專利名稱：一種細(xì)胞計數(shù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測量方法，具體地說，是關(guān)于細(xì)胞計數(shù)的方法及其用途，尤其是 該方法在細(xì)胞內(nèi)蛋白印跡中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞計數(shù)是在生命科學(xué)研究中經(jīng)常使用的技術(shù)。目前有許多方法用于細(xì)胞計數(shù)，
但是又各有局限經(jīng)典的血球計數(shù)板法及其系列衍生方法(如申請?zhí)枮?1213605.0的 中國專利所述細(xì)胞計數(shù)方法)雖然測量直觀，但由于細(xì)胞分散不利或檢測人員的熟練 程度等原因會產(chǎn)生計數(shù)誤差，且單個樣本計數(shù)耗時較長，無法同時對大量樣本進(jìn)行操 作，降低了實驗結(jié)果的平行性.；染色法雖然可以滿足批量操作的要求，但是各種染料 的消耗又提高了實驗的成本(如日本專利WO2006t)03696)。尤其是在使用細(xì)胞內(nèi)蛋白 印跡(In-cellwestern,ICW)測量某種蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)的實驗中，需要對細(xì)胞的總 數(shù)進(jìn)行計算，使用的熒光染料(如美國專利US5563070，歐洲專利EP0634640等)價 格更是昂貴，同時數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性不高。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)計數(shù)準(zhǔn)確度不高、成本高昂等不足，本發(fā)明提供了一種成本低 廉，數(shù)據(jù)可靠，批處理結(jié)果平行性好的細(xì)胞計數(shù)方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案步驟包括以下步驟
1. 將需要計數(shù)的未知數(shù)量的實驗組細(xì)胞和至少4組已知數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞貼壁培 養(yǎng)于平面之上；
2. 需要細(xì)胞計數(shù)時吸去原培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞一次；
3. 加入濃度為0. 1% 1%的戊二醛溶液浸泡細(xì)胞10分鐘~1小時；
4. 吸去戊二醛溶液，用PBS清洗細(xì)胞兩次以上；
5. 吸去殘存PBS，并晾干細(xì)胞培養(yǎng)平面；
6. 使用紅外激光掃描成像系統(tǒng)，選擇660nm—710nm之間任一波長激光激發(fā)，在 大于激發(fā)激光波長40nm處檢測樣品的熒光強(qiáng)度；
7. 結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熒光強(qiáng)度1# 與細(xì)胞 數(shù)量N標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系公式I標(biāo)a-aXN標(biāo)準(zhǔn)+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為
截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知； 8.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的熒光強(qiáng)度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即N實驗二 (I 實驗—b)/a。
所述的戊二醛溶液采用水、生理鹽水、PBS緩沖液作為溶劑配制。
本發(fā)明能夠應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)蛋白印跡，在所述的步驟5中，吸出PBS溶液，用 Ttriton-X100溶液洗滌若干次，每次3 5分鐘；加入封閉劑室溫振蕩1~3小時；加入 纖維連接蛋白抗體于4°C保持10~16小時或室溫下保持4小時，用吐溫洗滌液洗滌若 干次，每次3 5分鐘；加入800nm熒光標(biāo)記二抗于室溫振蕩l 3小時，再用吐溫洗滌 液洗滌若干次，每次3 5分鐘；吸去殘存液體并晾干96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；在所述的步驟 6之前使用紅外雙色激光掃描成像系統(tǒng)Odyssey對96孔板進(jìn)行掃描,780nm激光激發(fā)， 檢測820nm波長處樣品的熒光強(qiáng)度，該熒光強(qiáng)度代表纖維連接蛋白的含量；在所述的 步驟8之后用代表纖維連接蛋白的含量820nm波長處熒光強(qiáng)度除以該實驗組的細(xì)胞 數(shù)，求出平均每個細(xì)胞所表達(dá)的纖維連接蛋白的數(shù)量。
本發(fā)明的有益效果是由于采用戊二醛對細(xì)胞進(jìn)行浸泡處理，在起到固定細(xì)胞作 用的同時，利用戊二醛與蛋白質(zhì)相互作用產(chǎn)生紅外熒光這一現(xiàn)象，結(jié)合紅外熒光檢測 設(shè)備對細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計算，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明體現(xiàn)了簡化實驗步驟，降低成本 (與使用熒光染料相比費用降低十幾倍)，提高實驗精度及結(jié)果平行性的有益效果。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
具體實施例方式
實施例h使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)
1. 人骨肉瘤細(xì)胞MG-63以未知密度(實驗組)及己知的每孔密度(標(biāo)準(zhǔn)組)16 X104、 8X104、 4X104、 2X104、 1X104、 0.5X104、 0.25乂104個細(xì)胞，接入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板；
2. 培養(yǎng)6小時待細(xì)胞充分貼壁后，吸出培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗孔內(nèi)細(xì)胞一次；
3. 向孔內(nèi)加入加入0.5%戊二醛溶液，其體積應(yīng)至少可以覆蓋所培養(yǎng)的細(xì)胞，靜 置30分鐘；
4. 吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔內(nèi)細(xì)胞至少兩次；
5. 吸去殘存水分，并晾干96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；
6. 使用紅外雙色激光掃描成像系統(tǒng)Odyssey， 680nm激光激發(fā)，檢測720nm波長 處樣品的熒光強(qiáng)度；
7. 結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熒光強(qiáng)度Iwt與細(xì)胞 數(shù)量N標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系公式I標(biāo)準(zhǔn)-aXN標(biāo)準(zhǔn)+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截 距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知；
8. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的熒光強(qiáng)度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即N^二 (I 實驗—b)/a0
采用本發(fā)明所述的方法對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，在線性范圍廣(0.25X104 16X104)， 數(shù)據(jù)結(jié)果平行性好，線性程度高(112 = 0.998)，根據(jù)所得一元方程及測量樣本的720nm 處熒光強(qiáng)度，可以快速、準(zhǔn)確的計算出樣本中的細(xì)胞數(shù)目。
實施例2:使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)
1. 人骨肉瘤細(xì)胞MG-63以未知密度(實驗組)及已知的密度(標(biāo)準(zhǔn)組)按每孔16 X104、 8XI04、 4X104、 2X104、 1X104、 0.5乂104細(xì)胞，接入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板；
2. 培養(yǎng)6小時待細(xì)胞充分貼壁后，吸出培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗孔內(nèi)細(xì)胞一次；
3. 向孔內(nèi)加入加入1%戊二醛(PBS配置)溶液，其體積應(yīng)至少可以覆蓋所培養(yǎng)的 細(xì)胞，靜置10分鐘；
4. 吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔內(nèi)細(xì)胞至少兩次；
5. 吸去殘存水分，并晾干48孔細(xì)胞培養(yǎng)板；
6. 使用紅外激光掃描成像系統(tǒng)，660nm激光激發(fā)，檢測700nm波長處樣品的熒光 強(qiáng)度；
7. 結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熒光強(qiáng)度1 與細(xì)胞數(shù) 量N標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系公式I標(biāo)準(zhǔn)=aXN +b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距， 皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知；
8. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的熒光強(qiáng)度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即N錢=(I 實驗—b)/a。
采用本發(fā)明所述的方法對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，在線性范圍廣(0.5X104 16X104)， 數(shù)據(jù)結(jié)果平行性好，線性程度高(R2二0.995)，根據(jù)所得一元方程及測量樣本的700nm
處熒光強(qiáng)度，可以快速、準(zhǔn)確的計算出樣本中的細(xì)胞數(shù)目。 實施例3:使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)
1. 人骨肉瘤細(xì)胞MG-63以未知密度(實驗組)及已知密度(標(biāo)準(zhǔn)組)按每孔8X
104、 4X104、 2X104、 1X104、 0.5X1()4細(xì)胞，接入384孔細(xì)胞培養(yǎng)板；
2. 培養(yǎng)6小時待細(xì)胞充分貼壁后，吸出培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗孔內(nèi)細(xì)胞一次；
3. 向孔內(nèi)加入加入0.1%戊二醛(PBS配置)溶液，其體積應(yīng)至少可以覆蓋所培養(yǎng) 的細(xì)胞，靜置l小時；
4. 吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔內(nèi)細(xì)胞至少兩次；
5. 吸去殘存水分，并晾干384孔細(xì)胞培養(yǎng)板；
6. 使用紅外激光掃描成像系統(tǒng)，710nm激光激發(fā)，檢測750nm波長處樣品的熒光 強(qiáng)度；
7. 結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熒光強(qiáng)度Iff應(yīng)與細(xì)胞 數(shù)量N標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系公式I標(biāo)準(zhǔn)-aXN標(biāo)準(zhǔn)+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截 距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知；
8. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的熒光強(qiáng)度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即N錢- (I 實驗一b)/a。
采用本發(fā)明所述的方法對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，在線性范圍廣(0.25X104 8X104)， 數(shù)據(jù)結(jié)果平行性好，線性程度高(R2^0.996)，根據(jù)所得一元方程及測量樣本的720nm 處熒光強(qiáng)度，可以快速、準(zhǔn)確的計算出樣本中的細(xì)胞數(shù)目。
實施例4 :本發(fā)明在細(xì)胞內(nèi)蛋白印跡中的應(yīng)用 以檢測人骨肉瘤細(xì)胞MG-63的纖維連接蛋白表達(dá)為例
1. 將未知數(shù)量的細(xì)胞(實驗組)和己知數(shù)量的系列標(biāo)準(zhǔn)組MG-63細(xì)胞(4X 104、 2X104、 1X104、 0.5X104)接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)適當(dāng)時間；
2. 吸去培養(yǎng)基，用PBS溶液小心清洗孔內(nèi)細(xì)胞；
3. 加入0.5%戊二醛(PBS配置)溶液，靜置30分鐘后；
4. 吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔內(nèi)細(xì)胞至少兩次；
5. 吸出PBS溶液，用Ttriton-XlOO溶液洗滌5次，每次5分鐘；加入封閉劑 室溫振蕩2小時；加入纖維連接蛋白抗體于4°C保持16小時，用吐溫洗滌 液洗滌5次，每次5分鐘；加入800nm熒光標(biāo)記二抗于室溫振蕩1小時， 再用吐溫洗滌液洗滌5次，每次5分鐘；吸去殘存液體并晾干96孔細(xì)胞培 養(yǎng)板；
6. 使用紅外雙色激光掃描成像系統(tǒng)Odyssey對96孔板進(jìn)行掃描，780nm激光 激發(fā)，檢測820nm波長處樣品的熒光強(qiáng)度，該熒光強(qiáng)度代表纖維連接蛋白 的含量；
7. 使用紅外雙色激光掃描成像系統(tǒng)Odyssey對96孔板進(jìn)行掃描，680nm激光 激發(fā)，檢測720nm波長處樣品的熒光強(qiáng)度，該熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞數(shù)量；
8. 結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到720nm波長處熒 光強(qiáng)度I標(biāo)準(zhǔn)與細(xì)胞數(shù)量N標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系公式I鄉(xiāng)=aXN Ml.+b，其中a為一 元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知；
9. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的熒光強(qiáng)度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即N^ =(I實驗一b)/a;
10. 用代表纖維連接蛋白的含量820nm波長處熒光強(qiáng)度除以該實驗組的細(xì)胞 數(shù)，求出平均每個細(xì)胞所表達(dá)的纖維連接蛋白的數(shù)量。
實施例5 :本發(fā)明在細(xì)胞內(nèi)蛋白印跡中的應(yīng)用 以檢測人骨肉瘤細(xì)胞MG-63的纖維連接蛋白表達(dá)為例
1. 將未知數(shù)量的細(xì)胞(實驗組)和已知數(shù)量的系列標(biāo)準(zhǔn)組MG-63細(xì)胞(4X 104、 2X104、 1X104、 0.5X104)接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)適當(dāng)時間；
2. 吸去培養(yǎng)基，用PBS溶液小心清洗孔內(nèi)細(xì)胞；
3. 加入0.5%戊二醛(PBS配置)溶液，靜置30分鐘后；
4. 吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔內(nèi)細(xì)胞至少兩次；
5. 吸出PBS溶液，用Ttriton-X100溶液洗滌4次，每次3分鐘；加入封閉劑 室溫振蕩3小時；加入纖維連接蛋白抗體于室溫4小時，用吐溫洗滌液洗 滌4次，每次3分鐘；加入800nm熒光標(biāo)記二抗于室溫振蕩3小吋，再用
吐溫洗滌液洗滌4次，每次3分鐘；吸去殘存液體并晾干96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；
6. 使用紅外雙色激光掃描成像系統(tǒng)Odyssey對96孔板進(jìn)行掃描，780nm激光 激發(fā)，檢測820nm波長處樣品的熒光強(qiáng)度，該熒光強(qiáng)度代表纖維連接蛋白 的含量；
7. 使用紅外雙色激光掃描成像系統(tǒng)Odyssey對96孔板進(jìn)行掃描，680nm激光 激發(fā)，檢測720nm波長處樣品的熒光強(qiáng)度，該熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞數(shù)量；
8. 結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到720nm波長處熒 光強(qiáng)度I標(biāo)準(zhǔn)與細(xì)胞數(shù)量N標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系公式I標(biāo)準(zhǔn)-aXN標(biāo)準(zhǔn)+b，其中a為一 元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知；
9. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的熒光強(qiáng)度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即N實驗 =(I實驗一b)/a;
10. 用代表纖維連接蛋白的含量820nm波長處熒光強(qiáng)度除以該實驗組的細(xì)胞 數(shù)，求出平均每個細(xì)胞所表達(dá)的纖維連接蛋白的數(shù)量。
細(xì)胞內(nèi)蛋白印跡目的在于檢測細(xì)胞中某種蛋白的表達(dá)量，為了對不同樣本進(jìn)行歸 一化處理，以消除實驗樣品中細(xì)胞數(shù)量的差異而導(dǎo)致的數(shù)據(jù)誤差，需要對各個樣本的 細(xì)胞數(shù)進(jìn)行量化， 一般使用兩種與核酸結(jié)合的熒光染料進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。將本發(fā)明所述 方法運用于細(xì)胞內(nèi)蛋白印跡中，使用戊二醛進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，大大降低了成本，同時戊 二醛作為一種已知的固定劑，在該細(xì)胞內(nèi)蛋白印跡中兼有固定細(xì)胞和細(xì)胞計數(shù)的雙重 作用，從而簡化了實驗的操作步驟。
權(quán)利要求
1、一種細(xì)胞計數(shù)的方法，其特征在于包括下述步驟(a)將需要計數(shù)的未知數(shù)量的實驗組細(xì)胞和至少4組已知數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于平面之上；(b)需要細(xì)胞計數(shù)時吸去原培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞一次；(c)加入濃度為0. 1％～1％的戊二醛溶液浸泡細(xì)胞10分鐘～1小時；(d)吸去戊二醛溶液，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞兩次以上；(e)吸去殘存磷酸鹽緩沖液，并晾干細(xì)胞培養(yǎng)平面；(f)使用紅外激光掃描成像系統(tǒng)，選擇660nm—710nm之間任一波長激光激發(fā)，在大于激發(fā)激光波長40nm處檢測樣品的熒光強(qiáng)度；(g)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熒光強(qiáng)度I標(biāo)準(zhǔn)與細(xì)胞數(shù)量N標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系公式I標(biāo)準(zhǔn)＝a×N標(biāo)準(zhǔn)+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知；(h)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的熒光強(qiáng)度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即N實驗＝(I實驗—b)/a。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞計數(shù)的方法，其特征在于所述的戊二醛 溶液采用水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液作為溶劑配制。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞計數(shù)的方法，其特征在于所述的步驟(e) 中，吸出PBS溶液，用Ttriton-XlOO溶液洗滌若干次，每次3 5分鐘；加入封 閉劑室溫振蕩1~3小時；加入纖維連接蛋白抗體于4°C保持10~16小時或室溫 下保持4小時，用吐溫洗滌液洗漆若干次，每次3 5分鐘；加入800nm熒光標(biāo) 記二抗于室溫振蕩1~3小時，再用吐溫洗滌液洗滌若干次，每次3 5分鐘；吸 去殘存液體并晾干96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；在所述的步驟(f)之前使用紅外雙色激光 掃描成像系統(tǒng)Odyssey對96孔板進(jìn)行掃描，780nm激光激發(fā)，檢測820nm波 長處樣品的熒光強(qiáng)度，該熒光強(qiáng)度代表纖維連接蛋白的含量；在所述的步驟(h) 之后用代表纖維連接蛋白的含量820nm波長處熒光強(qiáng)度除以該實驗組的細(xì)胞 數(shù)，求出平均每個細(xì)胞所表達(dá)的纖維連接蛋白的數(shù)量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細(xì)胞計數(shù)的方法，將需要計數(shù)的實驗組細(xì)胞和已知數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于平面之上；吸去原培養(yǎng)基，清洗細(xì)胞，加入戊二醛溶液浸泡，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞后晾干細(xì)胞；使用紅外激光檢測樣品的熒光強(qiáng)度；結(jié)合已知細(xì)胞數(shù)量與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熒光強(qiáng)度I_{標(biāo)準(zhǔn)}與細(xì)胞數(shù)量N_{標(biāo)準(zhǔn)}的關(guān)系公式I_{標(biāo)準(zhǔn)}＝a×N_{標(biāo)準(zhǔn)}+b；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的熒光強(qiáng)度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即N_實驗＝(I_實驗-b)/a。本發(fā)明體現(xiàn)了簡化實驗步驟，降低成本，提高實驗精度及結(jié)果平行性的有益效果。
文檔編號C12Q1/02GK101382482SQ200810231880
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者澎 商, 維 張, 李京寶, 哲 王, 田宗成, 續(xù)惠云, 麗 謝, 騫愛榮 申請人:西北工業(yè)大學(xué)