一種用于新城疫病毒class I檢測(cè)的熒光定量RT-PCR試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種用于新城疫病毒class?I檢測(cè)的熒光定量RT-PCR試劑盒及其應(yīng)用。一種用于新城疫病毒class?I檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒，包含：上游引物CNPIF：SEQ?ID?NO.1,下游引物CNPIR：SEQ?ID?NO.2,以及TaqMan探針CNPIP：5′-JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3′。本發(fā)明選取Class?I?NP基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，首次報(bào)告建立了一種新的基于NP基因的檢測(cè)新城疫病毒class?I的RRT–PCR試劑盒以及方法，具有高靈敏度、高特異性、搞重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】—種用于新城疫病毒CI ass I檢測(cè)的熒光定量RT-PCR試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種用于新城疫病毒class I檢測(cè)的熒光定量RT-PCR試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]新城疫(Newcastle disease, ND)是唯一分布五大洲的0 IE A類傳染病，我國(guó)ND疫情十分嚴(yán)重，仍然是養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展最直接的威脅[1]，可對(duì)家禽生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[2]。
[0003]新城疫病毒(NDV)， 是新城疫的病原，屬禽副粘病毒I型(AMPV-1)，有囊膜，基因組為單股負(fù)鏈RNA，大小約15kb，編碼6種蛋白質(zhì)，包括RNA聚合酶(L)，血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)，融合蛋白(F)，基質(zhì)蛋白(M)，磷蛋白(P)和核蛋白(N)。新城疫病毒分離株根據(jù)對(duì)雞致病嚴(yán)重程度可分為三個(gè)主要致病型(毒力型)[2] =Lentogenic株是低致病力型，可造成雞輕微呼吸道或腸道感染；MeS0geniC株是中等致病力型，主要引起呼吸系統(tǒng)疾病；Velogenic株是高致病力型，造成高死亡率，基于病理表現(xiàn)被進(jìn)一步分為嗜神經(jīng)或嗜內(nèi)臟型。高毒力型NDV屬于必須報(bào)告的0 IE A類傳染病，它的發(fā)生可導(dǎo)致檢疫和貿(mào)易禁運(yùn)。NDV只有一個(gè)血清型，但是分為2類:class Kclass I I,絕大多數(shù)常見(jiàn)的都是class II，可分成1-1VlO個(gè)基因型。class II與class I核酸差異較大。
[0004]目前，用雞胚進(jìn)行病毒分離，然后用新城疫特異性抗體做血凝抑制試驗(yàn)代表病毒檢測(cè)的參考標(biāo)準(zhǔn)[3]。雖然病毒分離是一個(gè)敏感和特異性的方法，但由于NDV毒力差異大，低毒和無(wú)毒株普遍存在，加之弱毒疫苗的普遍使用，對(duì)分離毒株血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果必須結(jié)合毒力鑒定才能確診，一般需要數(shù)天才能完成[1]。
[0005]將熒光定量RT-PCR應(yīng)用于新城疫病毒的檢測(cè)已有報(bào)道。Mark G.Wise等⑴建立了 RRT-PCR技術(shù)檢測(cè)鳥類臨床標(biāo)本新城疫病毒。檢測(cè)采用單管水解探針，引物和探針根據(jù)M基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)，可檢測(cè)到大約1000拷貝病毒基因組RNA和IOEID5tl病毒。BeateM.Crossley等「7」建立了高通量的檢測(cè)外來(lái)NDV的RRT-PCR方法。L.Mia Kim等「8」建立了新城疫病毒L基因基礎(chǔ)上的RRT-PCR技術(shù)，對(duì)Mark G.Wise等建立的新城疫病毒M基因RRT - PCR是一個(gè)有力的補(bǔ)充。但目前尚未有有關(guān)新城疫病毒NP基因RRT - PCR檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種用于新城疫病毒class I檢測(cè)的RT-PCR試劑盒。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供該試劑盒的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的又一目的是提供一種實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)新城疫病毒class I的方法。
[0009]本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0010]一種用于新城疫病毒class I檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒，包含:上游引物 CNPIF:5 ' -CCTCAACTTATTACAACCTC-3 ' (SEQ ID N0.1)，下游引物 CNPIR:5' -TACAGATGCCATACCCATTGC-3' (SEQ ID N0.2)，以及 TaqMan 探針 CNPIP:5' -JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3' (SEQ ID N0.3)。
[0011]所述的試劑盒還包含102、103、104、105、106、107、108拷貝/ UL的NP基因陽(yáng)性質(zhì)粒
作為標(biāo)準(zhǔn)品模板。
[0012]所述的NP基因陽(yáng)性質(zhì)粒是以pGEM-T載體為出發(fā)載體，在其EcoR V位點(diǎn)插入序列如SEQ ID N0.4所示的NP基因所得
[0013]所述的試劑盒還包含~TaqMan Universal PCR Master Mix Kit為美國(guó)ABI公司
[0014]本發(fā)明所述的試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)新城疫病毒class I中的應(yīng)用。
[0015]一種實(shí)時(shí) 熒光定量檢測(cè)新城疫病毒class I的方法，將標(biāo)準(zhǔn)品模板和待測(cè)樣品DNA模板以及分別置于各自的反應(yīng)體系中，并同時(shí)置入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢后由PCR儀自動(dòng)得出檢測(cè)結(jié)果，其中
[0016]進(jìn)入PCR儀的標(biāo)準(zhǔn)品模板的反應(yīng)體系為25 U 1:其中ABI TaqMan Universal PCRMaster Mix加入量為12.5^1，模板加入量為3 yl，上游引物和下游引物在體系中的終濃度均為0.5iimol/L，探針在體系中的終濃度為0.5iimol/L，其余為無(wú)菌去離子水；
[0017]進(jìn)入PCR儀的待測(cè)樣品DNA模板的反應(yīng)體系為25 ill:其中ABI TaqMan UniversalPCR Master Mix加入量為12.5iU，模板加入量為3 yl，上游引物和下游引物在體系中的終濃度均為0.5 ii mo 1/L,探針在體系中的終濃度為0.5 u mol/L，其余為無(wú)菌去離子水；
[0018]其中所述的上游引物CNPIF:5' -CCTCAACTTATTACAACCTC-3' (SEQ ID N0.1),下游引物 CNPIR:5 ' -TACAGATGCCATACCCATTGC-3 ' (SEQ ID N0.2)，以及 TaqMan 探針CNPIP:5' - J0E-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3' (SEQ ID N0.3)；
[0019]PCR儀中的反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性IOmin,然后95°C 15s, 60°C lmin43個(gè)循環(huán)；熒光信號(hào)的收集及數(shù)據(jù)的采集定在60°C。檢測(cè)結(jié)束，根據(jù)噪音情況設(shè)定和調(diào)整基線及閾值，并利用隨機(jī)軟件進(jìn)行分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)熒光曲線和Ct值判斷結(jié)果。
[0020]有益效果:
[0021]本發(fā)明基于NP基因相對(duì)比F基因更保守。Class I分離株NP基因之間氨基酸序列的同源性在93.0%_99.5%之間，Class I毒株與Class II毒株NP蛋白同源性在88.2%-92.5%之間；選取Class I NP基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，首次報(bào)告建立了一種新的基于NP基因的檢測(cè)新城疫病毒class I的RRT-PCR試劑盒以及方法，具有高靈敏度、高特異性、搞重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明方法對(duì)Mark G.Wise等建立的新城疫病毒M基因RRT - PCR也是一個(gè)重要的補(bǔ)充。這兩個(gè)方法結(jié)合可以快速檢測(cè)所有class I和class II新城疫病毒并初步分群。隨著NDV分子生物學(xué)研究的不斷深入，NDV基因序列及功能得到不斷的揭示，ND分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)將得到進(jìn)一步的補(bǔ)充和完善。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1熒光定量RT-PCR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線
[0023]圖中，從左至右依次為稀釋度IO2~IO8的NP基因克隆陽(yáng)性質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線。
[0024]圖2RRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1NP基因陽(yáng)性質(zhì)粒的構(gòu)建
[0026]化學(xué)合成SEQ ID N0.4所示的NP基因511_1274bp獲得目的片段，純化后TA克隆連接到PGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)上，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5 a中，小提質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定，挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，抽提純化質(zhì)粒DNA，測(cè)其核酸濃度，計(jì)算出拷貝數(shù)，以此作為熒光定量RT-PCR質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。SEQ ID N0.4所示的NP基因511_1274bp片段也可通過(guò)PCR方式擴(kuò)增得到，以新城疫病毒JS-1O- 06株基因組為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到。
[0027]實(shí)施例2
[0028]根據(jù)GenBank上5株class I NDV NP基因序列，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定測(cè)序的8株class I NDV NP基因序列(表1 )，選取保守區(qū)(靠近5'端)設(shè)計(jì)引物。采用LASERGENE軟件包(DNASTAR Inc.，Madison, WI, USA)和 Primer Premier5.0 軟件(Premier BiosoftInternational, Palo Alto, CA)設(shè)計(jì)和分析引物，合成NDV的I對(duì)特異引物及相應(yīng)的探針，并在NCBI上進(jìn)行了 BLAST比對(duì)驗(yàn)證。擴(kuò)增片段位于NDV class I國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)分離株DE-R49-99NP基因的800_1086bp,長(zhǎng)度為287bp,探針位于NP基因970_990bp，上、下游引物及探針如下所示:
[0029]CNPIF:5' -CCTCAACTTATTACAACCTC-3' (SEQ ID N0.1), (800_819bp) [0030]CNPIR:5' -TACAGATGCCATACCCATTGC-3' (SEQ ID N0.2), (1066_1086bp)
[0031]Probe: (JOE) 5 ' -CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-3 ' (TAMRA) (SEQ ID N0.3)(970-990bp);
[0032]探針為TaqMan探針，5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是J0E，3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA，探針命名為:CNPIP。引物由上海生工有限公司合成，探針由大連寶生物工程有限公司合成。
[0033]表1本實(shí)驗(yàn)所用NDV標(biāo)準(zhǔn)參考分離株及其它禽病毒株
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種用于新城疫病毒class I檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于包含:上游引物CNPIF:SEQ ID N0.1,下游引物CNPIR:SEQ ID N0.2，以及TaqMan探針CNPIP:5' -J0E-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包含102、103、104、105、106、IO7, IO8拷貝/ U L的NP基因陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品模板。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的NP基因陽(yáng)性質(zhì)粒是以pGEM-T載體為出發(fā)載體，在其EcoR V位點(diǎn)插入序列如SEQ ID N0.4所示的NP基因所得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包含TaqManUniversalPCR Master Mix Kit為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。
5.權(quán)利要求1所述的試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)新城疫病毒classI中的應(yīng)用。
6.一種實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)新城疫病毒class I的方法，將標(biāo)準(zhǔn)品模板和待測(cè)樣品RNA模板分別置于各自的反應(yīng)體系中，并同時(shí)置入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢后由PCR儀自動(dòng)得出檢測(cè)結(jié)果，其特征在于其中 進(jìn)入PCR儀的標(biāo)準(zhǔn)品模板的反應(yīng)體系為25 ill:其中ABI TaqMan Universal PCRMaster Mix加入量為12.5^1，模板加入量為3 yl，上游引物和下游引物在體系中的終濃度均為0.5iimol/L，探針在體系中的終濃度為0.5iimol/L，其余為無(wú)菌去離子水； 進(jìn)入PCR儀的待測(cè)樣品DNA模板的反應(yīng)體系為25 ill:其中ABI TaqMan Universal PCRMaster Mix加入量為12.5^1，模板加入量為3 yl，上游引物和下游引物在體系中的終濃度均為0.5iimol/L，探針在體系中的終濃度為0.5iimol/L，其余為無(wú)菌去離子水； 其中所述的上游引物為CNPIF:SEQ ID N0.1,下游引物為CNPIR:SEQ ID N0.2，探針為CNPIP:5, -J0E-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3'； PCR儀中的反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性lOmin，然后95°C 15s, 60°C lmin43個(gè)循環(huán)；熒光信號(hào)的收集及數(shù)據(jù)的采集定在60°C。檢測(cè)結(jié)束，根據(jù)噪音情況設(shè)定和調(diào)整基線及閾值，并利用隨機(jī)軟件進(jìn)行分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)熒光曲線和Ct值判斷結(jié)果。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103667524SQ201310598236
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】曹軍平, 劉秀梵, 王曉泉, 劉曉文, 朱愛(ài)萍, 程漢, 趙旭庭 申請(qǐng)人:曹軍平