專利名稱：耐灰葉斑病玉米及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐灰葉斑病(GLS)玉米植物以及生產(chǎn)該種植物的方法。更具體地講， 本發(fā)明涉及能夠引起玉米GLS耐受性的可確認(rèn)的遺傳物質(zhì)，以及該遺傳物質(zhì)基因滲入到玉 米植株中的現(xiàn)象。此外，本發(fā)明涉及來自一個(gè)或多個(gè)親本植物的期望遺傳物質(zhì)以一定的速 度、精密度、和準(zhǔn)確度滲入到子代植物中的現(xiàn)象。
背景技術(shù)：
從歷史上看，玉米是一種具有食物、飼料和工業(yè)用途的重要作物。影響玉米的任何 環(huán)境脅迫因素如病害可對(duì)這些用途的玉米谷物可用性產(chǎn)生影響?；胰~斑病(下文稱為GLS)在過去的三十年中已經(jīng)變成一種突出病害，并且在美國(guó) 和其他主要玉米產(chǎn)地如墨西哥、巴西、歐洲、和南非是一種顯著的葉片病害。GLS的發(fā)病率和 嚴(yán)重性在美國(guó)似乎是漸增的(Wang等人，Phytopathology 88 1269-75 (1998))，這或許是 由于玉米種植增加而耕作減少的原因。這些病癥可能導(dǎo)致真菌越冬以及下一季節(jié)的早期感 染(Laterall 和 Rossi，Plant Dis. 67 :842_37 (1983))。在美國(guó)在 GLS 流行期間已經(jīng)報(bào)道 了超過 50% 的產(chǎn)量損失(Laterall 和 Rossi，同上；Lipps, Plant Dis. 71 :281 (1987))，并 且其中嚴(yán)重流行導(dǎo)致莖倒伏和早衰增加時(shí)預(yù)計(jì)的損失已經(jīng)高達(dá)100% (Laterall和Rossi， 同上)。引起GLS的真菌病原體玉米灰葉斑病菌(Cercospora zeae-maydis)表征性地 生成與葉脈平行的、長(zhǎng)矩形淺灰-棕褐色葉片損傷(Tehon和Daniels，Mycologia 17 240-49(1925) ；Latterell 和 Rossi，同上；Ward 等人，Plant Dis. 83 :884_95 (1999))。損傷 可使部分或全部葉片枯萎并且通常首先出現(xiàn)在較低的葉片中。GLS引起的枯萎與光合作用 區(qū)域的早熟損失關(guān)聯(lián)。開花后玉米植株的主要接收區(qū)是穗，枯萎誘導(dǎo)植物將光合作用產(chǎn)物 以高水平從莖和根轉(zhuǎn)移到穗，因此引起早衰和產(chǎn)量降低。具有GLS耐受性的玉米品種的快速有效的開發(fā)是有益的。在商業(yè)雜交體和自交體 中的GLS耐受性水平隨品種而不同。已經(jīng)報(bào)道了一些表現(xiàn)出強(qiáng)耐受性的品種。然而，使用 表型選擇以將GLS性狀從耐受性品種滲入到易感品種中可能是耗時(shí)的并且是困難的。GLS 對(duì)環(huán)境條件敏感并且需要高濕度和葉片長(zhǎng)期濕潤(rùn)。這種敏感性使得每年僅基于表型來可靠 地選擇 GLS 耐受性變得困難(Lehmensiek 等人，Theor. Appl. Genet. 103 :797_803 (2001))。 特定的病害篩選位點(diǎn)可能操縱起來比較昂貴，并且為了區(qū)分耐受性水平，植物必須生長(zhǎng)至 成熟。與之相反，通過使用與GLS耐受性關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記進(jìn)行選擇具有以下優(yōu)點(diǎn)使得至少 一些選擇僅基于子代的遺傳組合物進(jìn)行。因此，可在植物生命周期非常早的階段測(cè)量GLS 耐受性，甚至在種子階段。通過使用與GLS耐受性性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記提高選擇速率意味 著具有GLS耐受性的植物育種能夠以較快速率發(fā)生，并且能夠較迅速地開發(fā)商業(yè)上可接受的耐GLS植物。發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方案基于與提高GLS耐受性顯著相關(guān)的基因座的精細(xì)作圖，以及將 該知識(shí)應(yīng)用于植物育種。提供了鑒定耐GLS玉米植物的組合物和方法。提供了利用標(biāo)記進(jìn) 行育種以制備耐GLS的玉米植物的方法，以及通過此類方法產(chǎn)生的植物。
實(shí)施方案包括使用改良的供體品種PHJEP作為種質(zhì)來源以將GLS耐受性滲入到玉 米植物及其子代中。所述品種的代表性樣品已經(jīng)作為保藏號(hào)PTA-8851被保藏在美國(guó)典型 培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。一個(gè)方面是命名PHJEP的玉米品種的種子，其中所述玉米品種的代表性樣品已經(jīng) 以保藏號(hào)PTA-8851被保藏，或者得自該種子的子代種子，所述種子包含PHJEP灰葉斑病耐 受性基因座，并且當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)，產(chǎn)生表現(xiàn)出耐灰葉斑病的植物。由PHJEP種子或其子代的種子 產(chǎn)生的植物也是受關(guān)注的，這些植物的細(xì)胞也同樣受關(guān)注。實(shí)施方案也包括得自PHJEP的特定重組染色體區(qū)間，它們與GLS耐受性提高關(guān)聯(lián)， 并且將該染色體區(qū)間基因滲入到其他品種和植物中。一些實(shí)施方案包括將PHJEP的特定單 倍型基因滲入到其他品種和植物中。在一個(gè)方面，子代種子中的PHJEP灰葉斑病耐受性基因座位于PHJEP來源的染色 體區(qū)間上，該區(qū)間包含由UMC1346和UMC1702限定的PHJEP的染色體區(qū)域。在另一方面， 子代種子中的PHJEP灰葉斑病耐受性基因座由單倍型限定，它包含在PHM 00045-01上 的等位基因G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM 15534-13上的等位基因A、在PHM 04694-10上的等位基因G、在PHM 01811-32上的等位基因T、在PHM 01963-15上的等位基 因T、在PHM 01963-22上的等位基因C、在PHM 05013-12上的等位基因T、在PHM 00586-10 上的等位基因T、在PHM 00049-01上的等位基因A。在另一個(gè)方面，PHJEP灰葉斑病耐受性 基因座由單倍型限定，它包含在PHM 00045-01上的等位基因G、在PHM 00043-01上的等 位基因A、在PHM 01963-22上的等位基因C、和在PHM 05013-12上的等位基因T。在其他方面，子代種子是PHJEP灰葉斑病耐受性基因座的回交轉(zhuǎn)化體。由選自 PHVNV, PHW3Y、PHVRA, PHEWB、和PHWRC的輪回親本產(chǎn)生的回交轉(zhuǎn)化體的子代種子也是受關(guān) 注的。在其他方面，子代種子是雜交品種，并且雜交品種的至少一個(gè)自交親本是PHJEP 灰葉斑病耐受性基因座到選自PHVNV、PHW3Y、PHVRA, PHEWB、和PHWRC的輪回親本的回交轉(zhuǎn) 化體。其他實(shí)施方案包括鑒定包含與灰葉斑病耐受性關(guān)聯(lián)的基因座的第一玉米植物的 方法，所述方法包括(a)獲取所述第一玉米植物在染色體4上BNLG1755和UMC1299之間 的染色體區(qū)間的第一遺傳特征圖，(b)從包含與灰葉斑病耐受性關(guān)聯(lián)的基因座的第二玉米 植物獲取第二遺傳特征圖，其中所述基因座位于在染色體4上BNLG1755和UMC1299之間， 和(c)比較所述第一遺傳特征圖和所述第二遺傳特征圖。在另一方面，如果所述第一玉米植物包含與灰葉斑病耐受性關(guān)聯(lián)的基因座，該方 法還包括選擇所述第一玉米植物的方法。此外，第二遺傳特征圖可為PHJEP或PHJEP子代的遺傳特征圖，或者可包含一個(gè)或 多個(gè)標(biāo)記等位基因，所述等位基因選自在PHM00045-01上的等位基因G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM15534-13上的等位基因A、在PHM 04694-10上的等位基因G、在 PHM01811-32上的等位基因T、在PHM 01963-15上的等位基因T、在PHM01963-22上的等 位基因C、在PHM 05013-12上的等位基因T、在PHM00586-10上的等位基因T、以及在PHM 00049-01上的等位基因A。第二遺傳特征圖也可包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記等位基因，所述等位基因選自在PHM 00045-01上的等位基因G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM 01963-22上的等位基 因C、和在PHM 05013-12上的等位基因T。在其他方面，遺傳特征圖能夠被確定為在染色體4上BNLG1755和UMC0371之間 的染色體區(qū)間。此外，與灰葉斑病耐受性關(guān)聯(lián)的基因座可為PHM 15534、PHM 04694、PHM 0181UPHM 01963, PHM 05013、或 PHM 00586。通過所述方法鑒定的玉米植物和那些玉米植物的細(xì)胞及種子也是受關(guān)注的。另一個(gè)實(shí)施方案包括鑒定包含與灰葉斑病耐受性關(guān)聯(lián)的基因座的第一玉米植物 的方法，所述方法包括(a)獲取所述第一玉米植物在染色體4上的染色體區(qū)間的第一遺傳 特征圖，所述區(qū)間由以下序列描述并且包括以下序列SEQ ID NO :86，或基于Clustal V比 對(duì)方法與SEQID NO :86具有95%同一性的核苷酸序列，以及SEQ ID NO :87，或基于Clustal V比對(duì)方法與SEQ ID NO 87具有95%同一性的核苷酸序列，(b)從包含與灰葉斑病耐受性 關(guān)聯(lián)的基因座的第二玉米植物獲取第二遺傳特征圖，其中所述基因座在所述區(qū)間中，以及 (c)比較所述第一遺傳特征圖和所述第二遺傳特征圖。其他實(shí)施方案包括包含以下單倍型的玉米種子在PHM 00045-01上的等位基因 G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM 15534-13上的等位基因A、在PHM 04694-10上 的等位基因G、在PHM 01811-32上的等位基因T、在PHM 01963-15上的等位基因T、在PHM 01963-22上的等位基因C、在PHM 05013-12上的等位基因T、在PHM 00586-10上的等位基 因T、在PHM 00049-01上的等位基因A ；并且玉米種子包含以下單倍型在PHM 00045-01 上的等位基因G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM 01963-22上的等位基因C、和在 PHM05013-12上的等位基因T。由該玉米種子生成的植物也是受關(guān)注的。^X在詳述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)了解本發(fā)明不受特定實(shí)施方案的限制，它當(dāng)然能夠改變。 也應(yīng)當(dāng)了解本文所用的術(shù)語僅是為了描述特定實(shí)施方案，而不旨在進(jìn)行限制。當(dāng)在本說明 書和所附權(quán)利要求中使用時(shí)，除非內(nèi)容清楚地表明，單數(shù)和單數(shù)形式的術(shù)語包括復(fù)數(shù)指代。 因此，例如術(shù)語“一個(gè)植物”也包括多個(gè)植物；也取決于上下文，使用的術(shù)語“植物”也可包 括該植物遺傳相似或相同的子代；使用的術(shù)語“核酸”實(shí)際上任選地包括該核酸分子的多個(gè) 拷貝；同樣地，術(shù)語“探針”任選地(并且通常)包括許多相似或相同的探針分子。除非另外說明，核酸是以5'到3'方向從左往右寫。說明書中所述的數(shù)字范圍包 括限定范圍的端值并且包括在限定范圍內(nèi)的各個(gè)整數(shù)或任何非整數(shù)的分?jǐn)?shù)。除非另外指 明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員一般理解相同的 含義。雖然與本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本發(fā)明的測(cè) 試實(shí)踐，但本文描述了優(yōu)選的材料和方法。在本發(fā)明的描述和權(quán)利要求中，將根據(jù)下文列陳 述的定義使用以下術(shù)語?！爸参铩笨蔀檎麄€(gè)植株、其任何部分、或來源于植物的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物。因此，術(shù)語“植物”可指代以下任何一種材料整個(gè)植株、植物部分或器官(例如葉片、莖、根等)、植 物組織、種子、植物細(xì)胞、和/或子代的相同材料。植物細(xì)胞是從植物中獲取的細(xì)胞或來源 于從植物中所獲取細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)出的細(xì)胞。術(shù)語“玉米植物”包括整個(gè)玉米植株、玉米植物細(xì)胞、玉米植物原生質(zhì)體、能從其中 再生玉米植株的玉米植物細(xì)胞或玉米組織培養(yǎng)物、玉米植物愈傷組織、玉米植物叢生物和 玉米植物中的完整玉米植物細(xì)胞或玉米植物部分，如玉米種子、玉米芯、玉米花、玉米子葉、 玉米葉、玉米莖、玉米芽、玉米根 、玉米根尖等。術(shù)語“玉米”包括玉米(Zea mays)物種的任何成員?！坝衩?maize)”和“玉米 (corn)”本文可互換使用。“種子”是包封在保護(hù)種皮中的小胚體。它是成熟的植物胚珠在授精后生成的產(chǎn) 物?！胺N質(zhì)”指?jìng)€(gè)體(例如一個(gè)植株)、一組個(gè)體(例如一個(gè)植物品系、品種或家族)、或 來源于一個(gè)品系、品種、物種、或培養(yǎng)物的克隆的或從其中得到的遺傳物質(zhì)。種質(zhì)可為生物 或細(xì)胞的部分，或者可從生物或細(xì)胞中分離得到。種質(zhì)通常提供遺傳物質(zhì)與特異性分子構(gòu) 成，該分子構(gòu)成提供生物或細(xì)胞培養(yǎng)物的一些或全部遺傳性狀的物理基礎(chǔ)。如本文所用，種 質(zhì)包括可從中生長(zhǎng)出新植物的細(xì)胞、種子或組織，或者植物部分如葉、莖、花粉、或細(xì)胞，它 們能夠被培養(yǎng)成整個(gè)植株。當(dāng)與植物一起使用時(shí)，“品種”包括植物學(xué)和栽植植物，包括自交體和雜交體，并且 指植物學(xué)分類上已知的最低階層的植物族群，其中該族群可由給定基因型或基因型組合的 特性的表達(dá)來限定。術(shù)語“自交體”指基本上純合的品種。術(shù)語“雜交體”指兩個(gè)遺傳上不同的個(gè)體之間自交產(chǎn)生的任何子代，包括兩個(gè)不同 自交系之間的雜交。術(shù)語“等位基因”指在特定基因座處發(fā)生的兩個(gè)或更多個(gè)不同核苷酸序列的其中一個(gè)。當(dāng)?shù)任换蚺c性狀關(guān)聯(lián)時(shí)，以及當(dāng)存在的等位基因是期望的性狀或性狀形式將發(fā) 生在包含等位基因的植物中的指示時(shí)，等位基因與性狀“關(guān)聯(lián)”?！癇AC”或細(xì)菌人工染色體是來源于大腸桿菌(Escherichia coli)天然存在的F因 子的克隆載體。BAC能夠接受DNA序列的較大插入序列。在玉米中，已經(jīng)將許多BAC或細(xì)菌 人工染色體裝配成重疊群(重疊的鄰接基因片段，或“鄰接DNA”)，它們每個(gè)包含玉米基因 組DNA的較大插入序列?！坝欣任换颉笔窃谔囟ɑ蜃牡任换颍摶蜃x予或有助于產(chǎn)生農(nóng)學(xué)上 期望的表型，例如GLS耐受性，或者作為另外一種選擇是允許鑒定能夠從育種程序或種植 中除去的易感植物的等位基因。標(biāo)記的有利等位基因是分離有利表型的標(biāo)記等位基因，或 者作為另外一種選擇，分離易感植物表型并因此提供鑒定易感病植物的有益效果。染色體 片段的一種有利等位基因形式是包括在位于染色體片段上的一個(gè)或多個(gè)基因座上的核苷 酸序列的染色體片段，所述核苷酸序列有助于產(chǎn)生優(yōu)異的農(nóng)學(xué)性能。“等位基因頻率”指等位基因存在于個(gè)體、品系、或一組品系中的基因座上的頻率 (比例或百分比)。例如，就等位基因“A”而言，基因型“AA”、“Aa”、或“aa”的二倍體個(gè)體
8分別具有1. 0,0. 5、或0. 0的等位基因頻率。人們能夠通過平均化來自品系的個(gè)體樣品的等 位基因頻率來估計(jì)該品系中的等位基因頻率。同樣地，人們能夠通過平均化構(gòu)成種群的品 系的等位基因頻率來計(jì)算該種群品系中的等位基因頻率。就一組限定數(shù)目的個(gè)體或品系而 言，可將所有等位基因頻率表示為包含等位基因的個(gè)體或品系(或任何其他指定組)的計(jì) 數(shù)。當(dāng)?shù)任换蚺c性狀關(guān)聯(lián)時(shí)，以及當(dāng)存在的等位基因是期望的性狀或性狀形式將發(fā) 生在包含等位基因的植物中的指示時(shí)，等位基因與性狀“正”相關(guān)。當(dāng)?shù)任换蚺c性狀關(guān)聯(lián) 時(shí)，以及當(dāng)存在的等位基因是期望的性狀或性狀形式將不發(fā)生在包含等位基因的植物中的 指示時(shí)，等位基因與性狀“負(fù)”相關(guān)。假如個(gè)體在等位基因僅有一種類型的等位基因(例如二倍體個(gè)體在兩個(gè)同源染 色體中的每一個(gè)的基因座上具有一拷貝的相同等位基因)，則該個(gè)體是“純合的”。假如一種以上的等位基因類型存在于給定基因座上(例如二倍體個(gè)體具有兩個(gè) 不同等位基因中的每一個(gè)的一個(gè)拷貝)，則該個(gè)體是“雜合的”。雜合情況的一種特殊情況是其中一個(gè)染色體具有一個(gè)基因的等位基因而其他染 色體完全缺乏該基因、基因座、或區(qū)域一換句話說，具有相對(duì)于第一染色體的缺失。這種情 況稱為“半合子的”。術(shù)語“同質(zhì)”指一組成員在一個(gè)或多個(gè)特定基因座上具有相同基因型。與之相反， 術(shù)語“異質(zhì)”用于指明一組內(nèi)的個(gè)體在一個(gè)或多個(gè)特定基因座上基因型不同。“基因座”是多態(tài)核酸、性狀決定子、基因、或標(biāo)記所在的染色體區(qū)域。因此，例如 “基因座”是物種基因組中的特定染色體位置，其中能夠發(fā)現(xiàn)特定基因。與GLS耐受性關(guān)聯(lián) 的基因座指示與表型可計(jì)量的GLS耐受性直接相關(guān)的基因組上的區(qū)域?！斑z傳互補(bǔ)序列”具有至少一套或倍數(shù)性等位基因。例如，單交種雜合體繼承兩個(gè) 遺傳互補(bǔ)序列，各來自每個(gè)自交親本。術(shù)語“數(shù)量性狀基因座”或“QTL”指在至少一種遺傳背景下(例如在至少一個(gè)育種 種群或子代中)，具有與表型性狀的差異表達(dá)關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)等位基因的多態(tài)基因座。QTL 能夠通過單基因機(jī)制或多基因機(jī)制發(fā)揮作用。術(shù)語“標(biāo)記”、“分子標(biāo)記”、“標(biāo)記核酸”、和“標(biāo)記座位”指核苷酸序列或其編碼的產(chǎn) 物(例如蛋白)，當(dāng)鑒定關(guān)聯(lián)的基因座它們時(shí)用作參考點(diǎn)。標(biāo)記能夠來源于基因組核苷酸序 列或表達(dá)的核苷酸序列(例如來源于剪接的RNA或cDNA)，或來源于編碼的多肽。該術(shù)語 也指與標(biāo)記序列互補(bǔ)或側(cè)接標(biāo)記序列的核酸序列，如用作探針或能夠擴(kuò)增標(biāo)記序列的引物 對(duì)的核酸。很多玉米分子標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的，并且被公布于或得自多個(gè)來源，例如Maize GDB 因特網(wǎng)資源和 University ofArizona 運(yùn)營(yíng)的 Arizona Genomics Institute 因特網(wǎng)資 源。同樣地，已經(jīng)建立了用于檢測(cè)分子標(biāo)記的多種方法。“多態(tài)性，，是DNA中的變異，這種現(xiàn)象太過普遍以至于不僅僅是由于新的突變而產(chǎn) 生(即種群中的發(fā)生頻率為至少)。在子代中分離的任何差異繼承的多態(tài)性狀(包括 核酸多態(tài)性)是潛在的標(biāo)記?；蚪M可變性可為任何一種起源，例如插入、缺失、復(fù)制、重復(fù) 元件、點(diǎn)突變、重組事件、或轉(zhuǎn)座因子的存在和序列?！皹?biāo)記探針”是可用于鑒定標(biāo)記座位存在與否的核酸序列或分子，例如與標(biāo)記座位 序列互補(bǔ)的核酸分子探針。作為另外一種選擇，在某些方面分子探針指能夠區(qū)別(即基因型)存在于標(biāo)記座位上的特定等位基因的任何類型的探針。當(dāng)核酸在溶液中特異性雜交 時(shí)，例如根據(jù)Watson-Crick堿基配對(duì)原則雜交，核酸是“互補(bǔ)的”?！皹?biāo)記座位”是可用于追蹤存在的第二連接基因座的基因座，例如編碼或有助于表 達(dá)表型性狀的連接基因座。例如標(biāo)記座位能夠用于監(jiān)控等位基因在某一基因座的分離，如 QTL,它們與標(biāo)記座位在遺傳上或在物理上連鎖?！皹?biāo)記等位基因”或者“標(biāo)記座位的等位基因”是種群中位于標(biāo)記座位的多個(gè)多態(tài) 性核苷酸序列的其中一個(gè)，它就標(biāo)記座位而言是多態(tài)的。在某些方面，本發(fā)明提供與玉米 GLS耐受性關(guān)聯(lián)的標(biāo)記座位。期望每個(gè)鑒定的標(biāo)記與有助于產(chǎn)生GLS耐受性的遺傳元件如 QTL在物理上和遺傳上相近(導(dǎo)致物理和/或遺傳連鎖)?！斑z傳標(biāo)記”是種群中的多態(tài)核酸，并且其中可通過一種或多種分析方法檢測(cè)并區(qū) 分出它們的等位基因，例如RFLP、AFLP、同功酶、SNP、SSR等。該術(shù)語也指與基因組序列互 補(bǔ)的核酸序列，如用作探針的核酸。術(shù)語“遺傳標(biāo)記”可指任何類型的核酸基的標(biāo)記，包括 但不限于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment LengthPolymorphism, RFLP)、 簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, CAPS) (Rafalski 和 Tingey，1993，Trends in Genetics 9 :275_280)、擴(kuò)增片段
(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) (Vos ^A, 1995, Nucleic Acids Res. 23 :4407_4414)、單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotide Polymorphism, SNP) (Brookes, 1999, Gene 234 :177-186)、序列特異性擴(kuò)增區(qū)域(Sequence Characterized Amplified Region, SCAR)(Paran 禾口 Michelmore，1993， Theor. App1. Genet. 85 :985_993)、 序列標(biāo)簽位點(diǎn)(Sequence Tagged Site, STS) (Onozaki 等人，2004，Euphytical38 255-262)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Stranded ConformationPo 1 ymorphism, SSCP) (Orita 等人，1989，Proc Natl Acad Sci USA86 :2766_2770)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(Inter-Simple Sequence Repeat, I SSR) (Blair 等人，1999，Theor. App 1. Genet. 98 :780_792)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座 TitL ^ ?！纜^^ti (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism, IRAP) 轉(zhuǎn)座子微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性(Retrotransposon-MicrosatelliteAmplified Polymorphism, REMAP) (Kalendar 等人，1999，Theor. App 1. Genet. 98 :704_711)、RNA 裂解產(chǎn)物(如 Lynx 標(biāo) 記)等。術(shù)語“插入缺失(indel) ”指插入或缺失，其中可將一個(gè)品系相對(duì)于第二品系稱為 插入，或者可將第二品系相對(duì)于第一品系稱為具有缺失。對(duì)應(yīng)于種群成員之間的遺傳多態(tài)性的標(biāo)記能夠通過本領(lǐng)域已建立的方法進(jìn)行 檢測(cè)。這些方法包括例如基于PCR的序列特異性擴(kuò)增方法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè) (RFLP)、同功酶標(biāo)記檢測(cè)、通過等位基因特異性雜交(ASH)進(jìn)行的多核苷酸多態(tài)性檢測(cè)、 植物基因組的擴(kuò)增可變序列檢測(cè)、自主序列復(fù)制檢測(cè)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列檢測(cè)(SSR)、單核苷酸 多態(tài)性檢測(cè)(SNP)、或擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)(AFLP)。已經(jīng)建立的方法也已知用于檢 測(cè)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)和來源于EST序列的SSR標(biāo)記以及隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)。 經(jīng)由酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)對(duì)基因繪圖的方法也是為人們熟知的(參見例如 Konieczny&Ausubel, Plant J. 4 :403_10(1993))?！皹?biāo)記輔助選擇”(或MAS)是一種基于標(biāo)記基因型進(jìn)行表型選擇的方法。
“標(biāo)記輔助反選擇”是一種通過它將標(biāo)記基因型用于鑒定植物的方法，所述植物將 不被選擇，使得它們被從育種程序或種植中去除?！皡⒈刃蛄小笔怯米餍蛄斜葘?duì)基準(zhǔn)的限定序列。參比序列通過對(duì)基因座上的多個(gè)品 系進(jìn)行基因分型、以序列比對(duì)程序進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)(例如Sequencher)、然后獲取比對(duì) 的共有序列來獲取?！盎驁D譜”是對(duì)給定物種中一個(gè)或多個(gè)染色體(或連鎖群)上的基因座間的基因 連鎖關(guān)系的描述，一般以圖表或表格形式描述。該基因座是遺傳界標(biāo)或標(biāo)記，并且就每個(gè)基 因圖譜而言，標(biāo)記間的距離通過它們之間的重組頻率來測(cè)量。基因圖譜是作圖的種群、使用 的標(biāo)記的類型、以及不同種群間各個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性潛力的產(chǎn)物。一個(gè)基因圖譜與另一個(gè)基 因圖譜在基因座之間的順序和遺傳距離可能不同。例如，在內(nèi)部來源的基因圖譜上(本文 也將Pioneer Hi-Bred稱為“PHB”)的IOcM大概等同于在IBM2 2005 neighbors框圖譜 (在玉米⑶B上可用的高分辨率圖譜)上的25-30cM。然而，使用常見標(biāo)記的通用框能夠?qū)?一個(gè)圖譜與另一個(gè)圖譜的信息關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可使用常見標(biāo)記的框架來鑒定 在各個(gè)個(gè)體基因圖譜上的標(biāo)記位置和受關(guān)注的其他基因座?！盎蜃鲌D”是限定基因座的連鎖關(guān)系的方法，該方法通過使用遺傳標(biāo)記、標(biāo)記的 種群分離、以及重組頻率的標(biāo)準(zhǔn)遺傳原則進(jìn)行?！盎驁D譜位置”是在相同連鎖群上，相對(duì)于 圍繞的遺傳標(biāo)記在基因圖譜上的位置，其中能夠在給定種群中發(fā)現(xiàn)指定標(biāo)記?；蚪M的“物理圖譜”指絕對(duì)距離(例如在堿基對(duì)或分離和重疊鄰接的基因片段 如重疊群中測(cè)量的距離)。基因組的物理圖譜不考慮物理圖譜上不同點(diǎn)之間的遺傳行為 (例如重組頻率)?！爸亟M”是在減數(shù)分裂期間同源染色體片段的交換，以此重組連鎖的基因；也指此 類交換的產(chǎn)物?！斑z傳重組頻率”是兩個(gè)基因座之間的交換事件(重組)的頻率。在標(biāo)記和/或 減數(shù)分裂后性狀的分離后可觀察到重組頻率?？蓪⑦z傳重組頻率用厘摩(cM)表示，其中一 cM是兩個(gè)遺傳標(biāo)記間的距離，它們顯示的重組頻率(即那兩個(gè)標(biāo)記間每100次細(xì)胞分 裂發(fā)生交換事件一次)?！盎蚪M”指總DNA或整套基因，由染色體或染色體組攜帶。如本文所用，術(shù)語“連鎖”用于描述一個(gè)標(biāo)記座位與另一個(gè)標(biāo)記座位或一些其他基 因座(例如耐受性基因座)“關(guān)聯(lián)”的程度。較接近的兩個(gè)標(biāo)記座位位于相同染色體上，越 是接近，它們將結(jié)合成配子，并且一起出現(xiàn)的頻率將越高；非常接近的標(biāo)記座位基本上不再 分離，因?yàn)樗鼈冎g將出現(xiàn)交換點(diǎn)的可能性非常小。如本文所用，“連鎖平衡”描述其中兩個(gè)標(biāo)記獨(dú)立地分離的情況，即，在子代中隨機(jī) 分離。認(rèn)為顯示連鎖平衡的標(biāo)記不連鎖(無論它們是否位于相同染色體上)。術(shù)語“連鎖不平衡”指基因座或性狀(或者兩者都有)非隨機(jī)地分離。在任一情 況下，連鎖不平衡意味著相關(guān)的基因座沿著一段染色體在物理上足夠接近，以便它們以大 于隨機(jī)(即非隨機(jī))的頻率一起分離(在共分離性狀的情況下，產(chǎn)生該性狀的基因座彼此 足夠接近)。顯示連鎖不平衡的標(biāo)記被認(rèn)為是連鎖的。連鎖不平衡最常見地用量度r2測(cè)量，它通過Hill，W.G.和Robertson，A, Theor. Appl. Genet. 38 =226-231(1968)的公式計(jì)算。當(dāng)r2 = 1時(shí)，兩個(gè)標(biāo)記座位間存在完全的LD，意味著標(biāo)記還未進(jìn)行重組分離并且具有相同的等位基因頻率。r2值大于1/3指示足夠強(qiáng)的 LD 將被用于作圖(Ardlie 等人，Nature Reviews Genetics 3:299-309(2002))。因此，當(dāng) 成對(duì)標(biāo)記座位間的r2值大于或等于0. 33,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、或1. 0時(shí)，等位基因 處于連鎖不平衡。如本文所用，分子標(biāo)記和表型間的連鎖關(guān)系被給定為“概率”或“調(diào)整概率”。概 率值是表型的特定組合和特定標(biāo)記等位基因隨機(jī)性存在或不存在的統(tǒng)計(jì)學(xué)可能性。因此， 概率評(píng)分越低，表型和特性標(biāo)記將共分離的可能性越大。在某些方面，認(rèn)為概率評(píng)分是“顯 著的”或“不顯著的”。在一些實(shí)施方案中，認(rèn)為隨機(jī)分離的概率評(píng)分為0.05 (ρ = 0.05，或 5%的概率)是共分離的顯著性指示。然而，本發(fā)明不受該特定標(biāo)準(zhǔn)的限制，并且可接受的 概率可以是小于50% (ρ = 0. 5)的任何概率。例如，顯著概率可小于0. 25、小于0. 20、小于 0. 15、或小于0. 1。術(shù)語“物理上連鎖”有時(shí)用于指示兩個(gè)基因座例如兩個(gè)標(biāo)記座位物理上存在于相 同染色體上。有利的是，兩個(gè)連鎖基因座位置接近，使得減數(shù)分裂期間這兩個(gè)基因座不發(fā)生高 頻率的同源染色體對(duì)間的重組，例如使得連鎖基因座至少約90 %的時(shí)間，如91 %、92%、 93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%,99. 75%、或更多的時(shí)間共分離。在本專利申請(qǐng)中，短語“緊密連鎖”指兩個(gè)連鎖基因座間重組的發(fā)生頻率為等于或 小于約10% (即在基因圖譜上的分離頻率不超過IOcM)。換句話說，緊密連鎖的基因座至少 90%的情況下共分離。當(dāng)標(biāo)記座位顯示與期望性狀(例如病原體耐受性)共分離(連鎖) 的顯著概率時(shí)，它們?cè)诒景l(fā)明中尤其有用。例如在某些方面，這些標(biāo)記可被稱為連鎖QTL標(biāo) 記。在其他方面，尤其有用的分子標(biāo)記是那些連鎖或緊密連鎖的標(biāo)記。在某些方面，能夠?qū)⑦B鎖表示成任何期望的限制或范圍。例如在一些實(shí)施方案中， 兩個(gè)連鎖基因座是被小于50cM的圖譜單位分開的兩個(gè)基因座。在其他實(shí)施方案中，連鎖基 因座是被小于40cM的圖譜單位分開的兩個(gè)基因座。在其他實(shí)施方案中，兩個(gè)連鎖基因座是 被小于30cM的圖譜單位分開的兩個(gè)基因座。在其他實(shí)施方案中，兩個(gè)連鎖基因座是被小于 25cM的圖譜單位分開的兩個(gè)基因座。在其他實(shí)施方案中，兩個(gè)連鎖基因座是被小于20cM的 圖譜單位分開的兩個(gè)基因座。在其他實(shí)施方案中，兩個(gè)連鎖基因座是被小于15cM的圖譜單 位分開的兩個(gè)基因座。在某些方面，有利地是限定連鎖的相等范圍，例如介于10和20cM之 間，或者介于10和30cM之間，或者介于10和40cM之間。標(biāo)記與第二基因座連鎖越緊密，標(biāo)記越可能變成第二基因座的指示。因此在一個(gè) 實(shí)施方案中，緊密連鎖的基因座如標(biāo)記座位和第二基因座顯示10%或更低，優(yōu)選約9%或 更低，更優(yōu)選約8 %或更低，更優(yōu)選約7 %或更低，更優(yōu)選約6 %或更低，更優(yōu)選約5 %或更 低，更優(yōu)選約4%或更低，更優(yōu)選約3%或更低，更優(yōu)選約2%或更低的基因座內(nèi)重組頻率。 在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，關(guān)聯(lián)基因座顯示約或更低的重組頻率，例如約0. 75%或更 低，更優(yōu)選約0. 5%或更低，更優(yōu)選約0. 25%或更低的重組頻率。位于相同染色體上，并且 它們間的距離使得兩個(gè)基因座間的重組發(fā)生頻率小于10 % (例如約9 %、8 %、7 %、6 %、 5%,4%,3%,2%U%>0. 75%,0. 5%,0. 25%、或更低)的兩個(gè)基因座也稱為彼此緊密連 鎖。在某些情況下，兩個(gè)不同標(biāo)記能夠具有相同的基因圖譜坐標(biāo)。在那種情況下，兩個(gè)標(biāo)記 彼此足夠接近使得它們之間的重組發(fā)生頻率低至無法檢測(cè)。
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當(dāng)涉及兩個(gè)遺傳因子間的關(guān)系時(shí)，如有助于產(chǎn)生耐受性和緊密關(guān)聯(lián)標(biāo)記的遺傳因 子，“相引”相連鎖指示下述狀態(tài)其中在耐受性基因座上的“有利”等位基因與相應(yīng)連鎖的 標(biāo)記座位的“有利”等位基因物理上附連在相同染色體鏈上。在相引相中，兩個(gè)有利等位基 因被繼承了該染色體鏈的子代一起繼承。在“相斥”相連鎖中，在受關(guān)注基因座上的“有利” 等位基因與在連鎖標(biāo)記座位上的“不利”等位基因物理上連鎖，并且兩個(gè)“有利”等位基因 不被一起繼承(即這兩個(gè)基因座彼此“異相”)。如本文所用，術(shù)語“染色體區(qū)間”、“染色體的區(qū)間”、“染色體片段”、或“染色體的片 段”命名基因組DNA的鄰接線性片段，它駐留在植物中的單染色體上，通常定義關(guān)于限定染 色體區(qū)間的端點(diǎn)的兩個(gè)標(biāo)記。位于單染色體間隔上的遺傳因子或基因是物理上連鎖的。不 特別限定染色體區(qū)間的大小。在某些方面，例如在本發(fā)明的上下文中，位于單染色體區(qū)間中的遺傳因子一般也 是遺傳連鎖的，通常在例如小于或等于20cM或者小于或等于IOcM的遺傳重組距離內(nèi)。艮口， 在單染色體區(qū)間內(nèi)的兩個(gè)遺傳因子發(fā)生重組的頻率小于或等于20%或10%。在一個(gè)方面，本發(fā)明的任何標(biāo)記與等于或小于50cM的任何其他標(biāo)記連鎖(遺傳上 和物理上)。在另一方面，本發(fā)明的任何標(biāo)記與非常接近(例如距離等于或小于IOcM)的任 何其他標(biāo)記緊密連鎖(遺傳上和物理上)。在相同染色體上的兩個(gè)緊密連鎖的標(biāo)記可被彼 此定位于 9、8、7、6、5、4、3、2、1、0. 75,0. 5 或 0. 25cM 或更小。短語“灰葉斑病”或“GLS”指由真菌病原體玉米灰葉斑病菌引起的谷物病害，它表 征性地生成與葉脈平行的、長(zhǎng)矩形淺灰_棕褐色葉片損傷。玉米植物對(duì)GLS “新賦予的耐受性”或“提高的耐受性”指示玉米植物當(dāng)導(dǎo)入病害 如誘發(fā)劑玉米灰葉斑病菌時(shí)其產(chǎn)量和/或存活能力或其他相關(guān)農(nóng)學(xué)指標(biāo)較少受影響。耐受 性是一個(gè)相對(duì)定義，指示被感染的植物比另一株同樣處理的、更易感的植物玉米產(chǎn)量更高。 即，與易感玉米植物相比，在耐受性玉米植物中病害引起的玉米存活率和/或產(chǎn)量減少的 程度較低。技術(shù)人員將會(huì)知道玉米植物對(duì)GLS的耐受性相差很大，能夠提供一系列耐受性較 高至耐受性較低的表型，并且耐受性取決于感染的嚴(yán)重程度能夠發(fā)生變化。然而，通過簡(jiǎn)單 的觀察，技術(shù)人員能測(cè)定不同植物、植物品系或植物家族對(duì)GLS的相對(duì)耐受性或易感性，此 外也將認(rèn)識(shí)到“耐受性”的表型等級(jí)。例如可使用1至9的視覺評(píng)分指示GLS耐受性。評(píng) 分越高指示耐受性越強(qiáng)。僅當(dāng)在測(cè)量實(shí)驗(yàn)中存在足夠的選擇壓力時(shí)，數(shù)據(jù)將被收集。在本發(fā)明上下文中的術(shù)語“雜交的”或“雜交”指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合 (例如細(xì)胞、種子或植物)。該術(shù)語包括有性雜交(一株植物被另一株植物授粉)和自交 (自花授粉，例如當(dāng)花粉和胚珠來自相同植物時(shí))。術(shù)語“雜交”指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配 子融合行為。術(shù)語“滲入”指基因座的期望等位基因從一種遺傳背景傳遞到另一種遺傳背景的 現(xiàn)象。例如在特定基因座的期望等位基因通過滲入、經(jīng)由相同物種的兩個(gè)親本間的有性雜 交可被傳遞到至少一個(gè)子代，其中至少一個(gè)親本在其基因組中具有期望的等位基因。作為 另外一種選擇，例如等位基因的傳遞能夠通過兩個(gè)供體基因組之間的重組而發(fā)生，例如在 融合原生質(zhì)體中，其中至少其中一個(gè)供體原生質(zhì)體在其基因組中具有期望的等位基因。期 望的等位基因可為例如標(biāo)記的選擇等位基因、QTL、轉(zhuǎn)基因等。在任何情況下，能夠?qū)?br> 13望等位基因的子代與具有期望遺傳背景的品系反復(fù)回交并選擇期望的等位基因以產(chǎn)生固 定在選擇遺傳背景中的等位基因。當(dāng)重復(fù)“基因滲入”過程兩次或更多次時(shí)，該過程常被稱為“回交”?！盎亟晦D(zhuǎn)化體”是通過回交將某一基因座或性狀滲入某一品種的產(chǎn)物?！盎亟弧敝钙渲须s交子代反復(fù)與其中一個(gè)親本回交的過程。在一個(gè)回交方案中， “供體”親本指具有將被滲入的期望基因或基因座的親本植物?！笆荏w”親本(使用一次或 多次)或“輪回”親本(使用兩次或多次)指將基因或基因座滲入其中的親本植物。例 如參見 Ragot, M.等人(1995)Marker-assisted backcrossing :a practical example, inTechniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques,第 72 卷第 45—56 頁(yè)，以及 Openshaw 等人，(1994)Marker-assisted Selectionin Backcross Breeding, Analysis of Molecular Marker Data，H 41—43 M。率刀女臺(tái)Fl ft 術(shù)語“BC1”指輪回親本的第二次使用，“BC2”指輪回親本的第三次使用等等?！捌废怠被颉捌贩N”是一組具有相同親本的個(gè)體，它們一般是某種程度的自交體，并 且一般在大多數(shù)基因座是純合的和同質(zhì)的(同基因的或接近同基因的)。“亞系”指子代的 自交體亞群，它們與相同祖先來源的其他相似自交體亞群遺傳上不同?！白嫦绕废怠笔怯米骰騺碓吹挠H本品系，例如用于開發(fā)優(yōu)良品系。“祖先種群”是 已經(jīng)產(chǎn)生大部分基因變異的一組祖先，這些基因變異被用于開發(fā)優(yōu)良品系。“子代”是祖先 的子代，并且可通過多代育種從它們的祖先分離得到。例如優(yōu)良品系是它們的祖先的子代。 “譜系結(jié)構(gòu)”規(guī)定了子代和產(chǎn)生該子代的各個(gè)祖先的關(guān)系。譜系結(jié)構(gòu)能夠跨越一代或多代， 描述子代及其父母親本、祖父母親本、曾祖父母親本等的關(guān)系。“優(yōu)良品系”或“優(yōu)良品種”是農(nóng)學(xué)上優(yōu)異的品系，該品系由多代育種以及選擇優(yōu)異 農(nóng)學(xué)特性產(chǎn)生。多個(gè)優(yōu)良品系對(duì)玉米育種領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是可用的和已知的。“優(yōu)良 種群”是一類優(yōu)良個(gè)體或品系，根據(jù)給定作物物種如玉米的農(nóng)學(xué)上優(yōu)異的基因型，它們將可 用于代表技術(shù)發(fā)展水平。同樣的，“優(yōu)良種質(zhì)”或優(yōu)良品種的種質(zhì)是農(nóng)學(xué)上優(yōu)異的種質(zhì)，通常 來源于和/或能夠生成具有優(yōu)異農(nóng)學(xué)性能的植物，如現(xiàn)有的或新開發(fā)的優(yōu)良玉米品系。與之相反，“外來玉米品種”或“外來玉米種質(zhì)”是來源于不屬于可利用優(yōu)良玉米品 系或品種的種質(zhì)的玉米的品種或種質(zhì)。在雜交發(fā)生在兩個(gè)玉米植株或品種的種質(zhì)之間的情 況下，外來種質(zhì)的子代不與它雜交的優(yōu)良種質(zhì)密切相關(guān)。最常見的是外來種質(zhì)不來源于任 何已知的玉米優(yōu)良品系，而是選擇將新遺傳因子(通常新等位基因)導(dǎo)入育種程序。在核酸擴(kuò)增的情況下術(shù)語“擴(kuò)增”是其中產(chǎn)生附加拷貝的選擇核酸(或其轉(zhuǎn)錄 形式)的任何過程。一般的擴(kuò)增方法包括基于多種聚合酶的復(fù)制方法包括聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)、連接酶介導(dǎo)的方法如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、以及基于RNA聚合酶的擴(kuò)增(例如通過轉(zhuǎn) 錄)方法?！皵U(kuò)增子”是被擴(kuò)增的核酸，例如使用任何可用的擴(kuò)增方法(例如PCR、LCR、轉(zhuǎn)錄 等)通過擴(kuò)增模板核酸制備的核酸?！盎蚪M學(xué)核酸”是按順序?qū)?yīng)于細(xì)胞中的可遺傳核酸的核酸。常見實(shí)例包括核基 因組DNA及其擴(kuò)增子。在某些情況下基因組核酸不同于剪接RNA或?qū)?yīng)的cDNA，因?yàn)榧艚?RNA或cDNA通過例如剪接機(jī)制進(jìn)行處理以除去內(nèi)含子?；蚪M核酸任選地包含非轉(zhuǎn)錄的 (例如染色體結(jié)構(gòu)序列、啟動(dòng)子區(qū)、或增強(qiáng)子區(qū))和/或非翻譯的序列(例如內(nèi)含子)，然而
14剪接RNA/cDNA通常不具備非轉(zhuǎn)錄的序列或內(nèi)含子?！澳０搴怂帷笔窃跀U(kuò)增反應(yīng)(例如基于 聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng)如PCR、連接酶介導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng)如LCR、轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等)中起到模板作用的 核酸。模板核酸可為基因組起源的，或者可來源于表達(dá)序列如cDNA或EST?！昂塑账嵝蛄小薄ⅰ岸嗪塑账帷?、“核酸序列”、和“核酸片段”可互換使用，并且指作為單 鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基?！昂塑账帷?是構(gòu)成DNA或RNA聚合物的單體單元，它由嘌呤或嘧啶堿基、戊糖、和磷酸基組成。核苷酸 (通常以它們的5'單磷酸形式存在)通過如下它們的單個(gè)字母名稱來指代“A”為腺苷酸 或脫氧腺苷酸(分別對(duì)應(yīng)RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“G”表示鳥苷酸或脫 氧鳥苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脫氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C 或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“ I ”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸?！巴庠春怂帷敝羔槍?duì)序列、基因組位置、或兩者的，不是原產(chǎn)于指定體系(例如種質(zhì)、 植物、或品種)的核酸。如本文所用，應(yīng)用于多核苷酸或多肽的術(shù)語“外源的”或“異源的” 通常指已經(jīng)被人工供給生物系統(tǒng)(例如研究的植物細(xì)胞、植物基因、特定植物物種或品種 或植物染色體)的分子，并且所述分子不是該特定生物系統(tǒng)自有的。該術(shù)語能夠指示從除 天然存在來源之外的來源獲取的有關(guān)材料，或者能夠指具有非天然構(gòu)型、遺傳位置或部件 排列的分子。與之相反，例如“天然的”或“內(nèi)源的”基因是不包含由除染色體或其他遺傳因子 之外的來源編碼的核酸元件的基因，在所述染色體或其他遺傳因子上內(nèi)源基因通常天然存 在。內(nèi)源基因、轉(zhuǎn)錄物或多肽由其天然染色體座位編碼，并且不被人工供給于細(xì)胞。關(guān)于核酸或多肽的術(shù)語“重組體”指示該材料(例如重組核酸、基因、多核苷酸、或 多肽)已經(jīng)被人工干預(yù)改變。重組分子部分的排列一般不是天然構(gòu)型，或者重組多核苷酸 或多肽的一級(jí)序列已經(jīng)在某些方面被操縱了。可在材料的天然環(huán)境或狀態(tài)下、或使其脫離 天然環(huán)境或狀態(tài)，對(duì)所述材料進(jìn)行改變以產(chǎn)生重組材料。例如如果在獲取天然存在核酸的 細(xì)胞中通過人工干預(yù)使得天然存在的核酸發(fā)生變化，或者轉(zhuǎn)錄出該核酸的DNA已經(jīng)發(fā)生了 變化，該核苷酸變成重組核酸。如果核苷酸序列已經(jīng)從其天然環(huán)境中移除并被克隆進(jìn)任何 類型的人工核酸載體中，該基因序列開放閱讀框是重組體。制備重組分子尤其是重組核酸 分子的規(guī)程和試劑是本領(lǐng)域常見的和常規(guī)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，可制備人工染色體并通 過本領(lǐng)域已知的任何方法將其插入玉米植物中(例如直接遞送方法如PEG誘導(dǎo)的DNA攝 入、原生質(zhì)體融合、顯微注射、電穿孔、以及基因槍轟擊)。人工染色體是一條可穩(wěn)定復(fù)制并 沿著內(nèi)源染色體分離的DNA。它具有容納并表達(dá)該處插入的異源基因的能力。將異源DNA 整合到大復(fù)制區(qū)域(著絲粒的主要復(fù)制起始位點(diǎn))中或與其足夠接近，啟動(dòng)兆堿基大小的 染色體片段的大規(guī)模擴(kuò)增，這導(dǎo)致重新形成染色體。參見例如美國(guó)專利6，077，697，該專利 以引用方式并入本文。術(shù)語重組體也可指包含重組材料的生物，如包含重組核酸的植物被認(rèn)為是重組植 物。在一些實(shí)施方案中，重組生物體是轉(zhuǎn)基因生物體。當(dāng)涉及將異源或外源核酸轉(zhuǎn)位到細(xì)胞中時(shí)，術(shù)語“導(dǎo)入”指使用任何方法將核酸摻 入細(xì)胞。該術(shù)語包括核酸導(dǎo)入方法如“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”、和“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。如本文所用，術(shù)語“載體”用于指將核酸片段轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的多核苷酸或其他分 子。術(shù)語“運(yùn)載體”有時(shí)與“載體”互換使用。載體任選地包含介導(dǎo)載體維持和使其發(fā)揮預(yù)
15期用途的部分(例如復(fù)制必需的序列、賦予藥物或抗生素抗性的基因、多克隆位點(diǎn)、或者可 操作地連接的使得克隆基因能夠表達(dá)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件)。載體通常來源于質(zhì)粒、噬 菌體、或者植物或動(dòng)物病毒?！翱寺≥d體”或“穿梭載體”或“亞克隆載體”包含可操作地連 接的部分，所述部分有利于亞克隆步驟(例如包含多個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的多克隆位 點(diǎn))ο如本文所用，術(shù)語“表達(dá)載體”指包含可操作地連接的多核苷酸序列的載體，所述 多核苷酸序列有利于在特定宿主生物中表達(dá)編碼序列(例如細(xì)菌表達(dá)載體或植物表達(dá)載 體)。有利于在原核生物中表達(dá)的多核苷酸序列通常包括例如啟動(dòng)子、操縱子(任選的)、 和核糖體結(jié)合位點(diǎn)、通常還包括其他序列。真核細(xì)胞能夠使用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止和聚腺 苷酸化信號(hào)、以及一般不同于原核生物使用的那些序列的其他序列。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”指在其細(xì)胞中包含異源多核苷酸的植物。異源多核苷酸一般 被穩(wěn)定地整合進(jìn)基因組中，使得該多核苷酸傳遞至連續(xù)的世代。異源多核苷酸可單獨(dú)地或 作為重組表達(dá)盒的部分整合進(jìn)基因組中。本文所用的“轉(zhuǎn)基因”包括因異源核酸存在而已 經(jīng)改變了基因型的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括初始進(jìn)行此類 改變的轉(zhuǎn)基因以及從初始的轉(zhuǎn)基因生物或細(xì)胞通過雜交或無性繁殖產(chǎn)生的那些轉(zhuǎn)基因生 物或細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法(如雜交)或通過諸 如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā) 生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。“定位克隆”是一種克隆方法，其中靶核酸通過它與標(biāo)記核酸的基因組接近程度被 鑒定并分離。例如基因組核酸克隆能夠包括部分或全部?jī)蓚€(gè)更多的彼此緊密連鎖的染色體 區(qū)域。如果可使用標(biāo)記從基因組文庫(kù)中鑒定基因組核酸克隆，能夠使用標(biāo)準(zhǔn)方法如亞克隆 或測(cè)序來鑒定和/或分離靠近標(biāo)記的克隆的亞序列。當(dāng)指定核酸使用給定核酸的序列進(jìn)行構(gòu)建時(shí)，或者當(dāng)指定核酸使用給定核酸進(jìn)行 構(gòu)建時(shí)，該指定核酸“來源于”給定核酸。例如，cDNA或EST來源于表達(dá)mRNA。術(shù)語“遺傳因子”或“基因”指具有功能意義的DNA的可遺傳序列，即基因組序列。 也可使用術(shù)語“基因”指例如cDNA和/或由基因組序列編碼的mRNA，以及該基因組序列。術(shù)語“基因型”是個(gè)體(或個(gè)體組)在一個(gè)或多個(gè)基因座上的基因組成，它與可觀 察到的性狀(表型)形成對(duì)照。基因型由一個(gè)或多個(gè)已知基因座的等位基因限定，個(gè)體已 經(jīng)從其親本中繼承了所述基因座。術(shù)語基因型可被用于指?jìng)€(gè)體在單個(gè)基因座上的基因組 成，在多個(gè)基因座上的基因組成，或者更一般的，術(shù)語基因型可被用于指?jìng)€(gè)體在其基因組中 的所有基因的基因組成。“單倍型”是個(gè)體在多個(gè)基因座上的基因型。單倍型描述的基因座通常是物理上和 遺傳上連鎖的，即在相同染色體片段上。術(shù)語“單倍型”可指在特定基因座的多態(tài)性，如單 標(biāo)記座位，或者在沿染色體片段的多個(gè)基因座上的多態(tài)性。前者也可被稱為“標(biāo)記單倍型” 或“標(biāo)記等位基因”，而后者可被稱為“遠(yuǎn)程單倍型”。術(shù)語“表型”或“表型性狀”或“性狀”指生物的一個(gè)或多個(gè)性狀。表型可用肉眼或 者本領(lǐng)域已知的任何其他評(píng)估手段觀察到，例如顯微鏡法、生物化學(xué)分析、基因組分析、或 用于特定病害耐受性的檢測(cè)分析法。在某些情況下，表型由單個(gè)基因或基因座直接控制，即 “單基因性狀”。在其他情況下，表型是若干個(gè)基因的結(jié)果。
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“分子表型”是在一組(一個(gè)或多個(gè))分子水平上可檢測(cè)的表型。此類分子可為核 酸如基因組DNA或RNA、蛋白、或代謝物。例如，分子表型可為一種或多種基因產(chǎn)物的表達(dá) 譜，例如在植物發(fā)育的特定階段，響應(yīng)于環(huán)境條件或脅迫等的基因產(chǎn)物。表達(dá)譜通常在RNA 或蛋白水平上評(píng)估，例如在核酸陣列或“芯片”上評(píng)估或者使用抗體或其他結(jié)合蛋白進(jìn)行評(píng) 估?！按硇詷悠贰笔呛w采樣種群的相關(guān)組合物和特性的樣品?！爸z?！笔窃诿總€(gè)染色體上的單個(gè)位點(diǎn)，用于在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中的著 絲粒裝配和正確的染色體分離。術(shù)語“產(chǎn)量”指具有商業(yè)價(jià)值的特定植物產(chǎn)品每單位面積的產(chǎn)量。例如玉米產(chǎn)量 一般以每季每英畝種子蒲式耳數(shù)或每季每公頃種子公噸數(shù)來測(cè)量。產(chǎn)量受遺傳和環(huán)境因素 的影響?！稗r(nóng)學(xué)”、“農(nóng)學(xué)特性”、和“農(nóng)學(xué)性能”指給定植物品種的性狀(以及產(chǎn)生性狀的遺 傳因子)，所述性狀有助于經(jīng)過生長(zhǎng)期的產(chǎn)量。單個(gè)農(nóng)學(xué)特性包括出苗活力、營(yíng)養(yǎng)勢(shì)、脅迫耐 受性、病害抗性或耐受性、除草劑抗性、發(fā)生分枝、開花、結(jié)實(shí)率、種子大小、種子密度、抗倒 伏性、脫粒率等。因此產(chǎn)量是所有農(nóng)學(xué)特性的最終結(jié)果。一“組”標(biāo)記或探針指標(biāo)記或探針、或由此獲得的數(shù)據(jù)的一個(gè)集合或組，它們用于 常見目的，例如鑒定具有期望性狀的玉米植物(例如GLS耐受性)。很多情況下，對(duì)應(yīng)于標(biāo) 記或探針的數(shù)據(jù)、或者來源于它們的應(yīng)用的數(shù)據(jù)，被儲(chǔ)存在電子介質(zhì)中。當(dāng)一組的每個(gè)成員 具有針對(duì)特定目的的效用時(shí)，從包括一些但不是全部標(biāo)記的所述組以及亞組中選擇的單個(gè) 標(biāo)記對(duì)達(dá)到特定目的也是有效的?！斑z傳特征圖”是對(duì)特定性狀或基因座的序列特征的鑒定和表征?！安檎冶怼笔菍⒁环N形式的數(shù)據(jù)與另一種形式的數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，或者將一種或多種形式 的數(shù)據(jù)與該數(shù)據(jù)相關(guān)的預(yù)測(cè)結(jié)果關(guān)聯(lián)的表。例如，查找表能夠包括等位基因數(shù)據(jù)和預(yù)測(cè)的 包含給定等位基因的植物可能顯示的性狀間的相關(guān)性。這些表可為并且通常為多維的，例 如同時(shí)考慮多個(gè)等位基因并且也任選地考慮其他因素，例如遺傳背景如進(jìn)行性狀預(yù)測(cè)?！爸丿B群”指來源于單一基因來源的一組重疊DNA片段。重疊群圖譜描述了 代表延長(zhǎng)染色體片段的重疊群的連鎖文庫(kù)的相對(duì)順序。“公開重疊群”是公開可用的 一組重疊DNA片段，它們來源于單一基因來源。公開來源的實(shí)例包括Maize Mapping Project (University ofMissouri-Columbia、University of Georgia、禾口 University of Arizona)、Arizona Genomics Institute、MaizeGDB 網(wǎng)站、以及 Maize Sequence 網(wǎng)站。序 列比對(duì)或重疊群也可用于查找本文列出的特定標(biāo)記的上游或下游序列。這些新序列靠近本 文所述的標(biāo)記，然后被用于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)功能等同的標(biāo)記。例如將不同的物理和/或基因圖 譜進(jìn)行比對(duì)以定位等同標(biāo)記，所述標(biāo)記不在所述公開中描述，但是位于相似區(qū)域內(nèi)。這些圖 譜可在玉米物種中，或者甚至包括已經(jīng)與玉米進(jìn)行了遺傳上或物理上的比對(duì)的其他物種， 如大米、小麥、大麥、或高粱?？捎肔ASARGENE 生物信息計(jì)算包(DNASTAR Inc.，Madison, WI)的 Megalign 程序 進(jìn)行序列比對(duì)和相似度百分比計(jì)算。用帶默認(rèn)參數(shù)(空位罰分=10，空位長(zhǎng)度罰分=10) 的Clustal比對(duì)方法(Higgins和Sharp，CABIOS 5 151-153 (1989))進(jìn)行序列的多重比對(duì)。 用Clustal方法進(jìn)行成對(duì)比對(duì)和蛋白質(zhì)序列的百分比同一性計(jì)算的默認(rèn)參數(shù)為KTUPLE = 1、空位罰分=3、窗口(WINDOW) = 5和DIAG0NALSSAVED = 5。就核酸而言，這些參數(shù)為空位罰分=10，空位長(zhǎng)度罰分=10，KTUPLE = 2，空位罰分=5，窗口 = 4，和DIAGONALS SAVED =4。氨基酸或核苷酸序列的“主要部分”包含足夠的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸 序列以提供該多肽或基因的推定鑒定，所述序列可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來人工評(píng)估，或使用 計(jì)算機(jī)自動(dòng)化的序列比較和鑒定工具進(jìn)行評(píng)估，所述工具使用算法如BLAST (Altschul， S. F.等人，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1993))和 Gapped Blast (Altschul, S. F.等人， Nucleic AcidsRes. 25 :3389_3402 (1997))?？墒褂?BLASTN 程序進(jìn)行 BLAST 核苷酸搜索， 得分=100，字長(zhǎng)=12，以獲取與編碼本實(shí)施方案的蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。 可使用BLASTX程序進(jìn)行BLAST蛋白搜索，得分=50，字長(zhǎng)=3，以獲取與本實(shí)施方案的多 肽同源的氨基酸序列。為了獲取用于比對(duì)目的的空位比對(duì)，可利用Gapped BLAST (BLAST 2. 0)，如 Altschul 等人(1997)Nucleic Acids Res. 25 3389.作為另外一種選擇，可使用 PSI-BLAST (BLAST 2. 0)進(jìn)行重復(fù)搜索，它檢測(cè)分子間的較遠(yuǎn)關(guān)系。參見Altschul等人 (1997)同上。當(dāng)利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST時(shí)，可使用相應(yīng)程序(例如用于核 苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)的默認(rèn)參數(shù)。也可通過檢查進(jìn)行手動(dòng)比對(duì)?！半娔X可讀介質(zhì)”是一種信息存儲(chǔ)介質(zhì)，使用電腦可用的或定制的接口可對(duì)之進(jìn)行 存取利用。實(shí)例包括存儲(chǔ)器(例如R0M、RAM、或閃存)、光存儲(chǔ)介質(zhì)(例如CD-ROM)、磁存儲(chǔ) 介質(zhì)(電腦硬盤、軟盤等)、穿孔卡片、以及許多其他可商購(gòu)獲得的存儲(chǔ)介質(zhì)。信息可在受關(guān) 注的系統(tǒng)和電腦之間傳遞，或者傳遞到電腦及用于存儲(chǔ)或獲取存儲(chǔ)信息的電腦可讀介質(zhì)上 或者從中獲取信息。這種傳遞可為電傳遞，或者可通過其他可用方法如IR連接、無線連接 等進(jìn)行?！跋到y(tǒng)說明書”是可被系統(tǒng)部分或完全執(zhí)行的說明書。說明書通常以系統(tǒng)軟件形式存在。附圖和序列簡(jiǎn)述根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細(xì)描 述和附圖以及序列表形成本申請(qǐng)的一部分。此序列表中以單個(gè)字母表示核苷酸，以三字母 表示氛基酸，如 Nucleic AcidsResearch 13 :3021_3030 (1985)禾口 Biochemical Journal 219 (No. 2) =345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，它們以引用方式全文并 入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的 規(guī)定。

圖1示出在IBM2 2004 neighbors染色體4圖譜上的PHJEP GLSQTL的最終位置。 距離單位為CM0圖2示出在第二輪作圖后，在IBM2 2004 neighbors染色體4圖譜上的GLS QTL 的特寫圖。在第二輪QTL作圖中使用加框的標(biāo)記。箭頭顯示在該第二輪QTL作圖后的QTL 區(qū)域。黑色框示出精細(xì)作圖后的最終QTL位置。圖3示出精細(xì)作圖后的GLS QTL圖譜位置。圖4A-F示出序列BAC的物理圖譜排列(獲取自Maize GenomeBrowser,它在因特 網(wǎng)上公開可用；網(wǎng)址為http://www. maizesequence. org)，所述序列BAC在包含GLS QTL的 染色體4區(qū)域中。圖5示出GLS QTL滲入到PHN46中的過程。深灰色指示PH14T起點(diǎn)。水平線指示 PHN46起點(diǎn)。對(duì)角線指示重組區(qū)域。*UMC1299位置來自IBM2 Neighbors框圖譜一與物理圖譜位置一致。圖6示出PHN46(左)、PH14T(中)和PHJEP(右)中的GLS病害抗性水平。圖7示出以下雜交體的GLS病害抗性水平A)具有QTL滲入的Pioneer雜交體， 它通過雜交自交體PHP38和PHJEP制備，和B)不具有QTL滲入的Pioneer雜交體3394。圖8示出GLS QTL進(jìn)一步滲入到優(yōu)良材料中的過程。深灰色指示PH14T起點(diǎn)。水 平線指示PHN46起點(diǎn)。對(duì)角線指示PHJEP和新的優(yōu)良種質(zhì)之間的重組。圓點(diǎn)指示PH14T和 PHN46之間的重組。無陰影部分指示新的優(yōu)良種質(zhì)PHVNV、PHEHG, PHW3Y、PHEWB、或PHWRC。圖9提供基因組和SSR標(biāo)記的列表，包括那些證明與GLS耐受性表型連鎖不平衡 的標(biāo)記(從基因圖譜中直接或通過外推法得到)。該表提供用于SSR標(biāo)記座位基因型分析 的左和右PCR引物序列。也顯示在SSR的串聯(lián)重復(fù)元件中的核苷酸數(shù)目。圖10提供列出證明與GLS耐受性表型連鎖不平衡的SNP標(biāo)記。該表提供用于生 成包含SNP的擴(kuò)增子的PCR引物的序列。序列描述以及關(guān)聯(lián)的序列表遵循如37 C. F R. § 1. 821-1. 825中所列出的管理專 利申請(qǐng)中的核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)則。序列表包含核苷酸序列字符的單字母 碼以及氨基酸的三字母碼，如遵照IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)所定義的，該標(biāo)準(zhǔn)在Nucleic Acids Res. 13 3021-3030(1985)以及在 Biochemical J. 219(2) :345_373 (1984)中描述，這兩 篇文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循在37C. F. R. § 1.822中列出的規(guī)則。SEQ ID N0:liPSEQ ID NO :2 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacm2. pk027. hlO. f■的引物。SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacm. pk098. d7 的引物。SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacm. pkl06. j3 的引物。SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacm. pk018. hl5 的引物。SEQ ID NO :9 禾口 SEQ ID NO :10 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC末端bacm. pk040. ol7 的引物。 該引物對(duì)代表本文稱為PHM 00045的CAPs標(biāo)記。SEQ ID NO 11 禾口 SEQ ID NO 12 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacm2. pk065. b22. f 的 引物。SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO 14 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacb. pk0333. ol9 的引 物。該引物對(duì)代表本文稱為PHM 00043的CAPs標(biāo)記。SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacc. pk0267. ml2. f 的 引物。SEQ ID NO 17 和 SEQ ID NO 18 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 EST 橫穿(overgo)探針 cl33021_l 的引物。SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO 20 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacb. pk0241. hl7. f 的 引物。SEQ ID NO :21 禾口 SEQ ID NO 22 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增克隆 chp2. pk0007. d2 的引物。SEQ ID NO 23 和 SEQ ID NO 24 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacc. pk0530. f 13. f 的 引物。SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO 26 是設(shè)計(jì)用于克隆 p0094. csstg88 的引物。
19SEQ ID N0:27禾口 SEQ ID NO :28是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增BAC末端bacb. pk0269. nl9的弓丨 SEQ ID N0:29 禾口 SEQ ID NO :30 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacb. pk0009. b21. f 的 SEQ ID N0:31 和 SEQ ID NO :32 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacb. pk0117. i09. f 的 SEQ ID N0:33禾口 SEQ ID NO :34是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增BAC末端bacc. pk0280. nl2的弓丨 SEQ ID NO 35 和 SEQ ID NO 36 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacb. pk0219. j20 的引 SEQ ID N0:37 禾口 SEQ ID NO :38 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacc. pk0132. bl6. f 的 SEQ ID N0:39禾口 SEQ ID NO :40是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增BAC末端bacb. pk0221. o22的弓丨 SEQ ID N0:41禾口 SEQ ID NO :42是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增BAC末端bacb. pk0544. jl8的弓丨 SEQ ID NO 43 和 SEQ ID NO 44 是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 BAC 末端 bacb. pk0540. cl8. f 的 SEQ ID N0:45禾口 SEQ ID NO :46是設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增BAC末端bacm. pk022. b8的引物。物。引物。引物。物。物。引物。物。物。引物。
該引物對(duì)代表本文稱為PHM 00049的CAPs標(biāo)記。SEQ ID NO 47 和 SEQ ID NO 48 是用于標(biāo)記座位 PHM 7245 的引物。SEQ ID NO :49是分類為L(zhǎng)RR樣蛋白激酶型的推定R基因的注解核苷酸序列。SEQ ID NO 50是由SEQ ID NO 49編碼的蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:51 是 PHM 15534-13 正向引物的序列。SEQ ID N0:52 是 PHM 15534-13 反向引物的序列。SEQ ID NO :53 是 PHM 15534-13 探針 1 的序列。SEQ ID N0:54 是 PHM 15534-13 探針 2 的序列。SEQ ID N0:55 是 PHM 15534 參比序列的序列。SEQ ID N0:56 是 PHM 04694-10 正向引物的序列。SEQ ID N0:57 是 PHM 04694-10 反向引物的序列。SEQ ID NO :58 是 PHM 04694-10 探針 1 的序列。SEQ ID NO :59 是 PHM 04694-10 探針 2 的序列。SEQ ID N0:60 是 PHM 04694-10 參比序列的序列。SEQ ID N0:61 是 PHM 01811-32 正向引物的序列。SEQ ID N0:62 是 PHM 01811-32 反向引物的序列。SEQ ID N0:63 是 PHM 01811-32 探針 1 的序列。SEQ ID N0:64 是 PHM 01811-32 探針 2 的序列。SEQ ID N0:65 是 PHM 01811-32 參比序列的序列。SEQ ID N0:66 是 PHM 01963-15 正向引物的序列。0174]SEQIDNO67是PHM 01963-15反向引物的序列。0175]SEQIDNO68是PHM 01963-15探針1的序列。0176]SEQIDNO69是PHM 01963-15探針2的序列。0177]SEQIDNO70是PHM 01963-15參比序列的序列。0178]SEQIDNO71是PHM 01963-22正向引物的序列。0179]SEQIDNO72是PHM 01963-22反向引物的序列。0180]SEQIDNO73是PHM 01963-22探針1的序列。0181]SEQIDNO74是PHM 01963-22探針2的序列。0182]SEQIDNO75是PHM 01963-22參比序列的序列。0183]SEQIDNO76是PHM 05013-12正向引物的序列。0184]SEQIDNO77是PHM 05013-12反向引物的序列。0185]SEQIDNO78是PHM 05013-12探針1的序列。0186]SEQIDNO79是PHM 05013-12探針2的序列。0187]SEQIDNO80是PHM 05013-12參比序列的序列。0188]SEQIDNO81是PHM 00586-10正向引物的序列。0189]SEQIDNO82是PHM 00586-10反向引物的序列。0190]SEQIDNO83是PHM 00586-10探針1的序列。0191]SEQIDNO84是PHM 00586-10探針2的序列。0192]SEQIDNO85是PHM 00586-10參比序列的序列。0193]SEQIDNO86是標(biāo)記bnlgl755的左引物的序列。0194]SEQIDNO87是標(biāo)記bnlgl755的右引物的序列。0195]SEQIDNO88是標(biāo)記umC156a的左引物的序列。0196]SEQIDNO89是標(biāo)記umC156a的右引物的序列。0197]SEQIDNO90是標(biāo)記umcll42的左引物的序列。0198]SEQIDNO91是標(biāo)記umc 1142的右引物的序列。0199]SEQIDNO92是標(biāo)記umcl346的左引物的序列。0200]SEQIDNO93是標(biāo)記umc 1346的右引物的序列。0201]SEQIDNO94是標(biāo)記umcl702的左引物的序列。0202]SEQIDNO95是標(biāo)記umcl702的右引物的序列。0203]SEQIDNO96是標(biāo)記mmc0371的左引物的序列。0204]SEQIDNO97是標(biāo)記mmc0371的右引物的序列。0205]SEQIDNO98是標(biāo)記bnlgl621a的左引物的序列。0206]SEQIDNO99是標(biāo)記bnlgl621a的右引物的序列。0207]SEQIDNO100是標(biāo)記umcl299的左引物的序列。0208]SEQIDNO101是標(biāo)記umcl299的右引物的序列。0209]SEQIDNO102是PHM 00045參比序列的序列。0210]SEQIDNO103是PHM 00049參比序列的序列。0211]發(fā)明詳述0212]使用MAS鑒定并選擇顯示GLS耐受性的玉米植物能夠提供有效的和環(huán)境友好的方
21法以減少這種病害引起的損失。本發(fā)明提供玉米標(biāo)記座位，所述標(biāo)記座位顯示統(tǒng)計(jì)意義上 顯著性的GLS耐受性共分離。能夠在標(biāo)記輔助的玉米育種程序中檢測(cè)這些基因座或附加的 連鎖基因座以制備耐受性植物或具有改善的GLS耐受性的植物。本文鑒定的連鎖SSR和 SNP標(biāo)記在下文和圖中提供。這些標(biāo)記包括PHM 15534、PHM04694、PHM 0181UPHM 01963、 PHM 05013、和 PHM 00586 (圖 10)。每個(gè)SSR型標(biāo)記顯示多個(gè)等位基因，所述等位基因可被視為不同大小的PCR擴(kuò)增 子。用于生成SSR標(biāo)記擴(kuò)增子的PCR引物在圖9中提供。SNP型標(biāo)記的等位基因使用等位 基因特異性的雜交規(guī)程進(jìn)行測(cè)定，該規(guī)程是本領(lǐng)域已知的。用于擴(kuò)增SNP結(jié)構(gòu)域的PCR引 物在圖10中提供本領(lǐng)域認(rèn)識(shí)到與QTL標(biāo)記連鎖的任何其他標(biāo)記(例如病害耐受性標(biāo)記)也發(fā)現(xiàn)用 于相同目的。提供了與本文所述的病害耐受性標(biāo)記連鎖的附加標(biāo)記的實(shí)例。例如可從表3 提供的緊密連鎖中測(cè)定連鎖標(biāo)記。然而并不意味著本發(fā)明使用的連鎖標(biāo)記受表3所述的那 些標(biāo)記的限制。本發(fā)明也提供與GLS耐受性關(guān)聯(lián)的染色體QTL區(qū)間。這些區(qū)間位于連鎖群4上。將 位于這些區(qū)間內(nèi)的任何標(biāo)記用作GLS耐受性標(biāo)記。這些區(qū)間包括(i)BNLG1755和UMC1299， (ii)BNLG1755 和 BNLG1621A， (iii)BNLG1755 和 MMC0371， (iv)BNLG1755 和 UMC1702， (ν) UMC156A 和 UMC1299，(vi)UMC156A 和 BNLG1621A，(vii)UMC156A 和 MMC0371，(viii)UMC156A 和 UMC1702， (ix)UMCl142 和 UMC1299， (x)UMCl142 和 BNLG1621A， (xi)UMCl142 和 MMC0371， (xii)UMC1142 和 UMC1702， (xiii)UMC1346 和 UMC1299， (xiv)UMC1346 和 BNLG1621A， (xv) UMC1346 和 MMC0371，以及(xvi)UMC1346 和 UMC1702。本發(fā)明還提供由PHM 00043 (SEQ ID NO 102)和 PHM 00049 (SEQID NO 103)限定 并包括它們的鄰接DNA區(qū)域，其中包含與GLS耐受性共分離的標(biāo)記座位(圖4)?？墒褂梦?于DNA鄰接片段內(nèi)的任何標(biāo)記座位作為GLS耐受性標(biāo)記，所述DNA鄰接片段位于以下兩個(gè) 核苷酸序列之間并包括它們SEQ ID NO :102，或者基于Clustal V比對(duì)方法與SEQ ID NO: 102具有95%同一性的核苷酸序列，以及SEQ IDNO 103，或者基于Clustal V比對(duì)方法與 SEQ ID NO 103具有95%同一性的核苷酸序列。鑒定攜帶優(yōu)選耐受性標(biāo)記座位的等位基因的玉米植物或種質(zhì)的方法是本發(fā)明的 一個(gè)特征。在這些方法中，取決于標(biāo)記座位的類型，可使用多種標(biāo)記檢測(cè)規(guī)程中的任何一種 來鑒定在標(biāo)記座位的等位基因。一般檢測(cè)方法包括ASH、SSR檢測(cè)、RFLP分析、以及多種其 他方法。雖然特定標(biāo)記等位基因可顯示與病害耐受性表型或易感性表型的共分離，但重要 的是注意到標(biāo)記座位是導(dǎo)致耐受性或易感性的QTL基因座非必需的部分。例如不需要標(biāo)記 多核苷酸序列是賦予病害耐受性的基因的部分(例如是基因開放閱讀框的部分)。在耐受 性或易感性等位基因從中起源的祖先玉米品系中，特定標(biāo)記等位基因與耐受性或易感性表 型的關(guān)聯(lián)是由于標(biāo)記等位基因和QTL耐受性或易感性等位基因之間的最初“相引”相連鎖。 最后通過反復(fù)重組，標(biāo)記和QTL基因座間的交換事件能夠改變這種取向。正是因?yàn)檫@個(gè)原 因，有利標(biāo)記等位基因可根據(jù)存在于耐受性親本中的相連鎖發(fā)生改變，所述耐受性親本用 于制備分離種群。這不改變可使用遺傳標(biāo)記監(jiān)控表型分離的事實(shí)。它僅僅改變?cè)诮o定分離 種群中認(rèn)為哪個(gè)標(biāo)記等位基因是有利的。
鑒定包含與改善耐受性關(guān)聯(lián)的標(biāo)記等位基因的玉米植物或種質(zhì)提供了進(jìn)行玉米 標(biāo)記輔助選擇的基礎(chǔ)。選擇包含有利標(biāo)記等位基因的玉米植物，而不選擇包含與耐受性負(fù) 相關(guān)的標(biāo)記等位基因的玉米植物?？蓪⑵谕臉?biāo)記等位基因滲入具有期望(例如優(yōu)良的或 外來的)遺傳背景的玉米以生成滲入耐受性的玉米植物或種質(zhì)。在某些方面，預(yù)期多個(gè)耐 受性標(biāo)記等位基因被連續(xù)或同時(shí)選擇和/或滲入?？稍趩蝹€(gè)植物中用于選擇耐受性的耐受 性標(biāo)記的組合不受限制，并且能夠包括圖3所述標(biāo)記、與圖3所述標(biāo)記連鎖的任何標(biāo)記、或 者位于本文限定的QTL區(qū)間中的任何標(biāo)記的任何組合。作為將受關(guān)注的性狀導(dǎo)入玉米的標(biāo)準(zhǔn)育種方法(例如基因滲入)的替代方法，也 可使用轉(zhuǎn)基因方法。在這些方法中，可將控制受關(guān)注性狀如病害耐受性的外源核酸導(dǎo)入靶 植物或種質(zhì)中。耐受性確認(rèn)能通過可用的耐受性規(guī)程進(jìn)行(例如如上文所述)。使用耐受 性檢測(cè)分析法確認(rèn)在任何特定植物或種群中耐受性性狀仍與標(biāo)記一起分離，并且當(dāng)然測(cè)量 通過將性狀滲入或轉(zhuǎn)基因?qū)肫谕尘矮@得的耐受性改善程度。在一個(gè)一分至九分的評(píng) 分等級(jí)中，包含灰葉斑病QTL的有利等位基因的植物可具有的耐受性評(píng)分為至少2. 7,2. 6、 2. 5,2. 4,2. 3,2. 2,2. 1,2. 0,1. 9,1. 8、或1. 7分，其評(píng)分在與不包含灰葉斑病QTL的有利等 位基因的近等基因植物進(jìn)行比較時(shí)更高。在一個(gè)1至9的視覺評(píng)分系統(tǒng)中，評(píng)分越高指示 抗性越高。僅當(dāng)在測(cè)量實(shí)驗(yàn)中存在足夠的選擇壓力時(shí)，數(shù)據(jù)將被收集。包括用于選擇包含受關(guān)注標(biāo)記的植物和/或用于將存在的標(biāo)記與耐受性關(guān)聯(lián)的 自動(dòng)化系統(tǒng)的系統(tǒng)也是本發(fā)明的一個(gè)特征。這些系統(tǒng)可包括與標(biāo)記座位檢測(cè)有關(guān)的探針、 用于檢測(cè)探針上標(biāo)記的檢測(cè)器、混合探針與模板和/或擴(kuò)增模板的合適流體處理元件和溫 度控制器、以及將標(biāo)記檢測(cè)與特定標(biāo)記座位或等位基因存在關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)說明書。試劑盒也是本發(fā)明的一個(gè)特征。例如試劑盒可包括用于檢測(cè)耐受性關(guān)聯(lián)的標(biāo)記 座位的合適的引物或探針，以及使用所述引物或探針來檢測(cè)標(biāo)記座位并將基因座與預(yù)測(cè)的 GLS耐受性關(guān)聯(lián)的說明書。該試劑盒還可包括包裝探針、引物、或說明書的包裝材料、對(duì)照物 如包括用于擴(kuò)增的探針、引物或模板核酸的對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)、分子量標(biāo)記等。耐受性標(biāo)記和有利等位基因在傳統(tǒng)的連鎖分析中，不需要直接知道染色體上基因的物理關(guān)系。孟德爾第一定 律是控制成對(duì)性狀的因子會(huì)分離，意指成對(duì)性狀的等位基因分離到兩個(gè)配子中去，然后進(jìn) 入不同的子代?？蓪⒔?jīng)典的連鎖分析認(rèn)為是對(duì)不同性狀的共分離相對(duì)頻率的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。 連鎖分析是關(guān)于性狀如何基于它們共分離的頻率集合的表征良好的描述性結(jié)構(gòu)。即，如果 兩個(gè)非等位性狀以大于隨機(jī)頻率的頻率被一起繼承，將它們稱為“連鎖的”。性狀被一起繼 承的頻率是性狀連鎖緊密程度的主要量度，即以較高頻率被一起繼承的性狀比以較低頻率 (但仍高于隨機(jī)頻率)被一起繼承的性狀連鎖更緊密。性狀連鎖是因?yàn)閷?dǎo)致該性狀的基因 位于相同染色體上?；蛟谌旧w上的位置越分散，它們共分離的可能性越低，因?yàn)橥慈?色體在減數(shù)分裂期間重組。因此基因在染色體上分散的越遠(yuǎn)，在減數(shù)分裂期間將發(fā)生會(huì)導(dǎo) 致兩個(gè)基因分開地分離到子代中的交換事件的可能性越大。連鎖的常見量度是性狀共分離的頻率。這可能以共分離百分比(重組頻率)表示， 或者也常見地以厘摩(cM)表示。cM以先驅(qū)遺傳學(xué)者Thomas Hunt Morgan命名，是遺傳重 組頻率的量度單位。一 cM等于由于在一代中的交換導(dǎo)致的在一個(gè)基因座上的性狀將與在 另一個(gè)基因座上的性狀分離的概率為(意味著性狀99%的情況下共分離)。因?yàn)槿旧?br> 23體距離與性狀間交換事件的頻率大約成比例，有與重組頻率關(guān)聯(lián)的近似物理距離。標(biāo)記座位本身是性狀，并且在分離期間能夠通過跟蹤標(biāo)記座位、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)連鎖分 析進(jìn)行評(píng)估。因此在本發(fā)明的情況下，一 cM等于由于在一代中的交換導(dǎo)致的標(biāo)記座位將 與另一個(gè)基因座(它可為任何其他性狀，例如另一個(gè)標(biāo)記座位，或另一個(gè)編碼QTL的性狀 基因座)分離的概率為1%。本文標(biāo)記參見圖3，例如PHM 15534, PHM 04694、PHM01811、 PHM 01963、PHM 05013、和 PHM 00586，以及任何染色體區(qū)間(i) BNLG1755 和 UMC1299，(ii) BNLG1755和BNLG1621A， (iii)BNLG1755和 MMC0371， (iv)BNLG1755和 UMC1702， (v)UMC156A 和 UMC1299， (vi)UMC156A 禾Π BNLG1621A, (vii)UMC156A 禾Π MMC0371, (viii)UMC156A 和 UMC1702, (ix)UMC1142 和 UMC1299， (x)UMC1142 和 BNLG1621A， (xi)UMC1142 和 MMC0371， (xii)UMC1142 和 UMC1702， (xiii)UMC1346 和 UMC1299， (xiv)UMC1346 和 BNLG1621A， (xv) UMC1346和MMC0371，以及(xvi)UMC1346和UMC1702，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們與新賦予的耐受性、提高 的耐受性、或玉米GLS易感性關(guān)聯(lián)。這意味著標(biāo)記與耐受性性狀的連鎖足夠緊密使得它們 可被用作耐受性性狀的預(yù)報(bào)。這在本文詳述的標(biāo)記輔助選擇(MAS)中是非常有用的。簡(jiǎn)而 言之，能夠選擇標(biāo)記等位基因與耐受性正相關(guān)的玉米植物或種質(zhì)，實(shí)際上不種植玉米并測(cè) 量新賦予的耐受性或提高的耐受性(或者相反地，如果玉米植物具有與新賦予的耐受性或 提高的耐受性負(fù)相關(guān)的標(biāo)記，可不選擇它們)。MAS是一種選擇期望表型并將期望性狀滲入 玉米栽培變種(例如將期望性狀滲入優(yōu)良品系)的強(qiáng)大快捷工具。MAS容易適應(yīng)高通量的 分子分析方法，該方法可迅速篩選大量植物或種質(zhì)遺傳材料的受關(guān)注的標(biāo)記，并且比種植 植物并觀察其可見性狀的方法的性價(jià)比高得多。在一些實(shí)施方案中，QTL標(biāo)記是圖3提供的標(biāo)記的亞群，例如設(shè)計(jì)用于bacb. pk0333. ol9 (例如 PHM 00043)、bacc. pk0267. ml2. f、cl33021_l、bacb. pk0241. hl7. f、 chp2. pk0007. d2、p0094. csstg88、bacb. pk0269. nl9、bacb. pk0009. b21. f、bacb. pk0117. i09. f、bacc. pk0280. nl2、bacb. pk0219. j20、bacc. pk0132. bl6. f、bacb. pk0221. o22、bacb. pk0544. j 18, bacb. pk0540. cl8. f、和 bacm. pk022. b8 (例如 PHM00049)的標(biāo)記。當(dāng)涉及兩個(gè)遺傳因子間的關(guān)系時(shí)，如有助于產(chǎn)生耐受性和緊密關(guān)聯(lián)標(biāo)記的遺傳因 子，則“耦合”相連鎖指示下述狀態(tài)其中在耐受性基因座上的“有利”等位基因與相應(yīng)連鎖 的標(biāo)記座位的“有利”等位基因物理上附連在相同染色體鏈上。在耦合相中，兩個(gè)有利等位 基因被繼承了該染色體鏈的子代一起繼承。在“相斥”相連鎖中，在受關(guān)注基因座上的“有 利”等位基因(例如QTL耐受性)與在緊密連鎖標(biāo)記座位上的“不利”等位基因物理上連 鎖，并且兩個(gè)“有利”等位基因不被一起繼承(即這兩個(gè)基因座彼此“異相”)。標(biāo)記的有利等位基因是與期望表型(例如病害耐受性)共分離的標(biāo)記的等位基 因。如本文所用，雖然所述標(biāo)記具有兩個(gè)或更多個(gè)存在于種群中的有利等位基因是可能的， QTL標(biāo)記具有最少一個(gè)有利等位基因。任何該標(biāo)記的有利等位基因可被有利地用于鑒定和 構(gòu)造耐受性玉米品系。任選地在植物中鑒定不同標(biāo)記的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)有利等位 基因，或者將它們滲入植物，并且它們?cè)贛AS期間可進(jìn)行選擇。期望鑒定具有至少一個(gè)此類 有利等位基因的植物或種質(zhì)，所述有利等位基因與新賦予的或提高的耐受性正相關(guān)。作為另外一種選擇，也發(fā)現(xiàn)與病害易感性關(guān)聯(lián)的標(biāo)記等位基因用于本發(fā)明，因?yàn)?該等位基因可用于鑒定并反選擇病害易感植物。在育種期間此種等位基因可用于排除目的 以鑒定具有與耐受性負(fù)相關(guān)的等位基因的植物或種質(zhì)，從而從隨后若干輪的育種中除去易感植物或種質(zhì)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，同時(shí)選擇多個(gè)標(biāo)記等位基因用于單個(gè)植物或一組植 物。在這些方法中，選擇的植物包含GLS耐受性的有利等位基因，或者將GLS耐受性的有利 等位基因滲入期望的玉米種質(zhì)中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到在相同植物中同時(shí)選擇GLS耐 受性的有利等位基因可能導(dǎo)致對(duì)植物附加的(或甚至協(xié)同的)保護(hù)效應(yīng)。技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到在某些情況下有利標(biāo)記等位基因的鑒別是種質(zhì)特異性的。測(cè)定所 研究的特定種質(zhì)以確定哪些標(biāo)記等位基因與耐受性(或易感性)關(guān)聯(lián)。技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到用 于鑒定有利等位基因的方法是常規(guī)的并且是本領(lǐng)域熟知的，此外鑒定和使用此類有利等位 基因?qū)儆诒景l(fā)明的范圍內(nèi)。此外鑒定除本文使用的或描述的種群之外的玉米種群中的有利 標(biāo)記等位基因?qū)儆诒景l(fā)明的范圍內(nèi)。用于擴(kuò)增SSR型標(biāo)記座位的擴(kuò)增引物是本發(fā)明的特征。本發(fā)明的另一個(gè)特征是特 異用于擴(kuò)增SNP結(jié)構(gòu)域(SNP標(biāo)記)的引物，以及用于檢測(cè)SNP序列的探針。圖9和10提 供了用于標(biāo)記座位擴(kuò)增的特異引物和用于檢測(cè)擴(kuò)增標(biāo)記座位的探針。然而技術(shù)人員將立即 認(rèn)識(shí)到可使用給定引物的任一側(cè)的其他序列代替給定引物，只要該引物能夠擴(kuò)增包括將被 檢測(cè)的等位基因的區(qū)域。此外應(yīng)當(dāng)理解用于檢測(cè)的精確探針能夠改變，例如能鑒定將被檢 測(cè)的標(biāo)記擴(kuò)增子區(qū)域的任何探針可被本文提供的那些實(shí)例取代。此外擴(kuò)增引物和檢測(cè)探針 的構(gòu)型當(dāng)然能夠改變。因此本發(fā)明不受本文所述的引物和探針的限制。在某些方面，本發(fā)明的方法利用擴(kuò)增步驟以檢測(cè)/確定標(biāo)記座位基因型。然而應(yīng) 當(dāng)理解標(biāo)記檢測(cè)不需要擴(kuò)增，例如人們能夠通過簡(jiǎn)單地對(duì)基因組DNA樣品進(jìn)行Southern 印跡直接檢測(cè)未擴(kuò)增的基因組DNA。已經(jīng)確定并提出了進(jìn)行Southern印跡、擴(kuò)增(PCR、 LCR等)以及多種其他核酸檢測(cè)方法的過程，例如Sambrook等人，Molecular CloninR-A Laboratory Manual(第 3 片反)，第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,2000 ( “Sambrook”)；Current Protocolsin Molecular Biology, F. M. Ausubel 等人編輯，Current Protocols, a jointventure between Greene Publishing Associates,Inc. and John Wiley&Sons,Inc. ,(supplemented through 2002) (“Ausubel”) 禾口 PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications (Innis 等人編輯)Academic Press Inc. San Diego，CA(1990) (“Innis”)。關(guān)于檢測(cè)植物中的核酸的附加細(xì)節(jié)也可參 見例如 Plant Molecular Biology (1993)Croy (編輯)BIOSScientific Publishers, Inc. (“Croy，，)。在擴(kuò)增/檢測(cè)方法中也可省略分離檢測(cè)探針，例如通過進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)，該反 應(yīng)通過當(dāng)摻入產(chǎn)物時(shí)改變相關(guān)擴(kuò)增引物、將標(biāo)記核苷酸摻入擴(kuò)增子、或通過監(jiān)控?cái)U(kuò)增子的 摩爾旋光度特性與未擴(kuò)增前體相比的變化(例如通過熒光偏振)來檢測(cè)產(chǎn)物形成。分子標(biāo)記通常通過任何本領(lǐng)域可用的確立方法進(jìn)行檢測(cè)，所述方法不受限制的包 括等位基因特異性雜交(ASH)或其他方法，用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài) 性(AFLP)檢測(cè)、擴(kuò)增可變序列檢測(cè)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)檢測(cè)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài) 性(RFLP)檢測(cè)、自主序列復(fù)制檢測(cè)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)檢測(cè)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)檢 測(cè)、酶切擴(kuò)增多態(tài)序列(CAPS)檢測(cè)、同功酶標(biāo)記檢測(cè)等。雖然本文圖表中提供的示例性標(biāo) 記是SSR或SNP (ASH)標(biāo)記，但是可在本發(fā)明的情況下使用任何前述標(biāo)記類型以鑒定染色體 片段，所述染色體片段包含有助于產(chǎn)生優(yōu)異農(nóng)學(xué)性能(例如新賦予的耐受性或提高的耐受
25性)的遺傳因子。QTL染餼體區(qū)間在某些方面，本發(fā)明提供QTL染色體區(qū)間，其中在那些區(qū)間中包含與GLS耐受性關(guān) 聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)QTL。本領(lǐng)域熟知的多種方法可用于鑒定染色體區(qū)間(在下文實(shí)施例中詳 述)。擴(kuò)展此類染色體區(qū)間的邊界以包含將與一個(gè)或多個(gè)QTL連鎖的標(biāo)記。換句話說，擴(kuò) 展染色體區(qū)間使得位于區(qū)間內(nèi)的任何標(biāo)記(包括限定區(qū)間邊界的末端標(biāo)記)可被用作病害 耐受性標(biāo)記。每個(gè)區(qū)間包含一個(gè)GLS QTL，此外甚至可包含一個(gè)以上的QTL。相同區(qū)間中非 常接近的多個(gè)QTL可攪亂特定標(biāo)記與特定QTL的關(guān)聯(lián)，因?yàn)橐粋€(gè)標(biāo)記可顯示與一個(gè)以上的 QTL連鎖。相反地，例如如果非常接近的兩個(gè)標(biāo)記顯示與期望表型性狀共分離，有時(shí)分不清 楚是否那些標(biāo)記中的每一個(gè)鑒定相同QTL或兩個(gè)不同的QTL。本發(fā)明提供玉米染色體區(qū)間，其中在所述區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記顯示與GLS耐受性共分離 (參見表1)。表 權(quán)利要求
命名為PHJEP的玉米品種的種子，其中所述玉米品種的代表性樣品已經(jīng)作為ATCC保藏號(hào)PTA 8851被保藏，或者得自所述種子的子代種子，所述子代種子包含PHJEP灰葉斑病耐受性基因座，并且當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)，產(chǎn)生表現(xiàn)出灰葉斑病耐受性的植物。
2.由權(quán)利要求1的種子或子代種子產(chǎn)生的植物。
3.權(quán)利要求2的植物的植物細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的子代種子，其中所述PHJEP灰葉斑病耐受性基因座位于PHJEP來源的 染色體區(qū)間上，所述染色體區(qū)間包含由UMC1346和UMC1702限定的PHJEP的染色體區(qū)域。
5.權(quán)利要求1的子代種子，其中所述PHJEP灰葉斑病耐受性基因座由單倍型限定，所述 單倍型包含在 PHM 00045-01 上的 G 在 PHM 00043-01 上的 A 在 PHM 15534-13 上的 A 在 PHM 04694-10 上的 G 在 PHM 01811-32 上的 T 在 PHM 01963-15 上的 T 在 PHM 01963-22 上的 C 在 PHM 05013-12 上的 T 在 PHM 00586-10 上的 T 在 PHM 00049-01 上的 A。
6.權(quán)利要求1的子代種子，其中所述PHJEP灰葉斑病耐受性基因座由單倍型限定，所述 單倍型包含在 PHM 00045-01 上的 G 在 PHM 00043-01 上的 A 在 PHM 01963-22 上的 C 在 PHM 05013-12 上的 T。
7.權(quán)利要求1的子代種子，其中所述子代種子是所述PHJEP灰葉斑病耐受性基因座的 回交轉(zhuǎn)化體。
8.權(quán)利要求7的子代種子，其中所述回交轉(zhuǎn)化體用選自PHVNV、PHW3Y、PHVRA,PHEffB, 和PHWRC的輪回親本產(chǎn)生。
9.權(quán)利要求1的子代種子，其中所述子代種子是雜交品種，并且所述雜交品種的至少 一個(gè)自交親本是所述PHJEP灰葉斑病耐受性基因座到選自PHVNV、PHW3Y、PHVRA, PHEWB、和 PHWRC的輪回親本的回交轉(zhuǎn)化體。
10.用于鑒定包含與灰葉斑病耐受性關(guān)聯(lián)的基因座的第一玉米植物的方法，所述方法 包括(a)獲取所述第一玉米植物在染色體4上BNLG1755和UMC1299之間的染色體區(qū)間的第 一遺傳特征圖，(b)從包含與灰葉斑病耐受性關(guān)聯(lián)的基因座的第二玉米植物獲取第二遺傳特征圖，其 中所述基因座位于染色體4上BNLG1755和UMC1299之間，和(c)比較所述第一遺傳特征圖和所述第二遺傳特征圖。
11.權(quán)利要求10的方法，如果所述第一玉米植物包含與灰葉斑病耐受性關(guān)聯(lián)的基因 座，所述方法還包括選擇所述第一玉米植物。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述第二遺傳特征圖是PHJEP或PHJEP的子代的遺傳特 征圖。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述第二遺傳特征圖包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的標(biāo)記 等位基因在PHM 00045-01上的等位基因G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM 15534-13上的等位基因A、在PHM 04694-10上的等位基因G、在PHM 01811-32上的等位基 因T、在PHM 01963-15上的等位基因T、在PHM 01963-22上的等位基因C、在PHM 05013-12 上的等位基因T、在PHM 00586-10上的等位基因T、以及在PHM 00049-01上的等位基因A。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述第二遺傳特征圖包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的標(biāo)記 等位基因在PHM 00045-01上的等位基因G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM 01963-22上的等位基因C、和在PHM 05013-12上的等位基因T。
15.權(quán)利要求10的方法，其中將所述第一遺傳特征圖和所述第二遺傳特征圖進(jìn)一步限 定為在染色體4上在BNLG1755和MMC0371之間的染色體區(qū)間的遺傳特征圖。
16.權(quán)利要求10的方法，其中與灰葉斑病耐受性關(guān)聯(lián)的基因座是PHM15534、PHM 04694、PHM 01811、PHM 01963、PHM 05013、或 PHM 00586。
17.通過權(quán)利要求10的方法鑒定的玉米植物。
18.權(quán)利要求17的玉米植物的細(xì)胞。
19.權(quán)利要求17的玉米植物的種子。
20.用于鑒定包含與灰葉斑病耐受性關(guān)聯(lián)的基因座的第一玉米植物的方法，所述方法 包括(a)獲取所述第一玉米植物在染色體4上的區(qū)間中的第一遺傳特征圖，所述區(qū)間由以 下序列描述并且包括以下序列SEQ ID NO :86，或基于Clustal V比對(duì)方法與SEQ ID NO: 86具有95%同一性的核苷酸序列，以及SEQ ID NO :87，或基于Clustal V比對(duì)方法與SEQ ID NO 87具有95%同一性的核苷酸序列；以及(b)從包含與灰葉斑病耐受性關(guān)聯(lián)的基因座的第二玉米植物獲取第二遺傳特征圖，其 中所述基因座位于所述區(qū)間中，和(c)比較所述第一遺傳特征圖和所述第二遺傳特征圖。
21.包含以下單倍型的玉米種子 在PHM 00045-01上的等位基因G 在PHM 00043-01上的等位基因A 在PHM 15534-13上的等位基因A 在PHM 04694-10上的等位基因G 在PHM 01811-32上的等位基因T 在PHM 01963-15上的等位基因T 在PHM 01963-22上的等位基因C 在PHM 05013-12上的等位基因T 在PHM 00586-10上的等位基因T 在PHM 00049-01上的等位基因A。
22.由權(quán)利要求21的玉米種子生產(chǎn)的植物。
23.包含以下單倍型的玉米種子 在PHM 00045-01上的等位基因G 在PHM 00043-01上的等位基因A在PHM 01963-22上的等位基因C，和 在PHM 05013-12上的等位基因T。
24.由權(quán)利要求23的玉米種子生產(chǎn)的植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定具有對(duì)灰葉斑病(GLS)新賦予的耐受性或提高的耐受性、或易感灰葉斑病的玉米植物的方法和組合物。所述方法使用分子遺傳標(biāo)記鑒定、選擇和/或構(gòu)建耐受性植物或鑒定并反選擇易感植物。顯示對(duì)GLS新賦予的耐受性或提高的耐受性的玉米植物也是本發(fā)明的一個(gè)特征，所述植物通過本發(fā)明的方法生成。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101970669SQ200880127682
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月31日
發(fā)明者W·A·威爾遜, 李柏林 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司;先鋒國(guó)際良種公司