專利名稱：辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶Pcipg5基因分子檢測技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體地說，本技術發(fā)明提供從來辣椒疫霉菌的多聚半乳糖 MW Pa》g 5 ^TOtt并合, 一對特異引物，皿供檢測辣椒疫霉特異性和靈敏，證 據。此外，本發(fā)明主要涉及利用該技術對辣椒病田土壤、病莖、病葉、病果中的辣椒疫霉 菌進行定性、定量分子檢測和疫情發(fā)生趨勢的預警，對辣椒疫病適時進行綜合防控和高效 治理。
背景技術：
植物病原卵菌是一類重要的植物病原菌，可侵染危害多種植物，導致多種植物的毀滅性 病害，如致病疫霉(尸/iy/o; /^ora z'"/eWfl"s )、辣椒疫霉(Pcfl;wz'a')、大豆疫霉(P yVie)、 寄生疫霉(P/7flraWric)、樟疫霉(Pd朋flmo/m')及冬生疫霉(PM)e附flfo)分別引起馬鈴 薯、辣椒、大豆、煙草、樟樹及柑橘的重要疫病，嚴重年份乃至絕產。該類病菌主要以菌 絲體或卵孢子在病殘體或土壤中度過不良環(huán)境而作為初侵染源，在適宜條件下，菌絲體或 卵孢子均可萌發(fā)產生孢子囊-釋放游動孢子，再借助雨水或氣流進行傳播、侵染而導致植物 病害。因此，對該類病菌的初侵源或侵染寄主早期進行適時檢控，利于控制病害的發(fā)生。 傳統(tǒng)的病害防控策略主要依靠品種、栽培、化防和生態(tài)調控等防治措施，這些防控措施主 要在病害爆發(fā)乃至產生明顯危害時才實施，忽視了對初侵染源或侵染寄主早期適時采取綜 合防控和高效治理措施，近而事半功倍，防效甚微，最終很難控制病害的發(fā)生與流行。
近年來，PCR技術及其相關分子檢測技術已廣泛用于植物病原菌消長動態(tài)的分子檢測與 預警，其中主要利用核糖體rDNA/ITS序列設計特異引物，已針對性的開展了大豆疫霉、致 病疫霉、冬生疫霉、寄生疫霉、辣椒疫霉的分子檢測技術研究，但這些技術性研發(fā)成果僅 能對病菌活動動態(tài)進行檢測與預警，但不能對病菌致病特性與發(fā)生趨勢進行檢測與預警。 研究標明疫霉菌-寄主互作過程中常分泌多種重要的細胞壁降解酶，主要包括多聚半乳糖醛 酸酶(,g)、果膠甲基酯酶(,辺e)、果膠裂解酶(A/)，它們主要通過降解或軟化植物細胞壁 的主要成分果膠、中膠層'及果膠聚合體，而促使病菌的侵入與定植，對寄主產生寄生與致 病性。該類致病酶是均由多基因編碼，其中少數(shù)關鍵基因是重要的致病靶基因，因此分離 鑒定這些重要致病酶的靶標基因，利用基因信息學設計并合成靶標基因的特異引物，針對 病菌不同時期的致病特性進行分子檢測與預警，以便在病菌初侵染期適時釆取綜合防控措 施，減少藥劑使用次數(shù)與使用量，阻斷病菌的擴展與蔓延，控制病害的發(fā)生與蔓延。因此， 開展重要疫霉菌致病酶類靶標基因克隆及其特異引物設計與合成，研制病菌分子檢測、預 警技術及其試劑盒，對重要疫霉病的綜合防控具有重要的理論與實踐意義。本發(fā)明以辣椒 疫霉為參試材料，通過解析辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶基因簇成員組成，將Pdpg5界定為 乾標致病基因，設計并合成尸dpg5基因的特異引物，驗證其特異性和靈敏度，借助PCR技 術對辣椒疫霉活動動態(tài)及致病特性進行定性、定量分子檢測與預警。在本發(fā)明申請之前， 從世界范圍內除利用辣椒疫霉rDNA/ITS序列特異引物對該病菌進行分子檢測外，無任何利用重要致病酶類的靶標基因特異引物對辣椒疫霉消長動態(tài)進行分子檢測與病情預警的資料
寸§ I 。

發(fā)明內容
1、 在界定辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶靶標致病基因帥《r的基礎上,通過基因tr
息比對，本發(fā)明設計并合成了尸c/;^ 5基因的一對特異性引物，提供了利用該對特異引物 對辣椒疫霉消長動態(tài)及致病特性進行定性、定量分子檢測的操作技術。先對所有參試種菌 進行PCR特異性擴增，驗證其特異性，然后對土壤卵孢子和游動孢子進行定量分子檢測， 進一步驗證其靈敏度，證明了該對引物可對不同時期的辣椒疫霉進行定性、定量分子檢測。 在此基礎上，利用PCR檢測技術對辣椒病田土壤、辣椒疫病組織(病莖、病葉、病果)疫 霉菌進行定性、定量分子檢測。因此，利用該對引物可對辣椒疫霉初侵染源及其侵染過程 的各個時期病菌消長動態(tài)進行檢測與預警，本技術發(fā)明的應用推廣，便于選擇最佳有效防
控時期，降低了病害防控成本，實施綜合防控與高效治理。
本發(fā)明所提供的多聚半乳糖醛酸酶尸";pg5基因的一對特異性引物，上游引物為尸dpg5-F， 含21bp,其序列如SeqlDNo:2所示；下游引物為尸";pg5-R,含24bp，其序列如Seq ID No:3所 示，該對引物擴增目的基因片段長度為357bp。該對引物序列與JGI中的jgi/phycaf7/20609中
適宜對疫霉菌進行分子檢測的引物序列比對，未發(fā)現(xiàn)一個與其完全相同序列的引物，因此是 一對新的辣椒疫霉分子檢測與預警引物。
2、 本發(fā)明為了證明該對引物的特異性，提供了利用該對引物對若干參試種菌PCR擴增 的結果及其特異性驗證技術方法。
3、 本發(fā)明為了驗證該對引物的靈敏度，提供了利用該對引物定量檢測土壤辣椒疫霉卵 孢子和游動孢子的技術方法。
4、 本發(fā)明提供了利用該對引物對辣椒疫病組織(病莖、病果和病葉)中辣椒疫霉進行 分子檢測的技術方法，進一步證明了該對特異引物對辣椒疫霉分子檢測與預警的效果。
5、 本發(fā)明提供了利用該對特異引物對病田土壤、病莖、病果、病葉中的辣椒疫霉分子 檢測技術方法，利用本技術發(fā)明可適時預測辣椒疫霉病疫情發(fā)展趨勢。
6、 本發(fā)明用于設計合成的特異引物的靶標基因尸ci/^ 5的宿主載體為pUC19。
具體操作步驟
1、 從辣椒疫霉菌中分離克隆尸g基因和靶標A力^ 5基因界定的具體步驟省略
因辣椒疫霉菌尸g基因分離克隆和/^//^ 5被界定為靶標基因的具體步驟已在前一個發(fā) 明專利申請中詳述，故在本發(fā)明中不再加一詳述，其尸c々^5基因全序列如S叫IDNo:l所示。
2、 靶標P"/^ 5基因特異引物設計與合成
(l)引物設計利用DNAMAN對辣椒疫霉等疫霉種菌，曲霉等真菌，番茄等植物，胡蘿卜歐 式桿菌等細菌及其他能征集到的所有多聚半乳糖醛酸酶基因序列進行比對，設計,c//^ 5基因的特異性引物，其上游引物為,"/^ 5-F，含21bp;下游引物為,c/;^ 5-R,含24bp,擴增基 因片段長度為357bp。
(2)引物合成將設計合成的引物發(fā)給上海博尚生物公司或上海鼎安生物公司，由生物 公司合成寄回后，直接應用。
3、乾標戶";^ 5基因特異性引物驗證步驟
(1) 參試種菌制作與菌體收集。
(2) 參試菌體DNA提取。
(3) 靶標戶c/;^ 5基因特異性引物對參試種菌DNA進行PCR擴增。
(4) 擴增結果的比較分析。
通過對所有參試種菌DNA的PCR擴增，結合擴增片段的有無情況，驗證該對引物的特異 性，其具體操作技術方法在具體實施方式
中詳細描述。
4、 靶標尸c/;^ 5基因特異性引物靈敏度驗證步驟
(1) 辣椒疫霉菌游動孢子DNA提取。
(2) 土壤卵孢子DNA提取及純化。
(3) 分別利用入選特異性引物進行PCR擴增。
(4) 綜合比較分析PCR檢測結果，檢驗入選引物的靈敏度。
本技術操作屬常規(guī)的分子生物學技術方法，具體操作過程在后續(xù)的具體實施方式
中加以 詳述。
5、 入選特異性引物對辣椒疫病組織(病莖、病果、病葉)分子檢測步驟
(1) 辣椒疫病組織(發(fā)病莖組織、葉片、果實)的DNA提取。
(2) 分別利用入選特異性引物進行PCR擴增。
(3) 綜合比較不同病組織PCR檢測結果，確定入選引物對辣椒疫病組織的檢測技術。 本技術操作過程采用的是常規(guī)分子生物學實驗技術方法，具體過程在后續(xù)的具體實施方
式中加以詳述。
6、 特異引物對病田土壤、病莖、病果、病葉中的辣椒疫霉分子檢測步驟
為了進一步證明本發(fā)明設計合成的靶標尸c々^ 5基因特異引物對辣椒疫霉的檢測效果， 本發(fā)明提供了該對特異引物對病田土壤、病莖、病果、病葉中的辣椒疫霉分子檢測技術， 具體操作步驟
(1) 分別提取辣椒疫霉病病田土壤菌體、病莖、病果、病葉的總DNA。
(2) 以不同來源的DNA為模板，利用入選特異引物進行PCR擴增，對不同來源的辣椒疫 霉菌進行PCR擴增。
(3) 綜合比較不同來源的辣椒疫霉PCR檢測結果，正確預警辣椒疫霉消長動態(tài)和疫情發(fā) 展趨勢。
綜合上述檢測結果，本發(fā)明所提供的辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶Pdpg 5靶標基因的一 對特異性引物能對不同時期的辣椒疫霉進行定性、定量檢測與預警，為對辣椒疫霉進行適時綜合防控與高效治理提供了方便易行的操作技術。


圖L靶標,c//^ 5基因特異引物對不同參試種菌DNA的PCR擴贈結果示意圖
圖中1:標準DNA; 2:陰性對照水；3-7:辣椒疫霉；8:大豆疫霉；9:寄生疫霉；10:致 病疫霉；11:樟疫霉；12:掘氏疫霉；13:棕櫚疫霉；14:熱帶疫霉；15:苧麻疫霉；16: 惡疫霉；17:苜蓿疫霉；18:芋疫霉；19:標準DNA; 20:隱地疫霉；21:豌豆疫霉；22: 草莓疫霉；23:大雄疫霉；24:菜豆疫霉；25:蔥疫霉；26:冬生疫霉；27:瓜果腐霉； 28:水霉；29:甘薯根霉；30:立枯絲核；31:串珠鐮刀菌；32:腐皮鐮孢菌；33:茄鏈 格孢；34:青霉菌；35:淡黃曲霉。
結果顯示來自靶標基因尸d;^ 5的一對特異引物對辣椒疫霉具特異的檢測效果，進一步 說明尸dpg5基因是辣椒疫霉,《基因霧成員中的一個新基因。
圖2.靶標&//^ 5基因特異引物PCR擴增不同濃度游動孢子DM示意圖
圖中1:標準DNA; 2:陰性對照水；3:陽性對照辣椒疫霉DNA; 4-15:來自不同體積的游 動孢子DNA 0. 5， 1. 0， 1. 5， 2. 0， 2. 5, 3. 0， 3. 5， 4. 0， 4. 5， 5. 0， 5. 5， 6. 0〃L ( 7個游動孢子/〃L )。
結果顯示該對特異引物對不同濃度的游動孢子具明顯的檢測效果，而且隨著游動孢子濃 度的增加，PCR擴增產物呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢，致使檢測游動孢子的精度最低可達3.5個 /〃L。
圖3.靶標戶"7^ 5基因特異引物PCR擴增土壤中卵孢子DNA示意圖
圖中1:標準DM; 2:陰性對照水；3:陽性對照辣椒疫霉DM; 4-11:來自含不同數(shù)量的 卵孢子土壤DNA 20,10,1. 0, 0. 5, 0. 2, 0. 1， 0. 05， 0. 01個卵孢子/克土壤。DNA模板最低檢測 量分別為10-5ng/;/L和0. 05個卵孢子/克土壤。
結果顯示該對特異引物對土壤中的卵孢子具明顯的檢測效果，而且隨著卵孢子數(shù)量的增 加，PCR擴增產物呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢，致使檢測卵孢子的精度最低可達0.05個卵孢子/ 克土壤。
圖2和圖3檢測結果，驗證了該對特異引物對辣椒疫霉具很高的檢測靈敏度，近而可對
辣椒疫霉進行定性、定量分子檢測。
圖4.靶標Pc//^ 5基因特異引物對不同辣椒疫病組織DNA PCR擴增結果示意圖
圖中1:標準DNA; 2-3:陰性對照水和健康辣椒組織DNA; 4:辣椒疫霉DNA陽性對照；5-7: 來自不同辣椒疫病組織的DNA:病莖、病果、病葉(分別取0. 25//L病組織DNA)?？梢娫搶?br> 特異引物對不同辣椒疫霉病組織中的辣椒疫霉具明顯的檢測效果。
圖5.靶標,"/W 5基因特異引物對不同辣椒疫病材料PCR擴增結果示意圖 圖中1:標準DNA; 2-3:無菌水和健康辣椒組織DNA; 4:辣椒疫霉菌絲體DNA; 5:病莖組
織DNA; 6:病果組織DNA; 7:病葉組織DNA; 8:人工接種卵孢子的土壤菌體DNA; 9:含
有卵孢子的病田土壤菌體DNA (分別取O. 25^L DNA)。結果顯示利用本技術發(fā)明，可對不同辣椒疫病材料進行定性、定量分子檢測，應用該技 術可準確預測辣椒疫霉消長動態(tài)和疫情發(fā)展趨勢，便于及時確定病害最佳防控時期，特別 是在病菌早期活動時期適時進行綜合防控和治理，如根據對土壤中卵孢子檢測的有無、多 少及繁殖速度,適時處理土壤，ffiff源頭病齒的繁殖與蔓延,達到髙效治理的目的。
具體實施例方式
本發(fā)明所提供的實施例，均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(New York: Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，或Draper, J等(Blackwell科 學出版社，1988 ),鄭小波(疫霉菌及其研究技術，中國農業(yè)出版社，1997 )所述的搡作技 術規(guī)程，或按照制造廠商所建議的實驗條件。 實施l:靶標戶c/》《5基因特異引物設計與合成
(1) 特異引物設計利用DNAMAN對已知的辣椒疫霉，大豆疫霉，橡膠疫霉等卵菌，曲霉、 鏈格孢菌等真菌，番茄、桃、檸檬等多種植物，及所能查到的所有的多聚半乳糖醛酸酶基因 進行比對，設計戶c//^5的特異性引物，,c々^5-F,尸c々^5-R,擴贈片段長度357bp。尸c/^5-F 5， -ACGGGCGCTAACATCAAGATC-3， 21bp, ,c//^5-R 5， -GATATGGTTGTTCTTAGTCAGGTC-3， 24bp。
(2) 引物合成將設計合成的引物發(fā)給上海博尚生物公司或上海鼎安生物公司，由生物公 司合成寄回后，直接應用。
實施2:特異性引物的驗證技術步驟與方法
1) 供試種菌及其培養(yǎng)制作
供試辣椒疫霉(P o /w/d )(山東)、大豆疫霉(Pso/ae)(吉林)、寄生疫霉(/^flraw'ric) (云南)、致病疫霉(P z'w/eWfl w )、樟疫霉(P d朋a/nomz' X CBS提供)、掘氏疫霉(P ^ec/w/e〃') (CBS提供)、棕櫚疫霉(P /w/附ivom ) ( CBS提供)、熱帶疫霉(i frop/aifo ) ( CBS提供)、 苧麻疫霉toe/i證^ )(福建)、惡疫霉(P ca加畫)(CBS提供)、苜蓿疫霉(陜西)、 芋疫霉(P coZocasz'fle )(廣東)、隱地疫霉(f! ayptogea) (CBS)、豌豆疫霉(f! eo^rosepricfl) (云南)、草莓疫霉(^ #aga/v'fle)(山東)、大雄疫霉(P ,wegfl^e/7nfl) (ATCC)、菜豆疫霉(P /7/w化oZzO (山東)、蔥疫霉;wt!')、冬生疫霉(/J /u7 emflfo )( CBS119904 )、瓜果腐霉(fy/^w ap/^"Hewwto/n )(山東)、水霉(& /7ra/egm'fl sp.)(山東)分別用V8培養(yǎng)基(培養(yǎng)基的制 作參照方中達，植病研究方法，1998)。甘薯根霉(i /iz'zo;w^6fltotos)(山東)、立枯絲核菌 (i /i&octo/H'fl soZam')(山東)、串珠鐮刀菌(jFksflrZM附附om7!7"oA7ne)(山東)、腐皮鐮孢菌(E so/am〕(山東)、茶鏈格孢M/ter膠!'" so/am')、青霉菌(Pem'dffiw/w sp.)(山東)及淡黃曲霉 (J^e/^Z^ CKA/je^)(山東)均用馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)(培養(yǎng)基制作參照方中達， 植病研究方法，1998)。辣椒疫霉游動孢子懸浮液和卵孢子制備及記述方法參考鄭小波(1997 ) 描述的方法。
2) 菌體培養(yǎng)與收集
供試疫霉菌移至燕麥平板培養(yǎng)基上，于25'C生化培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2-3d后，從菌落邊緣切 取菌塊，轉至V8培養(yǎng)基，而其它參試真菌移至PDA培養(yǎng)基上，所有參試種菌均25"C震蕩 培養(yǎng)5-7d,無菌紗布過濾，經冷凍抽干研制成粉，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 73)參試種菌菌絲體DNA提取
采用CTAB法或改良CTAB法，提取的DNA于-20。C保存?zhèn)溆茫⒎謩e取( 50ng/^L) 作為模板進行PCR擴增。
4 )特異引物對參試種菌DM的PCR擴增技術方法
PCR反應體系為10xPCR緩沖液5^L，模板DNA (50ng) 2 〃L,引物尸c/pg 5-F和尸a》g 5-R 各1;iL, dNTP (2.5mmol/L) 4#L， MgCL2 (25mmol/L) 4 ^L， TaqE0.5/^L, ddH20 ( 32.5/^L )。
PCR檢測程序為95。C預變性4min; 94。C變性lmin, 50°C 30s, 72。Clmin, 35個循環(huán)； 最后72。C延伸10 min。取1QuLPCR擴增產物用1.5%的TBE膠檢觀"用DL2000 DNA Marker 作對照。電.泳結東后，用Bio Imaging System Gene Cenius LP-400全自動凝膠成像系統(tǒng)觀察 結果并掃描于計算機軟件中保存。 實施3:特異引物靈敏度驗證技術方法
1) 辣椒疫霉游動孢子DNA提取
取5(^L無菌水中加入350個游動孢子(顯微鏡下直接記述)，加O. 05g石英砂，在渦旋 器上劇烈震蕩3min,稍離心，上清液即為游動孢子的DNA粗提液，分別取0. 5-l(^L上清 液直接作為PCR擴增模板。
2) 土壤卵孢子DM提取及純化
參照Zhu等(Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62:316-322)報道的方法(稍微 改進)。分別取含有20, 10, 5.0, 2.0,1.0，0.05，0.01個卵孢子/lg土壤放入5mL滅菌離心管 中，加入適量石英砂，劇烈振蕩lmin。然后加2mLNa3PO4緩沖液(0.12mol/L,PH8.0),于30°C 振蕩15 min (160rpm/min)， 10000rpm/min離心10 min后,棄上清。向沉淀中力口入3mLDNA 提取液(100mmol/LTris-HCI， 100mmol/LEDTA， 100mmol/LNa3PO4, 20mol/LNaCI， 1%CTAB， pH 8.0)、 30;wL蛋白酶K (10mg/mL)和0.5mL溶菌酶(50mg/mL)，于37。C振蕩20min (225 rpm/min)，隨后加入0.4mL 20% SDS,置65。C水洛1.5h,經2-3次冷凍處理后，室溫條件下 6000 rpm/min離心10min,收集上清，加入等體積酚氯仿異戊醇，12000 rpm/min離心10min。 在上清中加0.6倍體積異丙醇，4'C沉淀lh,室溫條件下14000rpm/min離心15min,收集核 酸沉淀，經70%乙醇漂洗2-3次，風干后，加100//L無菌水溶解DNA備用，純化方法采 用DNA凝膠回收純化法。
3) 特異引物對辣椒疫霉游動孢子DNA PCR擴增技術方法 PCR反應體系、PCR檢測程序及凝膠成像觀察同上，省略。
4) 特異引物對土壤卵孢子DNA PCR擴增技術方法 PCR反應體系、PCR檢測程序及凝膠成像觀察同上，省略。
實施4:特異引物對不同病組織DNA PCR檢測技術方法 l)辣椒疫病組織病莖、病葉、病果DM提取
將供試辣椒疫霉轉至V8固體平板中，25'C黑暗培養(yǎng)2-3d后，用打空氣從菌落邊緣取菌 落塊(2mmx2mm),創(chuàng)傷接種于辣椒幼苗(7-9片葉)莖基部、同一個辣椒品種的果實，同樣大小的菌塊微傷口接種于辣椒葉片，然后分別切取不同發(fā)病組織，參考Wang等(Nucleic Acids Research, 1993， 21: 4153-4154 )的NaOH法(稍加改進)提取病組織的DNA:分別取 一段適量的病莖、病果、病葉，1 mg病組織加入10^L0.5mol/LNaOH,充分研磨后轉至1.5mL 的eppendorf離心管中，10000 rpm離心5 min,取5〃L上清液加入495〃L0.1mmol/LTris (PH 8.0)，混均后取1;/L直接用于PCR擴增，用本方法提取的健康辣椒莖、果實、葉片的混合 DNA為空白對照。
2)特異引物對不同辣椒疫病組織DNA PCR擴增技術方法
PCR反應體系、PCR檢測程序及凝膠成像觀察同上，省略。 實施5:特異性引物對不同辣椒疫病材料DNA檢測技術
1) 不同辣椒疫霉病原材料MA提取均按上述方法進行。
2) 特異引物對不同辣椒疫病材料DNA的PCR擴增技術方法 PCR反應體系、PCR檢測程序及凝膠成像觀察同上，省略。序列表
<110>山東農業(yè)大學
<120>辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶？"7^ 5基因序列
<160>2
<210〉1
<211〉1086
<212>腿
<213>辣椒疫霉(Phytophthora capsici)
<220>
<221>CDS
<222>(1) ... (1086)
<400>1
atgaagctcttctccactgtcaccgcagccctcgcgctcctagccaccaccgtcaacgga60
ac3cccatg8tccgtcaggcagaagaagcctcaacctgtaccctctccggcacgtacaag120
tccggcaccgacatctcgtcctgcagcacgctcaccatcggcactctgagcgttcctgcc180
ggtgtcacgctggacctgagcaaggccaagacgggcgctaacatcaagatCtCCggt3CC240
gtcacgttcggccagaagaagtgggCGggtccgctcgtgttgcttggcggcagtaacctc300
aaggtcagcgggtccggtactcttgacggtcaggggtcttggUctggaagcaagggcag360
tcgatcactcgcccagtattcttccgtctcc柳acgtcctcagctcaactgtttctgga420
tttactattaagaacatgccgttccgUccUcagcattgtcacctgcaagg汪tacgaca480
ctgtcgggacUacgatcgactcgagcgctggc雄ggcctggccagaacacag汪cggc540
ttcgacctgactaagaacaaccatatcacgatcaccggcaacaagatctacaaccaggat600
gactgtttggcaatgcagtccagtacgaacaccgtattcagcaacaactaCtgC3gtggC660
ggtcacggUtctccatcggatcgctcggtgg纖cgctgtcaaccaaggttccacggtc720
cagggcctcacggtcaaggggtcaatagcaccaacggcctccgcatcaag780
acc"cgtggatctcaagggtcttgtgtctgatgtcacgt3caccgac3acaagctgagc840
aacgtcaagaacgccatcgtgatccactcggactacagcaagtccaagggcggatacacc900
ggtaaggccacgagcgcagtgaccatcaaggacatcaccgtctcgggtctctcaggtacg960
gcgacc￡ucctgtacg8C"cgtggcca3Ctccaaggtggtgtccaactggngttctcg1020
ggcatcactgtca柳catcC3，CgggCngtgcagcggtcaacccagcactgtcaag1080
tgctaa1086
<210>2 <211>21 <212>腿 <213>人工序列
10acgggcgcta acatcaagat c 21
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213〉人工序列
<400>3
gacctgacU agaacaacca tatc
權利要求
1.利用辣(甜)椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶Pcipg 5基因設計并合成了一對特異引物，通過PCR技術驗證其特異性和靈敏度，然后對辣椒病田土壤、病莖、病葉及病果中的辣椒疫霉進行定性、定量分子檢測與預警。本技術發(fā)明可對不同時期的辣椒疫霉及其致病特性進行準確檢測與預警。這對特異性引物，上游引物為Pcipg 5-F，含21bp，其序列為Seq ID No2所示；下游引物為Pcipg 5-R，含24bp，其序列為Seq ID No3所示。該對特異引物擴增目的基因片段長度為357bp。
2. —種辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶A:/;^5基因分子檢測技術的制備方法，其步驟如下1) 從辣椒疫霉中分離克隆尸dpg基因和靶標^c力^ 5基因界定的具體步驟省略 基因分離克隆和靶標基因界定步驟已在前一發(fā)明專利中詳述，故在本發(fā)明中不再詳述，其5基因全序列如Seq ID No:l所示。2) A;/;^ 5基因特異引物設計與合成(l)引物設計利用DNAMAN對辣椒疫霉等疫霉種菌，曲霉等真菌，番茄等植物，胡蘿卜 歐式桿菌等細菌及其他能征集到的所有多聚半乳糖醛酸酶基因序列進行比對，設計并合成 ,c/;^ 5基因的特異性引物。2)戶c/;^ 5基因特異性引物驗證(1) 參試種菌制作與菌體收集；(2) 參試種菌DNA提??；(3) 特異性引物對參試種菌DNA的PCR擴增；(4) 擴增結果比較分析。3) 戶"'pg 5基因特異引物靈敏度驗證(1) 辣椒疫霉菌游動孢子DNA提取。(2) 土壤卵孢子DNA提取及純化。(3) 分別進行PCR擴增。(4) 綜合比較分析，檢驗入選引物的靈敏度。4) 入選特異引物對辣椒疫病莖、病果、病葉檢測(1) 病莖、病葉、病果的DNA提取。(2) 入選特異引物對不同模板DNA進行PCR擴增。(3) 綜合比較不同病組織PCR檢測結果，確定入選引物對辣椒疫病組織的檢測技術。5) 、入選引物對病田土壤、病莖、病果、病葉辣椒疫霉菌的分子檢測(1)分別提取辣椒疫霉病田土壤菌體、病莖、病果、病葉DNA。 (2 )對不同模板的DNA進行PCR擴增，比較對不同來源辣椒疫霉菌的檢測效果。 (3)綜合比較入選特異引物對不同來源辣椒疫霉菌的PCR檢測結果，正確預警辣椒疫 霉菌消長動態(tài)和疫情發(fā)展趨勢。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學領域，利用辣(甜)椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶Pcipg 5基因設計并合成了一對特異引物，通過PCR對多個參試種菌進行特異性驗證，然后對土壤辣椒疫霉卵孢子和游動孢子進行定量分子檢測，驗證其靈敏度，在此基礎上，對辣椒病田土壤、病莖、病葉及病果中的辣椒疫霉菌進行定性、定量分子檢測與預警。應用該技術發(fā)明可對不同時期的辣椒疫霉菌及其致病特性進行檢測與預警，便于制定綜合防控技術策略，確定選擇最佳防控時期對辣椒疫霉菌進行綜合防控和高效治理，真正從源頭上控制病菌的侵染與危害，提高辣(甜)椒疫霉病綜合防控的效果。
文檔編號C12Q1/68GK101643782SQ200910018358
公開日2010年2月10日 申請日期2009年9月10日 優(yōu)先權日2009年9月10日
發(fā)明者張修國 申請人:山東農業(yè)大學