專利名稱：網(wǎng)織紅細胞檢測方法及檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細胞檢測方法及裝置，特別是涉及一種網(wǎng)織紅細胞的 檢測方法及檢測裝置。
技術(shù)背景網(wǎng)織紅細胞(reticulocyte)是介于晚幼紅細胞和成熟紅細胞之間的尚未 完全成熟的紅細胞。網(wǎng)織紅細胞計數(shù)是評價骨髓造血功能和紅細胞生成活 力的重要指標。在正常生理情況下骨髓從原始細胞到網(wǎng)織紅細胞需4天，然后網(wǎng)織紅 細胞在骨髓中成熟48小時進入外圍血液，血液中的網(wǎng)織紅細胞繼續(xù)成熟 48小時變成成熟的紅細胞。外周血中網(wǎng)織紅細胞數(shù)量，對于評價骨髓紅系 造血及網(wǎng)織紅細胞從骨髓到外周血的轉(zhuǎn)送速率有重要意義計數(shù)網(wǎng)織紅細胞是血液學診斷中評估紅細胞生成能力的基礎(chǔ)性實驗， 是貧血的診斷、分型和療效監(jiān)測的基礎(chǔ)，能夠確認骨髓的化療和移植療效， 監(jiān)測EPO (促紅細胞生成素)的療效等。網(wǎng)織紅細胞是從骨髓最新被釋放到外周血的成熟紅細胞的前體細胞， 同成熟紅細胞相比，其細胞內(nèi)仍殘存少量的RNA。因此，測定網(wǎng)織紅細胞 的基本原理就是用某種染料與細胞內(nèi)RNA結(jié)合，再通過顯微鏡鏡檢或采 用流式細胞術(shù)(FCM)等方法檢測被染色的網(wǎng)織紅細胞。目前，網(wǎng)織紅細胞的鏡檢方法是1949年建立的利用新亞甲藍(New Methylene Blue， NMB)活體染色方法。用新亞甲藍這種染料進行的活體染 色被認為是確定網(wǎng)織紅細胞的參考方法。傳統(tǒng)采用RNA染料(如新亞甲藍)鏡檢法可以直接觀察細胞的形態(tài)， 又不需要昂貴設備，是診治貧血的基本實驗方法。這種方法，需要在顯微 鏡下人工統(tǒng)計大量的細胞數(shù)目(例如500到1000)，計數(shù)精確性差，而且緩 慢、繁瑣，受人為因素的干擾較大。而且，臨床上用網(wǎng)織紅細胞的指標只 有網(wǎng)織紅細胞百分比計數(shù)及其派生的網(wǎng)織紅細胞絕對值和生成指數(shù)。目前用于多用途FCM分析網(wǎng)織紅細胞最通用的一種染料是 EP0226272提出的噻唑橙(thiazoleorange， TO)。該熒光染料的一個缺點是他們通常需要很長孵育時間，不能滿足自動檢測儀器的需要。噻唑橙在室溫下需要30-60分鐘的孵育時間。US5994138提供了一種改進的試劑體系， 將噻唑橙染色的孵育時間從數(shù)十分鐘減少到數(shù)十秒鐘。但是，噻唑橙染色 需要昂貴的氬離子激光(488nm)作為激發(fā)光源。吖啶橙染色與鏡檢法相關(guān)性較好，染色時間也短，無需細胞固定。但 是，吖啶橙能沉淀RNA;這就由于潛在的猝滅而阻礙了對RNA含量的定 量測定。此外，吖啶橙不會導致被染色細胞的擴散熒光分布。細胞的年齡 分布(依據(jù)與熒光成正比的RNA含量)就是不可靠的。吖啶橙對流式細胞儀 中的塑料管有很大的親和力，這將導致背景增加，并且延長從流式細胞儀 管道清除染料的過程。US5773299提供了一種利用非對稱花青(unsymmetrical cyanine dye) 測量網(wǎng)織紅細胞的方法。但是，這種方法同樣需要價格高而且體積大的氬 離子激光器，所以裝置本身價格高且體積大。W09532424提供了一種利用Coriphosphine O染色測定網(wǎng)織紅細胞的 方法。該方法可以在60秒內(nèi)完成對網(wǎng)織紅細胞的染色。但是，這種方法需 要釆用波長為450nm-540nm的激發(fā)光源，優(yōu)選較少見的綠色激發(fā)光源，成 本較高。目前，作為網(wǎng)織紅細胞檢驗金標準的流式細胞儀和大部分的全自動網(wǎng) 織紅檢測儀均采用了昂貴的氬離子激光(488nm)作為光源。僅僅檢測器光源 就需要數(shù)萬元的成本。而且生物自身的自發(fā)熒光也在這個范圍之內(nèi)，產(chǎn)生一定的干擾。另外，作為流式細胞儀的常規(guī)熒光染料的染色速度慢，通常需要機外 人工對樣本進行預處理。為了滿足自動血液分析儀的檢測速度，需要在60秒內(nèi)完成對網(wǎng)狀紅細胞的測試。因此，為了適應全自動血液分析儀進行網(wǎng)織紅細胞檢測的需要，目前 迫切需要開發(fā)一種新的可迅速準確檢測網(wǎng)織紅細胞的方法，該方法必須滿 足在數(shù)十秒鐘內(nèi)自動完成網(wǎng)織紅細胞的測量，同時，還要求這種檢測方法 的實現(xiàn)成本比較低廉。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，提供一種能夠在短時間 內(nèi)完成網(wǎng)織紅細胞檢測且成本低廉的網(wǎng)織紅細胞檢測方法。本發(fā)明的另一目的在于提供采用上述j"法進行網(wǎng)織紅細ii檢測的裝置。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案 本發(fā)明公開一種網(wǎng)織紅細胞檢測方法，所述方法包括步驟A、 將網(wǎng)織紅細胞檢測試劑與待測全血混勻，制備成測定用試樣；B、 將測定用試樣導入具有激光光源的檢測裝置中，檢測細胞樣本經(jīng) 激光照射的前向低角度散射光強度及熒光強度；所述網(wǎng)織紅細胞檢測試劑包括具有如下式(I)或(II)所示的結(jié)構(gòu)的 紅色激發(fā)熒光染料，R7 R4其中，Rl、 R2、 R2，、 R3、 R4、 R5、 R5，、 R6可以相同或不相同，表示 氫原子、低級垸基、?；?、低級烷氧基或帶苯環(huán)的低級烷基，其中R6還可 以是苯環(huán)；R7為氫原子或氯原子；n為l或2; X—為陰離子。所述紅色激發(fā)熒光染料優(yōu)選具有如下式(III)、 (IV)或(V)所示的 結(jié)構(gòu)，(IV)(V)所述步驟A中，網(wǎng)織紅細胞檢測試劑與待測全血混合后于25°C 50 x:溫度下反應10秒 1分鐘。所述步驟A中，網(wǎng)織紅細胞檢測試劑與待測全血的混合比例為250:1 畫:l。步驟B中，所述激光光源發(fā)射紅色區(qū)域激光，包括氦氖激光或紅色半 導體激光。所述激光光源發(fā)射的紅色區(qū)域激光的波長為600 680nm。 步驟B中，所述前向低角度散射光的散射角度為1 6度。所述方法進一步包括步驟，繪制前向低角度散射光強度與熒光強度的 二維散點圖，根據(jù)細胞在散點圖上的位置確定網(wǎng)織紅細胞區(qū)域。本發(fā)明還公開了一種網(wǎng)織紅細胞檢測裝置，用于根據(jù)上述的方法檢測 網(wǎng)織紅細胞，所述裝置包括一個流動室，在該流動室中，網(wǎng)織紅細胞檢測試劑與待測全血混勻后 形成的測定用試樣呈單細胞通過；一個用于照射從流動室噴出的細胞樣本的激光光源；一個用于檢測細胞被激光光源照射后的前向低角度散射光強度的第一檢測器；一個用于檢測細胞被激光光源照射后的熒光強度的第二檢測器。優(yōu)選的，所述裝置還包括一個信號處理單元，所述信號處理單元收集 第一檢測器的前向低角度散射光強度信號及第二檢測器的熒光強度信號， 并繪制前向低角度散射光強度-熒光強度的二維散點圖，由二維散點圖確 定網(wǎng)織紅細胞的分布。
所述第一檢測器優(yōu)選為光電二極管，所述第二檢測器優(yōu)選為光電倍增管。
由于采用了以上的技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于 本發(fā)明提供了一種快速、廉價的檢測樣本中網(wǎng)織紅細胞的方法。本發(fā) 明通過采用特定的紅色熒光染料，能夠在短時間內(nèi)(60秒內(nèi))完成網(wǎng)織紅 細胞的檢測，并且無需人工預處理樣本，可在利用流式細胞技術(shù)的全自動 血液分析儀檢測網(wǎng)織紅細胞，從而能夠?qū)崿F(xiàn)網(wǎng)織紅細胞的自動檢測；本發(fā) 明還可以采用價格低廉的紅色激光作為激發(fā)光源，極大降低了檢測成本。 采用本發(fā)明的方法及裝置利用臨床血液樣本進行測試，并與手工鏡檢對照， 一致性較好。


圖1是本發(fā)明的一種網(wǎng)織紅細胞檢測裝置的光學檢測系統(tǒng)原理框圖。 FSC-前向散射光，F(xiàn)L-熒光，SSC-側(cè)向散射光。
圖2是實施例1中采用本發(fā)明的方法及裝置對正常血液樣本進行檢測 的散點圖。FSC-前向散射光，F(xiàn)L-熒光，RBC-紅細胞，RET-網(wǎng)織紅細胞， PLT-血小板。
圖3是實施例2中采用本發(fā)明的方法及裝置對異常血液樣本進行檢測 的散點圖。FSC-前向散射光，F(xiàn)L-熒光，RBC-紅細胞，RET-網(wǎng)織紅細胞， PLT-血小板。
圖4是實施例3中采用本發(fā)明的方法及裝置對網(wǎng)織紅細胞提純樣本進 行檢測的散點圖。FSC-前向散射光，F(xiàn)L-熒光，RBC-紅細胞，RET-網(wǎng)織紅 細胞，PLT-血小板。
圖5是實施例4中采用本發(fā)明的方法及裝置對血液樣本進行檢測的散點圖。
圖6是實施例5中采用本發(fā)明的方法及裝置對血液樣本進行檢測的散點圖。
具體實施例方式
本發(fā)明采用一種特定的紅色熒光染料對網(wǎng)織紅細胞進行染色，染色過
程能夠在短時間內(nèi)(60秒內(nèi))完成，染色后的細胞釆用流式細胞術(shù)測定細 胞的前向低角度散射光強度和側(cè)向熒光強度，并根據(jù)熒光強度的差異來區(qū) 分血液中的成熟紅細胞與網(wǎng)織紅細胞。
本發(fā)明方法采用一種新型的紅色激發(fā)熒光染料，為菁類陽離子熒光染 料，能夠被紅色半導體激光器等提供紅色區(qū)域激光的器件發(fā)出的紅色激光 所激發(fā)；該熒光染料能夠特異結(jié)合細胞內(nèi)核酸(RNA、 DNA)，可以標記 網(wǎng)織紅細胞內(nèi)殘留的核酸物質(zhì)。本發(fā)明采用紅色激發(fā)熒光染料具有如下式 (I)或(II)所示的結(jié)構(gòu)，<formula>formula see original document page 10</formula>
其中，Rl、 R2、 R2'、 R3、 R4、 R5、 R5，、 R6可以相同或不相同，表示 氫原子、低級烷基、?；⒌图壽趸驇П江h(huán)的低級垸基，其中R6還可 以是苯環(huán)；R7為氫原子或氯原子；n為l或2; X—為陰離子。
本發(fā)明中，所述低級烷基通常是指具有1 30個碳原子數(shù)的烷基。 本發(fā)明優(yōu)選具有如下式(n:)、(IV)或(V)所示的結(jié)構(gòu)的紅色激發(fā) 熒光染料，<formula>formula see original document page 11</formula>本發(fā)明采用的紅色熒光染料染色速度快，通常孵育10s 40s即可完成 染色。熒光染料可滲透到網(wǎng)織紅細胞膜內(nèi)，將細胞質(zhì)內(nèi)的RNA加以染色， 細胞質(zhì)內(nèi)含有RNA的網(wǎng)織紅細胞將被染色，且依照RNA含量的多寡反應
染色的程度。
本發(fā)明中，血液樣本為經(jīng)過抗凝劑處理的待測全血，血液樣本不需經(jīng) 過預先固定即可與網(wǎng)織紅細胞檢測試劑相混合。本發(fā)明的方法中，網(wǎng)織紅 細胞檢測試劑與血液樣本的混合比例為250: 1 1000: 1，優(yōu)選為500: 1。 混合后在孵育池中進行孵育。孵育溫度優(yōu)選25 50'C，更優(yōu)選35"C。反應 時間將因試劑中含有的色素不同，以及濃度的不同而有差異，優(yōu)選10秒 1分鐘，更優(yōu)選20秒 40秒，最優(yōu)選30秒。
隨后網(wǎng)織紅細胞檢測試劑與血液樣本混合形成的測定用試樣導入具 有激光光源的檢測裝置中進行檢測。本發(fā)明采用發(fā)射紅色區(qū)域激光光源， 所使用紅色波長的光源，能夠發(fā)出所用色素的激發(fā)波長附近的紅色波長的 光，例如600 680nm左右的光，則沒有特殊的限制，例如可以使用He-Ne 激光器、紅色區(qū)域的半導體激光器等。本發(fā)明優(yōu)選采用633nm的半導體激光管作為光源，有效降低了光源成本。檢測裝置可以為利用流式細胞技術(shù) 的全自動血液分析儀，從而能夠?qū)崿F(xiàn)網(wǎng)織紅細胞的自動檢測。
待測細胞被制備成單個細胞的懸液，被染色的細胞在注射器或氣泵的
壓力下進入流動室(Flow Cell)。流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的約束下，細 胞排成單列，由流動室的噴嘴噴出，成為細胞液柱。液柱與入射的光束垂 直相交，相交點稱為測量區(qū)。通過測量區(qū)的細胞被激發(fā)后，產(chǎn)生熒光和散 射光，通過光學系統(tǒng)(透鏡、光闌、濾片和檢測器等)收集光信號。熒光FL 信號強度與細胞結(jié)合的熒光染料濃度相關(guān)，散射光信號與細胞的大小、形 狀、質(zhì)膜和細胞內(nèi)部的折射率有關(guān)。其中，前向散射光FSC與細胞的尺寸 相關(guān)，可以用來分辨細胞的大小。散射角度小于10的光線稱為低角度散射 光FSC，該信號與細胞的體積和內(nèi)容物密切相關(guān)。本發(fā)明中具體采用了 1~6 度的前向低角度散射光線。
分別將熒光信號FL與散射光FSC為X和Y兩個變量構(gòu)成一個二維圖 像。其中，F(xiàn)L與熒光染色程度相關(guān)，F(xiàn)SC與細胞的大小有關(guān)，由此劃分網(wǎng) 織紅細胞、成熟紅細胞、血小板及白細胞的分布，再根據(jù)網(wǎng)織紅細胞特異 性染料的染色，精確地計數(shù)網(wǎng)織紅細胞和計算網(wǎng)織紅細胞的其它參數(shù)。
具體而言，由于RNA含量的不同，所以可以將紅細胞和網(wǎng)織紅細胞 區(qū)分出來，幼稚的網(wǎng)織紅細胞顯示最強的熒光，反之成熟紅細胞極少或沒 有熒光。由于DNA和RNA含量的不同，可以將網(wǎng)織紅細胞和白細胞區(qū)分 出來。另外，血小板也被染色，根據(jù)熒光強度和體積將其區(qū)分出來。
根據(jù)熒光強度，將網(wǎng)織紅細胞分成低熒光強度網(wǎng)織紅細胞、中熒光強 度網(wǎng)織紅細胞和高熒光強度網(wǎng)織紅細胞三部分。
本發(fā)明還公開了采用上述方法檢測網(wǎng)織紅細胞的裝置，主要包括-
一個流動室，在該流動室中，網(wǎng)織紅細胞檢測試劑與待測全血混勻后 形成的測定用試樣呈單細胞通過；
一個用于照射從流動室噴出的細胞樣本的激光光源； "i一個用于檢測細胞被激光光源照射后的前向低角度散射光強度的第一
一個用于檢測細胞被激光光源照射后的熒光強度的第二檢測器。 以及一個信號處理單元，用于收集第一檢測器的前向低角度散射光強度信號及第二檢測器的熒光強度信號，并繪制前向低角度散射光強度-熒 光強度的二維散點圖，由二維散點圖確定網(wǎng)織紅細胞的分布。
圖1列出了本發(fā)明的檢測網(wǎng)織紅細胞裝置的具體光學檢測系統(tǒng)原理 框圖。其中，光源12為紅色激光器，可以為氦氖激光或半導體激光器；光 源發(fā)出的激光被透鏡16準直后照射到流動室14的檢測區(qū)上；細胞在鞘流 的作用下逐個穿過檢測區(qū)。當血液細胞穿過流動室時，照射到細胞的激光 會向四周散射。每一種細胞都有不同的散射特性，可以用來區(qū)分不同的細 胞。散射角度小于10的光線稱為低角度散射光FSC，該信號與細胞的體 積和內(nèi)容物密切相關(guān)。這里具體采用了 1 6度的前向低角度散射光線，被 檢測的前向散射光角度是通過光闌30來控制。低角度散射光線經(jīng)過透鏡 32整理后被檢測器34轉(zhuǎn)化為電信號。前向散射光FSC的檢測器34是光 電二極管。
在與入射光線垂直的90度方向，檢測兩個信號側(cè)向散射光SSC和 熒光信號FL。他們都是通過收集透鏡18進行收集，經(jīng)過光柵20后到達二 色鏡22:其中，側(cè)向散射光SSC被二色鏡折射到檢測器28。熒光FL透過 二色鏡通道后，經(jīng)過濾色片40進一步濾掉激光光源，被檢測器42探測到。
側(cè)向散射光檢測器28可以是光電倍增管或者光電二極管。
熒光檢測器42為光電倍增管。
該裝置還包括一個信號處理單元。在網(wǎng)織紅細胞檢測中，信號處理單 元收集前向散射光(FSC)和熒光(FL)通道的信號。熒光信號和散射光信號經(jīng) 過模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換，分別被劃分成4096級。根據(jù)這兩種信號的強度分布繪制 二維散點圖，散點圖的y軸為前向散射光FSC， x軸為熒光。
網(wǎng)織紅細胞(RET)中含有可以被熒光染料染色的核酸，熒光信號比較 強。而成熟紅細胞(RBC)的熒光強度較弱，故比較靠近y軸。血小板(PLT) 的體積較小，而且只能被非特異性染色，熒光強度和前向散射光信號都比 較弱，集中在靠近原點的區(qū)域。
利用熒光強度的差別辨別成熟紅細胞(RBC)和網(wǎng)織紅細胞(RET)。并 且根據(jù)熒光的強度將散點圖中RET分為3個區(qū)，熒光強度越高，網(wǎng)織紅細 胞越幼稚。
以下通過具體的實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述。 以下實施例通過釆用本發(fā)明的方法及裝置利用臨床血液樣本進行測試，并與手工鏡檢對照， 一致性較好。另外，正常情況下，網(wǎng)織紅細胞在 血液中的含量很少。我們還進行了提純后高濃度網(wǎng)織紅細胞的測試，進一 步驗證了散點圖上網(wǎng)織紅細胞的位置。 實施例l配置如下組成的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑。熒光染料(III) 7mgNaH2P04.H20 53.8mgNa2HP04.7H20 163.4mg椰油甜菜堿 100mg精致水 1L(調(diào)整pH為7 )在1毫升的試劑中加入經(jīng)過抗凝劑處理的血液4微升，在4(TC下的孵育 池中孵育30秒，形成測定用試樣。測定用試樣采用本發(fā)明的方法及本發(fā)明的帶紅色半導體激光器的檢測 裝置進行檢測，紅色半導體激光器的激發(fā)波長為633nm 635nm，功率為 5mW。通過測定前向低角度散射光FSC強度及熒光FL強度，得到如圖2所示 的散射圖。測量結(jié)果顯示，該樣本中網(wǎng)織紅細胞(RET)在總紅細胞中所占的 比例為1.25%。另外，將相同血樣采用傳統(tǒng)手工鏡檢方法檢測，結(jié)果網(wǎng)織紅細胞(RET) 在總紅細胞中所占的比例為1.17%。釆用上述網(wǎng)織紅細胞檢測試劑處理后經(jīng)儀器檢測的結(jié)果與手工鏡檢結(jié) 果一致性好。實施例2:配置如下組成的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑。熒光染料(III) 7mgNaH2P04.H20 53.8mgNa2HP04.7H20 163.4mg椰油甜菜堿 100mg精致水 1L (調(diào)整pH為7)在1毫升試劑中加入經(jīng)過抗凝劑處理的血液4微升，在40。C下恒溫放置 30秒后，或孵育池中孵育30秒，形成測試用試樣。測定用試樣采用本發(fā)明方法及本發(fā)明的帶紅色半導體激光器的檢測裝置進行檢測，紅色半導體激光器的激發(fā)波長為633nm 635nm，功率為5mW。 通過測定前向低角度散射光FSC強度及熒光FL強度，得到如圖3所示的散射圖。本實施例與實施例l不同之處在于所測定血液樣本不同，實施例l所測 為正常人血液樣本，本實施例所測異常血液樣本，含有較高的網(wǎng)織紅細胞。 測量結(jié)果顯示，該樣本中網(wǎng)織紅細胞(RET)在總紅細胞中所占的比例為5.08 %。傳統(tǒng)手工鏡檢結(jié)果為5.22%，兩者一致性好。為丫證明網(wǎng)織紅細胞在散點圖上的位置，我們從血液中提純了網(wǎng)織紅 細胞。配置如下組成的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑。(調(diào)整pH為7)采用與實施例l相同的方法進行檢測，結(jié)果如圖4所示，圖4為從全血中 提純分離后的網(wǎng)織紅細胞檢測散點圖。從圖中可以很清楚地看到較高濃度 的網(wǎng)織紅細胞在散點圖上的位置分布。實施例4:配制如下組成的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑。 熒光染料(IV) 7mg 磷酸氫二鈉 53.8mg 磷酸二氫鈉 163.4mg 椰油甜菜堿 100mg 精致水 1L (調(diào)整pH為7)在1亳升試劑中加入經(jīng)過抗凝劑處理的血液4微升，在4(TC下恒溫放 置30秒后，或孵育池中孵育30秒，形成測試用試樣。測定用試樣采用本發(fā)明方法及本發(fā)明的帶紅色半導體激光器的檢測裝 置進行檢測，激發(fā)波長為633nm 635nm，功率為5mW。通過測定前方低實施例3:熒光染料(ni)NaH2P04.H20 Na2HP04.7H20椰油甜菜堿 精致水7mg 53.8mg 163.4mg 100mg角度散射光強度及熒光強度，得到如圖5所示的散射圖。其中網(wǎng)織紅細胞 (RET)在總紅細胞中所占的比例為5.35%。另外，將相同血樣釆用傳統(tǒng)手工鏡檢方法檢測，結(jié)果網(wǎng)織紅細胞(RET) 在總紅細胞中所占的比例為5.22%。釆用上述網(wǎng)織紅細胞檢測試劑處理后經(jīng)儀器檢測的結(jié)果與手工鏡檢結(jié) 果一致性好。本樣本為異常血液，網(wǎng)織紅細胞含量較高。實施例5:配制如下組成的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑。熒光染料(V) 7mg磷酸氫二鈉 53.8mg磷酸二氫鈉 163.4mg椰油甜菜堿 100mg精致水 1L (調(diào)整pH為7)在1毫升試劑中加入經(jīng)過抗凝劑處理的血液4微升，在4(TC下恒溫放 置30秒后，或孵育池中孵育30秒，形成測試用試樣。測定用試樣采用本發(fā)明方法及本發(fā)明的帶紅色半導體激光器的檢測裝 置進行檢測，激發(fā)波長為633nm 635nm，功率為5mW。通過測定前方低 角度散射光強度及熒光強度，得到如圖6所示的散射圖。其中網(wǎng)織紅細胞 (RET)在總紅細胞中所占的比例為5.35%。另外，將相同血樣采用傳統(tǒng)手工鏡檢方法檢測，結(jié)果網(wǎng)織紅細胞(RET) 在總紅細胞中所占的比例為5.22%。采用上述網(wǎng)織紅細胞檢測試劑處理后經(jīng)儀器檢測的結(jié)果與手工鏡檢結(jié) 果一致性好。本樣本為異常血液，網(wǎng)織紅細胞含量較高。
權(quán)利要求
1. 一種網(wǎng)織紅細胞檢測方法，所述方法包括步驟A、將網(wǎng)織紅細胞檢測試劑與待測全血混勻，制備成測定用試樣；B、將測定用試樣導入具有激光光源的檢測裝置中，檢測細胞樣本經(jīng)激光照射的前向低角度散射光強度及熒光強度；所述網(wǎng)織紅細胞檢測試劑包括具有如下式(I)或(II)所示的結(jié)構(gòu)的紅色激發(fā)熒光染料，id="icf0001" file="A2007100731420002C1.gif" wi="128" he="94" top= "82" left = "41" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中，R1、R2、R2’、R3、R4、R5、R5’、R6可以相同或不相同，表示氫原子、低級烷基、?；⒌图壨檠趸驇П江h(huán)的低級烷基，其中R6還可以是苯環(huán)；R7為氫原子或氯原子；n為1或2；X-為陰離子。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種網(wǎng)織紅細胞檢測方法，其特征在于所 述紅色激發(fā)熒光染料具有如下式(m)、 (IV)或(V)所示的結(jié)構(gòu)，<formula>formula see original document page 3</formula>
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種網(wǎng)織紅細胞檢測方法，其特征在于所述步驟A中，網(wǎng)織紅細胞檢測試劑與待測全血混合后于25'C 50'C溫度 下反應10秒 1分鐘。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種網(wǎng)織紅細胞檢測方法，其特征在于所 述步驟A中，網(wǎng)織紅細胞檢測試劑與待測全血的混合比例為250:1 1000:1。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種網(wǎng)織紅細胞檢測方法，其特征在于步驟B中，所述激光光源發(fā)射紅色區(qū)域激光，包括氦氖激光或紅色半導體激光。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種網(wǎng)織紅細胞檢測方法，其特征在于所述激光光源發(fā)射的紅色區(qū)域激光的波長為600 680nm。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種網(wǎng)織紅細胞檢測方法，其特征在于 步驟B中，所述前向低角度散射光的散射角度為1 6度。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種網(wǎng)織紅細胞檢測方法，其特征在于-所述檢測裝置為流式細胞檢測儀。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種網(wǎng)織紅細胞檢測方法，其特征在于 所述方法進一步包括步驟，繪制前向低角度散射光強度與熒光強度的二維 散點圖，根據(jù)細胞在散點圖上的位置確定網(wǎng)織紅細胞區(qū)域。
10、 一種網(wǎng)織紅細胞檢測裝置，用于根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法檢測網(wǎng)織紅細胞，所述裝置包括--個流動室，在該流動室中,網(wǎng)織紅細胞檢測試劑與待測全血混勻后 形成的測定用試樣呈單細胞通過；-個用于照射從流動室噴出的細胞樣本的激光光源；一個用于檢測細胞被激光光源照射后的前向低角度散射光強度的第一一個用于檢測細胞被激光光源照射后的熒光強度的第二檢測器。
11、 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的一種網(wǎng)織紅細胞檢測裝置，其特征在于 所述裝置還包括一個信號處理單元，所述信號處理單元收集第一檢測器的 前向低角度散射光強度信號及第二檢測器的熒光強度信號，并繪制前向低 角度散射光強度--熒光強度的二維散點圖，由二維散點圖確定網(wǎng)織紅細胞 的分布。
12、 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的一種網(wǎng)織紅細胞檢測裝置，其特征 在于所述第一檢測器為光電二極管，所述第二檢測器為光電倍增管。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速、廉價的檢測樣本中網(wǎng)織紅細胞的方法以及利用該方法對網(wǎng)織紅細胞進行檢測的裝置。本發(fā)明的方法可以在利用流式細胞技術(shù)的全自動血液分析儀上檢測網(wǎng)織紅細胞。該方法采用一種紅色熒光染料，利用紅色激光作為激發(fā)光源，可以在60秒鐘內(nèi)完成網(wǎng)織紅細胞的自動檢測。
文檔編號C12Q1/02GK101236158SQ20071007314
公開日2008年8月6日 申請日期2007年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月29日
發(fā)明者兵 徐, 軍 趙 申請人:深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司