液混合均勻后涂布篩選平板，通過(guò)卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子。
(4) 突變文庫(kù)的篩選
具有不同特性堿性蛋白酶基因的篩選用無(wú)菌牙簽將轉(zhuǎn)化子和對(duì)照菌枯草芽孢桿菌 Sac/〃M WB600-pBE2R點(diǎn)種在含l。/o脫脂乳的LB平板(含30昭/ml卡那霉素)上，
5(TC培養(yǎng)12-16h。將平板上長(zhǎng)出并產(chǎn)生蛋白水解圈的轉(zhuǎn)化子采用96孔板高通量復(fù)篩，復(fù)篩 底物為N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide (AAPF)。將平板上用于復(fù)篩的單細(xì)胞克隆接入5ml2xYT液體培養(yǎng)基試管中(含有30嗎/ml卡那霉素)，于37。C、 180rpm過(guò)夜培養(yǎng)。 發(fā)酵液離心，取10W上清液，100pl含50mMTris-HCl， 10mMCaCl2， 100mMNaCl， 0.2 mM AAPF (pH8.5) ， 5(TC反應(yīng)lmin，加入10(^1苯甲基磺酰氟終止酶活，于410nm檢測(cè)產(chǎn)物的 吸收值。選擇將底物AAPF轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物能力高的轉(zhuǎn)化子用于下一輪error-prone PCR。
重復(fù)2輪步驟(1)(2)(3)，其中第二輪轉(zhuǎn)化子和對(duì)照菌枯草芽孢桿菌Sfl"7/w w^/fo WB600-pBE2R培養(yǎng)的溫度降至45。C ，第三輪轉(zhuǎn)化子和對(duì)照菌枯草芽孢桿菌^^7/w wto'fo WB600-pBE2R培養(yǎng)溫度降至4(TC，過(guò)程示意圖見(jiàn)附圖3。
(5)DNA shuffling
將篩選到的具有不同特性的堿性蛋白酶基因各3ng混合，用DNaseI片段化，采用50pl 體系ddH20 8pl， 10xDNase I buffer 5(il， DNA各3ng， DNase I 0.05U，將上述反應(yīng)體系 于15'C反應(yīng)20min，于85'C水浴中保溫30min，以終止DNase I酶活。于2%瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)片段化產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)附圖4。將DNase I片段化的產(chǎn)物用DNA片段純化試劑盒Ver.2.0 (TaKaRa)純化回收作為無(wú)引物PCR的模板。
無(wú)引物PCR的反應(yīng)體系為ddH20 21pl, 10xbuffer2.5W， dNTPlpl，模板10ng， 7bg 酶0.25U。無(wú)引物PCR擴(kuò)增程序94'C預(yù)變性lmin， 94'C變性30s、 (TC退火30s、 72'C延伸 90s、反應(yīng)50個(gè)循環(huán)，72'C延伸5min。將無(wú)引物PCR產(chǎn)物稀釋1(^倍，作為有引物PCR的模 板。
有引物PCR反應(yīng)體系為5(Hil: ddH20 39pl、 10xbuffer5pl、 dNTP2pl、上游引物 (10pmol爾l) 1^1、下游引物(10pmol/pl) 1^1、模板10ng、 7b《酶0.5U。 PCR擴(kuò)增程序 94。C預(yù)變性lmin,94。C變性30s、57。C退火30s、72。C延伸90s、反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，72。C延伸5min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約810bp處出現(xiàn)特異性條帶。片段化過(guò)程及兩歩驟PCR 過(guò)程的電泳圖如附圖4所示。
3、表達(dá)載體的構(gòu)建以及含有低溫堿性蛋白酶基因的工程菌的構(gòu)建和篩選
(1) 將有引物PCR產(chǎn)物純化回收后，用臉oI和SamHI雙酶切，酶切產(chǎn)物與質(zhì)粒pBE2R的 相同酶切產(chǎn)物，采用DNA連接試劑盒Ver.2.0 (TaKaRa) 16'C連接6h，將連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化到五.co// DH5a中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌 Sad〃M swto'fcWB600中，構(gòu)建基因突變文庫(kù)。
(2) 將枯草芽孢桿菌5a"7/船^to'foWB600的轉(zhuǎn)化子及對(duì)照菌枯草芽孢桿菌3a"7/w s"to7k WB600-pBE2R點(diǎn)種含P/。脫脂乳的LB (含30jxg/ml卡那霉素)平板，于3(TC培養(yǎng) 12-16h,挑取產(chǎn)生水解圈的轉(zhuǎn)化子用于復(fù)篩。將平板上的單細(xì)胞克隆接入5ml2xYT液體培 養(yǎng)基試管中(含有30pg/ml卡那霉素)，于37°0、 180rpm過(guò)夜培養(yǎng)。發(fā)酵液離心，取10pl 上清液，100pil含50mMTris-HCl、 10mMCaCl2、 100mMNaCl、 0.2 mM AAPF (pH8.5), 3(TC反應(yīng)lmin，加入lO(Hil苯甲基磺酰氟終止酶活，于410nm檢測(cè)產(chǎn)物的吸收值，從中篩 選出一株產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的轉(zhuǎn)化子并命名為Saa'//^ ^to'fc WB600-TC4。
(3) 測(cè)序經(jīng)過(guò)測(cè)序得到該工程菌編碼低溫堿性蛋白酶成熟肽基因的特征為長(zhǎng)度810bp、核酸 DNA、單鏈、線性、序列描述SEQIDNo.2。 4、低溫堿性蛋白酶的制備、純化
(1) 發(fā)酵和鹽析
將工程菌Sa"7/wsWB600-TC4接入LB培養(yǎng)基(含30昭/ml卡那霉素)，37°C、 180r/min振蕩培養(yǎng)12-16h。取100ml發(fā)酵液，4°C、 8000r/min離心20min，收集上清，邊 攪拌邊加入研細(xì)的固體硫酸銨使其飽和度達(dá)到70%, (C靜置過(guò)夜。4'C、 8000r/min離心 20min，蛋白沉淀溶于適量PBS (pH7.6)緩沖液中。
(2) 脫鹽
將鹽析所得沉淀物溶液裝入透析袋，將透析袋放入10倍該溶液體積的PBS (pH7.6)緩 沖液中，4。C透析。4°C、 8000r/min離心20min，取上清液。
(3) Sephadex G-50柱層析
Sephadex G-50層析柱(1.6 cm x 60 cm)用PBS緩沖液(pH7.6)平衡，將脫鹽后的上 清液上柱，用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫，以部分收集器收集流出液，緩沖液流速為lml/min， 收集速度為4min/管，收集活性組分。
以下是對(duì)重組堿性蛋白酶的基本性質(zhì)的檢測(cè)
(1) 酶活測(cè)定方法
酶活單位定義將lml酶液在pH10.5，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生l)ag酪氨酸所需的酶量定 義為一個(gè)酶活力單位(U/ml)。
堿性蛋白酶酶活力測(cè)定方法采用Folin法。用硼砂/NaOH(pH 10.5)緩沖液配制1%的酪素 溶液作為底物并將酶液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)。取lml稀釋的酶液，于一定溫度下保溫2min，加 入同樣溫度的底物lml，反應(yīng)10min，加入2ml 10%三氯乙酸終止反應(yīng)。靜置離心，取Iml 上清液，加入5ml0.4mol/LNa2CO3溶液、lml福林酚試劑，混勻，相同溫度下保溫20min， 于680nm波長(zhǎng)，用10mm比色皿測(cè)其吸光度(X)。以滅活酶液為對(duì)照。
酶活力計(jì)算公式X=AxKx4/10xn=0.4xAxK>n
式中X—樣品的酶活力(U/ml) ; A—樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度；K一吸光常數(shù)， 取97; 4—反應(yīng)試劑的總體積(ml) ; IO—反應(yīng)時(shí)間(min) ， n—稀釋倍數(shù)。所得結(jié)果表 示至整數(shù)，平行實(shí)驗(yàn)相對(duì)誤差不得超過(guò)3%。
(2) 重組堿性蛋白酶的性質(zhì)
I .最適作用pH:用不同pH的緩沖液檸檬酸/檸檬酸鈉(pH5.0-6.0) 、 Na2HP04/NaH2P04 (pH7.0-8,0)、硼砂/NaOH (pH9.0-11.0) 、 Na2HP04/NaOH (pHl 1.0-12.0)配制1%的酪素 溶液并稀釋粗酶液。取lml稀釋酶液于4(TC測(cè)定酶活，以確定酶的最適作用pH，見(jiàn)附圖5。
II.最適作用溫度將酶液分別在2(TC、 30°C、 40°C、 50°C、 60'C、 7(TC水浴中保溫2min 后測(cè)定酶活，以確定酶的最適作用溫度，見(jiàn)附圖6。SEQUENCE LISTING
〈110〉天津科技大學(xué)
〈120〉低溫堿性蛋白酶基因、含有該基因的工程菌及二者的構(gòu)建方法 <130〉 20090710 <160〉 4
<170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1 〈211〉 810 〈212〉 DNA
〈213〉堿性蛋白酶成熟肽基因aprN 〈400〉 1
gcgc犯tcag tgccatgggg肪ttagccgt gtgcaagccc c柳tgccca taaccgtgga 60
ttgacaggtt ctggtgtaaa agttgctgtc ctcgatacag gtatttccac tcatccagac 120
ttaaatattc gtggtggcgc tagctttgta ccaggggaac catccactca agatgggagt 180
gggcatggca cgcatgtggc cgggacgatt gctgctttaa acaattcgat tggcgttctt 240
ggcgtggcgc cgagcgcgga^ actotacgct gtt犯3gt3t taggggcg兆cggttcsggt 300
tcggtcagct cgattgccca aggattgg犯tgggcaggga ac組ggcat gcacgttgct 360
犯tttgagtt tagg犯gccc ttcgccaagt gccacacttg 3gcaagctgt taatagcgcg 420
acttctagag gcgttcttgt tgtagcggca tctgggaatt caggtgcagg ctcaatcagc 480
tatccggccc gttatgcgaai cgcaatggca gtcggagcta ctgaccaaaa c犯c犯ccgc 540
gccagctttt cacagtatgg cgcagggctt gacattgtcg caccaggtgt aaacgtgcag 600
agcacatacc caggttcaac gtatgccagc ttaaacggta catcgatggc tactcctcat 660
gttgcaggtg cagcagccct tgtta犯c犯aag朋cccat cttggtccaa tgtacaaatc 720
cgcaatcatc taaagaaaac ggcaacgagc ttaggaagca cgaacttgta tggaagcgga 780
cttgtcaatg cagaagcggc aacacgctaa 810<210〉 2 <211> 810 <212〉 DNA
<213>低溫堿性蛋白酶基肉 <400〉 2
gcgcaatcag tgccatgggg aattagccgt gtgcaagccc cagctgccca taaccgtgga 60
ttgacaggtt ctggtgtaaa agttgctgtc ctcgatacag gtatttccat tcatccagac 120
ttaaatsttc gtggtggcgc tsgctttgt3 ccagggg朋c cstccsctcs agstggg3gt 180
gggcatggC3 cgcstgtggc cgggacgatt gctgcttt肌acaattcgat tggcgttctt 240
ggcgtggcgc cgagcgcgga actatacgct gttaaagtat taggggcgag cggttcaggt 300
tcggtcagct cgatagccca aggattggca tgggcaggga acaatggcat gcacgttgct 360
aatttgagtt taggaagccc ttcgccaagt gccacacttg cgcaagctgt taatagcgcg 420
acttctagag gcgttcttgt tgtagcggca tctgggaatt caggtgcagg ctcaatcagc 480
tatccggccc gttgtgcgaa cgcaatggca gtcggagcta ctgaccaaaa caacaaccgc 540
gccagctttt cacagcatgg cgcagggctt gaca/ttgtcg caccaggtgt aaacgtgcag 600
agcacatacc caggttcaac gtatgccagc ttaaacggta catcgatggc tactcctcat 660
gttgcaggtg cagcagccct agttaaacaa aagaacccat cttggtccaa tgtacaaatc 720
cgC33tc3tc tsaagaaaac ggcaacaagc ttaggasgca cgaacttata tggsagcggs 780
cttgtc犯tg cag肪gcggc朋C3CgCt3a
<210> 3
〈211> 27 <212>鵬 <213〉上游引物Pl
<400> 3
tcagtgccat ggggaattag ccgtgtg
〈210〉 4
810
27<211> 35
<212〉 歸
<213>下游引物P2
<400> 4
aaaaggatcc ttagcgtgtt gccgcttctg cattg 35
1權(quán)利要求
1、一種低溫堿性蛋白酶基因，其特征在于其基因序列描述如SEQ ID No.2，序列特征為810bp，核酸，單鏈，線性，DNA。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種低溫堿性蛋白酶基因，其特征在于所述基因的源基 因是從嗜堿芽孢桿菌(5ac/〃M a/ca/op/n7瓜 ATCC 21522)中獲得的。
3、 一種如權(quán)利要求l所述的低溫堿性蛋白酶基因的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建的步驟是(1) 堿性蛋白酶成熟肽基因的獲得；(2) 堿性蛋白酶成熟肽基因的定向改造，以獲得堿性蛋白酶的基因文庫(kù)；(3) 表達(dá)載體構(gòu)建以及含有低溫堿性蛋白酶基因的工程菌的構(gòu)建以及篩選；(4) 篩選得到目的菌株后進(jìn)行測(cè)序，得到該基因序列。
4、 一種含有如權(quán)利要求1所述低溫堿性蛋白酶基因的產(chǎn)低溫堿性蛋白酶工程菌，其 特征在于該工程菌含具有產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的特性。
5、 一種如權(quán)利要求4所述產(chǎn)低溫堿性蛋白酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于方法 的步驟包括(1) 堿性蛋白酶成熟肽基因的獲得；(2) 堿性蛋白酶成熟肽基因的定向改造，以獲得堿性蛋白酶基因文庫(kù)；(3) 表達(dá)載體構(gòu)建以及含有低溫堿性蛋白酶基因的工程菌的構(gòu)建以及篩選。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于-所述歩驟(2)中堿性蛋白酶成熟肽基因的定向改造方法采用error-prone PCR和DNA shuffling 。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種產(chǎn)低溫堿性蛋白酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(3)中表達(dá)載體為pBE2R， pBE2R是一種大腸-枯草穿梭分泌表達(dá)型載體，含有一 個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子P43啟動(dòng)蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄， 一個(gè)嗜堿芽孢桿菌堿性蛋白酶信號(hào)肽用于指導(dǎo) 菌體中合成的蛋白酶分泌至胞外。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種產(chǎn)堿性蛋白酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述 步驟(3)中構(gòu)建工程菌的宿主菌為枯草芽孢桿菌萬(wàn)"d/ZM w6"fe WB600，該菌為6種胞外 蛋白酶缺失菌株。
9、 一種由權(quán)利要求4所述產(chǎn)低溫堿性蛋白酶工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的低溫堿性蛋白酶，其 特征在于該酶的成熟肽堿基序列為SEQIDNo.2，最適作用溫度為3(TC，最適作用pH 為11.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種低溫堿性蛋白酶基因、含有該基因的工程菌及二者的構(gòu)建方法以及低溫堿性蛋白酶，低溫堿性蛋白酶基因序列描述如SEQ ID No.2，序列特征為810bp，核酸，單鏈，線性，DNA。產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的工程菌由宿主菌枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB600轉(zhuǎn)化而來(lái)，具有產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的特性，構(gòu)建工程菌的步驟包括該方法包括目的基因的獲得、目的基因的定向改造、表達(dá)載體構(gòu)建、含有低溫堿性蛋白酶基因的工程菌的構(gòu)建以及篩選。低溫堿性蛋白酶的成熟肽堿基序列見(jiàn)SEQ ID No.2，其最適作用溫度為30℃，最適作用pH為11.0。該工程菌所產(chǎn)堿性蛋白酶最適溫度為30℃，最適pH為11.0，為洗滌劑中添加使用的低溫堿性蛋白酶提供了理論基礎(chǔ)，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N15/75GK101597615SQ20091006967
公開(kāi)日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2009年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日
發(fā)明者堃 成, 梁曉梅, 王建玲, 王春霞, 路福平, 明 黎 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)