專利名稱：：用basp1基因和/或srd5a2基因中的甲基化胞嘧啶檢測肝癌、肝癌風險、肝癌...的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明提供以下方法、試劑盒和試劑通過鑒定和/或定量臨床樣品中的特定基因和/或其DNA片段的曱基化，來檢測肝癌、肝癌風險、肝癌復發(fā)風險和肝癌惡化并監(jiān)測肝癌隨時間進展。
背景技術：
：肝癌自慢性肝病(慢性肝炎和肝硬化)發(fā)展而來，這種起因的大部分病例會伴隨長期的肝炎病毒感染。在日本，超過95%的肝癌患者雍患長期的乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染，特別是超過80%的肝癌源自HCV相關疾病。肝炎患者通常在肝炎出現(xiàn)后的20-30年內變得更嚴重，并在進展為肝硬化后發(fā)展為肝癌。肝硬化前期(纖維化程度F3)和肝硬化(纖維化程度F4)尤其與高肝癌率有關，據(jù)稱那些患者將在10年內發(fā)展為肝癌。發(fā)病的年齡為60歲以上，在老一代人中病例更多。也存在在發(fā)生肝炎后，在相對早的時期及在較年輕一代中發(fā)展為肝癌的病例。但對這種病例的起因尚未十分明確。過去，常規(guī)進行以下方法來檢測肝癌:用現(xiàn)有的腫瘤標記AFP(a-曱胎蛋白)和PIVKA-II(維生素K缺乏誘發(fā)的蛋白-II)的免疫分析進行篩選，和通過高風險肝癌患者的回聲測定(超聲波檢查)進行監(jiān)測。，對于通過這些檢測已被懷疑患有肝癌的患者，通過診斷成像、更詳細的回聲、CT(計算機層析X射線照相術)或MRI(磁共振成像)檢測來證實肝癌的位置、大小和數(shù)量。此外，若有需要，通過活組織檢查用病理檢測來最終確診肝癌。對已經確診的肝癌進行治療肝切除術、經導管動脈栓塞術(TAE)、穿刺治療(經皮乙醇注射療法(PEIT)、射頻消融(RFA)和微波凝固治療(MCT))。然而，由于沒有除去病毒，以及即使經過治療肝病也沒有被治愈，因此肝癌復發(fā)率極高。如果通過目前的免疫分析和回聲測定檢測出早期肝癌(直徑小于3cm、直徑小于5cm和單一的或高度分化的肺瘤)，并經過適當治療，則預后相對4交好。然而，用于免疫分析的現(xiàn)有的腫瘤標記AFP和PIVKA-II的靈敏度和特異性不夠。尤其是對于早期肝癌，這兩種標記的靈敏度明顯很低(參見非專利文獻l、2、3和4)。因此，很難檢測早期肝癌，當檢測到時大部分病例已經發(fā)展為晚期癌癥(advancedcancer)，與其它癌癥比較，肝癌患者5年內的存活率很低(參見非專利文獻5)同時，當前在回聲測定中儀器的改進使我們能夠檢測早期肝癌，但因為如下若干問題其不適合篩選高風險肝癌患者一次測定耗時30分鐘左右、需要專門技能、依賴儀器性能和對普通醫(yī)院的普及率較低。另外，由于很難檢查整個肝，尤其是被其它器官遮住的部分和肝的內部，因此存在漏檢肝癌風險。因此，仍沒有足夠令人滿意的現(xiàn)有的用于檢測肝癌尤其是早期肝癌的方法。近來分子生物學技術的發(fā)展正在闡明人癌細胞中沒有任何遺傳變化和任何核苷酸序列改變的DNA修飾的特征?；蜃兓⑼蛔?、擴增和缺損的特征作為代表性實例已眾所周知。通過近來的表觀遺傳學(epigeneticalstudy)研究，已經報道在變異細胞(variable.cell)尤其是癌細胞中特定基因高度反常地曱基化。在高等真核細胞中，基因組DNA僅在CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基上被曱基化，富含CpG的區(qū)域稱為"CpG島"，已知其在完整的人類基因組的大約一半上存在。通常CpG島存在于啟動子區(qū)，在這種情況下曱基化與基因表達調控密切相關。簡言之，在未曱基化情況下，基因可表達(轉錄出mRNA)，但在曱基化情況下，通過某些調控系統(tǒng)的過程基因表達相反受到抑制。已知這種通過曱基化的基因表達調控對組織、發(fā)育、分化、疾病、性別或年齡具有特異性。特別地，由于在癌細胞或轉化細胞中經常觀察到受CpG島上的異常的高度曱基化阻抑的基因表達，因此認為其與癌癥發(fā)生有關。基于基礎研究中的這些證據(jù)，迄今一直在變異癌癥中進行關于CpG島上異常的高度曱基化與癌癥發(fā)生之間關系的臨床研究。在肝癌中，一直在進行類似的臨床研究，業(yè)已報道在肝癌患者的肺瘤組織中觀察到特定基因的異常的高度曱基化(參見非專利文獻6、7和8)。因此，可推斷的是，將對癌細胞的特定基因或其DNA片段上的曱基化的鑒定用于診斷，對檢測早期癌癥而言非常有用。另外，曱基化被認為是與癌癥發(fā)生直接相關的因素之一，它被認為是在癌癥發(fā)生前發(fā)展；隨癌癥進展或惡化而改變；并且對不同患者或臨床病癥表現(xiàn)出不同概況。因此，曱基化的鑒定可能能夠用于檢測癌癥前病灶、預測肝癌治療后的復發(fā)、檢測肝癌惡化和監(jiān)測肝癌隨時間的進展。然而，先前的臨床研究結果是用確診后的用于分析的腫瘤組織DNA樣品來獲得，因此不能滿足用于檢測早期肝癌或肝癌發(fā)生風險的篩選用途。使用組織的測定由于操作復雜和樣品處理能力極低而不適于常規(guī)試驗。另外，用于分析的多種基因和分析中使用單種基因選擇不當，可造成靈敏度和特異性不足。因此，實踐中很難將DNA片段曱基化的鑒定用于診斷癌癥。同時，少量DNA在血液中循環(huán)，尤其是業(yè)已知曉癌癥患者血液中DNA的量不斷增力o(參見非專利文獻9和10)。研究認為這是由于以下原因引起當胂瘤組織以異常速度不斷增殖時，較老的細胞通過程序性死亡(細胞凋亡)或壞死而被破壞，其中的大量DNA釋放到血液中，。因為來自變異組織或血液細胞的DNA以及源自腫瘤組織的DNA都包括在血液中，所以一直以來很難通過用常規(guī)技術來區(qū)分來源于特定腫瘤組織的DNA。但是，利用血液中的DNA來診斷癌癥是極有前景的診斷實踐應用。參考文獻9[專利文獻l]TetznerR等，WO2004/113567:24-25,2004[非專利文獻l]NomuraF等，AmJGastroenterol94:650-4，1999[非專利文獻2]MartinezCerezoFJ等，P、evEspEnfermDig84:311-4,1993HanSL等，Hepatogastroenterology52:348-512005[非專利文獻5]OsakaCancerRegistry,Annualreport2006[非專利文獻6]YuJ等，CellRes13:319-33,2003[非專利文獻7]KanaiY等，Hepatology29:703-9，1999[非專利文獻8]KondoY等，Hepatology32:970-9,2000[非專利文獻9]LeonSA等，JImmunolMethods9:157-64,1975[非專利文獻10]RenN等，WorldJGastroenterol12:3911-4,2006[非專利文獻ll]HermanJG等，ProcNatlAcadSciUSA93:9821-6，1996.CottrdlSE等，NucleicAcidsRes32:el0,2004.[非專利文獻13]EadsCA等，NucleicAcidsRes28:e32，2000.[非專利文獻14]IizukaN等，Lancet361:923-929,2003[非專利文獻15]TheGeneralRulesfortheClinicalandPathologicStudyofPrimaryLiverCancerLiver(用于原發(fā)性肝癌的臨床和病理研究通用法則)，LiverCancerStudyGroupofJapan(日本肝癌研討會)，第二版。Tokyo:Kanehara&CO"LTD,2003.發(fā)明簡述本發(fā)明目的是解決通過使用常規(guī)腫瘤標記的免疫分析和對高風險肝癌患者的回聲測定來篩選或監(jiān)測肝癌中的問題；發(fā)現(xiàn)可高靈敏和高特異性地檢測的新肺瘤標記，甚至發(fā)現(xiàn)很難通過常規(guī)方法檢測的早期肝癌；并提供使用這些標記來進行的簡單、準確和高通量的方法及其試劑盒和試劑。本發(fā)明還旨在提供通過用血液樣品作為測量靶標用于易于自動化的肝癌檢測的方法。另外，利用合適的新的腫瘤標記，來實現(xiàn)為高風險肝癌患者檢測癌癥前病灶和預測肝癌治療后的復發(fā)，和實現(xiàn)為肝癌患者檢測肝癌惡化和監(jiān)測肝癌隨時間的i^良，這也是本發(fā)明目標。因此，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)預料不到地可通過鑒定和/或定量臨床樣品中的一種或多種特定基因或其各自的DNA片段的甲基化，來高靈敏度、高特異性且容易準確地檢測肝癌，尤其是早期肝癌；可容易地檢測肝癌風險、肝癌治療后的復發(fā)風險和肝癌惡化;.可容易地監(jiān)測肝癌隨時間的進展，據(jù)此發(fā)明人完成了本發(fā)明。簡言之，本發(fā)明關鍵要點是用于檢測肝癌、檢測肝癌風險、檢測肝癌治療后復發(fā)、檢測肝癌惡化和監(jiān)測肝癌隨時間的*的方法。更具體地，本發(fā)明涉及以下方法用于檢測BASP1基因和/或SRD5A2基因中含CpG序列的區(qū)域中的肝癌特異性的曱基化胞嘧啶的存在情況和/或量的方法，該方法包括下述步驟(a)-(d)，其中患者樣品中的BASP1基因和/或SRD5A2基因中肝癌特異性的甲基化胞嘧啶的存在和/或量是患者以下情況的指征罹患肝癌；肝癌風險增加；具有肝癌治療后復發(fā)風險；具有惡性肝癌；或肝癌隨時間進展，所述步驟如下進行(a)從來自患者的樣品中分離基因組DNA;(b)提供用于化學處理或酶處理所述基因組DNA的試劑，以區(qū)分(differectiate)曱基化胞嘧啶和非曱基化胞嘧啶；(c)用PCR方法擴增基因組DNA的BASP1基因和/或SRD5A2基因的含曱基化胞嘧啶的區(qū)域；和(d)測定所述患者樣品中的BASP1基因和/或SRD5A2基因的含CpG序列的區(qū)域中的肝癌特異性曱基化胞嘧啶的存在情況和/或量，其存在和/或量表明患者罹患肝癌、肝癌風險增加、具有肝癌治療后復發(fā)風險、具有惡性肝癌或肝癌隨時間進展。本發(fā)明另一目標是用于指示患者罹患肝癌、肝癌風險增加、具有肝癌治療后復發(fā)風險、具有惡性肝癌或肝癌隨時間進展的方法，所述方法通過用包括以下步驟(a)-(d)的方法檢測患者樣品中的BASP1基因、SRD5A2基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFT緣因或RASSFl基因中的至少兩種基因中的含CpG序列區(qū)域中的肝癌特異性甲基化胞嘧啶的存在情況和/或量，以及通過與所述曱基化胞嗜咬的存在情況和/或量聯(lián)合運用來進行(a)從來自患者的樣品中分離基因組DNA;(b)提供用于化學處理或酶處理所述基因組DNA的試劑，以區(qū)分曱基化胞嘧啶和非曱基化胞嘧啶；(c)用PCR方法擴增基因組DNA的BASP1基因、SRD5A2基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFTR基因或RASSF1基因中的至少2種基因的含曱基化胞嘧啶的區(qū)域；和(d)測定所述患者樣品中的BASPl基因、SRD5A2基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFT驢因或RASSF1基因中的至少2種基因的含CpG序列的區(qū)域中的肝癌特異性甲基化胞嘧啶的存在情況和/或量，其存在和/或量表明患者罹患肝癌、肝癌風險增加、具有肝癌治療后復發(fā)風險、具有惡性肝癌或肝癌隨時間進展。本發(fā)明更具體的目標是上述方法中的任一種，其中PCR引物對中的任一個引物的核苷酸序列與基因組DNA核苷酸序列在包含可經歷甲基化的胞嘧啶殘基的區(qū)域處互補，并當所述胞嘧啶甲基化時可與所述基因組DNA的核苷酸序列特異性雜交?；蛘?，本發(fā)明優(yōu)選實施方案為上述過程的方法，其中PCR引物對中的至少任一個引物可與不含可經歷曱基化的胞嘧啶殘基的區(qū)域特異性雜交，并且同時使用用于阻斷由所述PCR引物進行的擴增的寡核普酸，所述寡核苷酸的核苷酸序列與所述PCR引物的核苷酸序列部分地重疊，且在其它部分與基因組DNA核苷酸序列在包含可經歷曱基化的胞嘧啶殘基的區(qū)域處互補，當所述胞嘧啶未曱基化時，所述寡核苷酸可與所述基因組DNA核苷酸序列特異性雜交。12所述方法中的任一種的優(yōu)選實施方案為，其中將用于使未曱基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶的試劑提供給基因組DNA來作為步驟(b)的化學處理，以使所述DNA的幾乎所有未曱基化的胞嘧啶轉化為尿嗜啶。亞硫酸氫鹽的試劑，例如亞硫酸氫鈉和/或亞石克酸鈉和/或6-羥基-2,5，7，8-四曱基色滿-2-甲酸。所述方法中的任一種的另外優(yōu)選實施方案為，其中將限制酶提供給基因組DNA來作為步驟(b)的酶處理，所述限制酶不能消化含曱基化胞嘧啶識別位點但可消化不含曱基化胞嘧啶識別位點。優(yōu)選血液樣品，其中同時應用常用的腫瘤標記蛋白(例如AFP和/或PIVKA-II)的濃度值和/或不定的(freefloating)DNA量的濃度值，例如GSTP1基因的量。本發(fā)明方法優(yōu)選用于測定早期肝癌。用于本發(fā)明的樣品來源于人血清、血漿、全血、組織、血液細胞、排泄物或內分泌物/外分泌物。另外，本發(fā)明優(yōu)選其中在步驟(c)中實施用熒光探針的實時PCR擴增的實施方案。本發(fā)明還涉及一種方法，其中PCR引物對可與不含可經歷曱基化的胞嘧啶殘基的基因組DNA核苷酸序列至少在其3'-端處特異性雜交，對于步驟(d)，通過序列分析或通過質譜來進行由所述PCR引物擴增的產物中曱基化胞嘧啶的存在情況和/或量的測定。本發(fā)明優(yōu)選包含兩種核酸引物的以下引物對1)BASP1一MSF(SEQIDNo:l)和BASP1—MSR(SEQIDNo:2)2)SPINT2—MSF(SEQIDNo:3)和SPINT2一MSR(SEQIDNo:4)3)APC一MSF(SEQIDNo:5)和APC一MSR(SEQIDNo:6)4)CCND2一MSF(SEQIDNo:7)和CCND2一MSR(SEQIDNo:8)5)CFTR一MSF(SEQIDNo:9)和CFTR一MSR(SEQIDNo:lO)6)RASSF1—MSF(SEQIDNo:ll)和RASSF1—MSR(SEQIDNo:12)7)SRD5A2一MSF(SEQIDNo:13)和SRD5A2—MSR(SEQIDNo:14)8)BASP1一F(SEQIDNo:15)和BASP1—R(SEQIDNo:16)9)PINT2—F(SEQIDNo:17)和SPINT2一R(SEQIDNo:18)10)APC一F(SEQIDNo:19)和APC—R(SEQIDNo:20)11)CCND2—F(SEQIDNo:21)和CCND2一R(SEQIDNo:22)12)CFTR一F(SEQIDNo:23)和CFTR一R(SEQIDNo:24)13)RASSF1—F(SEQIDNo:25)和RASSF1—R(SEQIDNo:26)14)SRD5A2—F(SEQIDNo:27)和SRD5A2—R(SEQIDNo:28)15)SPINT2—HMF(SEQIDNo:29)和SPINT2—HMR(SEQIDNo:30)。本發(fā)明優(yōu)選探針選自以下1)BASPl一TMP(SEQIDNo:31)2)SPINT2—TMP(SEQIDNo:32)3)APC—TMP(SEQIDNo:33)4)CCND2—TMP(SEQIDNo:34)5)CFTR一TMP(SEQIDNo:35)6)RASSFl一TMP(SEQIDNo:36)7)SRD5A2JTMP(SEQIDNo:37)8)SPINT2—HMBF(SEQIDNo:38)9)SPINT2_HMBR(SEQIDNo:39)。本發(fā)明另一目標是試劑盒，其用于檢測肝癌特異性的曱基化胞嘧啶堿基的存在情況和/或量的方法中的任一種，或用于表明患者罹患肝癌或在將來可能罹患肝癌的方法中的任一種，所述試劑盒包含(a)上述引物對中的至少一對，和/或；(b)上述探針中的至少一種。本發(fā)明另外的目標是試劑，其用于檢測肝癌特異性的曱基化胞嘧啶堿基的存在情況和/或量的方法中的任一種，或用于指示患者罹患肝癌或在將來可能罹患肝癌的方法中的任一種，所述試劑包括.(a)上述引物對中的至少一對，和/或；(b)上述探針中的至少一對。本發(fā)明另一目標是用于上述方法中的任一種的裝置系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括(a)上述引物對中的至少一對，和/或；(b)上述探針中的至少一種。本發(fā)明還涉及上述引物或探針的以下用途用于檢測患者樣品中的HCC相關基因的含CpG序列區(qū)域中的肝癌特異性甲基化胞嘧咬堿基的存在情況和/或量，或用于檢測患者肝癌、肝癌風險增加、肝癌治療后復發(fā)風險、惡性肝癌或肝癌隨時間進展。通過用本發(fā)明測定方法容易并準確地檢測臨床樣品的肝癌(尤其是早期肝癌)情況是可能的，通過預先檢測肝癌風險和肝癌治療后復發(fā)風險，預期有助于改進肝癌患者治療的效果。作為另一用途，通過檢測肝癌惡化和監(jiān)測肝癌隨時間的進展，預期提供了用于確定肝癌療程的指征。發(fā)明詳述(l)肝癌特異性曱基化基因發(fā)明人通過比較由手術切離自肝癌患者的76例腫瘤組織和16例非腫瘤組織之間的基因表達水平，選出在腫瘤組織中其表達水平特異性降低的基因，也即其CpG島很可能高度曱基化的基因，另外，選出在其啟動子區(qū)確實具有CpG島的23種肝癌特異性曱基化候選基因。接下來，通過為所述候選基因進行對來源于切離自早期肝癌患者的腫瘤組織的基因組DNA曱基化分析，選出兩種肝癌特異性曱基化候選基因。另外，通過確證對肝癌患者血液中的所述兩種基因具有特異性的肝癌來源的曱基化DNA片段的檢測，最終將所述兩種基因(SAST^(brainabundantmembraneattachedsignalprotein1,大月S富含的膜W十著4言號蛋白1)基因和57A^2(類固醇-5a-還原酶，a多肽2)基因)鑒定為肝癌特異性曱基化基因。所述兩種基因SJ5P/基因和5TD^42基因都已#皮克隆，其cDNA(mRNA)序列業(yè)已登記在GenBank中(A4S尸7:NM—006317,S/Z^」么NM—000348)。然而，尚未表明所述兩種基因的CpG島以癌癥特異性的方式高度曱基化。本發(fā)明發(fā)明人首次出人意料地發(fā)現(xiàn)所述兩種基因在肝腫瘤組織中高度曱基化，但在非腫瘤肝組織中很少曱基化。也就是說，他們發(fā)現(xiàn)所述兩種基因以肝癌特異性德方式高度曱基化,因而適合作為^r測肝癌的標記。同時，對于業(yè)已在先前的公開參考文獻中"t艮道的12種肝癌特異性曱基化異常的基因，通過對來源于切離自早期肝癌患者的腫瘤組織的基因組DNA實施曱基化分析，選出9種肝癌特異性曱基化候選基因。另外，通過確證對肝癌患者血液中的所述9種基因中的5種基因具有特異性的肝癌來源的曱基化DNA片段的檢測，最終將所述5種基因0S尸/AT2(絲氨酸蛋白酶抑制劑，kunitz型，2)基因、乂PC(腺瘤樣息肉及結腸癌)基因、CCM)2(細胞周期蛋白D2)基因、CF77(嚢性纖維化跨膜傳導調節(jié)蛋白，ATP-結合盒(binding-cassette))基因和iL4M尸7(Ras相關(RalGDS/AF-6)結構域家族l)基因)鑒定為肝癌特異性曱基化基因。所述5種基因S尸/AT基因、^尸C基因、CCA^Z)2基因、CF77基因和/ASSF7基因已經全部克隆，其cDNA(mRNA)序列業(yè)已登記在GenBank(6TYA72:NM一021102」尸C:NM—000038、CCM)2:NM—001759、CF77:NMJ)00492、7AXS尸7:NM—007182)。有若干報道表明所述5種基因的CpG島以肝癌特異性方式高度甲基化，但其甲基化頻率不同,在HCV陽性肝癌中未曾有過報道。發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)所述5種基因在HCV陽性肝胂瘤組織中高度曱基化，但在非腫瘤肝組織中很少曱基化。也就是說，他們發(fā)現(xiàn)所述5種基因以HCV陽性肝癌特異性方式高度曱基化，因而適合作為檢測肝癌(尤其是HCV陽性肝癌)的標記?？赏ㄟ^本發(fā)明檢測的癌癥優(yōu)選肝癌，更優(yōu)選肝細胞癌(HCC)，最16優(yōu)選HCV陽性HCC。在本發(fā)明中，肝癌才企測是指判斷受檢查者是否被懷疑患有肝癌。當受檢查者已被懷疑患有肝癌時，通過診斷成像和病理檢測來確診肝癌。本發(fā)明中檢測肝癌風險是指判斷受檢查者在不久的將來有沒有發(fā)展肝癌的高度可能。本發(fā)明中檢測肝癌復發(fā)是指判斷受檢查者有沒有在肝癌治療后復發(fā)肝癌的可能。本發(fā)明中檢測肝癌惡化是指判斷受檢查者的肝癌的發(fā)展是否高度惡化。本發(fā)明中監(jiān)測肝癌隨時間的進展是指判斷受檢查者的肝癌是否隨時間進展。另外，本發(fā)明涉及以下方法利用臨床樣品并通過鑒定和/或定量所述樣品中的SAS^基因和/或57A5^基因或其DNA片段上的曱基化或者所述樣品中的上述7種基因A4S尸/基因、S朋W2基因、57W72基因、爿尸C基因、CCM)2基因、CKTR基因和7ASS/^基因中的至少2種或其DNA片段上的曱基化，來檢測肝癌。本發(fā)明優(yōu)選使用包含3種或更多種基因的組合，但更優(yōu)選使用^ASP/基因、S^DX42基因或57W72基因。根據(jù)本發(fā)明，可將血液中常用的腫瘤標記蛋白的濃度值和/或血液中不定的DNA量與所述7種基因上的曱基化胞嘧啶的鑒定結果和/或定量值結合利用。常用的腫瘤標記蛋白優(yōu)選AFP和/或PIVKA-n,特別是AFP。不定的DNA量優(yōu)選為對GS7P7基因所測出的量。在亞硫酸氫鹽(BIS)處理之前或之后的DNA可用作被測量的DNA，其中優(yōu)選使用BIS處理后的DNA。臨床樣品原則上不受限制，只要是從受檢查者中獲得的即可。例如，血清、血漿、全血、組織、血液細胞、排泄物或內分泌物/外分泌物都可適用于本發(fā)明。優(yōu)選血清、血漿和全血，尤其優(yōu)選使用血清。活檢材料和通過手術切除的組織是合適的組織樣品，糞便和尿液是合適的排泄物樣品，膽汁和胰液是合適的內分泌物/外分泌物樣品。受檢查者或患者也不受限制，只要是人類即可。本發(fā)明優(yōu)選應用于高風險肝癌患者(慢性肝炎和肝硬化)，特別是HCV陽性高風險肝癌患者或肝癌患者。罹患肝癌并經過合適治療的患者可包括在高風險肝癌患者中。(2)甲基化的鑒定和/或定量根據(jù)本發(fā)明，"特定基因的曱基化鑒定和/或定量"是指確定包含在臨床樣品中特定基因的啟動子區(qū)的CpG島上的CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基的曱基化情況和/或定量所述曱基化水平。用于鑒定和/或定量甲基化的方法優(yōu)選甲基化特異性PCR(MSP)(參見非專利文獻11)和/或HM-PCR(重曱基(HeavyMethyl)PCR)(參見非專利文獻12)，其尤其優(yōu)選用TaqMan探針的TaqMan-MSP和/或TaqMan-HM-PCR(參見非專利文獻13)。對于擴增試劑，可使用根據(jù)公開方法自制的試劑，優(yōu)選使用LightCyclerTaqManMaster試劑盒(RocheDiagnosticsGmbH)。MSP是指本發(fā)明方法，其中PCR引物對中的至少任一個引物的核香酸序列與基因組DNA核苷酸序列在包含可經歷曱基化的胞嘧啶殘基的區(qū)域處互補，并當所述胞嘧啶被曱基化時，可與所述基因組DNA核苷酸序列特異性雜交。特別地，當可經歷曱基化的胞嘧咬被曱基化時，用可與含所述曱基化胞嘧啶的核苷酸序列特異性雜交的PCR引物進行PCR擴增，根據(jù)是否發(fā)生所述擴增來檢測是否存在曱基化。HM-PCR是指本發(fā)明方法，其中PCR引物對中的至少任一個引物可與不含可經過曱基化的胞嘧啶殘基的區(qū)域特異性雜交，并且同時使用用于阻斷由所述PCR引物進行的擴增的寡核普酸，所述寡核苷酸的核苷酸序列與所述PCR弓1物的核苷酸序列部分地重疊，且在其它部分與基補，當所述胞嘧啶未曱基化時，所述寡核苷酸可與所述基因組DNA核苦酸序列特異性雜交。特別地，PCR引物可與不含可經歷曱基化的胞嘧啶的核苷酸序列特異性雜交，也就是說，同時使用不依賴胞嘧咬曱基化的非曱基化特異性PCR引物和適用于阻斷由所述PCR《1物進行擴增的寡核苷酸(阻斷探針)。所述阻斷探針與所述PCR引物部分重疊。因此，當所述阻斷探針與靶標核苷酸序列雜交時，因所述PCR引物不能雜交，而擴增被阻斷。所述阻斷探針的其它部分與含可經歷甲基化的胞嘧啶的核苦酸序列互補，因而當所述胞嘧啶未甲基化時，所述探針可與含所述未甲基化的胞嘧啶的核苷酸序列特異性雜交。因此，通過所述PCR引物進行擴增，并且只有當胞嘧啶被曱基化時，才可根據(jù)是否發(fā)生由所述PCR引物的進行所述擴增，來檢測是否存在曱基化。另外，可應用其它方法來鑒定和/或定量本發(fā)明的曱基化，所述方法例如序列分析或質譜法，此處序列分析優(yōu)選用Pyrosequencer(BiotageAG)。根據(jù)本發(fā)明，為了鑒定和/或定量特定基因的曱基化，有必要從臨床樣品提取DNA用于預處理。例如，市售試劑盒如MagNAPureLCDNA分離"i式劑盒I(RocheDiagnosticsGmbH)或QIAampDNABloodMidi試劑盒(QIAGENGmbH)，或按已知方法制備的試劑，可用于DNA提取。優(yōu)選采用DNAExtractorSP試劑盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)從血清和血漿中提取DNA。用亞硫酸氫鹽試劑處理提取的DNA，將DNA上未曱基化的胞嘧啶轉化為尿嘧咬(BIS處理)。市售試劑盒如EpiTectBisulfite試劑盒(QIAGENGmbH)、EZDNA甲基化-Gold試劑盒(ZymoResearchCorporation)或DNA修飾試劑盒(Chemicor^International,Inc.)，或按已知方法制備的試劑，可用于BIS處理。通過核酸擴增方法如PCR,來擴增DNA的包含CpG島的區(qū)域(所述DNA中未曱基化的胞嘧啶被所述BIS處理轉化為尿嘧啶)，并用所述擴增產物來確證所述DNA，該DNA中未曱基化的胞嘧啶已被普遍(regularly)轉化為尿嘧啶。19具體而言，上迷過程通過以下方法來進行用引物通過核酸擴增來擴增未被BIS處理轉化為尿嘧啶的曱基化胞嘧咬的核普酸序列和轉化為尿嘧啶的未曱基化的胞嘧啶的核苷酸序列；通過所迷擴增產物的電泳和/或序列分析來確證所述擴增產物。所述擴增產物的長度通常可低于1000bp,優(yōu)選低于180bp，特別優(yōu)選大約為IOObp。在本發(fā)明中，優(yōu)選的引物對和通過所述引物對擴增所得的產物長度如表1所示。表l:用于肝癌特異性曱基化基因的MSP擴增的引物對<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>在以上核酸擴增中，TaqMan探針如表2所示，所述探針與表l所述的引物對l-7同時使用，能夠通過進行實時PCR來特異性鑒定和/或定量曱基化的胞嘧啶。用兩種不同的熒光物質在其5，端和3，端標記這些探針。焚光物質的使用不受限制，只要它們是兩種不同熒光物質即可。優(yōu)選例如用FAM標記5，端，尤其是用TAMRA標記3，端。表2:為鑒定MSP擴增得肝癌特異性曱基化基因產物的TaqMan探針<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>在上述核酸擴增中，阻斷探針如表3所示，所述探針與表l所述引物對15同時使用，能夠通過進行HM-PCR反應來特異性鑒定和/或定量曱基化胞的嘧啶。這些阻斷探針用標記物質來保護。標記物質原則上不受限制，只要可用所述阻斷探針來阻斷DNA延伸反應即可，優(yōu)選用磷酸鹽標記。另外，所述阻斷探針可用作單一試劑，優(yōu)選一次使用兩種探針。表3:用于肝癌特異性曱基化基因的HM-PCR的阻斷探針<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>本發(fā)明涉及上述引物和探針以及用于檢測肝癌、檢測肝癌風險、^r測肝癌治療后復發(fā)、檢測肝癌惡化和監(jiān)測肝癌隨時間的進展的方法。另外，本發(fā)明包括用于檢測肝癌的試劑盒和試劑，試劑可包括引物和探針，而試劑盒可包含用于DNA提取、BIS處理和核酸擴增的試劑在其內。本發(fā)明包括用于檢測肝癌、檢測肝癌風險、檢測肝癌治療后復發(fā)、檢測肝癌惡化和監(jiān)測肝癌隨時間的進展的裝置系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中利用用于檢測肝癌、檢測肝癌風險、檢測肝癌治療后復發(fā)、檢測肝癌惡化和監(jiān)測肝癌隨時間的進展的方法、試劑盒、試劑、引物和探針本領域技術人員可易于理解的是，某些堿基可在上述引物中的SEQIDNo.l-I4的5，端中缺失或插入，所述引物包括在能擴增所述7種胞嘧啶特異性曱基化基因的引物的范圍內。某些堿基可在上述引物中的SEQIDNo.l5-30的5，端缺失或插入，所述引物包括在能特異性擴增所述7種基因的引物的范圍內。因此，本發(fā)明引物包括其中某些堿基在所述范圍內的SEQIDNo.l-30中缺失或插入的引物。某些石咸基可在上述探針的末端缺失或插入，所述探針包含在可與用上述引物中的SEQIDNo.l-14和29-30擴增所得的產物中的核酸序列雜交的探針范圍內，所述核苦酸序列包含曱基化的胞嘧啶，也就是說，所述探針保持所述探針原有的雜交特異性。因此，本發(fā)明探針包括其中某些堿基在SEQIDNo.31-37上缺失或插入的在上述范圍內探針。另外，它們包含所述探針的互補鏈。某些堿基可在上述阻斷探針的末端缺失或插入，所述阻斷探針包含在能阻斷由引物對15進行的擴增的探針范圍內。因此，本發(fā)明的阻斷探針包括某些堿基在SEQIDNo.38和39上缺失或插入的在所述范圍內的阻斷探針。實施例接下來，通過展示可實際上用已知樣品實施的實施例來更詳細地解釋本發(fā)明。然而，本發(fā)明所延伸的范圍不僅僅限于這些實施例。實施例l.肝癌特異性甲基化基因的鑒定利用"AffymetrixHumanGenomeU95ADNAChips",通過在手術切自肝癌患者的76例胂瘤組織和16例非腫瘤組織之間比較基因表達水平，我們選出在腫瘤組織中表達水平特異性顯著降低2倍的101種基因，也就是說，這些基因的CpG島很可能高度甲基化。從所述基因中進一步選出23種在其啟動子區(qū)中實際含有CpG島的肝癌特異性曱基化候選基因。接下來，用BIS處理從20例早期肝癌患者(分級為I期或II期的肝癌,腫瘤尺寸小于1.3-3.6cm)獲得的各liig的腫瘤組織基因組DNA，用所述經BIS處理的DNA作為模板通過PCR擴增上述23種候選基因的包含CpG島的區(qū)域，通過直接序列測定來檢查曱基化情況。同樣地，同時分析來自正常肝組織和白細胞的基因組DNA的曱基化情況作為對照樣品。具體而言，作為曱基化分析結果，選出了4種在胂瘤組織中但不在正常肝組織和白細胞中高度曱基化的基因。進一步地，通過用相同的方法對切自新的20例肝癌患者(不同于上述肝癌患者)肝的每對腫瘤組織和非腫瘤組織的基因組DNA進行對上述4種基因的曱基化分析，確定了2種在所述腫瘤組織中但不在非腫瘤組織中高度曱基化的肝癌特異性甲基化候選基因。此外，通過確證在肝癌患者血液中對特異于所述2種基因的肝癌衍生的曱基化DNA片段的檢觀'h最終將所述2種基因0BAS尸7基因和S^)M2基因)鑒定為肝癌特異性曱基化基因。同時，我們選出12種在先前出版的文獻中業(yè)已報道的肝癌特異性曱基化異常的基因。接下來，用BIS處理從20例早期肝癌患者(分級為I期或II期的肝癌，腫瘤尺寸小于1.3-3.6cm)獲得的各l)ig的腫瘤組織基因組DNA,用所述經BIS處理的DNA作為模板通過PCR擴增上述12種候選基因中的包含CpG島的區(qū)域，通過直接序列測定來檢查曱基化情況。同樣地，同時分析來自正常肝組織和白細胞的基因組DNA的曱基化情況作為對照樣品。作為曱基化分析結果，選出9種在腫瘤組織中但不在正常肝組織和白細胞中高度曱基化的基因。進一步地，通過用相同的方法對切自新的20例肝癌患者(不同于上述肝癌患者)肝的每對腫瘤組織和非腫瘤組織的基因組DNA進行對上述9種基因的曱基化分析，確定了9種在所述肺瘤組織中但不在非腫瘤組織中高度曱基化的肝癌特異性曱基化候選基因此外，通過確證在肝癌患者血液中對特異于所述9種基因中的5種的肝癌衍生的曱基化DNA片段的檢測，最終將所述5種基因GSP/M7基因、APC基因、CCM)2基因、CF77基因和W5^F/基因)鑒定為肝癌特異性曱基化基因。24實施例2.肝癌特異性曱基化基因的少量病例性能評估用用于血清和血漿的DNAExtractorSP試劑盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.),從采自9例HCV陽性早期肝癌(高度分化的肝癌)和19例HCV陽性高風險肝癌患者(慢性肝炎和肝硬化)的1ml血清中才是取總DNA,制備50pl的DNA溶液。用自制的試劑經BIS處理所述DNA溶液，制得50]il經BIS處理的DNA溶液。接下來，用5pl所述經BIS處理的DNA溶液對7種肝癌特異性曱基化基因05AS尸/基因、5P/iW7基因、^尸C基因、CCWZ)2基因、C尸77基因、WMF/基因和基因)各實施曱基化特異性PCR(MSP)。在所述MSP中，通過加入對各種基因具有特異性的TaqMan才笨針，由實時PCR來進行曱基化DNA的定量測定。曱基化DNA的定量實際上按照以下方法實施。A4S尸/基因、S尸/iW2基因、CC7VD2基因、C尸77基因和7^5^F7基因用LightCyclerTaqManMaster試劑盒(RocheDiagnosticsGmbH)作為擴增試劑，用LightCyclerII(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增儀器，實施實時PCR。對于每種基因，將5pl經BIS處理的DNA溶液加入到PCR反應混合物中，在該混合物中濃度如表4所示的引物對和TaqMan探針的混在1xMastermix中，在20jil總體積中進行PCR。對于A4S尸/、5P/AT2、CCM)2和iAS57^基因，如下進行PCR擴增:在95。C初始變性10分鐘，接著是50個95。C10秒、63。C45秒和72。C5秒的循環(huán)，接著在4(TC溫熱30秒。對于CFTR^基因，如下進行PCR擴增:在95。C初始變性10分鐘，接著是50個95。C10秒、64。C60秒的循環(huán)，接著在40。C加熱30秒。在每一循環(huán)的72。C延伸反應后檢測熒光信號。通過Fl/F3分析模式在LightCycler軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測靶基因的擴增，用標準曲線定量50ial經BIS處理的DNA溶液中的曱基化DNA,標準曲線用同時測量的標準品(按以下系列稀釋人工曱基化的DNA:對于BASP1、SPINT2、CCND2和RASSF1基因為1000、200、40和4pg/jal，對于CFTRJ^因為200、50和20pg/iil)制定。此外,將溶液中所述曱基化DNA的量乘以50，并換算為lml血清中的曱基化DNA的量。將血清中所述曱基化DNA的量用于統(tǒng)計分析和臨床評估表4:肝癌特異性曱基化基因的MSP反應混合物的組成基因<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>^PC基因和^S7A^2基因用自制的試劑作為擴增試劑，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增儀器，實施實時PCR。對于每種基因,在使表5中所示濃度或量的引物對、TaqMan探針、乙酸鉀(pH7.5)和Aptamer48混入PCR^應混合物中后，加入5)il的經BIS處理的DNA溶液，所述反應混合物由50mMTricine(pH8.3)、3mM乙酸鎂、375pMdNTP、2.5。/。甘油和0.15單位ZO5(熱穩(wěn)定的DNA聚合酶)組成，在20jul總體積中進行PCR。對于APC基因，PCR擴增如下進行在95。C初始變性2分鐘，接著是50個95。C10秒、64。C60秒和72。C5秒的循環(huán)，接著在4(TC溫熱30秒。對于S^D5^2基因，PCR擴增如下進行在95。C初始變性2分鐘，接著是50個95。C15秒、66。C45秒和72。C5秒的循環(huán)，接著在恥。C溫熱30秒。通過Fl/F3分析模式在LightCycler軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測靶基因的擴增，用標準曲線定量50jLil的經BIS處理的DNA溶液中的曱基化DNA,標準曲線用同時測量的標準品(按以下系列稀釋人工曱基化的DNA:對于乂尸C基因為200、50、20和4pg/^il，對于57D5X2基因為200、40、10和4pg/pl)制定。此外，將溶液中所述曱基化DNA的量乘以50，并換算為lml血清中的曱基化DNA的量。將血清中的所述曱基化DNA的量用于統(tǒng)計分析和臨床評估。表5:肝癌特異性甲基化基因的MSP反應混合物的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在上述9例HCV陽性早期肝癌患者和19例HCV陽性高風險肝癌患者中，通過Iizuka等(參見非專利文獻14)所報道的方法用所述7種基因的曱基化DNA的量，來計算各基因的Fisher比。結果如表6所示。Fisher比越高，意味著基因在該分析結果中越有前景。因此，經證明5AS尸/基因為尤其有前景的基因。表6:通過Fisher比在攜帶HCV的早期肝癌患者與攜帶HCV的高風險肝癌患者之間進行的可離性的(separability)等級評定<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>對于通過ROC(receiveroperatingcharacteristic,4妄受者工作特性)分析評定的Fisher比等級的頭4種的基因，通過檢查所述基因檢測早期肝癌的能力來評估性能。還一起評估了頭兩種基因(SAS尸7基因和S/W77基因)的2基因組合的性能，以及頭2種基因與第四種基因C8AS尸/基因、S尸/iV77基因和57①X42基因)的3基因組合的性能。特別地，對于單種基因而言，用各基因的甲基化DNA的量GBAS7^基因的甲基化DNA的量指定為BASP1值，其它基因也如此指定)直接進行ROC分析；對于2基因組合和3基因組合而言，分別用通過將所述曱基化DNA的量輸入到以下公式中計算得到的值來進行ROC分析BASP1值+SPINT2值(2基因組合)，0.1xBASP1值十SPINT2值十SRD5A2值(3基因組合)。結果如圖l所示。作為以上ROC分析的結果，盡管沒有具有足以用單一基因檢測早期肝癌的性能的基因，但聯(lián)合2種或3種基因顯示出足以檢測早期肝癌的高性能。特別地，聯(lián)合BAS尸7基因和S尸/A^T2基因,可對于檢測早期肝癌具有78%的靈敏度和95%的特異性；聯(lián)合j5AS尸/基因、5P/AT2基因和57DM2基因，可具有89%的靈敏度和90%的特異性。因此，建議將對本發(fā)明業(yè)已發(fā)現(xiàn)的肝癌特異性甲基化基因的曱基化DNA量進行的測量用于檢測早期肝癌。實施例3.肝癌特異性曱基化基因的大量病例性能評估用用于血清和血漿的DNAExtractorSP試劑盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.),從采自以下患者的lml血清中提取總DNA并制備50pl的DNA溶液119例HCV陽性肝癌患者(包括25例分級為I期的早期肝癌(基于TheGeneralRulesfortheClinicalandPathologicStudyofPrimaryLiverCancer(原發(fā)性肝癌的臨床和病理研究的一般規(guī)定)來分期，參見非專利文獻15),其腫瘤尺寸小于3cm;和21例高度分化的早期肝癌)和80例HCV陽性高風險肝癌患者(慢性肝炎和肝硬化)。用自制的試劑經BIS處理所述DNA溶液，制備50pI經BIS處理的DNA溶液。接下來，用5pl所述經BIS處理的DNA溶液對7種肝癌特異性曱基化基因(SAS尸/基因、5P/A72基因、vl尸C基因、CCiVD2基因、CF77基因、^A^尸/基因和57D5J2基因)各實施曱基化特異性PCR(MSP)。在所述MSP中，通過加入對各種基因具有特異性的TaqMan探針，由實時PCR來進行曱基化DNA的定量測定。其間，按專利文獻l所述方法，同時用liul所述經BIS處理的DNA溶液測量lml血清中的總DNA的量。曱基化DNA的定量實際上按照以下方法實施。^AS"尸/基因、5^/A72基因、CX7VP2基因、CF77基因和7MS57^基因用LightCyclerTaqManMaster試劑盒(RocheDiagnosticsGmbH)作為擴增試劑，用LightCyclerII(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增儀器，實施實時PCR。對于每種基因，將5pl的經BIS處理的DNA溶液加入到PCR反應混合物中，在混合物中將濃度如表4所示的^1物對和TaqMan探針混入lxMastermix中，在20pl總體積中進行PCR。對于SAS尸/、S尸/AT2、CCA/D2和7MS5F/基因，如下進行PCR擴增在95。C初始變性10分鐘，接著是50個95。C10秒、63"C45秒和72。C5秒的循環(huán),接著在40。C溫熱30秒。對于CFT綠因，如下進行PCR擴增在95。C初始變性10分鐘，接著是50個95。C10秒、64。C60秒的循環(huán)，接著在40。C溫熱30秒。在每一循環(huán)的72。C延伸反應后檢測焚光信號。通過F1/F3分析模式在LightCycler軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測靶基因的擴增，用標準曲線定量50pl的經BIS處理的DNA溶液中的甲基化DNA，標準曲線用同時測量的標準品(按以下系列稀釋人工曱基化的DNA:對于A4S尸/、5P/AT2、CCM^和iL45^F/基因為1000、200、40和4pg/inl，對于CF77^基因為200、50和20pg/pl)制定。此外，將溶液中所述曱基化DNA的量乘以50,并換算為lml血清中的甲基化DNA的量。將血清29中所述曱基化DNA的量用于統(tǒng)計分析和臨床評估。X尸C基因和57DM2基因用自制的試劑作為擴增試劑，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增儀器，實施實時PCR。對于每種基因，在將表5中所示濃度或量的引物對、TaqMan探針、乙酸鉀(pH7.5)和Aptamer48混入PCIL良應混合物中后，加入5pl的經BIS處理的DNA溶液，所述反應混合物由50mMTricine(pH8,3)、3mM乙酸鎂、375)iMdNTP、2.5%甘油和0.15單位ZO5(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)組成，PCR在20W總體積中進行。對于v4尸C基因，PCR擴增如下進行在95。C初始變性2分鐘，接著是50個95。C10秒、64。C60秒和72。C5秒的循環(huán)，接著在40。C溫熱30秒。對于S7A5A2基因，PCR擴增如下進行在95。C初始變性2分鐘，接著是50個95。C15秒、66。C45秒和72。C5秒的循環(huán)，接著在40。C溫熱30秒。通過Fl/F3分析模式在LightCycler軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測靶基因的擴增，用標準曲線定量50iil經BIS處理的DNA溶液中的曱基化DNA，標準曲線用同時測量的標準品(按以下系列稀釋人工曱基化的DNA:對于APC基因為200、50、20和4pg爾l,對于SiD:^2基因為200、40、10和4pg/pl)制定。此外，將溶液中所述曱基化DNA的量乘以50,并換算為lml血清中的曱基化DNA的量。將血清中所述曱基化DNA的量用于統(tǒng)計分析和臨床評估。在上述119例HCV陽性肝癌患者和80例高風險肝癌患者中，通過Iizuka等(參見非專利文獻14)所報道的方法用所述7種基因的曱基化DNA的量，來計算各種基因的Fisher比。結果如表7所示。Fisher比越高，意味著基因在該分析結果中越有前景。因此，經證明5^SP/基因和S尸/iV72基因為尤其有前景的基因。用甲基化DNA的量對所述^45^/基因和57YAT2基因實施ROC分析。結果顯示，僅用所述S^SP/基因可對于^r測肝癌具有50。/。的靈敏度和95%的特異性或62%的靈敏度和80%的特異性；僅用所述尸/iW2基因，具有38%的靈敏度和96%的特異性。因此，建議將對本發(fā)明業(yè)已發(fā)現(xiàn)的肝癌特異性曱基化基因中的5AS尸/基因和/或5P/iV72基因的曱基化DNA量進行的測量用于檢測肝癌。表7:通過Fisher比在攜帶HCV的肝癌患者和攜帶HCV的高風險肝癌患者之間進行的分離性的等級評定<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>接下來，對于119例肝癌患者、25例分級為I期且腫瘤尺寸小于3cm的早期肝癌或21例高度分化的早期肝癌，通過用FLC(Fisherlinearclassifer,Fisher線性分類公式)分析檢查所述7種基因中的種聯(lián)合檢測肝癌的能力，來評估所述基因組合的性能。具體而言，通過Iizuka等(參見非專利文獻14)報道的方法用各種基因的曱基化DNA的量建立數(shù)據(jù)約簡算法(reductionalgorithm),用所述算法計算肝癌檢測的靈敏度、特異性和識別率，基于所述FLC分析的結果實施ROC分析。結果示于圖2-4中。作為所述FLC分析和ROC分析的結果，對于119例肝癌患者，可聯(lián)合3種基因5AS尸/基因、5TW72基因和CF77基因通過如下公式以70%的靈敏度、80%的特異性和74%的識別率來檢測肝癌0.9586xBASP1值+0,2843xSPINT2值—0.0078xCFTR值十0.3180(若計算值<0,則確定為肝癌)。對于25例分級為I期且腫瘤尺寸小于3cm的早期肝癌，可聯(lián)合3種基因A4S尸/基因、S尸/iW7基因和(X7VD2基因通過如下公式以52。/o的靈敏度、88%的特異性和79%的識別率檢測早期肝癌-0.003091xBASP1值—0.006448xSPINT2值—0.000655xCCND2值十0.350734(若計算值<0，則確定為肝癌)。對于21例高度分化的早期肝癌，可聯(lián)合3種基因A4S尸/基因、5P/AT2基因和RASSF1基因通過如下公式以67。/。的靈敏度、80%的特異性和77%的識別率檢測早期肝癌-0.009564xBASP1值—0.004042xSPINT2值—0.001373xRASSF1值十0.595593(若計算值<0，則確定為肝癌)(表8-10)。如圖2-4所示，所述^^測肝癌的能力超過了同時測量的常用的胂瘤標記AFP或PIVKA-II的能力(例如HCC攜帶者0=115)與HCV攜帶者(n=57)相比較AFP(截斷200);靈敏度30%,特異性100%,識別率53%;PIVKA-II(截斷40。/o);靈敏度60%,特異性85%，識別率68%)。因此，建議將對本發(fā)明業(yè)已發(fā)現(xiàn)的肝癌特異性曱基化基因的曱基化DNA量進行的測量用于檢測肝癌，尤其是早期肝癌。此外，將同時測量的AFP和PIVKA-II與上述種個基因聯(lián)合成9種因子，通過檢查所述9種因子中的2種或3種聯(lián)合檢測肝癌的能力，來評估所述因子組合的性能。結果顯示，可聯(lián)合2種因子萬^S尸7基因和AFP通過如下公式以75。/。的靈敏度、82%的特異性和78%的識別率檢測肝癌:一0.000478xBASP1值一0.000011xAFP值十0.001089(若計算值<0，則確定為肝癌)。還可聯(lián)合A45P/基因、5P/7VZ2基因和^P尸通過如下公式以79。/。的靈敏度、82%的特異性和80%的識別率檢測肝癌-0.000476xBASP1值-0.000017xSPINT2值-0.000010xAFP值十0.001789(若計算值<0,則確定為肝癌)。對于25例分級為I期且腫瘤尺寸小于3cm的早期肝癌，可聯(lián)合三種標記A4S尸/基因、SiW72基因和PIVKA-II通過如下公式以60Q/。的靈敏度、82%的特異性和74%的識別率檢測早期肝癌-0.002106xBASPl值-0.005210xSPINT2值十0.000069xPIVKA-lKi+0.001390(若計算值<0，確定為肝癌)。對于21例高度分化的早期肝癌，可聯(lián)合3種標記J尸C基因、S尸/A^2基因和AFP通過如下公式以67。/o的靈敏度、88%的特異性和81。/。的識別率檢測早期肝癌—0.002538xAPC值-0.003626xSPINT2值-0.013544xAFP值十0.852581(若計算值<0，則確定為肝癌)(表8-10)。因此，建議的是，測量本發(fā)明業(yè)已發(fā)現(xiàn)的肝癌特異性曱基化基因的曱基化DNA的量，并使所述測量值和常用的腫瘤標記AFP或PIVKA-II聯(lián)合，可進一步提高檢測肝癌的能力，尤其是早期肝癌。另外，將同時測量的血清中的DNA量、AFP、PIVKA-II和上述7種基因聯(lián)合成10種因子，通過檢查所述10種因子中的3種聯(lián)合檢測肝癌的能力來評估所述因子組合的性能。結果顯示，可通過如下各公式以87%的靈敏度、80%的特異性和85%的識別率檢測肝癌對于&iS尸7基因、S尸/A/T2基因和血清中的DNA量的組合，公式為-0.000219xBASP1值-0.000016xSPINT2值-0.015627x血清中的DNA量十0.618672(若計算值<0，則確定為肝癌)；對于BAS尸7基因、SM5v42基因和血清DNA的量的組合，公式為0.000220xBASPl值-0.000564xSRD5A2值-0.015633x血清中的DNA量十0.613763(若計算值<0,則確定為肝癌)；對于5ASP7基因、AFP和血清DNA的量的組合，公式為—0.000224xBASP1值-0.000010xAFP值-0.015610x血清中的DNA量十0.617716(若計算值<0，則確定為肝癌)。對于25例分級為I期且腫瘤尺寸小于3cm的早期肝癌，可聯(lián)合3種標記5D/^y^基因、S尸/AT2基因和血清中的DNA量通過如下公式以84%的靈敏度、88%的特異性和86%的識別率檢測早期肝癌-0.021150xSRD5A2值—0.007102xSPINT2值一0.052594x血清DNA量+2.091284(若計算值<0,則確定為肝癌)。對于21例高度分化的早期肝癌患者，可聯(lián)合3種標記57I)5y42基因、S尸/AT2基因和血清中的DNA量；3種標記S尸/AT2基因、AFP和血清中的DNA量；和3種標記5P/AT2基因、PIVKA-II和血清中的DNA量分別通過如下公式以86。/。的靈敏度、90。/。的特異性和89。/。的識別率檢測早期肝癌-0.001553xSRD5A2值一0.002923xSPINT2值—0.029064x血清中的DNA量十1.305493(若計算值<0，則確定為肝癌)；公式—0.003378xSPINT2值—0.00911233xAFP值-0.027178x血清中的DNA量十1.393957(若計算值<0，則確定為肝癌)；和公式-0.002833xSPINT2值十0.000061xPIVKA-II值-0.029513x血清中的DNA量+1.384308(若計算值<0,則確定為肝癌)(表S-IO)。因此，建議的是，測量本發(fā)明業(yè)已發(fā)現(xiàn)的肝癌特異性曱基化基因的曱基化DNA的量，并使所述測量值與血清中的DNA量聯(lián)合，使所述測量值、血清中的DNA量與AFP值聯(lián)合，或使所述測量值、血清中的DNA量與PrVKA-II值聯(lián)合，可進一步提高檢測肝癌，尤其是早期肝癌的能力。表8:通過聯(lián)合肝癌特異性甲基化基因、常用的腫瘤標記和血液DNA的量檢測肝癌的能力HCC的119個病例7種曱基化DNA標記(從7種標記中挑選)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>2種常規(guī)標記+7種曱基化DNA標記(從9種標記中挑選)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>DNA的量+2種常規(guī)標記+7種曱基化DNA標記(從10種標記中挑選)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表9:通過聯(lián)合肝癌特異性甲基化基因、常用的腫瘤標記和血液中的DNA量檢測肝癌的能力早期HCC(TNM分類為1期且腫瘤尺寸小于3cm〗的25個病例7種曱基化DNA標記(從7種標記中挑選)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>2種常規(guī)標記+7種甲基化DNA標記(從9種標記中挑選)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>DNA的量+2種常規(guī)標記+7種甲基化DNA標記(從10種標記中挑選)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表10:通過聯(lián)合肝癌特異性甲基化基因、常用的腫瘤標記和血液中的DNA量檢測肝癌的能力早期HCC(高度分化)的21個病例7種甲基化DNA標記(從7種標記中挑選)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實施例4.通過定量直接測序來定量曱基化的DNA對于上述7種肝癌特異性甲基化基因SAS尸/基因、S^D5Z2基因、S尸/W72基因、J尸C基因、CCA^)2基因、CF77基因和/A^^7基因，通過定量直接測序對以下來源的基因組DNA中的包含CpG島的區(qū)域進行甲基化分析所述基因組DNA來源于切自20例肝癌患者的肝的每對腫瘤組織和非腫瘤組織。具體而言，用BIS處理從組織提取的1嗎基因組DNA，用所述經BIS處理的DNA作為模板，用表ll所述引物對PCR擴增上述7種基因的包含CpG島的區(qū)域。PCRA應溶液由100pl終體積中的如下物質組成26.7ng的經BIS處理的DNA、用等體積TaqStart抗體(ClontechLaboratories,Inc.)在室溫預處理5分鐘的2單位的熱穩(wěn)定DNA聚合酶(TOYOBOCO.,LTD)、67mMTris-HCl(pH8.8)、16.6mM硫酸銨、0.01%Tween20、200dNTP、各lpM的引物對和1.5或3mM氯化4美通過用GeneAmpPCR系統(tǒng)9600(AppliedBiosystems)為PCR擴增儀如下進行DNA擴增在95。C初始變性2分鐘，接著是5個95。C變性25秒、7(TC退火45秒和72。C延伸45秒的循環(huán)，接著是40個95。C變性25秒、65。C退火50秒和72。C延伸45秒的循環(huán)。濃縮PCR產物，在瓊脂糖凝膠上進行電泳。從凝膠切取擴增產物的目標帶，用QIAquickGel提取試劑盒(QIAGENGmbH)分離。接下來，通過用PyrosequencerPSQ96MA和Pyrogold試劑(BiotageAG)以所述分離的產物作為模板進行定量直接測序，來檢查包含CpG的區(qū)域的曱基化情況。表ll:擴增肝癌特異性甲基化基因的包含CpG島的區(qū)域的PCR反應物組成<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>由定量直接測序得到的曱基化分析結果如表12-14所示。曱基化的量通過以下方式顯示高于75%的情況下附以"***(3個星號)"、低于75%且高于50%的情況下附以"**(2個星號)"、低于50%且高于25%的情況下附以"*G個星號)，，和低于25%的情況下沒有星號。如表12-14所示，通過對上述7種肝癌特異性曱基化基因的包含CpG島的區(qū)域進行定量曱基化分析，可明確地區(qū)分肝癌患者的腫瘤組織和非腫瘤組織以及HCV攜帶者(高風險肝癌患者)組織。也就是說，證明了通過所述定量測序所進行的對所述肝組織DNA的7種肝癌特異性曱基化基因的包含CpG島的區(qū)域的曱基化分析，可用于鑒定和識別肝癌。另外，比較了表12-14所示的在高度分化的HCC和分化不完全的HCC之間的CF77基因的曱基化DNA的量，分化階段(惡性階段)與曱基化DNA的量正相關(p0.05)。因此，建議定量曱基化分析可用于作為肝癌惡化的指征。il^:通過定量直接測序的甲基化分析結果肝癌患者/腫瘤組織<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表13:通過定量直接測序的甲基化分析結果肝癌患者/非胂瘤組織ID分化類型HCB/HBV感染腫瘤尺寸(cm)TMN分級甲基化DNA.的量(。/4)BASP1S剛T2APCCCND2CFTRRASSF1S畫1高度HCV14D23.28.024.332.0*18.019.5Z0.82高度HCV3.5H28.1*7.5IfU17.920.119.318.93高度HCV3.4n6.317.330.5*22.712.518.04中度—162S.2'12.631.1'25.7'17.439.7*22.25中度HCV3狂20.46.918.622.315.128.2*17.46中度一2.5D29.5*6.715,422.19.223.815.97中度HCV"n20.89.21"25.7*1"18.823.0豕高度HCV1.8iZ3.7S.l16.621.116.227.8,19,2中度HCV/HBV3.4IV24.7U.221.336.7'23.022.926.5'10高度HCV1.4i29.2*M23.819.814.933.3*21.9n高度HCV3.7D27.6*6.913.324.817.818.521.112高度HCV5.4II10.01(619.021.419.921.813中度HCV1.2121.9.418.62(821.319.917.S"中度HCV8.1II20.810.813.814.918.740,6'23.215中度一3.5ID22.8ll.l15.228.5*1"37.7*21.216高度HCV細VD2SV11.814.826.1*22.921.627.5*17高度氾V2.3HI17.810.718.820.7Hi19.924.818中度HCV4.5in19.75,813.131.9*16.817.218.619高度HCV3.8in21.4ll.l11.927.8*20.016.02"20低度HCV1.2ID19.09.4".8J*15.024.72S.3*表14:通過定量直接測序甲基化分析結果HCV攜帶者(高風險肝癌患者)/肝組織IDHCB/HBV感染曱基化DNA的量(％)BASP1S剛T2APC圓CFTR瞧S畫21HCV16.99.413.030.7*加.I23.519.222HCV17.437.2*18.328."實施例5.通過HM(重甲基)-PCR定量曱基化DNA對于上述7種肝癌特異性曱基化基因中的S尸/iV72基因，通過HM-PCR對以下來源的基因組DNA的含CpG島區(qū)域進行甲基化分析所述基因組來源于從10例肝癌患者獲得的胂瘤組織基因組DNA和從9例肝癌患者獲得的非腫瘤組織。具體而言，用BIS處理從組織提取的1pg的基因組DNA，制備75pd的經BIS處理的DNA溶液。接下來，用引物對15(SEQIDNo.29和30)和2種阻斷探針(SEQIDNo.38和39)以1pl39(13.3ng)的所述經BIS處理的DNA溶液為模板進行HM-PCR。在所述HM-PCR期間，用對5P/7VZ2基因具有特異性的TaqMan探針(SEQIDNo.32)通過實時PCR進行曱基化DNA定量。用LightCycler⑧TaqManMaster試劑盒(RocheDiagnosticsGmbH)作為擴增試劑，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增4義，實施實時PCR。將ljLil的經BIS處理的DNA溶液加入到PCRA應混合物中，在該混合物中將0.5pM引物對、20pM阻斷探針和0.1jiM的TaqMan探針混入lxMastermix中，在20pl總體積中進行PCR。PCR擴增如下進行在95。C初始變性10分鐘，接著是50個95。C10秒、58。C60秒的循環(huán)，接著在40。C溫熱30秒。在每一循環(huán)的58。C延伸反應后檢測熒光信號。通過F1/F3分析模式在LightCycler軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測把基因的擴增，用標準曲線計算75inl經BIS處理的DNA溶液中的曱基化DNA濃度，標準曲線用同時測量的標準品制定(按以下系列稀釋人工曱基化DNA:1000、200和40pg/pl)。如表15所示，可通過用100pg/jal作為截斷值以80%的靈敏度和88.9%的特異性來區(qū)分腫瘤組織與非腫瘤組織。因此,建議的是，將以下分析用于檢測和識別肝癌由HM-PCR對肝組織DNA的肝癌特異性曱基化基因(即M/iV77基因)的含CpG島區(qū)域的甲基化進行的分析。表15:通過HM-PCR進行的曱基化分析的結果IDCp濃度pg/zn)Met(%)HCC131.915.98E+0260.6HCC532.553.95E+0240.1HCC633.512.13E+0221.6HCC732.095.34E+0254.2HCC1133.352.36E+0223.9HCC12HCC2734.151.41E+0214.3HCC4334.551.09E+0211.1HCC64HCC11934.27L30E+0213.2非-HCC139.544.32E+000.4非-HCC5非-HCC6非.-HCC733.192.61E+0226.5非，HCC12非-HCC27非-HCC43非-HCC6A非-HCC119標準品5rm31.1A9.86E+021000標準品lng33.572.05E+02200標準品200pg37.181.98E+0140CP:交點Met:曱基化率實施例6.通過測量肝癌特異性曱基化基因檢測肝癌風險用用于血清和血漿的DNAExtractorSP試劑盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.),從采自31例HCV陽性肝癌患者(在采集血清并治愈性切除肝癌后隨訪2年以上的患者)的1ml血清中提取總DNA，制備50pl的DNA溶液。用自制的試劑經BIS處理所述DNA溶液，并制備50pl經BIS處理的DNA溶液。接下來，用5lil所述經BIS處理的DNA溶液對7種肝癌特異性曱基化基因(A4S尸/基因、6P/A72基因和57A^2基因)各實施曱基化特異性PCR(MSP)。在所述MSP中，通過一起加入對各種基因具有特異性的TaqMan探針，由實時PCR來進行曱基化DNA的定量測定。其間，按專41利文獻l所示方法，同時用ljal所述經BIS處理的DNA溶液測量lml血清中的總DNA量。曱基化DNA的定量實際上按照以下方法實施。SAS尸7基因和S尸/AT2基因用LightCyderTaqManMaster試劑盒(RocheDiagnosticsGmbH)作為擴增試劑，用LightCyderII(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增儀，實施實時PCR。對于每種基因，將5iLil的經BIS處理的DNA溶液加入到PCR^應混合物中，在該混合物中將濃度如表4所示的引物對和TaqMan探針混入1xMastermix中，在20jil總體積中進行PCR。PCR擴增如下進行在95。C初始變性10分鐘，接著是50個95。C10秒、63°C45秒和72。C5秒的循環(huán)，接著在40。C溫熱30秒。在每一循環(huán)的72。C延伸反應后檢測焚光信號。通過F1/F3分析模式在LightCycler軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測靶基因的擴增，用標準曲線定量50pi經BIS處理的DNA溶液中的甲基化DNA，標準曲線用同時測量的標準品(按以下系列稀釋人工甲基化DNA:1000、200、40和4pg/pl)制定。另外，將溶液中所述曱基化DNA的量乘以50,并換算為lml血清中的曱基化DNA的量。將血清中所述曱基化DNA的量用于統(tǒng)計分析和臨床評估。用自制的試劑作為擴增試劑，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增儀，實施實時PCR。在將表5中所示濃度或量的引物對、TaqMan探針、乙酸鉀(pH7.5)和Aptamer48混入PCR反應混合物中后，加入5iil的經BIS處理的DNA溶液，該反應混合物由50mMTricine(pH8.3)、3mM乙酸4美、375iaMdNTP、2.5%甘油和0.15單位Z05(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)組成，PCR在20pl總體積中進行。PCR擴增如下進行在95。C初始變性2分鐘，接著是50個95。C15秒、66°C45秒和72。C5秒的循環(huán)，接著在40。C溫熱30秒。在每一循環(huán)的66。C延伸反應后檢測熒光信號。通過F1/F3分析模式在LightCycler軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測靶基因的擴增，用標準曲線定量50pi的經BIS處理的DNA溶液中的曱基化DNA,標準曲線用同時測量的標準品制定(按以下系列稀釋人工曱基化的DNA:200、40、10和4pg/Vl)。此外，將溶液中所述甲基化DNA的量乘以50,并換算為lml血清中的曱基化DNA的量。將血清中的所述曱基化DNA的量用于統(tǒng)計分析和臨床評估。對于上述31例HCV陽性肝癌患者(在采集血清并治愈性切除肝癌后隨訪2年以上的患者)，用數(shù)據(jù)約簡算法來實施對^^測肝癌風險的臨床評估，所述算法已在用大量病例進行肝癌特異性甲基化基因性能評估的期間建立(實施例3)。具體而言，將各基因的曱基化DNA的量和同時測量的血清中的DNA量進行對數(shù)變換，接著通過所述數(shù)據(jù)約筒算法值的差異在手術后2年內重新發(fā)展為肝癌(復發(fā)性HCC)的8個病例(多中心肝癌發(fā)生群體multicentrichepatocarcinogenesispopulation)和在2年內在任何器官均沒發(fā)生轉移和復發(fā)的23個病例(未復發(fā)群體)。結果表明，根據(jù)以下聯(lián)合3種標記SASP/基因、S尸/A72基因和血清中的DNA量的公式，多中心肝癌發(fā)生群體比未復發(fā)群體具有明顯更低的分值(pO.05):—0.042965xBASP1值-0.187008xSP證2值-2.600843x血清中的DNA量十9.331859(表16)。同樣地，業(yè)已表明根據(jù)以下聯(lián)合3種標記MA5^基因、5TY7V72基因和血清中的DNA量的公式，多中心肝癌發(fā)生群體比未復發(fā)群體具有明顯更低的分值(pO.Ol):—0.112025xSRD5A2值-0.199992xSPINT2值-2.696542x血清中的DNA量十9.867470(表16)。兩個群體的隨訪期之間并沒有顯著性(significance)(p=0.741)。另外，當對同樣的31例肝癌進行肝癌風險研究時，即通過根據(jù)聯(lián)合3種標記BylS尸7基因、S尸/A^2基因和血清中的DNA量的公式-0.042965xBASPl值-0.187008xSPINT2值-2.600843x血清中的DNA量+9.331859計算所得的分值，將該31個病例分為分值》0的病例(12例)和分值<0的病例(19例)，分值>0的所有12個病例均沒有復發(fā)HCC，但分值〈0的19個病例中有8個(42.1。/。)復發(fā)HCC(Fisher確切檢驗p0.05)。另外，通過聯(lián)合3種標記S/A^2基因、5TW72基因和血清中的DNA量的公式—0.112025xSRD5A2值—0.199992xSPINT2值一2.696542x血清中的DNA量十9.867470得到的準確的相同結果。因此，建議的是，測量本發(fā)明業(yè)已發(fā)現(xiàn)的肝癌特異性甲基化基因的曱基化DNA的量，并將所述測量值及血清中的DNA量聯(lián)合，可使我們能夠檢測肝癌復發(fā)、HCC復發(fā)的風險。表16:對聯(lián)合肝癌特異性曱基化基因和血清DNA量的肝癌風險檢測的臨床評估<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實施例7.通過測量肝癌特異性甲基化基因檢測肝癌復發(fā)風險用用于血清和血漿的DNAExtractorSP試劑盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)，從采自81例HCV陽性肝癌患者(在采集血清并治愈性切除肝癌后隨訪1年以上的患者)的1ml血清中提取總DNA,并制備50nl的DNA溶液。用自制的試劑經BIS處理所述DNA溶液，并制備50pl經BIS處理的DNA溶液。接下來，用5pl所述經BIS處理的DNA溶液對7種肝癌特異性曱基化基因(SAS7^基因、5P/A72基因和^S7ZX^2基因)各實施曱基化特異性PCR(MSP)。在所述MSP中，通過將對各種基因具有特異性的TaqMan探針一起加入，由實時PCR來進行曱基化DNA的定量測定。其間，按專利文獻l所述的方法，同時用lpl所述經BIS處理的DNA溶液測量lml血清的總DNA量。曱基化DNA的定量實際上按照以下方法實施。用LightCyclerTaqManMaster試劑盒(RocheDiagnosticsGmbH)作為擴增試劑，用LightCyclerII(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增儀，實施實時PCR。對于每種基因，將5^1的經BIS處理的DNA溶液加入到PCR反應混合物中，在該混合物中將濃度如表4所示的引物對和TaqMan探針混入lxMastermix中，在20jil總體積中進行PCR。PCR擴增如下進行在95。C初始變性10分鐘，接著是50個95。C10秒、63°C45秒和72。C5秒的循環(huán)，接著在40。C溫熱30秒。在每一循環(huán)的72。C延伸反應后檢測熒光信號。通過F1/F3分析模式在LightCycler軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測靶基因的擴增，用標準曲線定量50jiil經BIS處理的DNA溶液中的曱基化DNA，標準曲線用同時測量的標準品(按以下系列稀釋人工曱基化DNA:1000、200、40和4pg/pl)制定。另外，將溶液中所述曱基化DNA的量乘以50，并換算為1.ml血清中的甲基化DNA的量。將血清中的所述曱基化DNA的量用于統(tǒng)計分析和臨床評估。用自制的試劑作為擴增試劑，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增儀，實施實時PCR。在將表5中所示濃度或量的引物對、TaqMan探針、乙酸鉀(pH7.5)和Aptamer48混入PCR反應混合物中后，加入5iil的經BIS處理的DNA溶液，該反應混合物由50mMTricine(pH8.3)、3mM乙酸鎂、375dNTP、2.5%甘油和0.15單位Z05(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)組成，PCR在20W總體積中進行。PCR擴增如下進行在95。C初始變性2分鐘，接著是50個95。C15秒、66。C45秒45和72。C5秒的循環(huán)，接著在40。C溫熱30秒。在每一循環(huán)的66。C延伸反應后檢測焚光信號。通過F1/F3分析模式在LightCycIer軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測靶基因的擴增，用標準曲線定量50p的經BIS處理的DNA溶液中的曱基化DNA，標準曲線用同時測量的標準品制定(按以下系列稀釋人工曱基化的DNA:200、40、10和4pg/jul)。另外，將溶液中所述曱基化DNA的量乘以50，并換算為lml血清中的曱基化DNA的量。將血清中的所述甲基化DNA的量用于統(tǒng)計分析和臨床評估。對于上述81例HCV陽性肝癌患者(在采集血清并治愈性肝癌切除后隨訪l年以上的患者)，用數(shù)據(jù)約簡算法來實施對4企測肝癌復發(fā)風險的臨床評估，所述算法已在用大量病例進行肝癌特異性曱基化基因性能評估的期間建立(實施例3)。具體而言，將各基因的甲基化DNA的量和同時測量的血清中的DNA量進行對數(shù)變換，接著通過所述數(shù)據(jù)約簡算法計算分值，隨后通過t-檢驗用平均值分析以下兩種病例之間的所述分值的差異在肝癌手術后1年內沒有復發(fā)肝癌的68個病例(未復發(fā)肝癌群體)和在l年內出現(xiàn)復發(fā)的13個病例(早期肝癌復發(fā)群體)。結果表明，根據(jù)以下聯(lián)合3種標記5AS尸/基因、S尸/W72基因和血清中的DNA量的公式，早期肝癌復發(fā)群體比未復發(fā)肝癌群體具有明顯更低的分值(p〈0.05):—0.042965xBASPl值-0.187008xSPINT2值一2.600843x血清中的DNA量十9.331859(表17)。此外，當對同樣的81例肝癌進行肝癌復發(fā)風險研究時，即通過根據(jù)聯(lián)合3種標記5ASP/基因、67YA^2基因和血清中的DNA量的公式-0.042965xBASPl值-0.187008xSPINT2值—2.600843x血清中的DNA量+9.331859計算所得的分值，將所述81個病例分為分值>0的病例(17例)和分值〈0的病例(64例)，分值>0的所有17個病例中均沒有早期肝癌復發(fā)，但分值<0的64個病例中有13個(20.3%)發(fā)展為早期肝癌復發(fā)(Fisher確切檢驗p二0.06)。此外，通過聯(lián)合3種標記S^Z)5^2基因、S尸/A^2基因和血清中的DNA量的公式-0.112025xSRD5A2值-0.199992xSPINT2值—2.696542x血清中的DNA量十9.867470,得到的準確的相同結果。因此，建議的是，測量本發(fā)明業(yè)已發(fā)現(xiàn)的肝癌特異性曱基化基因的曱基化DNA的量，并將所述測量值與血清中的DNA量聯(lián)合，可使我們能夠檢測早期肝癌復發(fā)的風險。表17:對聯(lián)合肝癌特異性曱基化基因和血清中的DNA量的肝癌復發(fā)風險檢測的臨床評估組合肝癌早期復發(fā)N平均值*標準差平均標準誤差BASP+SPINT+DNA(對數(shù)轉換)不復發(fā)復發(fā)6813-1.622687-3.8061982.47664281.88548790.30033700.5229403*p<0.005實施例8.通過測量肝癌特異性曱基化基因監(jiān)測肝癌隨時間的存活率用用于血清和血漿的DNAExtractorSP試劑盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.),從采自87例HCV陽性肝癌患者(經歷治愈性肝癌切除的患者)的lml血清中提取總DNA,并制備50pl的DNA溶液。用自制的試劑經BIS處理所述DNA溶液，并制備50W經BIS處理的DNA溶液?！酉聛?，用5pl所述經BIS處理的DNA溶液對7種肝癌特異性曱基化基因(^457^基因、5TWr2基因和57^D^42基因)各實施曱基化特異性PCR(MSP)。在所述MSP中，通過將對各種基因具有特異性的TaqMan探針一起加入，由實時PCR來進行曱基化DNA的定量測定。其間，按專利文獻l所述的方法，同時用lnl所述經BIS處理的DNA溶液測量lml血清的總DNA量。曱基化DNA的定量實際上按照以下方法實施。^4S尸7基因和S尸/7V72基因用LightCyclerTaqManMaster試劑盒(RocheDiagnosticsGmbH)作為擴增試劑，用LightCyclerII(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增儀，實施實時PCR。對于每種基因，將5iil的經BIS處理的DNA溶47液加入到PCFA應混合物中，在該混合物中將濃度如表4所示的引物對和TaqMar^罙針混入1xMastermix中，在20pl總體積中進行PCR。PCR擴增如下進行在95。C初始變性10分鐘，接著是50個95。C10秒、63°C45秒和72。C5秒的循環(huán)，接著在40。C溫熱30秒。在每一循環(huán)的72。C延伸反應后檢測焚光信號。通過F1/F3分析模式在LightCycler軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測靶基因的擴增，用標準曲線定量50pl經BIS處理的DNA溶液中的曱基化DNA，標準曲線用同時測量的標準品(按以下系列稀釋人工曱基化DNA:1000、200、40和4pg/W)制定。此外，將溶液中所述曱基化DNA的量乘以50,并換算為lml血清中的曱基化DNA的量。將血清中的所述曱基化DNA的量用于統(tǒng)計分析和臨床評估。用自制的試劑作為擴增試劑，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增儀，實施實時PCR。在將表5中所示濃度或量的引物對、TaqMan探針、乙酸鉀(pH7.5)和Aptamer48混入PCR反應混合物中后，加入5pl的經BIS處理的DNA溶液，該反應混合物由50mMTricine(pH8.3)、3mM乙酸鎂、375dNTP、2.5%甘油和0.15單位Z05(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)組成，PCR在20pl總體積中進行。PCR擴增如下進行在95。C初始變性2分鐘，接著是50個95。C15秒、66。C45秒和72。C5秒的循環(huán)，接著在40。C溫熱30秒。在每一循環(huán)的66。C延伸反應后檢測熒光信號。通過F1/F3分析模式在LightCycler軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測靶基因的擴增，用標準曲線定量50iil經BIS處理的DNA溶液中的曱基化DNA，標準曲線用同時測量的標準品(按以下系列稀釋人工甲基化的DNA:200、40、10和4pg/Vl)制定。此外，將溶液中所述甲基化DNA的量乘以50,并換算為1ml血清中的甲基化DNA的量。將血清中的所述曱基化DNA的量用于統(tǒng)計分析和臨床評估。對于上述87例HCV陽性肝癌患者(經歷治愈性肝癌切除的患者)，用數(shù)據(jù)約簡算法來實施對監(jiān)測肝癌隨時間的存活率的臨床評估，所述算法已在用大量病例進行肝癌特異性曱基化基因性能評估的期間建立(實施例3)。具體而言，將各基因的曱基化DNA的量和同時測量的血清中的DNA量進行對數(shù)變換，接著通過所述數(shù)據(jù)約簡算法計算分值，隨后比較以下兩種病例之間的肝癌手術后隨時間的存活率分值>0的病例(22例)和分值<0的病例(65例)。結果如圖5所示，根據(jù)聯(lián)合3種標記5AS尸/基因、5"尸/A^72基因和血清中的DNA量的公式—0.042965xBASP1值—0.187008xSPINT2值—2.600843x血清中的DNA量+9，331859的計算，分值>0的22個病例比分值〈0的65個病例具有明顯更高的存活率(總存活率p=0.0289，無病存活率p=0.0372)?？偞婊盥时硎疽环N表達患者在隨訪期的存活率的方法，其不考慮包括肝癌復發(fā)在內的死亡原因(死于其它疾病、老死、因肝硬化但不是肝癌而食管靜脈曲張發(fā)作、其它癌癥、交通事故或自殺的患者也包括在內)。無病存活率(無復發(fā)存活率)表示一種表達在隨訪期內在存活患者中是否觀察到肝癌轉移或復發(fā)的方法?？偞婊盥适中g后的某天(某時間點)的存活患者的百分率。無病存活率在某天(某時間點)在存活患者中無肝癌轉移或復發(fā)的患者的百分率。因此，建議的是，將本發(fā)明業(yè)已發(fā)現(xiàn)的肝癌特異性曱基化基因的甲基化DNA的量的測量，以及將所述測量值與血清中的DNA量的聯(lián)合,用于監(jiān)測肝癌手術后隨時間的存活率。實施例9.通過測量肝癌特異性甲基化基因檢測肝癌*用用于血清和血漿的DNAExtractorSP試劑盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd,),從采自M9例HCV陽性肝癌患者的1ml血清中提取總DNA,并制備50^的DNA溶液。用自制的試劑經BIS處理所述DNA溶液，并制備50pl經BIS處理的DNA溶液。接下來，用5pl所述經BIS處理的DNA溶液對7種肝癌特異性甲基化基因(A4S尸/基因、57W57基因和57D5AZ基因)各實施曱基化特異性PCR(MSP)。在所述MSP中，通過將對各種基因具有特異性的TaqMan探針一起加入，由實時PCR來進行曱基化DNA的定量測定。其間，按專利文獻l所述的方法，同時用lpl所述經BIS處理的DNA溶液測量lml血清的總DNA量。曱基化DNA的定量實際上按照以下方法實施。A4S尸/基因和S尸/A^2基因用LightCyclerTaqManMaster試劑盒(RocheDiagnosticsGmbH)作為擴增試劑，用LightCyclerII(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增儀，實施實時PCR。對于每種基因，將5pl的經BIS處理的DNA溶液加入到PCR反應混合物中，在該混合物中將濃度如表4所示的引物對和TaqMan探針混入1xMastermix中，在20jtd總體積中進行PCR。PCR擴增如下進行在95。C初始變性10分鐘，接著是50個95。C10秒、63°C45秒和72。C5秒的循環(huán)，接著在40。C溫熱30秒。在每一循環(huán)的72。C延伸反應后檢測熒光信號。通過F1/F3分析模式在LightCycler軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測耙基因的擴增，用標準曲線定量50jul經BIS處理的DNA溶液中的曱基化DNA,標準曲線用同時測量的標準品(按以下系列稀釋人工曱基化DNA:1000、200、40和4pg/W)制定。此外，將溶液中所述曱基化DNA的量乘以50,并換算為lml血清中的曱基化DNA的量。將血清中的所述曱基化DNA的量用于統(tǒng)計分析和臨床評估。用自制的試劑作為擴增試劑，用LightCycler2.0(RocheDiagnosticsGmbH)作為核酸擴增儀，實施實時PCR。在將表5中所示濃度或量的引物對、TaqMan探針、乙酸鉀(pH7.5)和Aptamer48混入PCR反應混合物中后，加入5pl的經BIS處理的DNA溶液，該反應混合物由50mMTricine(pH8.3)、3mM乙酸鎂、375pMdNTP、2.5%甘油和0.15單位Z05(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)組成，PCR在20pl總體積中進行。PCR擴增如下進行在95。C初始變性2分鐘，接著是50個95X:i5秒、66。C45秒50和72。C5秒的循環(huán)，接著在40。C溫熱30秒。在每一循環(huán)的66。C延伸反應后檢測熒光信號。通過F1/F3分析模式在LightCycler軟件(RocheDiagnosticsGmbH)中監(jiān)測靶基因的擴增，用標準曲線定量50pl經BIS處理的DNA溶液中的曱基化DNA,標準曲線用同時測量的標準品(按以下系列稀釋人工甲基化的DNA:200、40、10和4pg/pl)制定。此外，將溶液中所述曱基化DNA的量乘以50，并換算為lml血清中的曱基化DNA的量。將血清中的所述曱基化DNA的量用于統(tǒng)計分析和臨床評估。對于上述149例HCV陽性肝癌患者，用三種肝癌特異性曱基化基因、血清中的DNA量和數(shù)據(jù)約簡算法來實施對檢測肝癌進展的臨床評估，所述算法已在用大量病例進行肝癌特異性曱基化基因性能評估的期間建立(實施例3)。具體而言，用Pearson相關系數(shù)檢驗(Pearson，scorrelationcoefficienttest)來評估肺瘤尺寸與曱基化DNA的量、血清中的DNA量或以下分值之間的相關性，所述分值通過在對數(shù)變換甲基化DNA的量和血清中的DNA量后由所述數(shù)據(jù)約簡算法計算得到。結果，SJS尸J基因的曱基化DNA的量趨向于與腫瘤尺寸正相關(F0.216,pO.01)(表18)。此外，以下分值趨向于與腫瘤尺寸負相關(F-0.235,p<0.005，r=-0.244,p<0.005)(表18):由聯(lián)合3種標記SAS"尸/基因、5TW72基因和血清中的DNA量的公式-0.042965xBASPl值-0.187008xSPINT2值-2.600843x血清中的DNA量+9.331859計算得到的分值，或由聯(lián)合3種標記57DW2基因、5P/iV72基因和血清中的DNA量的公式—0.112025xSRD5A2值—0.199992xSPINT2值—2.696542x血清中的DNA量十9.867470計算得到的分值。因此，建議的是，將本發(fā)明業(yè)已發(fā)現(xiàn)的肝癌特異性曱基化基因的甲基化DNA量的測量，或者將所述測量值與血清中的DNA量的聯(lián)合，用于檢測肝癌—的腫瘤尺寸、肝癌的進展。表18:對用肝癌特異性甲基化基因的曱基化DNA的量或聯(lián)用肝癌特異性甲基化基因和血清中的DNA量檢測肝癌逸艮的臨床評估<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>工業(yè)適用性本發(fā)明用于檢測和診斷肝癌(尤其是用于肝癌篩選測定、檢測癌癥前病灶、檢測肝癌治療后復發(fā)風險、檢測肝癌惡化和監(jiān)測肝癌隨時間的進展)，并且可用于臨床診斷、制藥工業(yè)、試劑工業(yè)和醫(yī)療器械工業(yè)附圖簡述圖1.ROC分析對肝癌特異性曱基化基因的性能評估結果。圖2.FLC分析和ROC分析對肝癌特異性曱基化基因的性能評估結果檢測肝癌的能力(BASP1+SPINT2+CFTR,靈敏度70%,特異性80%，識別率74%)。圖3.FLC分析和ROC分析對肝癌(早期肝癌I期且腫瘤尺寸小于3cm)特異性曱基化基因的性能評估結果檢測早期肝癌的能力(BASP1+SPINT2+CCND2,靈敏度52°/。，特異性86%,識別率78%)圖4.FLC分析和ROC分析對肝癌(早期肝癌高度分化)特異性甲基化基因的性能評估結果檢測早期肝癌的能力(BASP1+SPINT2+RASSF1,靈敏度67%,特異性80%,識別率77%)。圖5.肝癌特異性曱基化基因和血清中的DNA量的測量值與肝癌手術后存活率(總存活率和無病存活率)之間的關系的臨床評估結果；A:總存活率，在rogrank檢驗(logranktest)中P=0.0289;B:無病存活率，在rogrank檢驗中P=0.0372。權利要求1.用于檢測BASP1基因和/或SRD5A2基因中含CpG序列的區(qū)域中的肝癌特異性甲基化胞嘧啶的存在情況和/或量的方法，所述方法包括下述步驟(a)-(d)(a)從來自患者的樣品分離基因組DNA；(b)提供用于化學處理或酶處理所述基因組DNA的試劑，以區(qū)分甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶；(c)用PCR方法擴增所述基因組DNA的BASP1基因和/或SRD5A2基因的含甲基化胞嘧啶的區(qū)域；和(d)測定來自所述患者的樣品中的BASP1基因和/或SRD5A2基因中的含CpG序列的區(qū)域中的肝癌特異性甲基化胞嘧啶的存在情況和/或量；其中所述患者樣品中的BASP1基因和/或SRD5A2基因中肝癌特異性的甲基化胞嘧啶的存在和/或量是所述患者以下情況的指征罹患肝癌；肝癌風險增加；具有肝癌治療后復發(fā)風險；具有惡性肝癌或肝癌隨時間進展。2.用于指示患者以下情況的方法罹患肝癌、肝癌風險增加、具有肝癌治療后復發(fā)風險、具有惡性肝癌或肝癌隨時間進展，所述方法通過檢測所述患者樣品中的以下基因中的至少兩種基因的含CpG序列區(qū)域中的肝癌特異性曱基化胞嘧啶的存在情況和/或量來進行BASP1基因、SRD5A2基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFT錄因或RASSF1基因，所述方法包括以下步驟(a)-(d):(a)從來自所述患者的樣品分離基因組DNA;(b)提供用于化學處理或酶處理所述基因組DNA的試劑，以區(qū)分曱基化胞嘧啶和非曱基化胞嘧啶；(c)用PCR方法擴增所述基因組DNA的以下基因中的至少2種基因的含曱基化胞嘧啶的區(qū)域BASP1基因、SRD5A2基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFT驢因或RASSF1基因；和(d)測定所述患者樣品中的以下基因中的至少2種基因的含CpG序列的區(qū)域中的肝癌特異性曱基化胞嘧啶的存在情況和/或量BASP1基因、SRD5A2基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFTR基因或RASSF1基因。3.權利要求1或2的方法，其中PCR引物對中的至少任一個引物的的胞嘧啶殘基的區(qū)域處互補，并且當所述胞嘧啶曱基化時與所述基因組DNA中的所述核苷酸序列特異性雜交。4.權利要求1或2的方法，其中PCR引物對中的至少一個引物與不含可經歷曱基化的胞嘧啶殘基的區(qū)域特異性雜交，并且同時使用用于阻斷由所述PCR引物所進行的擴增的寡核苦酸，其中所述寡核苷酸與所述PCR引物的核苷酸序列部分地重疊，且在其它部分與所述基因組DNA的核苷酸序列在包含可經歷曱基化的胞嘧啶殘基的區(qū)域處互補，當所述胞嘧啶未曱基化時，所述寡核苷酸可與所述基因組DNA的所述核苷酸序列特異性雜交。5.權利要求l-4中任一項的方法，其中使用熒光探針實施實時PCR擴增來作為步驟(c)。6.權利要求1或2的方法，其中PCR引物對可與不含可經歷曱基化的胞嘧啶殘基的基因組DNA核苷酸序列至少在其3'-端處特異性雜交，并通過序列分析或通過質譜來實施步驟(d)的產物中曱基化胞嘧啶的存在情況和/或量的測定。7.權利要求1或2的方法，其中通過給所述基因組DNA提供用于使未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶的試劑來實施步驟(b)的化學處理，8.權利要求7的方法，其中用于使所述DNA中的未曱基化的胞嘧咬轉化為尿嘧啶的所述試劑為含亞硫酸氫鹽的試劑。9.權利要求8的方法，其中所述含亞硫酸氬鹽的試劑包含亞硫酸氫鈉和/或亞疏酸鈉和/或6-羥基-2,5，7,8-四曱基色滿-2-曱酸。10.權利要求1或2的方法，其中通過給所述基因組DNA提供限制酶來實施步驟(b)的酶處理，所述限制酶不能消化含曱基化胞嗜咬的識別位點但能夠消化不含甲基化胞嘧啶的識別位點。11.權利要求1-10中任一項的方法，其中同時測定所述樣品中常用的腫瘤標記蛋白的濃度值和/或不定的DNA的量。12.權利要求ll的方法，其中常用的腫瘤標記蛋白為AFP和/或PIVKA-II。13.權利要求ll的方法，其中將GS丁P1基因的量作為所述樣品中的不定的DNA的量來測量。14.權利要求1-10中任一項的方法，其中肝癌為早期肝癌。15.權利要求1-10中任一項的方法，其中所述樣品來源于人血清、血漿、全血、組織、血液細胞、排泄物或內分泌物/外分泌物。16.包含以下組合的兩個引物的引物對1)BASP1一MSF(SEQIDNo:l)和BASPl一MSR(SEQIDNo:2)2)SPINT2一MSF(SEQIDNo:3)和SPINT2一MSR(SEQIDNo:4)3)APC一MSF(SEQIDNo:5)和APC—MSR(SEQIDNo:6)4)CCND2一MSF(SEQIDNo:7)和CCND2一MSR(SEQIDNo:8)5)CFTR一MSF(SEQIDNo:9)和CFTR一MSR(SEQIDNo:10)6)RASSF1一MSF(SEQIDNo:l1)和RASSF1一MSR(SEQIDNo:12)7)SRD5A2一MSF(SEQIDNo:13)和SRD5A2—MSR(SEQIDNo:14)8)BASPl一F(SEQIDNo:15)和BASPl一R(SEQIDNo:16)9)SPINT2—F(SEQIDNo:17)和SPINT2一R(SEQIDNo:18)10)APC一F(SEQIDNo:19)和APC—R(SEQIDNo:20)11)CCND2一F(SEQIDNo:21)和CCND2—R(SEQIDNo:22)12)CFTR一F(SEQIDNo:23)和CFTR一R(SEQIDNo:24)13)RASSF1—F(SEQIDNo:25)和RASSFl一R(SEQIDNo:26)14)SRD5A2一F(SEQIDNo:27)和SRD5A2—R(SEQIDNo:28)15)SPINT2—HMF(SEQIDNo:29)和SPINT2—HMR(SEQIDNo:30)。17.選自以下的探針1)BASPl一TMP(SEQIDNo:31)2)SPINT2一TMP(SEQIDNo:32)3)APC—TMP(SEQIDNo:33)4)CCND2一TMP(SEQIDNo:34)5)CFTR一TMP(SEQIDNo:35)6)RASSFl一TMP(SEQIDNo:36)7)SRD5A2一TMP(SEQIDNo:37)8)SPINT2—HMBF(SEQIDNo:38)9)SPINT2一HMBR(SEQIDNo:39)。18.用于權利要求l-15中任一項的方法的試劑盒，所述試劑盒由以下組成(a)權利要求16的引物對中的至少一對，和/或；(b)權利要求17的探針中的至少一種。19.用于權利要求1-15中任一項的方法的試劑，所述試劑由以下組成(a)權利要求16的引物對中的至少一對，和/或；(b)權利要求17的探針中的至少一種。20.用于權利要求1-15中任一項的方法的裝置系統(tǒng)，所述裝置系纟克由以下《且成(a)權利要求6的引物對中的至少一對，和/或；(b)權利要求17的探針中的至少一種。21.權利要求16或17的引物或探針的以下用途用于檢測患者樣品中的HCC相關基因的含CpG序列區(qū)域中的肝癌特異性曱基化胞嘧啶堿基的存在情況情況和/或量，或用于檢測患者肝癌、肝癌風險增加、肝癌治療后復發(fā)風險、惡性肝癌或肝癌隨時間進展。全文摘要本發(fā)明提供用于檢測肝癌的新型方法。該方法通過對臨床樣品中特定基因和/或其DNA片段的甲基化的鑒定和/或定量，并通過將所述甲基化DNA的值與血液中存在的腫瘤標記值和/或DNA量結合，從而高靈敏度、高特異性且簡單準確地檢測肝癌，尤其是早期肝癌。本發(fā)明還通過同樣的方法檢測癌癥前病灶、檢測肝癌治療后復發(fā)的風險、檢測肝癌惡化和監(jiān)測肝癌隨時間的進展。就特定基因而言，提及了BASP1基因、SPINT2基因、APC基因、CCND2基因、CFTR基因、RASSF1基因和SRD5A2基因。文檔編號C12Q1/68GK101675171SQ200880014389公開日2010年3月17日申請日期2008年3月1日優(yōu)先權日2007年3月2日發(fā)明者三浦俊昭,岡正朗,森部豐輝,濱本義彥,玉造滋,飯塚德男申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司