專利名稱：：一種HBV病毒rtN236T突變的熒光擴增檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種快速而且方便的HBV病毒rtN236T突變的雙色熒光PCR擴增檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(HBV)流行世界各地，估計全球有20億人感染，其中慢性感染者3.5億，我國約占半數(shù)，全球每年約有120萬人死于HBV感染。此種感染最終可發(fā)展為肝硬化、肝癌，是當(dāng)前WH0公布的人類疾病死亡原因中居第9位的疾病。因此針對HBV的抗病毒治療受到廣泛重視。隨著對HBV聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能的深入認(rèn)識，一些有效抑制HBVDNA復(fù)制的核苷類藥物(如拉米夫定LAM、阿德福韋ADV)逐步成為抗HBV治療的新選擇。由于HBV聚合酶如同其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶一樣具有較高的錯配傾向且缺乏校對能力，因此隨著感染的持續(xù)病毒準(zhǔn)種逐年增多，在核苷類藥物的選擇壓力下，耐藥變異株將逐漸增多，最終替代野生株成為優(yōu)勢株，從而導(dǎo)致臨床耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)。拉米夫定是L-核苷類似物，曾經(jīng)是治療乙型肝炎的最有效的藥物，已在全球廣泛使用，在中國已成為銷量最大的處方藥。但拉米夫定的藥發(fā)生率非常高，在治療l年時，耐藥發(fā)生率約為14%32%，治療時間延長耐藥發(fā)生率升高，治療5年時耐藥發(fā)生率達(dá)到60%70%。而阿德福韋耐藥變異位點集中于P基因D區(qū)rtN236T和(或)B區(qū)rtN236T，與拉米夫定無交叉耐藥現(xiàn)象。阿德福韋耐藥發(fā)生率相對拉米夫定耐藥要低得多，阿德福韋治療HBeAg陰性慢性乙肝的III期臨床試驗結(jié)果顯示，治療1、2、3、4、5年時累積的基因型耐藥發(fā)生率約為0、3%、11%、18%和29%。因此，阿德福韋已越來越多的被應(yīng)用于HBV的抗病毒治療中，通常與其他藥物進行聯(lián)合用藥。目前，國內(nèi)外尚無快速、靈敏的檢測阿德福韋耐藥突變的技術(shù)和產(chǎn)品，通常使用基因測序的方法進行突變檢測，但一方面，測序反應(yīng)靈敏度低導(dǎo)致假陰性率較高。另一方面，由于HBV耐藥株與敏感株常共存于患者血清中，對于HBV耐藥突變基因的檢測，該方法有致命的缺陷。椐了解，當(dāng)耐藥株低于50%時，隨耐藥毒株比例的下降，基因測序的假陰性率迅猛增高，通常不能對低于20%的突變基因進行檢測。國內(nèi)外，均有人使用ntPCR-RFLP的技術(shù)對rtN236T位點突變進行檢測，但該技術(shù)操作復(fù)雜、耗時長且價格昂貴又容易造成PCR產(chǎn)物污染，無法進行推廣和臨床應(yīng)用。T叫ManPCR技術(shù)作為一種快速診斷技術(shù)，具有特異性高、靈敏度高、操作簡便且價格較便宜等優(yōu)點，已在科研和臨床上得到廣泛的應(yīng)用。使用特異性探針雜交的方法結(jié)合常規(guī)T叫Man技術(shù)進行rt236基因突變檢測設(shè)計，由于rt236位點附近為非保守區(qū)，多個位點存在非耐藥性變異，因此，TaqManPCR技術(shù)容易導(dǎo)致假陽性率或假陰性率的發(fā)生，同時也不利于設(shè)計引物或探針，并且與測序技術(shù)一樣無法對病毒的共生關(guān)系進行準(zhǔn)確判斷。本發(fā)明對傳統(tǒng)TaqManPCR技術(shù)進行了巧妙改進，不僅可對rt236T變異的病毒DNA進行定性分析，同時，在同一個PCR管內(nèi)完成了rt236N野生株的定性檢測。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡便的HBV病毒rtN236T突變的熒光PCR擴增檢測試劑盒。1、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是使用一對特異性引物和一對特異性探針，擴增目標(biāo)片段長度為132bp，引物序列為引物1:5—-GTACAACATCTTGAGTCCCTTTT-3—(SeqNo.1)引物2:5—-CCAACTTCCAATTACATATCCC-3—(SeqNo.2)或者上述弓I物序列的互補序列，或者上述序列同源性大于75%的序列。設(shè)計的兩條探針方向相反，除突變檢測位點和3'端外(突變檢測位點序列可互補，也可不互補，根據(jù)檢測要求決定)其余區(qū)域互補；探針1和探針2的Tm值相近，同時也與兩條引物的Tm值相近(相互間的差異均小于3tO，兩條探針的3'端除互補序列外均延伸2-4個堿基；根據(jù)T與G可形成2價離子鍵而配對的原理，在用于突變型基因檢測的正向探針(探針1)此處設(shè)計成"ACT"，而用于突變病毒檢測的反向探針(探針2)設(shè)計成"GTT"。探針1與rt236T基因序列互補，探針2與rt236N基因序列互補，分別用于檢測變異株(rt236T)和野生株(rt236N)，探針序列為探針1:5—-CATACATTTGACTCCTAACAAAACC-3—(SeqNo.3)探針2:5—-TTGTTAGGGTTTAAATGTATGCC-3—(SeqNo.4)或者上述弓I物序列的互補序列，或者上述序列同源性大于75%的序列。上述的HBV病毒rtN236T突變的熒光定量PCR擴增檢測試劑盒，探針的熒光發(fā)光基團為可標(biāo)記為麗、TET、J0E、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、RhodamineGreen、Rhodamine6G、OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514、TexasRed、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange、或R0X中的任意兩禾中組合；熒光淬滅基團為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上的組合。上述的HBV病毒rtN236T突變的熒光定量PCR擴增檢測試劑盒，采用多色熒光PCR檢測技術(shù)，在一個反應(yīng)管內(nèi)同時對rt236N和rt236T突變的HBVDNA進行定性檢測。2、上述的HBV病毒rtN236T突變的熒光定量PCR擴增檢測試劑盒，PCR反應(yīng)組成成份包括10mMTris-HCl(PH8.3)、50mMKCl、300iiMd(AGC)TP、300iiMdUTP、5mMMgCl2、200nM引物1、200nM引物2、200nM探針1和200nM探針2、1UTaq酶、0.05UUNG酶。按如下程序進行實時熒光PCR檢測；反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)2分鐘，然后95t:保溫5分鐘，再按94°C20秒一60°C35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下同時采集相應(yīng)探針標(biāo)記通道的熒光)。本發(fā)明與現(xiàn)有HBV病毒DNArtN236T突變檢測方法及傳統(tǒng)的T叫Man技術(shù)相比，具有以下有益的技術(shù)效果(1)與傳統(tǒng)的T叫Man技術(shù)相比縮短探針的長度，使Tm值下降至與引物相近，以增強探針對突變位點的特異性，同時保證了靈敏性。傳統(tǒng)的T叫Man技術(shù)要求探針的Tm值相對引物高6-l(TC，是為了保證探針比引物優(yōu)先與模板退火雜交，以防止引物快速延伸至探針結(jié)合部位而阻止探針的結(jié)合，從而降低靈敏度，但這種設(shè)計使得探針對模板的選擇特異性較低，根本不能鑒別單個堿基的突變。本發(fā)明通過探針濃度的調(diào)節(jié)保證了較高的靈敏度，可實現(xiàn)對1000copies/ml的突變DNA進行檢測，另外，本發(fā)明設(shè)計的兩條探針為反向序4列，分別與模板的正反鏈結(jié)合，不存在競爭關(guān)系，不會降低靈敏度。由于探針的Tm值與引物相近，通過優(yōu)化退火溫度和提高反應(yīng)條件的特異性，探針能與完全配對的模板進行雜交，通過引物的延伸的酶切產(chǎn)生熒光擴增信號，而不能與發(fā)生變異的模板雜交，從而不產(chǎn)生熒光擴增信號。(2)與其他技術(shù)相比本發(fā)明在一個反應(yīng)管內(nèi)實行了全部的檢測，從HBV病毒核酸提取到檢測完畢，僅需要2個小時，操作非常簡單，且產(chǎn)物不開蓋，不會發(fā)生PCR產(chǎn)物的污染。并且本發(fā)明通過設(shè)計人工模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以對突變病毒的核酸進行定量分析，ntPCR-RFLP和測序技術(shù)均不能得到定量的結(jié)果。另外，本發(fā)明同時完成rt236位點兩種基因類型的檢測。本發(fā)明提供一種準(zhǔn)確快速對HBV病毒rtN236T突變進行熒光定量檢測的技術(shù)。同時本發(fā)明還可用于其他基因突變的檢測。具體實施例方式設(shè)計和制備引物、探針序列(針對HBVDNAP基因相關(guān)序列設(shè)計，GeneBank序列號為AF182802，下同)引物1:5—-GTACAACATCTTGAGTCCCTTTT-3—(SeqNo.1)引物2:5—-CCAACTTCCAATTACATATCCC-3—(SeqNo.2)探針1:5—FAM-CATACATTTGACTCCTAACAAAACC-BHQ1-3—(SeqNo.3)探針2:5—TET-TTGTTAGGGTTTAAATGTATGCC-BHQ1-3—(SeqNo.4)上述引物和探針均在寶生物工程(大連)有限公司合成。HBV病毒rtN236T突變的熒光擴增檢測試劑盒的組成為(20人份)組成成份名稱體積提取液A1ml提取液B1mlPCR反應(yīng)緩沖液460ii1PCR反應(yīng)酶40ii1陽性對照品150ill陽性對照品250ill陰性對照品50ill其中，PCR反應(yīng)緩沖液(使用終濃度)包括10mMTris-HCl(PH8.3)、50mMKCl、300iiMd(AGC)TP、300iiMdUTP、5mMMgCl2、200nM引物1、200nM引物2、200nM探針1和200nM探針2;PCR反應(yīng)酶(終濃度)包括:1UTaq酶、0.05UUNG酶；陽性對照品1為rt236T突變型HBVDNA臨床血清，陽性對照品2為rt236N野生型HBVDNA臨床血清，陰性對照品為HBVDNA陰性的血清。試劑盒的操作步驟如下(1)病毒核酸提取取待測血清樣本及陽性和陰性對照品各50iU，加入50ill核酸提取液A。振蕩混勻15s。13，000rpm離心10min，棄上清。加入充分混勻的核酸提取液B50iU，振蕩混勻，IO(TC水浴lOmin，13，OOOrpm離心3min。取上清供PCR擴增用。(2)熒光PCR反應(yīng)液的配制5按每人份PCR反應(yīng)緩沖液23ul、PCR反應(yīng)酶2ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按25ul/管分裝到0.2mlPCR管中，然后加入5ul待檢的核酸提取產(chǎn)物，按如下程序進行實時熒光PCR檢測反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)2分鐘，然后95t:保溫5分鐘，再按94°C20秒一60°C35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下同時采集FAM和TET通道熒光)。(3)質(zhì)量監(jiān)控與結(jié)果分析<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>根據(jù)儀器分析的結(jié)果，在如下情況視實驗有效FAM通道，陽性對照品1的Ct值<35，TET通道，陽性對照品2的Ct值<35。陰性對照品Ct值均<35。SEQUENCELISTING〈110〉上海復(fù)星醫(yī)藥(集團)股份有限公司上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司〈120〉一種HBV病毒rtN236T突變的熒光擴增檢測試劑盒〈160>4〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1gtacaacatcttgagtccctttt〈210>2〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2ccaacttccaattecatetccc〈210>3〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3catecatttgactccteacaaaacc6〈210>4〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4ttgttegggttteaatgtatgcc2權(quán)利要求一種HBV病毒rtN236T突變的熒光擴增檢測試劑盒，其特征在于包含一對特異性引物和一對特異性探針，擴增目標(biāo)片段長度為132bp，引物序列為引物15`-GTACAACATCTTGAGTCCCTTTT-3`(SeqNo.1)引物25`-CCAACTTCCAATTACATATCCC-3`(SeqNo.2)或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。設(shè)計的兩條探針方向相反，除突變檢測位點和3’端外(突變檢測位點序列可互補，也可不互補，根據(jù)檢測要求決定)其余區(qū)域基本互補；探針1和探針2的Tm值相近，同時也與兩條引物的Tm值相近(相互間的差異均小于3℃)，兩條探針的3’端除互補序列外均延伸2-4個堿基；探針1與rt236T基因序列互補，探針2與rt236N基因序列互補，分別用于檢測變異株(rt236T)和野生株(rt236N)，探針序列為探針15`-CATACATTTGACTCCTAACAAAACC-3`(SeqNo.3)探針25`-TTGTTAGGGTTTAAATGTATGCC-3`(SeqNo.4)或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV病毒rtN236T突變的熒光擴增檢測試劑盒，其特征在于標(biāo)記探針的熒光發(fā)光基團可為FAM、TET、J0E、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、RhodamineGreen、Rhodamine6G、OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514、TexasRed、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange、或腿中的任意兩種組合；熒光淬滅基團為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-l、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上的組合。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV病毒rtN236T突變的熒光擴增檢測試劑盒，其特征在于采用多色熒光PCR檢測技術(shù)，在一個反應(yīng)管內(nèi)同時對rt236N和rt236T突變的HBVDNA進行定性檢測。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV病毒rtN236T突變的熒光擴增檢測試劑盒，其特征在于，PCR反應(yīng)體系包括10mMTris-HCl(PH8.3)、50mMKCl、300iiMd(AGC)TP、300iiMdUTP、5mMMgCl2、200nM引物1、200nM引物2、200nM探針1、1UTaq酶、0.05UUNG酶。根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV病毒rtN236T突變的熒光擴增檢測試劑盒，其特征在于，可以按如下程序進行實時熒光PCR檢測反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)2分鐘，然后95t:保溫5分鐘，再按94°C20秒一60°C35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下同時采集相應(yīng)探針標(biāo)記通道的熒光)。全文摘要本發(fā)明涉及一種HBV病毒rtN236T突變的熒光擴增檢測試劑盒。本發(fā)明針對rtN236T變異(即236AAC/T→ACC/T突變)設(shè)計了一對引物和分別用兩種熒光染料標(biāo)記的一對特異性探針，在單管內(nèi)使用雙色熒光定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了分別對野生株(rt236N)和突變株(rt236T)HBVDNA進行熒光擴增檢測。本發(fā)明技術(shù)能快速的對HBVDNArt236N和rt236T同時進行定性檢測。文檔編號C12Q1/70GK101760558SQ20081020164公開日2010年6月30日申請日期2008年10月23日優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日發(fā)明者何劍軍,吳大治,夏懿申請人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團)股份有限公司;上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司