專(zhuān)利名稱(chēng)：紅景天及紅景天苷在干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紅景天尤其是紅景天苷在誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì) 胞中的應(yīng)用。(二) 背景技術(shù)紅景天系景天(CrowM/ace"e)科紅景天屬(i^oJ/o/fl丄.)才直物，為多 年生草本或亞灌木植物，主要分布在北半球的喜馬拉雅山區(qū)、亞洲西北部 和北美洲海拔在1,600 4，000米的地區(qū)。紅景天藥用歷史悠久，素有"黃 金人參""神仙草，，之稱(chēng)。藥典記載紅景天為景天科植物大花紅景天的干燥 根及根莖，其性甘、苦、平，益氣活血、通脈平喘，可用于氣虛血瘀、胸 痹心痛、中風(fēng)偏癱和倦怠氣喘?，F(xiàn)代藥理研究表明，紅景天的生物活性與 其所含的多種化學(xué)成分密不可分。紅景天苷(sa/^Y^Vfe)是從紅景天中分離提純的天然產(chǎn)物，為一種 單體化合物，是紅景天的有效成分之一，部分相關(guān)科屬中藥也含紅景天苷， 其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為oh ( I )紅景天苷單體的分離純化方法紅景天粉為原料，以水為溶劑用微波 法提取紅景天苷。最佳工藝參數(shù)為液固比20: 1,浸泡時(shí)間1.5h,低功率農(nóng)吏波處理60s，磁力攪拌15min,提取2次，提取率可達(dá)90%(參見(jiàn) 微波輔助提取紅景天苷，趙武奇殷涌光梁歧等，食品與發(fā)酵工業(yè)，2004， 30 (2), 19 22)。 藥理作用提高和改善抗各種高原反應(yīng)能力?？谷毖酢⒖蛊谧饔?。研究表明它通過(guò)維持5-HT含量正常化起到了 抗中樞疲勞的作用?？顾ダ稀＞哂锌寡趸饔眉绑w外清除羥自由基和超氧陰離子自由基的 能力。抑制大鼠腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，有效緩解 腎間質(zhì)損傷，防治腎間質(zhì)纖維化。抗肝纖維化作用。紅景天苷可明顯抑制乙醛刺激的HSC增殖及膠原 基因的表達(dá)，在體外有顯著的抗肝纖維化作用。對(duì)心腦血管的保護(hù)作用。紅景天苷可抑制大鼠缺血再灌注引起的白細(xì) 胞介素1(3表達(dá)的增加，減少腦缺血再灌注后腦組織中TNF-a的表達(dá)起到保 護(hù)腦血管的作用；通過(guò)抑制血管ACE的表達(dá)，在一定程度上可抗心肌缺血。提高機(jī)體免疫能力、抗腫瘤、抗病毒?？馆椛洹＜t景天苷有防護(hù)X射線(xiàn)輻射損傷機(jī)體組織和細(xì)胞膜的作用。 提高記憶力和防治老年癡呆，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。紅景天苷可抑制缺氧缺 糖損傷所致的線(xiàn)粒體膜電位和活性的降低，從而具有穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜電位的 作用，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；體外促進(jìn)神經(jīng)千細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化 為紅景天藥物用于相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 降血糖和改善蛋白質(zhì)、脂肪代謝。目前還未有紅景天及紅景天苷具有誘導(dǎo)成體干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞的作用纟艮道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供紅景天及紅景天苷的新用途，即紅景天及紅景天苷 誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是紅景天在制備誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用，如利 用紅景天誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞(如肝細(xì)胞，膽管細(xì)胞等)。本發(fā)明推薦以紅景天中的有效成份紅景天苷作為誘導(dǎo)成體干細(xì)胞定 向分化為肝系細(xì)胞的誘導(dǎo)劑。紅景天苷具有擬肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (Hepatocyte grow factor, HGF )樣作用。通常的，本發(fā)明所述的干細(xì)胞為成體干細(xì)胞，所述的成體干細(xì)胞包括 除造血干細(xì)胞外的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及多種祖細(xì)胞，優(yōu)選為骨髓間充質(zhì) 干細(xì)月包。本發(fā)明所述應(yīng)用為將紅景天苷與細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-4組合作為誘 導(dǎo)劑用于誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞。具體的，所述應(yīng)用為取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取穩(wěn) 定傳代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得成熟肝 細(xì)胞樣細(xì)胞；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加有紅景天苷與細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-4 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中紅景天苷與細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-4添加 量為紅景天苷終濃度為1 5^M(優(yōu)選為2pM),細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-4 終濃度為5 20ng/mL (優(yōu)選為10ng/mL)。優(yōu)選的，所述的應(yīng)用為取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，接種于MSC培養(yǎng)基，37°C、 5%(302條件 下培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率大于90%,將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為添加有2(iM紅景天 苦與10 ng/mL細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-4的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)14天，得 到成熟肝細(xì)胞樣細(xì)胞。所述MSC培養(yǎng)基本領(lǐng)域常見(jiàn)適用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng) 基，本發(fā)明中選用含10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM Hepes、 100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常見(jiàn)適用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，本發(fā)明中釆用含2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM 2_[4_(2_輕乙基)-l-哌。秦]乙磺酸(Hepes )、 1 x胰島素—轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、200昭/L 地塞米松、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基。一種誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，所述的誘導(dǎo)劑含有紅 景天，本發(fā)明所述的誘導(dǎo)劑特別是指誘導(dǎo)劑中含紅景天苷，或者含有紅景 天苷的同分異構(gòu)體，或基團(tuán)被修飾的單體化合物；另外，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，紅 景天苷元(即紅景天香去掉糖基，結(jié)構(gòu)式如式(II )所示)，也具有類(lèi)似 的作用，也可以作為誘導(dǎo)劑用于誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞。進(jìn)一步 本發(fā)明所述的誘導(dǎo)劑為紅景天苷或紅景天苷元與細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-4的 組合物，具體應(yīng)用時(shí)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加量為紅景天苦終濃度2yM, 細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-4終濃度10 ng/mL,或者在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加量為 紅景天香元終濃度2 ju M，細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-4終濃度10 ng/mL。1% 2%;步驟為(1) 、將硫酸先溶解到甲醇中，然后將油脂或脂肪酸和硫酸甲醇一起加入到低壓反應(yīng)釜中，反應(yīng)壓力0.2 0.3MPa，反應(yīng)溫度為80~95°C，催化劑硫酸占油 脂或脂肪酸重量的1% 2%，醇油重量比為0.8:1 1.2:1，反應(yīng)時(shí)間為16~20h;(2) 、將步驟(l)所得反應(yīng)混合物回收甲醇，然后將剩余物靜置分層，上層主 要為生物柴油，下層主要為甘油和硫酸；(3) 、將步驟(2)中的上層液體用60 7(TC溫水洗滌，洗至分層后下層水相呈中性，取上層油相經(jīng)真空干燥脫水得到粗生物柴油；(4) 、將步驟(3)中的粗生物柴油經(jīng)減壓蒸餾，在高于-0.1MPa真空條件下收 集17(TC 19(TC餾分，即為生物柴油制品。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了低酸催化制備生物柴油的新工藝，該工 藝具有原料適應(yīng)范圍廣，酸添加量低，是帶壓反應(yīng)，可以縮短反應(yīng)時(shí)間，降低 能耗，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高，工藝簡(jiǎn)單，同時(shí)減少了三廢污染的產(chǎn)生，降低了生物柴 油的生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。 實(shí)施例l:向低壓反應(yīng)釜中加入100g麻瘋果油(酸價(jià)3.8) ， 2g濃硫酸， 100 g甲醇，硫酸先溶解在甲醇中再加入到反應(yīng)釜中，反應(yīng)壓力0.2 0.3MPa， 反應(yīng)溫度85。C，反應(yīng)時(shí)間18h。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)甲醇蒸餾塔真空回收甲醇，然 后將產(chǎn)物靜置分層2小時(shí)，上層主要為脂肪酸甲酯，下層主要為甘油和硫酸。 將上層產(chǎn)物用約30 mL 60 7(TC熱水洗滌，靜置分層，重復(fù)2次后下層水相呈 中性，取上層油相經(jīng)真空干燥脫除水分得到粗生物柴油產(chǎn)品95 g，通過(guò)生成的 甘油測(cè)得甲酯的轉(zhuǎn)化率為94.4%。得到的粗甲酯經(jīng)減壓蒸餾塔減壓蒸熘，真空 度高于-0.1MPa，取17(TC 19(TC之間的餾分，為生物柴油最終產(chǎn)品。實(shí)施例2:向低壓反應(yīng)釜中加入100g麻瘋果油(酸價(jià)3.8) ， 1.5g濃硫 酸，80g甲醇，硫酸先緩慢滴加到甲醇中再加入到反應(yīng)釜中，反應(yīng)壓力 0.2 0.3MPa，反應(yīng)溫度95。C，反應(yīng)時(shí)間19 h。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)甲醇蒸餾塔真空 回收甲醇，然后將反應(yīng)產(chǎn)物靜置分層2小時(shí)，上層主要為脂肪酸甲酯，下層主 要為甘油和硫酸。將上層產(chǎn)物用約30mL60 7(TC熱水洗滌，靜置分層，重復(fù) 2次后下層水相呈中性，取上層油相經(jīng)真空干燥脫除水分得到粗生物柴油產(chǎn)品 96 g，通過(guò)生成的甘油測(cè)得甲酯的轉(zhuǎn)化率為95.3%。得到的粗甲酯經(jīng)減壓蒸餾 塔減壓蒸餾，在真空度高于-0.1MPa條件下取170。C 19(TC之間的餾分，為最 終生物柴油產(chǎn)品。實(shí)施例3:向低壓反應(yīng)釜中加入100g麻瘋果油(酸價(jià)3.8) ， 1 g濃硫酸， 100g甲醇，硫酸先溶解在甲醇中，再將硫酸甲醇溶液加入到反應(yīng)釜中，反應(yīng)肝損傷及中晚期肝臟疾病領(lǐng)域的深入研究，為新藥開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)。(四)


圖1為呈梭形的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；圖2為呈漩渦狀生長(zhǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；圖3為不同誘導(dǎo)條件下甲胎蛋白(AFP)的表達(dá)；A:紅景天苷+FGF-4 聯(lián)合誘導(dǎo)組；B: FGF-4單獨(dú)誘導(dǎo)組；C: HGF+FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)組；D: HepG2陽(yáng)性對(duì)照；圖4為不同誘導(dǎo)條件下CK18的表達(dá)；A:紅景天苷+FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)組； B: FGF-4單獨(dú)誘導(dǎo)組；C: HGF+FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)組；D: Hela細(xì)胞陽(yáng)性 對(duì)照組；圖5為不同誘導(dǎo)條件下糖原合成情況；A: FGF-4單獨(dú)誘導(dǎo)組；B: HGF+FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)組；C:紅景天苷+FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)組； 圖6為不同誘導(dǎo)條件下谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)分泌情況； 圖7為不同誘導(dǎo)條件下谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)分泌情況； 圖8為不同誘導(dǎo)條件下尿素氮分泌情況。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一 步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不僅限于此實(shí)施例1: 試劑及材料4周齡SD大鼠浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；紅景天苷及紅景天苷元中國(guó)藥品生物制品檢定所；Percoll: Pharmacia公司；低糖DMEM培養(yǎng)基GIBCO公司；高糖DMEM培養(yǎng)基GIBCCV〉司；胎牛血清GIBCO公司；Hepes (2-[4-(2-羥乙基)-l-哌嗪]乙磺酸)Amresco公司；胰島素/轉(zhuǎn)鐵蛋白/竭Sigma公司；地塞米+>: Sigma ^>司；HGF: Pepro Tech公司；FGF-4: Pepro Tech公司。實(shí)驗(yàn)步驟(1 )骨髓干細(xì)胞的獲取及其支持培養(yǎng)乙醚麻醉后頸推脫臼法處死SD大鼠(4周齡)，無(wú)菌取脛骨和股骨， 剪開(kāi)兩端骨骺，不含血清的MSC培養(yǎng)液(即低糖DMEM培養(yǎng)基添力。2mM 谷氨酰胺、10mM Hepes和各100U/ml的青、鏈霉素)反復(fù)沖洗骨髓腔，400m 篩網(wǎng)過(guò)濾，收集骨髓細(xì)胞。配制密度為1.073 kg/L的Percoll溶液(先用9份 密度為1.077kg/L的Percoll原液與1份8.5。/oNaCl或1.5M PBS混合達(dá)到生理 性滲透壓，然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS )稀釋至Percoll濃 度為60%,即可得密度為1.073 kg/L的Percoll溶液)，密度梯度離心，收 集中間的白膜層細(xì)胞即大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，以3xl0Vcm2密度接種于培 養(yǎng)瓶中，MSC培養(yǎng)液(為低糖DMEM培養(yǎng)基添加10。/。胎牛血清、2mM谷 氨酰胺、10mMHepes、各100U/ml青、鏈霉素)，37。C飽和濕度、5%C02 孵箱培養(yǎng)24h后換液，去除懸浮細(xì)胞。以后每3天換液1次，此時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞 呈梭型且呈旋渦狀生長(zhǎng)(圖l、圖2)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)60%~70%融合后采用不同的接種密度進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。(2)紅景天苦誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞取培養(yǎng)第3代的MSCs,以5xl0Vcm2密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)亞(低糖 DMEM培養(yǎng)基添加10。/。胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mMHepes、各 100U/ml的青、鏈霉素)，37。C飽和濕度、5%(302孵箱培養(yǎng)；細(xì)胞匯合率 大90%時(shí)，換成基礎(chǔ)培養(yǎng)基(為高糖DMEM培養(yǎng)基添加2。/。胎牛血清、2mM 谷氨酰胺、10mM 2-[4-(2-羥乙基)-l-哌溱]乙磺酸(Hepes )、 1 x胰島素-轉(zhuǎn) 鐵蛋白-竭、200(ig/L地塞米松、100U/ml青鏈霉素和100U/ml鏈霉素)；分 為3個(gè)誘導(dǎo)組，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加FGF-4單獨(dú)誘導(dǎo)組生長(zhǎng)因子FGF-4 10ng/ml;HGF+FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)組生長(zhǎng)因子FGF-4 10ng/ml， HGF 20ng/ml; 紅景天香+FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)組生長(zhǎng)因子FGF-4 10ng/ml,單體化合物 紅景天苷2jiM;每3天換液1次，并觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)的變化。于第7、 14、 21天分別收獲 細(xì)胞，提取蛋白檢測(cè)甲胎蛋白(AFP)和CK18的表達(dá)情況(圖3、圖4); 于第14天后Periodicacid-Schiff法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)糖原合成(圖5 )。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論從紅景天苦誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞的特異性蛋白(AFP, CK18)表達(dá)情況來(lái)看，誘導(dǎo)時(shí)間和物質(zhì)表達(dá)情況之間具有明顯的時(shí)效關(guān) 系。在誘導(dǎo)的第4天，AFP開(kāi)始表達(dá)，在誘導(dǎo)的第7天達(dá)到高峰，接近陽(yáng)性 對(duì)照，在14天白蛋白表達(dá)，AFP已成陰性；CK18在第10天開(kāi)始表達(dá)，第 14天達(dá)到高峰，紅景天香+ FGF-4組已經(jīng)接近陽(yáng)性對(duì)照組；糖原染色顯示， 紅景天芬+ FGF-4組糖原陽(yáng)性率明顯已經(jīng)超過(guò)FGF-4單獨(dú)誘導(dǎo)組及HGF+FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)組。(3)紅景天芬衍生物(以紅景天苷元為代表)誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞定向 分化為肝細(xì)胞取培養(yǎng)第3代的MSCs,以5xl0Vcm2密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)條 件同上實(shí)施例2;分為3個(gè)誘導(dǎo)組，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加FGF-4單獨(dú)誘導(dǎo)組生長(zhǎng)因子FGF-4 10ng/ml;HGF+FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)組生長(zhǎng)因子FGF-4 1 Ong/ml, HGF 20ng/ml;紅景天苷元+FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)組生長(zhǎng)因子FGF-4 10ng/ml，單體化合 物紅景天苷元2pM;每3天換液1次，并觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)的變化。于第14、 21及28天分別收獲 細(xì)胞，取上清檢測(cè)肝細(xì)胞特異性生化指標(biāo)一 —谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(圖6 ) 及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)(圖7 )及尿素氮(圖8 )的分泌情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論從紅景天香元誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞的生化指標(biāo)(ALT、 AST和BUN)情況來(lái)看，誘導(dǎo)時(shí)間和物質(zhì)表達(dá)情況之間具有明顯的時(shí)效關(guān) 系。ALT、 AST和BUN隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，在誘導(dǎo)的第3、 4周達(dá)到正常 肝細(xì)胞的分泌水平。由此推測(cè)紅景天苷及其衍生物均具有誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞 定向分化為肝細(xì)胞的作用。利用紅景天苷及其衍生物紅景天苷元(或者其它同分異構(gòu)體及其基團(tuán) 被修飾的紅景天苷)可以誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞，如果將其成 功引入急慢性肝損傷以及晚期肝臟疾病(如肝衰竭)，通過(guò)大量增殖逐步恢 復(fù)肝臟的正常功能，這將為治療難治性肝臟疾病提供組織細(xì)胞來(lái)源；同時(shí) 通過(guò)此法大量擴(kuò)增肝細(xì)胞，可以進(jìn)一步進(jìn)行組織工程學(xué)等方面的研究。本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容，可以滿(mǎn)足本研究領(lǐng)域技術(shù)人員的應(yīng)用，同時(shí)， 在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作出各種 改動(dòng)或者修改，這些基于本發(fā)明的操作同樣落于本發(fā)明所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.紅景天在制備誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于紅景天中提取的紅景天苷在制備誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的干細(xì)胞為成體干細(xì)胞。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述成體干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為紅景天苷與細(xì)胞 生長(zhǎng)因子FGF-4組合作為誘導(dǎo)劑用于誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化 為肝系細(xì)胞。
6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為if又大鼠骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取穩(wěn)定傳代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于誘導(dǎo)培養(yǎng) 基中，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得成熟肝細(xì)胞樣細(xì)胞；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添 加有紅景天苷與細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-4的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中紅景天苷與細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-4添加量為紅景天苷終濃度為1 5 U M,細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-4終濃度為5 20 ng/mL。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為取大鼠骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，接種于 MSC培養(yǎng)基，37°C、 5。/。C02條件下培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率大于90%,將細(xì) 胞培養(yǎng)基更換為添加有2jaM紅景天苷與10 ng/mL細(xì)胞生長(zhǎng)因子 FGF-4的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)14天，得到成熟肝細(xì)胞樣細(xì)胞。
8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述MSC培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mMHepes、 100U/ml青霉素、100U/ml鏈 霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mMHepes、 1 x胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、200 ia g/L地塞米松、100U/ml青霉素、100U/ml 鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基。
9. 一種誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，其特征在于所述的誘 導(dǎo)劑含有紅景天。
10. 如權(quán)利要求10所述的誘導(dǎo)劑，其特征在于所述的誘導(dǎo)劑含紅景天苷元 或紅景天苷。
全文摘要
本發(fā)明提供了紅景天及紅景天苷在誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞中的應(yīng)用，尤其是紅景天苷與細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-4組合作為誘導(dǎo)劑用于誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞。本發(fā)明開(kāi)拓了紅景天苷的新用途，即體外誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞等干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞；提供了紅景天及紅景天苷在誘導(dǎo)成體干細(xì)胞定向分化為肝系細(xì)胞中的作用，有利于體內(nèi)干細(xì)胞移植治療急慢性肝損傷及中晚期肝臟疾病領(lǐng)域的深入研究，為新藥開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N5/071GK101225374SQ20081005951
公開(kāi)日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者喬洪翔, 吳理茂, 李連達(dá), 歐陽(yáng)競(jìng)鋒 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)