專利名稱：改造型麻疹病毒全基因cDNA克隆及感染性病毒的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一株利用我國成功研制的麻疹減毒活疫苗 毒株基因組進(jìn)行野毒株血凝素基因片段替換后并構(gòu)建感染性克隆的制備方法、克隆編碼區(qū) 序列替換方法以及它們在疫苗研究中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
麻疹病毒(Measles Virus, MV)是副粘病毒科麻疹病毒屬(morbillivirus)成員，是一種 不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，也是在全世界引起高度傳染性疾病的病毒之一，通過呼 吸道飛沫小滴，或者接觸感染。易感人群對麻疹的發(fā)病率幾乎達(dá)到100%，大部分感染者 能完全恢復(fù)，但少數(shù)能引起嚴(yán)重的呼吸道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。長_47 (CC-47)疫苗株為我國自主研制的疫苗株，起源于1957年分離的Leningmd-4 株麻疹病毒，經(jīng)人腎細(xì)胞傳26代、人羊膜細(xì)胞傳47代以及雞胚成纖維細(xì)胞傳若干代后逐 漸適應(yīng)減毒而成(Rota, J.S., Wang, Z.D.， Rota， RA. ,and Bellini， W丄1994. Comparision of sequences of the H， F and N coding genes of measles virus vaccine strains. Virus Research 31 : 317-330)。麻疹疫苗的有效性和安全性已經(jīng)得到明確的肯定，然而世界衛(wèi)生組織全球消滅 麻疹的努力仍然一直沒有停止，對于其主要原因業(yè)內(nèi)比較一致的認(rèn)識(shí) 一是麻疹免疫計(jì)劃 沒有得到嚴(yán)格的貫徹執(zhí)行，二是麻疹病毒新流行株的基因變異也在部分影響疫苗的免疫效 果。在1998年之前，從來沒有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的命名方法來描述野生型麻疹病毒基因的變異特 征。1998年的春天，WHO (世界衛(wèi)生組織)舉行的一個(gè)會(huì)議上闡述了這個(gè)問題，該建議 在2001年的會(huì)議上進(jìn)一步得到完善。目前己采納了一個(gè)統(tǒng)一的基因分型命名標(biāo)準(zhǔn)，以便 在不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比較。麻疹病毒N蛋白羧基末端450個(gè)核苷酸和HA蛋白核苷酸序 列變異程度最高，可用來鑒定基因型別。依據(jù)WHO麻疹病毒基因分型標(biāo)準(zhǔn)，相近毒株間 HA蛋白基因序列差異<2%， N蛋白基因羧基端450nt序列差異< 2.5 %，可以列為同一 基因型(WHO. Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild type measles viruses ( update) part I .WER ，2001 ,76 : 249- 2511 )。 WHO當(dāng)前已認(rèn)可了麻疹病毒8個(gè)進(jìn)化 分支，命名為A、 B、 C、 D、 E、 F、 G禾BH。在這些分支中目前已有20個(gè)確認(rèn)的基因型 和2個(gè)建議的新的基因型(g3和d9)。這些基因型是A， Bl， B2， Cl， C2， Dl， D2，D3， D4， D5， D6， D7， D8， E， F， Gl, G2， Hl和H2。除F基因型外，其它每個(gè)基因 型均有一個(gè)參比株代表最早的病毒分離物，這些參比株序列可以在GeneBank或WHO Strain Bank中獲得，近期分離的病毒株序列便可與WHO的這些參比株序列進(jìn)行比對以確 定其基因型。當(dāng)前所有國內(nèi)外使用的麻疹疫苗株病毒均為A基因型，也包括中國使用的長-47疫苗 株。盡管中國長-47麻疹疫苗和美國麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹聯(lián)合疫苗(MMR)人群免 疫后血清能中和中國現(xiàn)流行的麻疹H1基因型，說明現(xiàn)有麻疹疫苗對中國現(xiàn)流行的麻疹病 毒能起到保護(hù)作用，但也應(yīng)注意到這些疫苗免疫血清中和中國株的滴度低于中和Edm和 Chi21株滴度的2 5倍(World Health Organization. Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses (update) Part II. Wkly Epidemiol Rec, 2001, 76: 249-251)。因此，麻疹病毒減毒與其基因變異密切相關(guān)，有必要從分子病毒學(xué)上深入研究 這種變化，確定疫苗株減毒的分子病毒學(xué)特征，篩選免疫保護(hù)好的毒株制備麻疹疫苗。并 且，主要在中國流行的HI基因型麻疹病毒的型內(nèi)基因變異還在繼續(xù)，也可能還有未發(fā)現(xiàn) 的H1亞組病毒還在流行。許文波等通過對中國4個(gè)省流行的麻疹病毒基因型進(jìn)行監(jiān)測研究，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)在中國 流行的新基因型，即H1、 H2基因型，其中中國絕對優(yōu)勢基因型為H1基因型，H2基因型 由越南輸入。HI基因型被劃分為3個(gè)亞型Hla、 Hlb、 Hlc。近年來中國麻疹病毒基因 型的流行特征Hla為絕對優(yōu)勢基因亞型；Hlb處于弱勢，2005年只在河北省發(fā)現(xiàn)；Hlc幾 近消失(張燕，許文波，朱貞等，中國2003年流行的麻疹野病毒分子流行病學(xué)分析，中 國計(jì)劃免疫，2005， 11(3): 1-101)。 1998年WHO將China93-7確定為H基因型代表株， 2001年WHO又將H基因型中的12株命名為HI基因型(China93-7為代表株)，1株命 名為H2基因型(China94-1為代表株)。對病毒基因組的研究是在70年代分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展并得到廣泛應(yīng)用之后才興起的。 到19世紀(jì)80年代為止，單股負(fù)鏈RNA病毒家族不少成員的基因序列得以測定，從而促 使了利用負(fù)鏈RNA病毒cDNA進(jìn)行病毒拯救的反向遺傳學(xué)研究的興起，也導(dǎo)致了利用其 研究病毒致病機(jī)制、持續(xù)性感染、疫苗減毒機(jī)制以及研制新型疫苗和構(gòu)建病毒表達(dá)載體等。 尤其是病毒的非編碼區(qū)序列(基因組末端及結(jié)構(gòu)基因間非編碼區(qū))具有順式調(diào)節(jié)元件功能， 能指導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，對于構(gòu)建病毒感染性克隆及表達(dá)載體具有非同尋常的意 義。李德新等在完成CC-47麻疹疫苗株非編碼區(qū)序列測定的基礎(chǔ)上(胡孔新，李德新等， 麻疹病毒CC-47株非編碼區(qū)核苷酸序列測定與比較，中華實(shí)驗(yàn)與臨床病毒學(xué)雜志，2001,15 (4): 327-331)，又利用該病毒全基因組構(gòu)建了長-47麻疹病毒感染性克隆(胡孔新，李 德新等，麻疹病毒全長正鏈cDNA的構(gòu)建及感染性研究，病毒學(xué)報(bào)，2004， 3: 210-212)。發(fā)明內(nèi)容為了構(gòu)建新一代符合現(xiàn)有麻疹疫苗流行株的疫苗病毒，本發(fā)明基于中國現(xiàn)有麻疹疫苗 株及流行株基因型現(xiàn)狀分析以及我們已經(jīng)建立的麻疹病毒感染性克隆技術(shù)平臺(tái)，在已經(jīng)構(gòu) 建的我國的長-47減毒活疫苗株感染性克隆和掌握的病毒拯救技術(shù)基礎(chǔ)上，利用該疫苗病 毒全基因組全長cDNA克隆進(jìn)行中國現(xiàn)有主要流行株(Hl基因型，代表株為China93-7) 主要表面抗原基因(H基因)的替換改造，獲得新的組合型麻疹病毒全長cDNA克隆，并 通過一系列病毒拯救技術(shù)獲得感染性病毒顆粒。本發(fā)明的一個(gè)目的在于構(gòu)建一種麻疹病毒全基因組克隆，其含有編碼一種改造型長 -47株麻疹病毒的全長反基因組正鏈RNA的核苷酸序列(以下簡稱為"改造型麻疹病毒 cDNA序列")，即該克隆中包含有麻疹病毒長-47株全基因組主要cDNA，其特征是，其全 基因組cDNA中，H蛋白編碼基因被麻疹野毒株或流行株病毒的H基因替換，以提供一種 含有以Hl基因型麻疹病毒流行株H蛋白基因替換的改造型長-47株麻疹病毒全基因克隆， 替換的基因片段優(yōu)選為流行株麻疹病毒H1基因型(代表野毒株China93-7) H蛋白基因 編碼區(qū)。從NCBI可査詢到麻疹病毒長-47株全基因序列(ACCESSION: EF033071)以及中國 流行株HI基因型代表株的H基因序列(ACCESSION: AF045201 )。經(jīng)China93-7毒株H 蛋白基因編碼區(qū)替換后的改造型麻疹病毒全基因cDNA序列如序列表中SEQ ID No: 1所示。進(jìn)一步的，本發(fā)明的麻疹病毒全基因組cDNA克隆還含有與上述改造型麻疹病毒 cDNA序列操作性相連的異源表達(dá)控制序列，在該異源表達(dá)控制序列的控制下，從所述 cDNA轉(zhuǎn)錄出麻疹病毒的全長反基因組正鏈RNA。這樣的異源表達(dá)控制序列主要指位于所 述cDNA序列的5'末端的RNA聚合酶啟動(dòng)子，優(yōu)選T7啟動(dòng)子(T7 promoter)。進(jìn)一步的，為使轉(zhuǎn)錄出來的RNA具有精確的3'和5'末端，所述麻疹病毒全基因組 cDNA克隆還包含一個(gè)與改造型麻疹病毒cDNA序列3'末端最后一個(gè)核苷酸緊鄰的丁型 肝炎病毒核酶序列；在丁型肝炎病毒核酶序列之后往往還包含T7RNA聚合酶終止子(簡 稱T7終止子，T7 terminator)。6本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種對重組的改造病毒進(jìn)行拯救，制備感染性麻疹病毒 顆粒的方法，以應(yīng)用于麻疹病毒疫苗的制備或病毒檢測。本發(fā)明的制備感染性麻疹病毒顆粒的方法，包括以下步驟1) 用帶有異源表達(dá)控制序列的上述改造型麻疹病毒全基因組cDNA克隆導(dǎo)入帶輔助 系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中，所述輔助系統(tǒng)能表達(dá)麻疹病毒反基因組正鏈RNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和包殼 所需的蛋白質(zhì)；2) 培養(yǎng)并回收所表達(dá)的病毒顆粒。 根據(jù)這種方法的一特定實(shí)施方案，其包括1) 構(gòu)建改造型麻疹病毒cDNA克隆，含有編碼麻疹病毒全長反基因組正鏈RNA的 核苷酸序列，以及與該核苷酸序列操作性相連的RNA聚合酶啟動(dòng)子；2) 構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)支持克隆，含有麻疹病毒的N、 P和L蛋白的編碼序列及與這些 序列操作性相連的RNA聚合酶啟動(dòng)子，編碼N、 P和L蛋白的序列可以在同一個(gè) 支持克隆中或在不同的支持克隆中；3) 用步驟l)和2)構(gòu)建的克隆共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有對應(yīng)于改造型麻 疹病毒cDNA克隆和支持克隆中的RNA聚合酶啟動(dòng)子的RNA聚合酶；4) 培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，并回收改造型麻疹病毒顆粒。在一個(gè)較佳的實(shí)施方式中，在用改造型麻疹病毒cDNA克隆和支持克隆轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞 之前用表達(dá)RNA聚合酶的重組痘苗病毒感染宿主細(xì)胞，更佳的是利用T7啟動(dòng)子和表達(dá) T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒(例如重組痘苗病毒VTF7-3)。本文所用的術(shù)語"克隆"指可以導(dǎo)入細(xì)胞并表達(dá)的雙鏈DNA?？寺】梢允遣《据d體 形式，優(yōu)選質(zhì)粒形式。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)改造型麻疹病毒的系統(tǒng)，在于通過基因重組技術(shù)改造，以一種 安全、有效、廣泛使用的預(yù)防麻疹的麻疹病毒減毒活疫苗株長-47株的全基因克隆質(zhì)粒為 基礎(chǔ)，對該質(zhì)粒中的H基因片段進(jìn)行替換，替換的基因片段優(yōu)選為流行株麻疹病毒H1基 因型(代表野毒株China93-7) H蛋白基因編碼區(qū)。本發(fā)明可直接運(yùn)用已經(jīng)公開的RNA 病毒反向遺傳技術(shù)在cDNA水平上進(jìn)行改造型長-47病毒拯救，并獲得有感染性的改造病 毒，從而極大的方便了新型病毒株的復(fù)制、增殖以及包裝的研究，并導(dǎo)致新型麻疹減毒活 疫苗的出現(xiàn)。該改造優(yōu)選但并不限于使用中國流行株麻疹病毒Hl基因型的代表株 China93-7，生產(chǎn)出的新型感染性病毒具備流行株的血凝素抗原，具有更適合的麻疹減毒活疫苗的應(yīng)用價(jià)值。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)-① 在本發(fā)明提供的改造克隆的基礎(chǔ)上，可以通過基因操作技術(shù)，替換其他基因型的流 行株(不限于H1基因型)的H基因片段，以通過病毒拯救，開發(fā)出適應(yīng)不同抗原 變異需要的候選麻疹病毒疫苗株；② 本發(fā)明提供的基因替換操作方法，還適用于對該克隆中麻疹病毒其它編碼區(qū)基因進(jìn) 行基因替換操作，如N蛋白基因、F蛋白基因以及P/M蛋白基因等，以研究麻疹 病毒不同基因的表達(dá)能力，及其對于新病毒生成的影響，新生病毒具有應(yīng)用于病毒 診斷試劑的開發(fā)價(jià)值，也具有新型疫苗應(yīng)用的價(jià)值。③ 本發(fā)明提供的基因替換操作方法，通過不同基因型麻疹病毒基因的多片段替換，以 及生成的新病毒具有適合多基因型麻疹病毒流行的通用疫苗價(jià)值。 鑒于負(fù)鏈RNA病毒載體的優(yōu)點(diǎn)，及其可以為進(jìn)一步的研究如致病機(jī)理、減毒機(jī)理 提供研究平臺(tái)的前景，廣泛使用的麻疹病毒減毒疫苗株所具有其無可比擬的優(yōu)勢。 本發(fā)明還可以直接指導(dǎo)構(gòu)建僅有以病毒非編碼區(qū)序列替換為主導(dǎo)的病毒拯救技術(shù)， 對于闡明麻疹病毒調(diào)控序列作為順式調(diào)節(jié)元件控制外源基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)以及復(fù)制和 包裝系統(tǒng)的評價(jià)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。⑤將長一47減毒活疫苗株病毒的所有非編碼區(qū)序列，P、 M編碼區(qū)序列及其編碼的蛋 白質(zhì)的氨基酸序列與國外野毒株、疫苗株病毒基因組相應(yīng)位置進(jìn)行比較，從基因和 蛋白水平來闡明長一47減毒活疫苗株與國外野毒株及疫苗株之間的異同和相應(yīng)的 功能改變，可以研究疫苗的減毒機(jī)制，細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)機(jī)理以及尋找強(qiáng)弱毒株間的分 子標(biāo)記，從而為麻疹病毒的分子流行病學(xué)調(diào)査提供參考。


圖1質(zhì)粒pRZ-mvfull-reH的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2質(zhì)粒pRZ-mvfiill-reH插入結(jié)構(gòu)的序列示意圖。
具體實(shí)施方式
長-47感染性克隆構(gòu)建及病毒拯救技術(shù)參見文獻(xiàn)(胡孔新，李德新等.麻疹病毒全長 正鏈cDNA的構(gòu)建及感染性研究.病毒學(xué)報(bào)，2004， 3: 210-212)，本發(fā)明內(nèi)容部分涉及的 質(zhì)粒、引物名稱及序列可以參照該文獻(xiàn)。簡述如下首先通過酶切分析和克隆策略優(yōu)化，8通過用RT-PCR方法分段擴(kuò)增長-47疫苗株的全基因，并分別克隆到質(zhì)粒載體中并進(jìn)行DNA 序列分析和鑒定，然后通過一定梯次的克隆步驟得到含有該病毒所有非編碼區(qū)序列以及編 碼區(qū)的全基因序列。對于克隆的改造，關(guān)鍵在于對中間質(zhì)粒pMVMl-2S的下一步克隆過程進(jìn)行，另外提 供一個(gè)含有Hl基因型野毒株麻疹病毒H蛋白基因的片段的克隆質(zhì)粒，然后通過酶切替換 并進(jìn)行方向鑒定和序列分析獲得。實(shí)施例1麻疹病毒長-47全長cDNA克隆的構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)"胡孔新，李德新等.麻疹病毒全長正鏈cDNA的構(gòu)建及感染性研究.病毒 學(xué)報(bào)，2004， 3: 210-212"記載的方法構(gòu)建含有麻疹病毒長-47株全基因的中間質(zhì)粒 pMVftill-2S，具體是經(jīng)傳統(tǒng)生物學(xué)方法研制的麻疹病毒長-47疫苗株為雞胚成纖維原代細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)(由 長春生物制品研究所提供，為商品疫苗，批號為9812445)。從該疫苗病毒感染的細(xì)胞提取 全細(xì)胞RNA，以隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板，用DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(DNA Polymerase Chain Reaction, PCR)擴(kuò)增長-47病毒基因組cDNA。然后克隆、拼接麻疹病毒 疫苗株CC-47的全長正鏈cDNA序列，并精確的置于T7啟動(dòng)子控制下和丁型肝炎病毒核 酶序列及T7終止子序列之前并進(jìn)行序列測定鑒定，獲得中間克隆質(zhì)粒pMVfull-2S。具體克隆策略及過程參見文獻(xiàn)，所涉及的基礎(chǔ)插入載體為pBlueScriptSKII (+)(購自 德國默克公司)。首先對pBlueScriptSKII (+)進(jìn)行質(zhì)粒改造，主要是以引入核酶序列以及 T7終止子序列為目的以質(zhì)粒為pT7Ribo (中國疾病預(yù)防控制中心病毒病毒病預(yù)防控制所 保存，含有核酶序列和T7終止子序列)為PCR擴(kuò)增模板，以引物5' -AGC TGC GCG CAC GCG TCA GCT ATG ACC ATG ATT ACG -3'和5， -AGC TGC GCG CTC GAC TCT AGA GGA TCC CCA -3' 擴(kuò)增核酶序列和T7終止子序列，并通過引物設(shè)計(jì)在5'和3'端各引入一個(gè)BssHII限制性酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物BssHII酶切后直接克隆到同樣酶切的質(zhì)粒pBlueScriptSKII中，形成 質(zhì)粒pRZ。核酶序列和T7終止子序列的來源并不局限于pT7Ribo質(zhì)粒，任何含有該片段 的質(zhì)粒、DNA片段都可以作為PCR擴(kuò)增的模板，或者直接通過基因合成等本領(lǐng)域中熟知 的分子克隆方法獲取該片段，插入載體的該片段完整序列參見圖2。然后按照文獻(xiàn)(胡孔新，李德新等，病毒學(xué)報(bào)，2004， 3: 210-212)所公開的引物對 麻疹病毒長-47進(jìn)行分段PCR，并按照步驟逐步插入pRZ中，最終獲得含有兩個(gè)BssHII 酶切插入位點(diǎn)的中間克隆質(zhì)粒pMVfull-2S 。實(shí)施例2麻疹病毒China93-7野毒株H基因片段的獲得野毒株麻疹病毒China93-7以B95a細(xì)胞(購自美國ATCC)培養(yǎng)并收獲病毒感染細(xì)胞， 以TRizol (購自美國Invitrogen公司)從感染細(xì)胞提取全細(xì)胞RNA，隨機(jī)引物合成cDNA， 并以引物5，-GGT TGA TAG GGA TCC CCG CT-3，和引物5'陽CGG CCG AAC GGG GAA CCA CTT GGA CC-3，組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物含有病毒China93-7病毒H基因的克 隆片段。擴(kuò)增產(chǎn)物直接克隆到pGEM-T載體(購自美國Promega公司沖，再分別以BamHI (插入麻疹病毒片段中的位點(diǎn))和Notl (載體上的酶切位點(diǎn))酶切，并回收插入的小片段， 該片段主要為H基因片段。實(shí)施例3改造型麻疹病毒全長cDNA克隆質(zhì)粒的構(gòu)建以引物Dl (5，-ACG CGT ATC TGG CGC CCT ACA GCT CAA CTT ACC TGC-3，)和 C2 (5，-CGG CCG AAC GGG GAA CCA CTT GGA CC-3 ， ) PCR擴(kuò)增長-47病毒cDNA，產(chǎn) 物直接克隆到pGEM-T載體(Promege公司)中，獲得質(zhì)粒pGEM-cc47-Spel，分別以BamHI (插入片段中的位點(diǎn))和NotI (載體上的酶切位點(diǎn))酶切質(zhì)粒，回收載體大片段，并將實(shí) 施例2中最后獲得的酶切片段回收產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pGEM-cc47-Spel的BamHI和Notl酶切 載體中，獲得新的含有China93-7 H基因片段以及麻疹長-47部分基因的重組質(zhì)粒 pGEM-cc47-937H-Spel，以Spel直接酶切pGEM-cc47-937H-Spel，回收插入片段(大片段， 約5.8kb)，再克隆到同樣以Spel酶切pMVfoll-2S后回收的載體大片段中，最終獲得的質(zhì) 粒pRZ-mvMl-reH，含有完整的改造替換H蛋白基因的CC-47株cDNA序列，并在T7啟 動(dòng)子控制下(參見圖1和圖2)。對pRZ-mvfUll-reH所有酶切接頭部位進(jìn)行序列測定分析， 確保正確，并將重組的克隆菌種(含pRZ-mvfull-reH的DH5a)保存于-70。C。實(shí)施例4改造型麻疹病毒顆粒的獲得實(shí)施例3獲得的pRZ-mvfull-reH質(zhì)粒可以在麻疹病毒CC-47株結(jié)構(gòu)蛋白N、 P、 L編 碼區(qū)瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒以及表達(dá)T7 RNA聚合酶的輔助重組痘苗病毒VTF7-3的作用下，通過 病毒反向遺傳學(xué)拯救技術(shù)獲得同一細(xì)胞中四質(zhì)粒RNA的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，并最終獲得了具有 感染性的麻疹病毒。以構(gòu)建pRZ-mvftill-reH質(zhì)粒進(jìn)行病毒拯救的過程，轉(zhuǎn)染入B95a細(xì)胞 用常規(guī)的脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法，具體可采用lipofectAMINETM2000試劑盒(購自Invitrogen 公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染1) 麻疹病毒N、 P、 L蛋白瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建參見文獻(xiàn)"胡孔新，李德新等.麻疹病毒全長正鏈cDNA的構(gòu)建及感染性研究.病毒學(xué)報(bào)，2004， 3: 210-212."構(gòu)建 并制備pcDNA-N、 pcDNA-P 、 p3Z-L質(zhì)粒DNA。以上三個(gè)質(zhì)粒中病毒蛋白N、 P 和L的基因均在T7啟動(dòng)子控制下。2) 在轉(zhuǎn)染前一天，用無抗生素DMEM培養(yǎng)基將B95a細(xì)胞傳代到6孔板，細(xì)胞密度 達(dá)到90-95%單層(約16-24小時(shí))，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。3) 轉(zhuǎn)染前l(fā)h，取重組痘苗病毒VTF7-3 (中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所保 存，該病毒為已公開的整合有T7 RNA聚合酶基因并在病毒感染時(shí)可以于感染細(xì)胞 胞槳內(nèi)表達(dá)T7RNA聚合酶的重組痘苗病毒)，感染細(xì)胞(moi=10)吸附lh，期間 輕柔搖動(dòng)幾次，使液體漫過細(xì)胞面。4) 在毒種管內(nèi)進(jìn)行配液操作將0.8-1 pg混合質(zhì)粒DNA(pcDNA-N、 pcDNA-P、 p3Z-L 和pRZ-mvfull-reH質(zhì)粒)加入50)^1 OPTIMEMI (購自Invirtogenl公司)中，然后 將2-3pl lipofectAMINE試劑加入OPTIMEMI中，5min后兩者混合均勻，室 溫放置20min。5) 用無血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基清洗培養(yǎng)板中的B95a細(xì)胞2次，每孔0.5ml 無血清和無抗生素的DMEM培養(yǎng)基。6) 將第4)步中混合好的含目的質(zhì)粒及l(fā)ipofectAMINE的混合液輕輕加入到細(xì)胞清洗 過的，無血清和無抗生素的DMEM培養(yǎng)基中。7) 輕輕混勻后37°C ， C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)后，加入含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基。8) 細(xì)胞37'C培養(yǎng)16小時(shí)后封好細(xì)胞培養(yǎng)板，42'C熱休克1小時(shí)。9) 換含100|ig/ml阿糖胞苷的完全培養(yǎng)液抑制痘苗病毒增殖，繼續(xù)37'C培養(yǎng)48—72h。10) 凍融細(xì)胞收獲毒種后準(zhǔn)備繼續(xù)感染細(xì)胞，該細(xì)胞裂解物種含有重組的改造病毒。盡管為說明目的公開了本發(fā)明的具體實(shí)施例和附圖，其目的在于幫助理解本發(fā)明的內(nèi) 容并據(jù)以實(shí)施，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解在不脫離本發(fā)明及所附的權(quán)利要求的精 神和范圍內(nèi)，各種替換、變化和修改都是可能的。因此，本發(fā)明不應(yīng)局限于實(shí)施例和附圖 所公開的內(nèi)容。序列表(SEQUENCE LISTING)<110>中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所<120>改造型麻疹病毒全基因cDNA克隆及感染性病毒的制備<130> JSP080224<160> 1< 170> Patentln version 3.1<210> 1<211> 15894<212> DNA<213> 麻疹病毒(morbillivirus)<400> 1gttgggtaagg3tsgttc33tC33tgstc3tcttctsgtgcscttsggst60gsttsgggst3tccgsg3tggccscacttt120taaggsgcttsgcsttgttc3gg3c333cc3CCC3tt3C3tcsggstccg180gtggsgccstC3gsgg33tcttstsgtscc33tccctggag3ttcctc33240ttaccactcgatccagacttctggsccggttggtcaggttccggstgtg3300gcgggcccaagc3ct33tsggta七3ttatccttatttgtggsgtctccsg360gtcaattgattcsgsggstc3ccgstg3ccctgacgttsgcstssggctgttsgsggttg420tccagsgtgscc3gtcsc33tctggccttaccttcgcstcaagaggtaccaacatggagg權(quán)atgaggcggaCC33t3Cttttc3cstgstgtagtgatcaatccsggttcg540gstggtttgs3tctcagst3ttgssgtgcssgsccctgsgggattcaaca600tgsttctgggt3CC3tCCt3gcccs33tttgggtcttgctcgc3ssggcggttscggccc660C3gscacggcsgctgattcgggtgg3t333gtsc3ccc33720tagttggtgssttt3gattgggttggatgtggtgsggsscsggsttgccg780aggacctctcctt3cgccgsttcatggtcgctctsstcctggst3tc3sgsgsscacccg840csggsttgctgtg3C3ttgsgtsgsggcsg900gattagccsgttttatcctgsctattasgtttgggstsgsaact3tgtstcctgctcttg960gactgcstgsatttgctggtgsgttstcc3C3cttgagtccttgstgsscctttscc3gc1020aaatgggggs3sctgc3ccctacatggt3atcctgg3g33ctcaattcag1080gtgcaggstcstaccctctgctctggsgct3tgccstggg3gt3gg3gtg11403Ctccstgggsggtttg3sctttggccgatcttsctttgatccsgc3t3ttttsgattsg1200ggt33ggsggtcagctggaa3ggtc3gttccacattggcatctg33ctcg1260gtstc3Ctgccg3ggstgc3sggcttgtttcsgsgsttgc3Ctg3ggsc31320agcggttggacccssgtstc3tttCt3C3Cggtgstcaaa1380gtg3g33tg3gctaccgagattggggggcsgsgggtcs33csgsgtcgsg1440ggsgsgctscagagaaaccgggcccsgcsgagcaagtgatgcgsgagctg1500CCC3tCttCC33ccggcsc3cccctsgcc3ttgscsctgcatcggagtcc3gcc33g3tc1560cgcsgg3C3gtcg33ggtc3gctgscgccctgcttsggctgcasgccstggcsggsstct1620sggctcsgsc3cgg3cscccct3tsgtgt33stcttctag1680actaggtgcgsgaggccgagscaitccgcct3CCCtCC3tCsttgtt3t3317403sccsggtccacacagccgcC3gcccstc3atccstcc3Ctcccscgattg1800gsgccgstggggcscgccstgtC33333Cggactggaatgcstccgggct1860ctcssggccgsgcccstcggctcsctggccatcgaggaagctstggcsgcatggtcagaa1920ggsgcgsgcc3cctgcsggg3ggcsgttcg1980ggtctcsgc333ccatgcctctcsgcasttggatcaactgssggcggtgc3cctcgcstc2040cgcggtcsggg3cctgg3g3gsgcgstgscgscgctg333ctttgggaatCCCCCC33g3210033tctcc3ggcatcaagcactgggttsc3gtgtcattstgttt3tgstc3csgcggtg332160gcggttsaggtgctg3ctctstc3tggttcaatcsggccttgstggtgst222033C3CCCtCtcsggsgg3g3C33tg33tctg3333c3gcgatgtggatattggcgsscct2280g3taccgsgggatstgct3tcsctgsccggggatctgctcCC3tCtCt3tggggttcagg2340gcttctgstgttgassctgcgsgstccscgsgctcctgsg3ctccsatcc24003ctttccg33gcttgggas33CtCtC33tgttcctccgcccccggacccc2楊ggtsgggcc3gcscttccggg3csccc3ttcsgscgcgsg3ttsgcctc32520tttggaacggagstcgcgtctttsttgacaggtggtgc33cccs3tgtgctcgs33gtc32580ccctcggaacC3tc3gggcc3ggtgc3cctgcgggg33tgtccccgsgtgtgtgagcaat2640gccgcactgstscaggsgtggscacccgastctggtsccaC33tCtCCCCg3gatcccsg2700ct3tt3tgstgstgsgctgttctctgstgtccaagatatt2760aaaacagcct七33tCtCC33gct3gs3tc32820ctgctgttsttgaagggagasgttgsgtC3gC3333t3tC28803gc3t3tccsccctggssgg3C3CCtCtC3tcgccsttcctggacttggg29403cgscccc3ctgcsgatgtcg333tC33tCccgscttgss3cccatcait33000C3ggccgsgc3ctggccgs3gttctC33g3aacccgttgccsgccg3C333060ctccaaggaa3cggsccsgttccsgaggacsgctgctg33gg33tttcsg3120ct333gccgsgstgsgctcsgccgtcgggtttgttcctgsC3ccggccct3180gc3tC3cgc3gtgtaatccgCtCC3tt3t3333tccsgccggctsgsggaiggstcggssg3240cgttscctg3tgactctccttgstgststcatgstcttgcc33gttcc3c3300cagatgctgsct3C3gctcs3cttscctgccsaccccatg3360cc3gtcgsccC33ct3gtsc33CCt333tCC33agtgatt3420gcctcccs3gttccsc33tg3csgsg3tct3cgscttcgaC33gtcggcstgggacatC33480asgggtcgstcgctccgstsC33CCC3CC3cctsc3gtg3tggcsggctggtgccccsgg3540tcagagtcst3gstcctggtctsggcgscsggssggstgai3tgcttt3tgtsc3tgtttc3600tgctgggggttgttgsggscsgcgstcccct3gggcctccaatcgggcgagcstttgggt366013ccctgcccttsggtgttggcC3ssgcccg33333CtCCtC3720ctgagcttgaiC3tagttgttagscgtaicagcsgggctcs3tgs333sctggtgttctaca37803C33C3CCCC3Ct33CtCtCCtC3C3CCttgg3g333ggtgggagtgtct3840tC33CgC333ccaagtgtgcsatgcggcta3tctgstsccgctcgataacccgcsgsggt3900tccgtgttgtttststgsgc3tcscccgtctttcggst33cgggtattacsccgttcct33960g33g33tgctgg33ttcsg3tcggtc33tgcsgtggccttC3scctgctggt33ccctts4020gg3ttg3CS3ggcgstsggccctggg33g3tC3tCg3C33tacsgagcaacttcctgagg權(quán)0C33C3ttt3tggtccscstcgggs3cttcsgg3g333g33gsgtgssgtctactctgccg41403tt3ttgC33gcctggtttttgcacttggtggg3tsgggg4200gc3cc3gtcttc3C3ttsgssgc3C3ggc3gsctctccatgc3C3sctcg4260ggttcsag33gsccttstgttscccgctg3tggatatc33tgssgscctt33tcgatt3c4320tctggsggsgcagatgcaagtccsggcsgttttgcagccatcsgttcctc4380cattt3cgacgscgtgstcscc3sgg3Ctsttcs3agttc4440tgtsgaiccgtsgtgcccsgc3stgcccg3333cg3cccccCtC3C33tg3csgccsgsag4500gcccggsc3333333CCCCCtccgaaagactccscggscc33gcg3g3ggccsgccsgc34560gccgscggc3sgcgcg33csccsggcggcc3csgccccgsC3csaggcca4620cc3CC3gccscccc33tctgcstcctcctcgtgggscccccg3ggscc33cccccsaggc4680tgcccccgstCC333CC3CC33ccgcstccCC3CC3CCCC3cccccsgc34740sctggsaggcccctccccctctccctcsacC3C33CCg33ccgcacaagc糊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1.一種麻疹病毒全基因cDNA克隆，含有編碼一種改造型長-47株麻疹病毒的全長反基因組正鏈RNA的核苷酸序列，所述改造型長-47株麻疹病毒是指長-47株麻疹病毒的H蛋白編碼基因被H1基因型麻疹病毒流行株的H基因替換。
2. 如權(quán)利要求1所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于所述Hl基因型麻疹病 毒流行株是China93-7。
3. 如權(quán)利要求2所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于所述核苷酸序列如序 列表中SEQIDNo: l所示。
4. 如權(quán)利要求1所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于該克隆還含有與所述 核苷酸序列操作性相連的異源表達(dá)控制序列，所述異源表達(dá)控制序列包含位于所述核 苷酸序列5'末端的RNA聚合酶啟動(dòng)子。
5. 如權(quán)利要求4所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于所述RNA聚合酶啟動(dòng) 子是T7啟動(dòng)子。
6. 如權(quán)利要求5所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于該克隆還包含一個(gè)與 所述核苷酸序列3'末端最后一個(gè)核苷酸緊鄰的丁型肝炎病毒核酶序列。
7. 如權(quán)利要求6所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆，其特征在于該克隆在丁型肝炎病 毒核酶序列下游具有T7終止子。
8. —種制備感染性麻疹病毒的方法，包括以下步驟1) 用權(quán)利要求4~7中任一權(quán)利要求所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆導(dǎo)入帶輔助系統(tǒng) 的宿主細(xì)胞中，所述輔助系統(tǒng)能表達(dá)麻疹病毒反基因組正鏈RNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和包殼 所需的蛋白質(zhì)；2) 培養(yǎng)并回收所表達(dá)的麻疹病毒顆粒。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟l)具體包括a) 構(gòu)建權(quán)利要求4~7中任一權(quán)利要求所述的麻疹病毒全基因cDNA克隆；b) 構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)支持克隆，含有麻疹病毒的N、 P和L蛋白的編碼序列及與這些序 列操作性相連的RNA聚合酶啟動(dòng)子，其中N、 P和L蛋白的編碼序列在同一個(gè)支持 克隆中或在不同的支持克隆中；c) 用步驟a)和b)構(gòu)建的克隆共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有對應(yīng)于麻疹病毒全 基因cDNA克隆和支持克隆中的RNA聚合酶啟動(dòng)子的RNA聚合酶。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于在所述步驟c)之前用表達(dá)對應(yīng)于所述RNA 聚合酶啟動(dòng)子的RNA聚合酶的重組痘苗病毒感染宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種改造型麻疹病毒全基因cDNA克隆，是對長-47株麻疹病毒全長cDNA克隆進(jìn)行中國現(xiàn)有主要流行株(H1基因型，代表株為China93-7)主要表面抗原基因(H基因)的替換改造獲得。本發(fā)明運(yùn)用RNA病毒反向遺傳技術(shù)在cDNA水平上進(jìn)行改造型長-47病毒拯救，獲得有感染性的改造病毒，從而極大的方便了新型病毒株的復(fù)制、增殖以及包裝的研究，而且，生產(chǎn)出的新型感染性病毒具備流行株的血凝素抗原，具有更適合的麻疹減毒活疫苗的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N15/40GK101323857SQ20081011763
公開日2008年12月17日 申請日期2008年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者修梅紅, 張全福, 川 李, 李德新, 梁米芳, 王曉芳, 胡孔新 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所