專利名稱：：一種耳聾易感基因篩查試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種對(duì)耳聾易感基因進(jìn)行篩査的試劑盒。
背景技術(shù)：
：人體疾病的控制與預(yù)防，關(guān)鍵是預(yù)知疾病，即知道疾病發(fā)病傾向，然后才能進(jìn)行針對(duì)性的保健。目前疾病的檢查分5個(gè)等級(jí)組織器官水平、臨床前、細(xì)胞水平、蛋白質(zhì)水平、基因水平(分子水平)，由此看出，基因檢測(cè)是最早的預(yù)警，也是最精確最高水平的診斷。基因檢測(cè)是通過(guò)對(duì)受檢者基因編碼序列的測(cè)定和定位分析，精確定格相關(guān)器官的生理健康狀態(tài)，探知現(xiàn)在，預(yù)示未來(lái)。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化操作，結(jié)果可隨時(shí)與國(guó)際接軌。它能使每個(gè)受檢者有意識(shí)、有針對(duì)性地捍衛(wèi)現(xiàn)時(shí)健康，調(diào)節(jié)與控制易患疾病因素的"適時(shí)"表達(dá)。人類目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的單基因遺傳疾病有6000多種，抽取羊水細(xì)胞，甚至從母體血中都可獲得胎兒細(xì)胞。檢査這些細(xì)胞的該基因是否有缺陷，就能確定胎兒是否從親體獲得遺傳性疾病，如是，則可立即終止妊娠。當(dāng)前更先進(jìn)的方法是進(jìn)行體外受精，然后取早期胚胎細(xì)胞進(jìn)行基因檢査，選取正常的早期胚胎植入母體妊娠。通過(guò)對(duì)病原體DNA的檢查，可以使傳染病的檢出率、檢出速度大大提高。例如對(duì)結(jié)核桿菌感染的診斷，以前要靠痰、糞便或血液培養(yǎng)，耗時(shí)兩周以上，現(xiàn)在用基因診斷的方法，不僅敏感性大大提高，而且在l小時(shí)內(nèi)就能得出結(jié)果?；驒z査對(duì)非感染性疾病的診斷也有幫助。目前基因診斷已擴(kuò)大到疾病易感性基因的檢查。有些基因改變本身并不致病，但這些基因改變的個(gè)體易受某些環(huán)境因素的作用而得某種疾病，例如現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)染色體上的BCR1基因發(fā)生突變的女性易患乳腺癌，據(jù)此可篩選出乳腺癌易感人群，加強(qiáng)預(yù)防?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)糖尿病、骨質(zhì)疏松、高血壓、白血病等多種疾病的易感基因。在各種疾病易感基因中，聾病易感基因已受到越來(lái)越多的關(guān)注。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部和中國(guó)殘聯(lián)的統(tǒng)計(jì)資料，我國(guó)目前有1.2億人存在聽(tīng)力障礙，其中聽(tīng)力4語(yǔ)言殘疾者達(dá)2780萬(wàn)人，并以每年3萬(wàn)聾兒的速度在增長(zhǎng)，其中一半以上患者的病因與遺傳因素有關(guān)。發(fā)達(dá)國(guó)家的臨床研究數(shù)據(jù)表明，遺傳性耳聾在耳聾患者中約占80%，因此近十幾年來(lái)，遺傳性耳聾的發(fā)病機(jī)制及其分子流行病學(xué)的研究成為了聾病研究最重要的內(nèi)容之一。隨著人類基因組計(jì)劃完成，聾病基因的定位和克隆取得了巨大的進(jìn)步，聾病的分子遺傳學(xué)研究和分子流行病學(xué)的數(shù)據(jù)使研究者們逐步認(rèn)識(shí)到聾病易感基因突變?cè)诰S護(hù)聽(tīng)力健康和發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力異常中的重要性。在目前已經(jīng)定位和克隆的耳聾相關(guān)基因中，GJB2是最常見(jiàn)的易感基因，在先天性重度耳聾患者中約占30-50%。目前，在該基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了IOO多種突變類型，然而，不同種族GJB2基因常見(jiàn)的突變形式不同。在中國(guó)常見(jiàn)的突變形式為235delC，其在所有致病性突變中約占74.14%，約22.2%的中國(guó)耳聾患者與該突變有關(guān)。該基因突變者多數(shù)表現(xiàn)為先天性重度耳聾，然而相當(dāng)一部分GJB2基因突變者在出生時(shí)其聽(tīng)力并無(wú)異常，在聽(tīng)力篩査中被判定為"通過(guò)"，使得此型耳聾的發(fā)現(xiàn)被延遲。因此，在新生兒期對(duì)GJB2基因突變進(jìn)行篩査是早期發(fā)現(xiàn)潛在耳聾危機(jī)、早期預(yù)警和早期干預(yù)的重要策略。藥物的耳毒性是導(dǎo)致語(yǔ)前聽(tīng)力損失的一個(gè)重要因素，部分與線粒體12SrRNA基因1555A—G突變有關(guān)，該突變可以增加耳蝸對(duì)氨基糖甙類藥物的敏感性。在美國(guó)，耳毒性藥物相關(guān)的聽(tīng)力損失患者中，10%的具有12SrRNA基因1555A—G突變，美國(guó)語(yǔ)前聽(tīng)力損失患者中，1555A—G突變患者的發(fā)病率約為1/20000-1/40000。在西班牙，12SrRNA基因1555A—G突變與15-20%的家族性非綜合征型聽(tīng)力損失有關(guān)，許多年老的家族成員即使沒(méi)有使用氨基糖甙類藥物也可發(fā)生因此突變導(dǎo)致的聽(tīng)力下降。而在中國(guó)，藥物性耳聾的發(fā)病率超出了原有的想象，在一系列的文章報(bào)道中，發(fā)現(xiàn)在門(mén)診散發(fā)的耳聾患者中的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)約5%的患者是由于12SrRNA基因1555A—G突變導(dǎo)致的，而在聾啞學(xué)校這樣一個(gè)特殊群體，則高達(dá)12%的患者是由于12SrRNA基因1555A—G突變接觸氨基糖甙類藥物而致聾。同時(shí)在中國(guó)群體中還發(fā)現(xiàn)了12SrRNA基因1494C—T突變與藥物性耳聾的關(guān)系，目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三個(gè)大的家系是由于1494C—T突變導(dǎo)致的。1555A—G突變和1494C—T突變者在出生時(shí)往往聽(tīng)力正常，很難通過(guò)聽(tīng)力篩査而被提前發(fā)現(xiàn)和預(yù)測(cè)，卻存在因耳毒性藥物的使用而發(fā)生聽(tīng)力損失的隱患。針對(duì)線粒體12SrRNA基因1555A—G突變和51494C—T突變的基因檢測(cè)可以揭示母系遺傳的特征，并可以進(jìn)行有效的預(yù)警。對(duì)Pendred綜合征病人的研究表明，在SLC26A4基因檢測(cè)時(shí)常帶有兩個(gè)突變位點(diǎn)，而61%的單純前庭水管擴(kuò)大患者僅帶有單個(gè)突變，這一點(diǎn)提示在1.7%的SLC26A4基因突變攜帶者中，超過(guò)30%的人都可能具有發(fā)病的危險(xiǎn)。同時(shí)也表明，在這些單純前庭水管擴(kuò)大患者中，可能存在其他基因的突變與SLC26A4基因的單個(gè)突變相互作用。最近的研究顯示，在810名感音神經(jīng)性耳聾的患兒中，20.8%的患兒表現(xiàn)為前庭水管擴(kuò)大并感音神經(jīng)性聾，理論上講，這些患兒出生后即有癥狀，然而這些癥狀發(fā)現(xiàn)的平均年齡卻為5.8歲?？梢酝茰y(cè)，他們之中約7%的患兒表現(xiàn)為語(yǔ)前聽(tīng)力損失，若當(dāng)時(shí)進(jìn)行早期基因檢測(cè)和干預(yù)的話這些患兒會(huì)大大受益。趙亞麗等對(duì)中國(guó)西北地區(qū)101個(gè)大前庭水管綜合征的家庭中107名患者和159名重度感音神經(jīng)性耳聾患者進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，初步繪制了前庭水管擴(kuò)大相關(guān)基因SLC26A4在中國(guó)人群的突變圖譜，發(fā)現(xiàn)了存在于中國(guó)人群突變熱點(diǎn)區(qū)域?yàn)閮?nèi)含子7的3'端的IVS7-2A>G。SLC26A4與大前庭導(dǎo)水管綜合征密切相關(guān)，基因診斷可以對(duì)疾病進(jìn)行早期的預(yù)防和預(yù)警，有利于明確病因并可以盡可能地防止聽(tīng)力進(jìn)行性下降。這些進(jìn)展為臨床疾病的診斷提供了更為全面的手段，為病人提供了更為有效的咨詢。通過(guò)上述三個(gè)易感基因與遺傳性耳聾的關(guān)系，結(jié)合當(dāng)前施行的聾病治療策略與技術(shù)，我們可以設(shè)計(jì)一套遺傳性耳聾綜合防治的方案1、如果患兒基因診斷結(jié)果提示先天性耳聾是由于GJB2基因突變導(dǎo)致的，那么該患兒的耳神經(jīng)傳導(dǎo)通路以及聽(tīng)覺(jué)語(yǔ)言中樞應(yīng)該是正常的，因此在患兒早期即可進(jìn)行人工耳蝸移植，使患兒獲得良好的語(yǔ)言發(fā)育。2、如果1555A〉G基因檢査為陽(yáng)性，那么患兒的母親家族中應(yīng)該永遠(yuǎn)避免應(yīng)用氨基糖甙類藥物，防止藥物性耳聾發(fā)生。進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，對(duì)于有生育耳聾患兒風(fēng)險(xiǎn)的夫婦意義特別重大。當(dāng)他們生育一個(gè)聾兒后，迫切想知道第二個(gè)孩子的情況，這時(shí)的基因診斷加上產(chǎn)前診斷，在懷孕10周后即可確認(rèn)胎兒的耳聾基因狀態(tài)，從而可以提前采取干預(yù)措施，避免聾兒出生。3、如果對(duì)所有新生兒進(jìn)行遲發(fā)性聽(tīng)力損失相關(guān)的四個(gè)基因突變熱點(diǎn)(GJB2235delC、SLC26A4IVS7-2A—G、12SrRNA1555A—G、12SrRNA1494C—T突變)進(jìn)行檢測(cè)，再加上對(duì)巨細(xì)胞病毒感染的檢査，那么對(duì)于新生兒中具有遲發(fā)性聽(tīng)力損失的高危兒來(lái)說(shuō)，其中60%可在新生兒期即做到癥狀前診斷，同時(shí)在先天性聽(tīng)力損失患兒中至少40%的可以明確病因。6這是一個(gè)令人鼓舞的數(shù)據(jù)和具有很好前景的革命性工作。這些干預(yù)措施可以使數(shù)萬(wàn)孩童及其家庭免除一生的痛苦，更可為國(guó)家每年節(jié)省數(shù)百億元的經(jīng)濟(jì)損失，其社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義也同樣巨大。為了實(shí)現(xiàn)聾病防治工作的"早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)"，我國(guó)自2000年開(kāi)始在全國(guó)普及新生兒聽(tīng)力篩査。目前新生兒的聽(tīng)力篩查正在不斷擴(kuò)展，所用的方法是新生兒在出生后三天內(nèi)應(yīng)用耳聲發(fā)射儀器進(jìn)行檢測(cè)，42天后進(jìn)行復(fù)査。國(guó)家衛(wèi)生部以及母嬰保健法要求的新生兒聽(tīng)力篩查的陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)率為r%。，而實(shí)際工作開(kāi)展至今的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)新生兒重度耳聾的平均發(fā)病率基本符合該比例。但是在對(duì)5歲兒童和青春期14歲人群的研究結(jié)果中，這一比例則分別約為2.53%。和3.54%Q，差別非常之大，研究顯示隨著新生兒的生長(zhǎng)發(fā)育，遲發(fā)型耳聾和藥物性耳聾的發(fā)病率迅速提高。這一現(xiàn)象表明，單純新生兒聽(tīng)力篩査具有很大的局限性，僅就技術(shù)策略來(lái)說(shuō)，聽(tīng)力篩査是無(wú)法發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力正常的藥物性耳聾基因攜帶者和遲發(fā)型耳聾患者的，而如果在新生兒聽(tīng)力篩查中融入聾病易感基因篩査的內(nèi)容將會(huì)如何呢？根據(jù)我們前期對(duì)10000例新生兒進(jìn)行易感基因篩査的研究，發(fā)現(xiàn)線粒體12SrRNAA1555G基因篩査陽(yáng)性者比例約為1%。；12SrRNAC1556T基因篩査陽(yáng)性者比例約為4.4%。；發(fā)現(xiàn)GJB2致聾基因突變者比例約為12.9%。；SLC26A4致聾基因突變者比例約為12%。。累計(jì)聾病基因檢測(cè)的陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)率約為30%。，比當(dāng)前聽(tīng)力篩查的檢出率高出30倍。以我國(guó)每年1800萬(wàn)新生兒計(jì)，通過(guò)易感基因篩査，每年將可篩査出54萬(wàn)名新生兒是致聾基因的攜帶者，并且如前文所述可以通過(guò)早期干預(yù)和提前預(yù)知使其中的5060%免于發(fā)病，這樣就在很大程度上彌補(bǔ)了新生兒聽(tīng)力篩査的不足。這說(shuō)明新生兒耳聾易感基因篩査具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。對(duì)于耳聾易感基因的檢測(cè)，國(guó)際及國(guó)內(nèi)都已發(fā)展出了多種技術(shù)策略及相應(yīng)的產(chǎn)品。目前市場(chǎng)上現(xiàn)有的聾病易感基因檢測(cè)方法及其產(chǎn)品主要有如下幾種1.基因芯片法目前已有的試劑盒采用了基因芯片的原理，可同時(shí)檢測(cè)4個(gè)耳聾相關(guān)基因(GJB2,GJB3,SLC26A4和12SrRNA)的IO個(gè)突變熱點(diǎn)。該試劑盒的組成包括PCR擴(kuò)增引物混合物、PCR擴(kuò)增試劑混合物、雜交試劑、洗滌試劑、芯片和蓋片等。優(yōu)點(diǎn)是快速、高通量篩查，但操作過(guò)于復(fù)雜，成本太高，不易普及。2.LDR法以連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligasedetectionreaction,LDR)為核心技術(shù)，目前有針對(duì)藥物性致聾相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)的試劑盒，可以檢測(cè)到多個(gè)位點(diǎn)的突變，但是需要探針技術(shù)、雜交，以及洗脫后進(jìn)行結(jié)果的判讀，操作環(huán)節(jié)較多，需要專業(yè)人員操作。同時(shí)雖然該法較芯片技術(shù)成本低，但一次檢測(cè)操作至少要5小時(shí)以上。3.RFLP法以限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)為核心技術(shù)，目前已有的該類型試劑盒主要由DNA提取部分、PCR部分、內(nèi)切酶試劑組成，成本比芯片技術(shù)及LDR技術(shù)相對(duì)較低，操作也相對(duì)簡(jiǎn)單，但是需要模板制備、PCR擴(kuò)增、酶切和電泳驗(yàn)證，操作時(shí)間長(zhǎng)，過(guò)程繁鎖，各個(gè)環(huán)節(jié)之間關(guān)系緊密，一步失誤則下一步無(wú)法進(jìn)行。DNA的提取還需要消耗一定的時(shí)間和成本，而且血樣的提取、結(jié)果的判讀需要有經(jīng)驗(yàn)的人員進(jìn)行專門(mén)的培訓(xùn)后才能勝任，不適合面向基層的普及應(yīng)用。4.定量PCR法目前有針對(duì)藥物性致聾相關(guān)基因的試劑盒，配以野生型和突變型兩種特異性引物、基因特異性熒光探針、PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶、核苷酸單體等成分，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR體外擴(kuò)增法檢測(cè)A1555A>G野生型、A1555A〉G突變型、C1494T野生型，C1494T突變型四種型別。該試劑盒的特異性較好，但對(duì)儀器和操作人員技術(shù)要求較高，成本較高，對(duì)操作人員需要較高的技術(shù)要求，因此不適合普及和推廣。如上所述，這些方法普遍存在技術(shù)要求高、步驟多、速度慢、成本高等特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)醫(yī)院的實(shí)施難度較大，尤其是很難在基層臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行推廣和普及，更無(wú)法成為耳聾易感基因篩查的工具。當(dāng)前，為了從根本上提高國(guó)民醫(yī)療水平，國(guó)家提出了"戰(zhàn)略前移、重心下移"的疾病防治新戰(zhàn)略，著重強(qiáng)調(diào)以預(yù)防為主、以農(nóng)村為主。因此，開(kāi)發(fā)易操作、成本低、適合基層推廣的技術(shù)方法和相應(yīng)產(chǎn)品成為當(dāng)務(wù)之急，具有重大的醫(yī)療價(jià)值和社會(huì)意義。四弓l物ARMS-PCR法(Tetrasprimeramplificationrefractorymutationsystem-PCR，TetrasprimerARMS-PCR)屬于等位基因特異PCR技術(shù)范疇，其基本原理是由于TaqDNA聚合酶無(wú)3'—5'外切酶活性，當(dāng)引物的3'末端堿基不能與模板互補(bǔ)時(shí)，延伸效率明顯降低，當(dāng)錯(cuò)配堿基的數(shù)目達(dá)到一定程度或者反應(yīng)條件達(dá)到一定的嚴(yán)謹(jǐn)程度時(shí)，延伸無(wú)法繼續(xù)，反應(yīng)終止，得不到特異長(zhǎng)度的擴(kuò)增條帶。基于此，針對(duì)一個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩個(gè)延伸方向相反的內(nèi)側(cè)8引物(Innerprimer),這兩個(gè)引物的3'末端堿基分別與SNP位點(diǎn)的一個(gè)堿基相同(或互補(bǔ))，然后按正常的方法設(shè)計(jì)兩個(gè)方向相反的外引物(Outerprimer);這四個(gè)引物可以組成三個(gè)引物對(duì)，在同一個(gè)擴(kuò)增體系進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠電泳檢測(cè)時(shí)，出現(xiàn)兩條帶的是純合基因型，出現(xiàn)三條帶的是雜合基因型。如上所述，四引物ARMS-PCR法的技術(shù)實(shí)施不需要特殊的設(shè)備和復(fù)雜的操作步驟，只需要一個(gè)PCR反應(yīng)和一次凝膠電泳就可以明確區(qū)分出三種基因型。因此該技術(shù)是一個(gè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便高效、使用成本低廉的基因分型方法，自2001年被提出以來(lái)即獲得了廣泛的應(yīng)用，尤其是對(duì)于多位點(diǎn)多樣本的檢測(cè)，其操作簡(jiǎn)捷和成本低廉的特點(diǎn)更是具有當(dāng)前其它方法所無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)以下的措施來(lái)達(dá)到的設(shè)計(jì)了一種遺傳性耳聾易感基因篩査試劑盒，以12srRNA基因1494位點(diǎn)的C—T突變、12srRNA基因1555位點(diǎn)的A—G突變、SLC26A4基因IVS7(-2)位點(diǎn)的A—G突變、GJB2基因235位點(diǎn)C(±)為檢測(cè)對(duì)象，根據(jù)四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)原理，針對(duì)每個(gè)待測(cè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)和優(yōu)化出一套特異引物，并將成套引物置于同一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)四個(gè)反應(yīng)管進(jìn)行一次多重PCR擴(kuò)增和一次凝膠電泳，即可同時(shí)獲得該四個(gè)位點(diǎn)的基因型。線粒體基因組12srRNA基因第1555位點(diǎn)A—G突變檢測(cè)的上游外引物位于1555位點(diǎn)上游的第1310-1360nt區(qū)域，下游外引物位于1555位點(diǎn)下游的第1640-1690nt區(qū)域，對(duì)應(yīng)突變基因型的內(nèi)引物位于1515-1555nt區(qū)域，對(duì)應(yīng)正?；蛐偷膬?nèi)引物位于1555-1595nt區(qū)域。引物序列及設(shè)定名稱如下SEQNO.01:上游外引物5，-TgTAgCCCATgAggTggCAAgAAATg-3，SEQNO.02:下游外引物5，-TTAgCTCAgAgCggTCAAgTTAAgTTgAAA-3，SEQNO.03:突變內(nèi)引物5，-TTTAACTAAAACCCCTACgCATTTATATAgAggAgg-3,SEQNO.04:正常內(nèi)引物5，-CACTTTCCAgTACACTTACCATgTTACgACTTgT-3，線粒體基因組12srRNA基因第1494位點(diǎn)C—T突變檢測(cè)的上游外引物位9于1494位點(diǎn)上游的第1200-1250nt區(qū)域，下游外引物位于1494位點(diǎn)下游的第1640-1690nt區(qū)域，對(duì)應(yīng)突變基因型的內(nèi)引物位于1450-1494nt區(qū)域，對(duì)應(yīng)正?；蛐偷膬?nèi)引物位于1494-1534nt區(qū)域。引物序列及設(shè)定名稱如下SEQNO.05:上游夕卜弓I物5，-AACCCCgATCAACCTCACCACCT-3，SEQNO.06:下游外引物5'-ggCTAggTTTAgCTCAgAgCggTCAAgT畫(huà)3，SEQNO.07:突變內(nèi)引物5'-CgTACACACCgCCCgTCACT-3，SEQNO.08:正常內(nèi)弓|物5，-TTTAgTTAAArgTCCTTTgAAgTATACTTgAggAgg-3，細(xì)胞核基因組中SLC26A4基因IVS7(-2)位點(diǎn)A—G突變檢測(cè)的上游外引物位于IVS7(-2)位點(diǎn)上游的IVS7的第(-360)—(-310)nt區(qū)域，下游外引物位于IVS7(-2)位點(diǎn)下游的IVS8的第95-135nt區(qū)域，對(duì)應(yīng)突變基因型的內(nèi)引物位于IVS7的第(-40)—(-2)nt區(qū)域，對(duì)應(yīng)正?；蛐偷膬?nèi)引物位于IVS7(-2)—EXON8(40)nt區(qū)域。引物序列及設(shè)定名稱如下SEQNO.09:上游外引物5，-CATgTgggAAgATTCATATgAgAATTgATTgT-3，SEQNO.10:下游夕卜引物5，-CCAgATCACACACAAATAggACTATTgAAggAgTAT匿3，SEQNO.ll:突變內(nèi)引物5，-ACCAATggAgTTTTTAACATCTTTTgTTTTATTTCg-3，SEQN0.12:正常內(nèi)引物5，-gCTCCATATgAAATggCAgTAgCAATTATCgTCT陽(yáng)3'細(xì)胞核基因組中GJB2基因第235位點(diǎn)堿基缺失檢測(cè)的上游外引物位于該基因5'-UTR區(qū)的第(-110)—(-60)nt區(qū)域，下游外引物位于235位點(diǎn)下游的第450-500nt區(qū)域，對(duì)應(yīng)突變基因型的內(nèi)引物位于190-235nt區(qū)域，對(duì)應(yīng)正?；蛐偷膬?nèi)引物位于235-275nt區(qū)域。引物序列及設(shè)定名稱如下SEQNO.13:上游外引物5，-gCTCAggAAgAgATTTAAgCATgCTTgCT-3，SEQNO.14:下游外引物5'-CATggAgAAgCCgTCgTACATgACAT-3，SEQNO,15:突變內(nèi)弓l物ATCTCCCACATCCggCTATgggCCTSEQNO.16:正常內(nèi)引物ggCgTggACACgAAgATCAgCTCCCg為了使篩查工作的實(shí)施具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，本試劑盒分別預(yù)制了四種可直接上機(jī)使用的多重PCR試劑，其組分分別為101.12srRNA基因1555位點(diǎn)分型的反應(yīng)試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、引物SEQNO.Ol、SEQN0.02、SEQN0.03、SEQNO龍2.12srRNA基因1494位點(diǎn)分型的反應(yīng)試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、引物SEQN0.05、SEQN0.06、SEQN0.07、SEQNO.08。3.SLC26A4基因IVS7(-2)位點(diǎn)分型的反應(yīng)試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、引物SEQN0.09、SEQNO.IO、SEQNO.ll、SEQNCU2。4.GJB2基因第235位點(diǎn)分型的反應(yīng)試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、引物SEQNO.B、SEQNCU4、SEQNCU5、SEQN0.16。圖l:四引物ARMS-PCR法技術(shù)原理示意圖。圖2:1555位點(diǎn)10個(gè)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖3:1494位點(diǎn)10個(gè)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖4:SLC位點(diǎn)10個(gè)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖5:GJB2位點(diǎn)10個(gè)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。具體實(shí)施例方式借助以下實(shí)施例對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步描述。下面這些實(shí)施例是示范性的，而不是限制性的，可根據(jù)上述技術(shù)方案和試劑情況，來(lái)確定具體的實(shí)施方式。一、待測(cè)樣本選擇待測(cè)樣本從解放軍總醫(yī)院承辦的中國(guó)貧困聾兒救助行動(dòng)一"華夏萬(wàn)名新生兒聽(tīng)力拯救項(xiàng)目"中選擇。該項(xiàng)目中所涉及的所有血樣都使用"DNA提取一PCR擴(kuò)增一測(cè)序"的技術(shù)方法對(duì)樣本的線粒體12SrRNA基因的1555位點(diǎn)和1494位點(diǎn)、SLC26A4基因的IVS7-2位點(diǎn)、GJB2基因的235位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型。ii本實(shí)施例中選擇上述己經(jīng)過(guò)基因分型的樣本作為待測(cè)樣本，其中各位點(diǎn)分別選擇4個(gè)純合陰性基因型樣本、4個(gè)雜合基因型樣本、2個(gè)純合陽(yáng)性基因型樣本，各取對(duì)應(yīng)樣本的基因組DNA備用。二、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序設(shè)置1、PCR體系取四種預(yù)制的多重PCR試劑，分別加到四個(gè)PCR反應(yīng)管中，在每個(gè)管中各加入10nggDNA，混勻后密封，將四個(gè)反應(yīng)管一起放置到PCR儀中。2、擴(kuò)增程序<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4、瓊脂糖凝膠電泳(1)使用0.5XTBE制備2X瓊脂糖凝膠；(2)從PCR管中吸取擴(kuò)增產(chǎn)物2pl，與2pl的6XLoadingBuffer混勻后加入凝膠的梳子孔中；(3)200V恒壓電泳90分鐘；(4)電泳結(jié)束后取出膠塊置入凝膠成像儀中，紫外燈下顯示電泳條帶并照相。結(jié)果如圖2、圖3、如圖4、圖5所示。5、結(jié)果分析及基因型判定根據(jù)電泳結(jié)果中各泳道的帶型特征，對(duì)各樣本的四個(gè)位點(diǎn)分別進(jìn)行基因型判定。結(jié)果基因型分型結(jié)果與測(cè)序法獲得的結(jié)果一致。權(quán)利要求1、一種遺傳性耳聾易感基因篩查試劑盒，其特征在于，以12srRNA基因1494位點(diǎn)的C→T突變、12srRNA基因1555位點(diǎn)的A→G突變、SLC26A4基因IVS7(-2)位點(diǎn)的A→G突變、GJB2基因235位點(diǎn)C(±)為檢測(cè)對(duì)象，根據(jù)四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)原理，針對(duì)每個(gè)待測(cè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)和優(yōu)化出一套特異引物，并將成套引物置于同一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)四個(gè)反應(yīng)管進(jìn)行一次多重PCR擴(kuò)增和一次凝膠電泳，即可同時(shí)獲得四個(gè)位點(diǎn)的基因型。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，12srRNA基因1555位點(diǎn)A—G突變檢測(cè)的上游外引物位于1555位點(diǎn)上游的第1310-1360nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQNO.Ol)，下游外引物位于1555位點(diǎn)下游的第1640-1690nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQNO.02),對(duì)應(yīng)突變基因型的內(nèi)引物位于1515-1555nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQNO.03),對(duì)應(yīng)正?；蛐偷膬?nèi)引物位于1555-1595nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQN0.04)。3、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，12srRNA基因1494位點(diǎn)C—T突變檢測(cè)的上游外引物位于1494位點(diǎn)上游的第1200-1250nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQN0.05)，下游外引物位于1494位點(diǎn)下游的第1640-1690nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQNO.06),對(duì)應(yīng)突變基因型的內(nèi)引物位于1450-1494nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQNO.07),對(duì)應(yīng)正?；蛐偷膬?nèi)引物位于1494-1534nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQN0.08)。4、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，SLC26A4基因IVS7(-2)位點(diǎn)A—G突變檢測(cè)的上游外引物位于IVS7(-2)位點(diǎn)上游的IVS7的第(-360)一(-310)nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQN0.09)，下游外引物位于IVS7(-2)位點(diǎn)下游的IVS8的第95-135nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQNO.IO)，對(duì)應(yīng)突變基因型的內(nèi)引物位于IVS7的第(-40)—(-2)nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQNO.ll)，對(duì)應(yīng)正?；蛐偷膬?nèi)引物位于IVS7(-2)—EXON8(40)nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQNCU2)。5、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，GJB2基因第235位點(diǎn)堿基缺失檢測(cè)的上游外引物位于該基因5'-UTR區(qū)的第(-110)—(-60)nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQN0.13)，下游外引物位于235位點(diǎn)下游的第450-500nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQNO.14),對(duì)應(yīng)突變基因型的內(nèi)引物位于190-235nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQNO.15),對(duì)應(yīng)正?；蛐偷膬?nèi)引物位于235-275nt區(qū)域(引物設(shè)定名稱為SEQNCU6)。6、如權(quán)利要求l、2、3、4、5之一所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括下列內(nèi)容(1)12srRNA基因1555位點(diǎn)分型的反應(yīng)試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、序列特異的兩種外引物、序列特異的兩種內(nèi)引物。(2)12srRNA基因1494位點(diǎn)分型的反應(yīng)試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、序列特異的兩種外引物、序列特異的兩種內(nèi)引物。(3)SLC26A4基因IVS7(-2)位點(diǎn)分型的反應(yīng)試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、序列特異的兩種外引物、序列特異的兩種內(nèi)引物。(4)GJB2基因第235位點(diǎn)分型的反應(yīng)試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、序列特異的兩種外引物、序列特異的兩種內(nèi)引物。全文摘要本發(fā)明涉及一種遺傳性耳聾易感基因篩查試劑盒，該試劑盒以12srRNA基因1494位點(diǎn)的C→T突變、12srRNA基因1555位點(diǎn)的A→G突變、SLC26A4基因IVS7(-2)位點(diǎn)的A→G突變、GJB2基因235位點(diǎn)C(±)為檢測(cè)對(duì)象，根據(jù)四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)原理，針對(duì)每個(gè)待測(cè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)和優(yōu)化出一套特異引物，并將成套引物置于同一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)四個(gè)反應(yīng)管進(jìn)行一次多重PCR擴(kuò)增和一次凝膠電泳，即可同時(shí)獲得四個(gè)位點(diǎn)的基因型。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101684497SQ20081022274公開(kāi)日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年9月23日優(yōu)先權(quán)日2008年9月23日發(fā)明者王秋菊,魏宏泉申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院