專利名稱：甘蔗細(xì)胞懸浮液制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘蔗細(xì)胞工程育種領(lǐng)域，尤其是一種甘蔗細(xì)胞懸浮液制備方法。 技術(shù)背景
植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是指將植物細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中 進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中能夠保持良好的分散狀態(tài)。由于液體培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)和 震蕩，使得愈傷組織上分裂的細(xì)胞不斷游離下來。液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物是混 雜的，既有游離的單個(gè)細(xì)胞，也有較大的細(xì)胞團(tuán)，還有接種殘?jiān)Ｄ壳爸参锛?xì) 胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞的形態(tài)、生理、遺傳、凋亡等研究工 作，特別是為基因工程在植物細(xì)胞水平上及植物化學(xué)誘變育種的操作提供了理 想的材料和途徑。遺傳轉(zhuǎn)化或者化學(xué)誘變的植物細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)分化形成植株， 即可獲得攜帶有目標(biāo)基因的或者誘變后變異的個(gè)體。目前采用的植物細(xì)胞懸浮 液制備方法通常為直接對(duì)外植體進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，或者以第一代愈傷組織， 即第一次從外植體分化的愈傷組織作為振蕩培養(yǎng)材料，這種類型需要較長的液 體振蕩培養(yǎng)多個(gè)周期，每個(gè)周期12 18天，需要時(shí)間長。而且，每個(gè)周期必須 進(jìn)行液體培養(yǎng)基的更換，以達(dá)到細(xì)胞數(shù)增殖的目的。由于進(jìn)行液體培養(yǎng)基的更 換操作必須在無菌條件下進(jìn)行，操作不當(dāng)，容易造成培養(yǎng)材料受污染，與固體 培養(yǎng)相比較，操作難度更大，培養(yǎng)材料容易在更換液體培養(yǎng)基的過程中被污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能簡(jiǎn)便高效地獲得甘蔗細(xì)胞懸浮液的制備方法。
本發(fā)明通過以外植體、第一代愈傷組織、第二代愈傷組織、第三代愈傷組 織和顆粒狀愈傷組織等多種類型材料作為液體振蕩培養(yǎng)材料，試驗(yàn)了 90rpm/min, 120rpm， 180rpm及220rpm/min等多個(gè)搖床轉(zhuǎn)速，對(duì)不同2. 4-W農(nóng)度
液體培養(yǎng)基進(jìn)行了比較研究，最終獲得了簡(jiǎn)便制備甘蔗細(xì)胞懸浮液的方法。
本發(fā)明以生長旺盛期的甘蔗新葉作為外植體，通過三次固體培養(yǎng)，使得培 養(yǎng)材料愈傷組織數(shù)量得到大量增殖。第一次采用[化+2.4-0(3!1^/1)+瓊脂(7§幾)+ 蔗糖(30g/L) +活性碳(0.5g/L)]固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，即采用較高的2.4-D濃度，培養(yǎng)15 20天，使得外植體快速分化獲得甘蔗愈傷組織。第二次和第三次繼代 培養(yǎng)均采用以上相同的培養(yǎng)基，僅降低2.4-D濃度至2mg/L和減去了活性碳，每 次培養(yǎng)時(shí)間為25 30天，使得第一次培養(yǎng)分化出的愈傷組織充分增殖并風(fēng)化為 顆粒狀愈傷組織，即再經(jīng)過兩次[N6+2.4-D(2mg/L)+瓊脂7(g/L) +蔗糖(30§/1)] 的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得顆粒狀甘蔗愈傷組織。以此愈傷組織作為懸浮培養(yǎng)材 料，以2.4-D濃度為lmg/L的液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，在搖床上振蕩培養(yǎng)，搖床 轉(zhuǎn)速為120rpm/min，搖床溫度為28'C，培養(yǎng)12天后，培養(yǎng)液中的顆粒狀愈傷組 織即分散為較均勻的細(xì)胞小團(tuán)塊，團(tuán)塊細(xì)胞數(shù)目在1 200之間。在無菌條件下， 將此懸浮液轉(zhuǎn)接到離心管中，在轉(zhuǎn)速為5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，去除上清 液；將得到的細(xì)胞或者細(xì)胞團(tuán)溶解于N6液體培養(yǎng)基中，在搖床轉(zhuǎn)速為 120rpm/min，搖床溫度為28。C，培養(yǎng)48小時(shí)，即可得到分散均勻的甘蔗細(xì)胞懸 浮液。
所述的外植體是指拔節(jié)期無病蟲危害健康植株的甘蔗新葉，經(jīng)過75%酒精消 毒處理后，切割為2 3毫米長作為外植體。
所述N6液體培養(yǎng)基是指[Ne+2.4-D (lmg/L) +蔗糖(30g/L)]。 有益效果
懸浮培養(yǎng)獲得的甘蔗細(xì)胞團(tuán)是進(jìn)行甘蔗基因工程育種、誘變育種、細(xì)胞學(xué) 研究的理想材料。特別是在甘蔗化學(xué)誘變育種中，與采用塊狀愈傷組織或者幼 嫩新葉作為誘變受體相比較，采用懸浮細(xì)胞系作為誘變受體能夠有效提高誘變 效率。本發(fā)明提出的甘蔗細(xì)胞懸浮液制備方法采用三次固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，使得 外植體分化的愈傷組織得到了充分增殖，僅采用了一個(gè)12天的液體振蕩培養(yǎng)周
期和一個(gè)2天的細(xì)胞分散培養(yǎng)；簡(jiǎn)化了液體培養(yǎng)過程中多次更換液體培養(yǎng)基以達(dá) 到細(xì)胞數(shù)量增殖的操作過程，縮短了液體振蕩培養(yǎng)周期，不需要多次更換液體 培養(yǎng)基，降低了材料因多次更換液體培養(yǎng)基導(dǎo)致污染的風(fēng)險(xiǎn)；該細(xì)胞懸浮液制 備方法可作為甘蔗科研單位或相關(guān)育種機(jī)構(gòu)借鑒利用。
具體實(shí)施例方式
一種甘蔗細(xì)胞懸浮液制備方法，實(shí)施中用到的儀器設(shè)備有超凈工作臺(tái)、滅 菌鍋、控溫?fù)u床和超速離心機(jī)等，其詳細(xì)實(shí)施步驟如下
1、愈傷組織培養(yǎng)在甘蔗拔節(jié)以后，選擇無病蟲危害的健康植株，采取幼嫩新葉，用自來水洗凈，以75%酒精擦洗消毒，在無菌工作臺(tái)內(nèi)剝?nèi)ネ鈱永先~，
每剝一層，以75%酒精擦洗消毒一次，最后一層新葉無需再進(jìn)行消毒。選擇自 甘蔗莖尖生長點(diǎn)2 3厘米長的新葉作為外植體，將其切為2 3毫米長后，接 種到固體培養(yǎng)基上[Ne+2.4-D (3mg/L) +瓊脂(78幾)+蔗糖(30g/L) +活性碳 (0.5g/L)]，每個(gè)培養(yǎng)皿培養(yǎng)8 10個(gè)外植體，在暗環(huán)境，溫度28 30'C下培 養(yǎng)時(shí)間為15 20天，即可得到第一次由外植體分化的愈傷組織。
2、 顆粒狀愈傷組織培養(yǎng)顆粒狀愈傷組織培養(yǎng)包含兩次繼代過程。首先， 在無菌條件下，將步驟1所得到的愈傷組織接種到[N6+2.4-D (2mg/L) +瓊脂 (7g/L)+蔗糖(30g/L)]的固體培養(yǎng)基上。接種過程中，選擇分化良好的愈傷組 織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，去除褐化及死亡的外植體或者愈傷組織。每個(gè)培養(yǎng)皿接種6 8塊大小適中的愈傷組織，自然光，室溫培養(yǎng)25 30天，使愈傷組織充分分化； 然后，在無菌條件下將得到的甘蔗愈傷組織接種到如上述相同的固體培養(yǎng)基中， 自然光室溫下繼續(xù)培養(yǎng)25 30天，即可以得到活性較好、黃綠色的顆粒狀愈傷 組織。
3、 顆粒狀愈傷組織懸浮培養(yǎng)在無菌條件下，將按照步驟2所述得到的顆 粒狀愈傷組織接種到N6液體培養(yǎng)基中[艮+2，4-D (lmg/L) +蔗糖(30g/L)]，在 搖床上振蕩培養(yǎng)12天，搖床轉(zhuǎn)速為120rmp/min，溫度為28°C。因?yàn)橛糜谡袷?培養(yǎng)的愈傷組織己經(jīng)為小的顆粒狀，因此，經(jīng)過12天的振蕩培養(yǎng)后即均勻分散 為小的細(xì)胞團(tuán)塊，懸浮于液體培養(yǎng)基中。液體振蕩培養(yǎng)的目的在于將固體培養(yǎng) 階段得到的顆粒狀愈傷組織分散為均勻更小的細(xì)胞團(tuán)塊。
4、 懸浮物離心在無菌條件下，將步驟3所述的小細(xì)胞團(tuán)塊溶液轉(zhuǎn)接到離 心管中進(jìn)行離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置為5000rpm/min，離心20min。在無菌條件下， 去除上清液，留下離心沉積物。
5、 細(xì)胞懸浮液的獲得在無菌條件下，將步驟4所得到的離心沉積物轉(zhuǎn)接 到如步驟3所述的液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)接的過程中，去除褐化、死亡的小細(xì)胞 團(tuán)塊和大的細(xì)胞團(tuán)塊。搖床上振蕩培養(yǎng)2天，搖床轉(zhuǎn)速為120rmp/min。即可得 到分散均勻的甘蔗細(xì)胞懸浮液。
權(quán)利要求
1、一種甘蔗細(xì)胞懸浮液制備方法，其特征在于以甘蔗新葉作為外植體，采用三次固體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到顆粒狀甘蔗愈傷組織，第一次培養(yǎng)時(shí)間15～20天，第二次和第三次培養(yǎng)時(shí)間各為25～30天；顆粒狀甘蔗愈傷組織接種到N6液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為120rpm/min、溫度為28℃的搖床上振蕩培養(yǎng)12天后，將培養(yǎng)液中的懸浮液轉(zhuǎn)接到離心管中，在轉(zhuǎn)速為5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，去除上清液；留下的離心沉積物轉(zhuǎn)接到N6液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為120rpm/min、溫度為28℃的搖床上振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，即可得到分散均勻的甘蔗細(xì)胞懸浮液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述三次固體培養(yǎng)基 培養(yǎng)時(shí)，第一次采用[N6+2. 4-D (3mg/L) +瓊脂(7^0+蔗糖(30g/L) +活性碳(0. 5g/L)]固體培養(yǎng)基，第二次和第三次采用[N6+2. 4-0(211^/0+瓊脂(78/1) + 蔗糖(30g/L)]固體培養(yǎng)基。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的外植體選擇自 甘蔗莖尖生長點(diǎn)2 3厘米長的新葉，經(jīng)過75%酒精消毒處理后，切割為2 3 毫米長作為外植體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的N6是指[N6+2.4-D (lmg/L) +蔗糖(30g/L)]液體培養(yǎng)基。
全文摘要
甘蔗細(xì)胞懸浮液制備方法，以甘蔗新葉作為外植體，采用三次固體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到顆粒狀甘蔗愈傷組織，甘蔗愈傷組織接種到N6液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為120rpm/min、溫度為28℃的搖床上振蕩培養(yǎng)12天后，將培養(yǎng)液中的懸浮液轉(zhuǎn)接到離心管中，在轉(zhuǎn)速為5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，去除上清液；留下的離心沉積物轉(zhuǎn)接到N6液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為120rpm/min、溫度為28℃的搖床上振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，即可得到分散均勻的甘蔗細(xì)胞懸浮液；本發(fā)明簡(jiǎn)化了液體培養(yǎng)過程中多次更換液體培養(yǎng)基以達(dá)到細(xì)胞數(shù)量增殖的操作過程，縮短了液體振蕩培養(yǎng)周期，不需要多次更換液體培養(yǎng)基，降低了材料因多次更換液體培養(yǎng)基導(dǎo)致污染的風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/04GK101434932SQ200810233740
公開日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者侯朝祥, 杰 催, 劉家勇, 劉新龍, 吳才文, 坤 楊, 俊 趙, 趙培方, 陳學(xué)寬 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所