專利名稱：茶尺蠖幾丁質(zhì)合成酶基因chsA及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于昆蟲基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種茶尺蠖幾丁質(zhì)合成酶A (chitinsynthaseA， chsA)基因分離和分析；還涉及利用基因干涉技術(shù)下調(diào)該基因，來達(dá) 到影響茶尺蠖蟲態(tài)變換或提高茶尺蠖對常規(guī)農(nóng)藥的敏感性。
背景技術(shù)：
茶尺蠖等鱗翅目昆蟲是主要茶園蟲害之一，因此也是重要的防治對象。茶尺蠖等鱗翅 目害蟲的卵、幼蟲、蛹和成蟲階段的體表均被一層厚厚的角質(zhì)所覆蓋，角質(zhì)不僅可以抵御 自然的不利環(huán)境，減少天敵生物的入侵，同時也使人工合成農(nóng)藥的防治效果大為降低。研 究顯示，茶尺蠖等害蟲體表角質(zhì)的核心成分就是幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)，其中幾丁質(zhì)類似于人類 建筑中鋼筋腳手架，對昆蟲角質(zhì)的強度起決定作用。幾丁質(zhì)是一類由N-乙酰葡糖胺聚合形 成的多糖聚合物，由茶尺蠖等害蟲表皮細(xì)胞的chsA催化形成?？梢?，chsA對于茶尺蠖害蟲的正常生理活動有著十分重要的意義。因此，今后鱗翅目害蟲農(nóng)藥研發(fā)的重點之一是克隆茶尺蠖等害蟲的chsA基因的全長序列，研究其特性，并充分利用chsA對昆蟲活動的 重要性,設(shè)計可抑制chsA基因活性或酶活性的新生物農(nóng)藥或增效劑。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種茶尺蠖幾丁質(zhì)合成酶基因chsA及其編碼的蛋白 質(zhì)，可用于分析chsA表達(dá)對茶尺蠖形態(tài)建成和活力的影響。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種茶尺蠖幾丁質(zhì)合成酶基因chsA，其具有SEQ ID No: l所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了上述基因chsA編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了上述基因chsA的用途，利用該基因物調(diào)節(jié)鱗翅目害蟲內(nèi)源chsA活性， 增加鱗翅目害蟲對農(nóng)藥的敏感性。作為本發(fā)明的基因chsA的用途的改進(jìn)鱗翅目害蟲為茶尺蠖。作為本發(fā)明的基因chsA的用途的進(jìn)一步改進(jìn)將根據(jù)SEQIDNo: l所示的核苷酸序列 設(shè)計的chsA-siRNA注射入茶尺蠖體內(nèi)，使內(nèi)源chsA表達(dá)下調(diào)，抑制茶尺蠖生長發(fā)育，從而 增加其對農(nóng)藥的敏感性。本發(fā)明是采用RT-PCR技術(shù)分離與茶尺蠖等鱗翅目害蟲表皮幾丁質(zhì)形成最為直接的 chsA基因；并利用雙鏈干涉技術(shù)明確該基因的正常表達(dá)對茶尺蠖生長發(fā)育的重要性，為針 對該基因或基因產(chǎn)物的農(nóng)藥活增效劑研發(fā)奠定基礎(chǔ)。綜上所述，本發(fā)明獲得了茶尺蠖chsA 的基因全長，分析了chsA表達(dá)對茶尺蠖形態(tài)建成和活力的影響，為可抑制chsA基因活性或 酶活性的新生物農(nóng)藥或增效劑研制奠定基礎(chǔ)。實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下一、茶樹鱗翅目害蟲chsA基因分離和分析以取食間隔期(或者稱為休眠期)、前蛹后期的茶尺蠖幼蟲為材料，采用TRIZOL (Invitrogen公司)試劑提取總RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工 生物工程有限公司)分離mRNA。分別取l-5嗎mRNA為模板，以MMLV第一鏈cDNA合 成試劑盒(上海生工生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行cDNA合成。采用產(chǎn)物重疊拼接延伸的策略進(jìn)行 chsA全長基因的克隆，見圖l 。即以cDNA為模板，分別以引物組合SEQ ID No:3和SEQ ID No: 4 (預(yù)計產(chǎn)物Fl長度為701bp) 、 SEQIDNo:5和SEQIDNo:6 (預(yù)計產(chǎn)物F2長度為1043bp)、 SEQ ID No:7和SEQ ID No: 8 (預(yù)計產(chǎn)物F3長度為685bp) 、 SEQ ID No:9和SEQ ID No: 10 (預(yù)計產(chǎn)物F4長度為1045bp) 、 SEQ IDNo:ll和SEQIDNo: 12 (預(yù)計產(chǎn)物F5長度為1120bp) 進(jìn)行PCR;以TaKaRa 3'RACE Core Set Ver.2.0試劑盒(寶生物[大連]有限公司)進(jìn)行3，端基 因序列克隆，所用基因特異引物為SEQIDNo:13和SEQIDNo:14 (預(yù)計3，END產(chǎn)物長度為 1280-1500bp之間)；以TaKaRa 5'-Ful1 RACE Kit試劑盒(寶生物[大連]有限公司)進(jìn)行5， 端基因序列克隆，所用基因特異引物為SEQ ID No:15和SEQ ID No:16 (預(yù)計5，END產(chǎn)物長 度為570-600bp之間)。將PCR和RACE產(chǎn)物在1.5。/。的瓊脂糖凝膠上電泳。電泳結(jié)束后割取 目標(biāo)條帶，以UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行片段回 收，并插入pUCm-T載體(上海生工生物工程有限公司)，陽性克隆委托Invitrogen公司進(jìn) 行序列分析。并根據(jù)序列的重疊區(qū)域由SeqMan軟件(DNAStar公司)進(jìn)行片斷拼接，獲 得了chsA全長序列，該基因長度為4977bp,具體如SEQ ID No:l。經(jīng)與美國生物信息數(shù)據(jù) 庫http:〃www. ncbi.nlm.nih.gov比對證實，該序列與甜菜夜蛾、小菜蛾等具有74%以上的同 源性。經(jīng)過EditSeq軟件推演得到了包含1565氨基酸的蛋白序列，具體如SEQ ID No:2。二、 chsA基因表達(dá)與茶尺蠖對農(nóng)藥敏感性的關(guān)系以本發(fā)明chsA基因序列SEQ ID No:l為材料，采用體外雙鏈干涉小RNA siRNA制備技術(shù)， 制備包含chsA的雙鏈干涉序列chsA-siRNA。將制備的chsA-siRNA注射入5齡后期茶尺蠖， 同時以注射蒸餾水為對照。注射l天后進(jìn)行chsA基因表達(dá)強度分析以TRIZOL(Invritrogen 公司)提取上述兩個樣品的總RNA，以MfLV第一鏈合成試劑盒(上海生工生物工程有限公 司)合成cDNA，并以SEQ ID No:17和SEQ ID No:18為引物組合(預(yù)計產(chǎn)物長度為437bp) 進(jìn)行PCR。結(jié)果顯示，注射chsA-siRNA干涉序列的茶尺蠖幼蟲內(nèi)源chsA表達(dá)強度為0.25， 而注射蒸餾水的對照chsA表達(dá)強度為0.95,見圖2。注射5-7天后觀察茶尺蠖生長發(fā)育的情 況，結(jié)果顯示，注射chsA-siRNA的茶尺蠖在幼蟲階段的死亡率為30y。左右，而注射蒸餾水 的對照的死亡率在7%左右。而且在未死亡的茶尺蠖幼蟲化蛹過程中，曾注射過chsA-siRNA 的茶尺蠖化蛹困難，出現(xiàn)明顯的畸形，見圖3，正?；悸试?0%以下；而注射蒸餾水的對 照，正?；急壤齾s達(dá)到85%以上?？梢姡琧hsA表達(dá)對茶尺蠖生長發(fā)育非常關(guān)鍵。 一旦chsA 表達(dá)被抑制，幾丁質(zhì)合成即出現(xiàn)障礙，茶尺蠖表皮等組織則無法正常形成。將以上述方法制備的chsA-si固A雙鏈干涉序列注射入3齡或4齡后期茶尺蠖，同時以注 射蒸餾水為對照。注射2-12小時內(nèi)，以適當(dāng)稀釋后的擬除蟲菊酯農(nóng)藥對茶尺蠖幼蟲進(jìn)行噴 霧，l-3天后觀察幼蟲死亡情況。結(jié)果顯示，注射chsA-siRNA的茶尺蠖幼蟲在噴施農(nóng)藥后 死亡率達(dá)到了100%;而注射蒸餾水的對照噴施農(nóng)藥后的死亡率在75%以下?？梢娮⑸?chsA-siRNA干涉序列可抑制茶尺蠖內(nèi)源chsA表達(dá)，使茶尺蠖對擬除蟲菊酯農(nóng)藥的敏感性增 加，農(nóng)藥噴施后茶尺蠖死亡率顯著增加。


'下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是chsA全長基因的克隆示意圖；注圖l中所示為茶尺蠖chsA基因克隆策略，即采用特殊引物分別克隆相關(guān)片斷，再 根據(jù)重疊區(qū)域進(jìn)行拼接。其中5'END為通過5'RACE試劑盒(大連寶生物[大連]有限公司) 和弓I物SEQ ID No: 15和SEQ ID No: 16所獲得的片斷，其預(yù)計長度為570-600bp之間；Fl為由 SEQIDNo:3和SEQIDNo:4引物組合PCR所獲得的片斷，其預(yù)計長度為701bp， Fl片斷與 3'END重疊區(qū)長度317bp; F2為由SEQ IDNo:5和SEQ ID No:6引物組合PCR所獲得的片斷， 其預(yù)計長度為1043bp， F2片斷與Fl重疊區(qū)長度100bp; F3為由SEQ ID No:7和SEQ ID No:8 引物組合PCR所獲得的片斷，其預(yù)計長度為685bp， F3片斷與F2重疊區(qū)長度57bp; F4為由SEQIDNo:9和SEQIDNo:10引物組合PCR所獲得的片斷，其預(yù)計長度為1049bp， F4片斷與 F3重疊區(qū)長度278bp; F5為由SEQIDNo:ll和SEQIDNo:12引物組合PCR所獲得的片斷，其 預(yù)計長度為1120bp， F5片斷與F4重疊區(qū)長度359bp; 3'END為通過3'RACE試劑盒(大連寶 生物[大連]有限公司)和引物SEQIDNo:13和SEQIDNo:14所獲得的片斷，其預(yù)計長度為 1280-1500bp之間。圖2是注射chsA-siRNA后，茶尺蠖幼蟲內(nèi)源chsA表達(dá)受抑制情況圖； 注圖中1為注射chsA-siRNA， 2為注射蒸餾水的對照，M為分子量標(biāo)記；本圖下 半部分為作為參照的18sRNA。圖3是注射chsA-siRNA序列后，茶尺蠖出現(xiàn)化蛹困難的圖；注圖中1為注射蒸餾水的對照，2-5均為注射chsA-siRNA后茶尺蠖出現(xiàn)化蛹困難的 種種表現(xiàn)。
具體實施方式
實施例l:選取2-3頭前蛹后期的茶尺蠖幼蟲，經(jīng)液氮研磨后，采用TRIZOL (Invitrogen公司)試 劑提取總RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司) 分離mRNA。取l嗎mRNA為模板，以MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物技術(shù) 有限公司)進(jìn)行cDNA合成。采用產(chǎn)物重疊拼接延伸的策略進(jìn)行chsA全長基因的克隆，見圖 1。即以cDNA為模板，分別以引物組合SEQ ID No:3和SEQ ID No: 4 (預(yù)計產(chǎn)物F1長度為 701bp) 、 SEQ ID No:5和SEQ ID No: 6 (預(yù)計產(chǎn)物F2長度為1043bp) 、 SEQ ID No:7和SEQ ID No: 8 (預(yù)計產(chǎn)物F3長度為685bp) 、 SEQ ID No:9和SEQ ID No: 10 (預(yù)計產(chǎn)物F4長度為 1045bp) 、 SEQIDNo:ll和SEQIDNo: 12 (預(yù)計產(chǎn)物F5長度為1120bp)進(jìn)行PCR擴增。PCR 程序為94'C預(yù)變性3分鐘，l個循環(huán)；94'C變性45秒、50-55'C退火45秒、72'C延伸1分鐘， 40個循環(huán)；72。C后延伸10分鐘。將上述PCR產(chǎn)物在1.5。/。的瓊脂糖凝膠上電泳。電泳結(jié)束后 割取目標(biāo)條帶，以UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行片 段回收，并插入pUCm-T載體(上海生工生物工程有限公司)，陽性克隆委托Invitrogen公 司進(jìn)行序列分析。取lpg純化mRNA，以TaKaRa 3'RACE Core Set Ver.2.0試劑盒(寶生物[大連]有限公司) 進(jìn)行3'端基因序列克隆，所用基因特異引物為SEQ ID No:13和SEQ ID No:14 (預(yù)計3'END 產(chǎn)物長度為1280-1500bp之間)，具體操作參照試劑盒使用說明。另取lpg純化rnRNA，以TaKaRa5，-FullRACEKit試劑盒(寶生物[大連]有限公司)進(jìn)行5'端基因序列克隆，所用基 因特異引物為SEQIDNo:15和SEQIDNo:16 (預(yù)計5，END產(chǎn)物長度為570-600bp之間)，具 體操作參照試劑盒使用說明。將上述RACE產(chǎn)物于1.5M瓊脂糖凝膠上電泳，并割取目標(biāo)條 帶，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行片段回收，并插 入pUCm-T載體(上海生工生物工程有限公司)，陽性克隆委托Invitrogen公司進(jìn)行序列分 析。將獲得的片斷序列由SeqMan軟件(DNAStar公司)根據(jù)重疊區(qū)域進(jìn)行片斷拼接，獲 得了chsA全長序列，該基因長度為4977bp，具體如SEQ ID No:l。經(jīng)與美國生物信息數(shù)據(jù) 庫http:〃www. ncbi.nlm.nih.gov比對證實，該序列與甜菜夜蛾、小菜蛾等具有74%以上的同 源性。經(jīng)過EditSeq軟件推演得到了包含1565個氨基酸的蛋白序列，具體如SEQ ID No:2， 該序列與甜菜夜蛾、煙草天蛾和小菜蛾等具有94%以上的同源性。證明所獲得的是編碼茶 尺蠖幾丁質(zhì)合成酶chsA的全長基因序列。實施例2:以本發(fā)明chsA基因序列SEQ ID No:l為材料，采用TaKaRa siRNA Cocktail Kit (si-RNAase III TM)(寶生物工程[大連]有限公司)制備可與茶尺蠖內(nèi)源chsA發(fā)生雙鏈干 涉作用的chsA-siRNAs,具體操作參照試劑盒使用說明。將制備的chs/bsiRNA以蒸餾水溶 解，注射入5齡后期茶尺蠖幼蟲，注射部位為尾部氣門處，注射劑量為每頭茶尺蠖10-100ng 的chsA-siRNAs(注射體積為2禮)，并以注射純水為對照。注射1天后，分別在雙鏈千涉處 理組和對照組中選取2頭幼蟲，以TRIZOL(Invitrogen公司)提取總RNA,以畫LV第一鏈合成 試劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA，并以SEQ ID No:17和SEQ ID No:18為引 物組合(預(yù)計產(chǎn)物長度為437bp)進(jìn)行PCR。 PCR反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性3分鐘，l個循環(huán)； 94。C變性45秒、55。C退火45秒、72。C延伸45秒，35個循環(huán)；72。C后延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物于 1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，并進(jìn)行拍照和條帶光密度讀取，以明確雙鏈干涉chsA注射對茶尺 蠖內(nèi)源chsA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，注射chsA-siRNA干涉序列的茶尺蠖幼蟲chsA表達(dá)強度 為0.25，而注射蒸餾水的對照chsA表達(dá)強度為0.95,見圖2。說明注射雙鏈chsA后可有效抑 制內(nèi)源chsA的表達(dá)。注射后7天觀察茶尺蠖生長發(fā)育情況，結(jié)果顯示，注射chsA-siRNA的 茶尺蠖在幼蟲階段的死亡率為30%，而注射蒸熘水的對照的死亡率為6%;而且在未死亡的 茶尺蠖幼蟲化蛹過程中，注射chsA-siRNA的茶尺蠖出現(xiàn)化蛹困難，正?；悸蕛H15%，而畸形蛹比例非常高，見圖3;而注射蒸餾水的對照，正常化蛹比例卻達(dá)到88%?？梢?，chsA 表達(dá)對茶尺蠖生長發(fā)育非常重要。 一旦chsA表達(dá)被抑制，幾丁質(zhì)合成即出現(xiàn)障礙，茶尺蠖 表皮等組織則無法正常形成，影響脫皮和形態(tài)發(fā)生。將以上述方法制備的chsA-siRNA雙鏈干涉序列注射入4齡后期茶尺蠖，注射劑量為每 頭茶尺蠖10-100ng的chsA-siRNAs(注射體積為2叱)，同時以注射蒸餾水為對照。注射10小 時后，將市售2.5%功夫菊酯農(nóng)藥用水稀釋10000倍，對茶尺蠖幼蟲進(jìn)行噴霧處理，2天后觀 察幼蟲死亡情況。結(jié)果顯示，注射chsA-siRNA的茶尺蠖幼蟲在噴施農(nóng)藥后死亡率達(dá)到了 100%;而注射蒸餾水的對照噴施農(nóng)藥后的死亡率約為73%?？梢娮⑸鋍hsA-siRNA干涉序列 沉默茶尺蠖內(nèi)源chsA表達(dá)后，茶尺蠖對擬除蟲菊酯農(nóng)藥的敏感性增加，農(nóng)藥噴施后茶尺蠖 死亡率顯著增加。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明 不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直 接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。<formula>formula see original document page 9</formula>ctccactgag犯gttgttcgtactgccgatgtataacggactgcttatcgaccaggtgcat1680ggccatg已atacgatcagaaggatgtg鄉(xiāng)3CcgaBga^cct3gccg33at1740aa鄉(xiāng)cgacgagtactacgaaaccatatcagtgcacacagac3acacggg1800ctcttctccca卿cggtgaagtcgtccgaccagataacgaggatctacgcatgcgcgac1860tatgtggcacg卿cgaaagacgaaatgatgagttttttgacgtctgtgatacggagtga1920tgatgatcaaagcgcgcgacgagttgctcaggtatcgtcgaCCC￡LgaCt￡L1980ctacgagtttg犯gca^c3ttttcatggacgactcattcg犯atttccgatcatagctg2040ggagg織tgcaagtgaatcgcttcgtgaagtgcctcatcgataccattgatgatgccgt2100gtctg犯gtgcacctcactaatgtgagacttcgacctccaaaga33taccccacgcctta2160tgggggccgtct3gtctggacactgcccgggaagaaca33cttatatgtcacttgaagga2220atcagacatagg卿cgatggtcacaggtaatgtacatgtattacctcct2280cggccaccgtctcatggacctgcctatcaccgtggatcgctcgctgag犯2340cacgtatctcctagccttggtgacttca犯cccaacgctgtcaccttgct2400cgtggatcta3c犯gaacttgggagccgcttgtgggcgtattcatccagt2460tggatcaggtttcatggcctggtaccaaatgtttgagtacgccatcggccattggctgca2520犯aggcgaccgaacac已tgatcggatgcgtactctgtagtcctggctgcttctcactctt2580cagagtaaaggcgctcatggEitgataacgtC3tgaagaaatacaccctcacctcacacga2640ggcgaggcattacgtgcgaatacg3c郷gggaggatcgatggttatgcacactgttgct2700固gcgtggttaccgagtag犯tactcagctgcctccgatgcgtacacgcactgccccga2760aggtttcaacgaattctacaaccaacgtcgtcgctgggtgccttccaccatcgccaacat2820tatggacttactcgcagattacaaacacactatcgtctcc2880ttacatagcatsccagatgatgttg3tgggtggt已cgatcctgggtcccggaactatatt2940tcttatgttggtgggtgccttcgtggctgctttccgaatccttcatttga3000atscaatctctaccctattttgatcttcatgttcgtctgcttca<caBtga<犯tcggstta3060tcaattgctggtggctcaaatactttcgacagcatacgctatgat犯tg3tggctgtgat3120agtgggtaccgcgctccagttgggcg鄉(xiāng)acggggtcggctctccatcagccatcttctt3180gatatcactctcgagttc犯cattcatagcagcatgtttgcatccac犯gagttctggtg3240tgtcgtgcctggtgtcatctatctactgtctataccctctatgtacttgctcctgatttt3300gtactctatcacaacgtaacttgggg犯cccgcgaagtag3360gact犯g犯gga犯tcg鄉(xiāng)C3gageta^gaaggaetgc卿ageiggc犯卿卿gggcgaa3420ac觀aagtctttgttgggcttccttcaaggtgtaaacagt3480agsgttctcgttcgccggtctattcaagtgtctgttgtgcacacatccta3540c犯ctgttgcatatcgcatctacacttgacaagttcgagaagaaattgga3600aactgttgagagggctgttgatcctcacggcctccacagaggccgaaagctgtcggtagg3660accccgcggtagcaccaatggtg￡LtC￡ltgggctggacgcgctggctgaagg8CC￡Lg￡Ltga<3720tcagattctgacactgacactctatctacggaaccta_g3ga^aagagaga3780cgatctcataaatccctactggattg鄉(xiāng)3ccctgatttg3ggt￡lg3Ctt3840tttgagtccctccgagattcacttctggaaggatctcattgax^3gta_tttatacccta/t3900tgatgctgat鄉(xiāng)gaggagcaggcccgtatatcg幼agattgcgagactc3960gtctgtcttttccttctttatgatcaatgctctctttgttctgattgtattcttgctgca4020actg犯caaggac犯ccttcacgttaagtggcccttcggagttaa犯cta4080tgatg郷ttacgca卿ggtgctcatctccaagg犯tatctgcaactggagcctattgg4140tttggtgttcgtattcttctttgcattgattttggtaatccagttcaccgccatgttgtt4200ccatcgatt"tggaactatttcgcacatattgtcgtcgacag犯ctg犯ctggttctgtac4260t犯g33gtCggacgacttgtctcaggacgc犯g犯tgc^t3gc3at3gt4320aaaggacttgacggtctcg已tgacgatt3tgacaatgactcggggtcggg4380cccgLC3taatgtgggcaggagga卿cgattC￡LC￡L￡Ltttg4440ggcacgctggatgtggccttcaagaagcg已ttcttcaatatgaacgctaa4500tgatggaccaggtac8ccagttctg犯tcgC犯g3tg3Cgttgcg犯ggg3g3CgCtg^4560ggctttggagattcagtgatggcgg犯卿agg朋gtcccagatgc已aac4620acttggtgctaa/taacgaatatggagtcactggaatgctgaataacaacctaggggtggt4680gccgcgtcaccggccgtcgaatgccaacatttc已gtcaaggatgtcttcgcggaaccc犯4740cgg郷tc^gtC犯CCg3gggtacgaaaccacgctaggcgacgatgacg8C3CC犯CtC■0犯tgagattaC3gCCg3g3Ccaaaccaggtttccttccagggcagattcta,gtcagg4860cccctaacagttaccaaaattacttttggggatagtaagct^g￡ita_gtg4920tttcataatttttagcgtatgaagcctctcatcctatttttataggtacgttgtatt4977SEQIDNo: 2Met Ala Thr Ser Gly Gly Arg Arg Arg Glu Glu Gly Ser Asp Asn1 5 10 15Ser Asp Asp Glu Leu Thr Pro Leu Ala His Asp lie Tyr Gly Gly 20 25 30Ser Gin Arg Thr Val Gin Glu Thr LysGly Trp Asp Val Phe Arg 35 40 45Qlu Phe Pro Pro LysGIn Asp Ser Gly Ser Met Glu Ser Gin Lys 50 55 60Cys Leu Glu Phe Thr Val Arg Leu Leu Lyslle Phe Ala Tyr Ala 65 70 75Leu Val Phe lie Val Val Leu Ser Ser Gly Val Leu Ala LysGly 80 85 90Thr Thr Leu Phe Met Thr Ser Gin Leu Arg LysAsp Arg Arg lie 95 100 105Ala Tyr Cys Asn Arg Asn Leu Gly Arg Asp LysGIn Phe Val Val 110 115 120Ser Leu Pro Asp Glu Glu Arg Val Ala Trp Met Trp Ala lie Leu 125 130 135Ala Ala Phe Ala lie Pro Glu lie Gly Ala Phe He Arg Ala Leu 140 145 150Arg He Cys Phe Phe LysSer Ser Arg Arg Pro Thr Ser Ala Gin 155 160 165Phe lie Val Val Phe Val Ala Glu Thr Leu His Thr He Cys Val 170 175 180Gly Leu Leu Phe Phe Lyslle Leu Pro Glu Leu Asp Val Val Lys 185 190 195Gly Ala Met Val Thr Asn Cys Leu Cys Val He Pro Ala lie Leu 200 205 210Ser Leu Leu Ser Arg Asn Asn Arg Glu Ser LysArg Phe Val Lys 215 220 225Val lie Val Asp Met Val Ala lie Val Ala Gin Val Thr Gly Phe230 235 240lie Val Trp Pro Leu Leu Glu Asn LysPro Val Leu Trp Leu He 245 250 255Pro He Ser Cys lie Cys lie Ser Leu Gly Trp Trp Glu Asn Tyr 260 265 270Val Thr Arg Gin Ser Pro lie Gly lie He LysSer Leu Gly Arg 275 280 285Leu LysAsp Glu Leu Asn Phe Thr Arg Tyr Phe Thr Tyr Arg Phe 290 295 300Met Ser Leu Trp Lyslle Val Val Phe Leu Met Val lie Leu Phe 305 310 315Ser lie Trp Thr Asp Gly Asp Asp Pro Ala Met Phe Phe Gin Leu 320 325 330Phe Asn Ala Gly Phe Gly Pro His Asn lie Val Val Glu Glu He 335 340 345Gin lie His Leu Gly Gly Thr Val lie Pro Asn Leu Ala Asn Val 250 355 360Thr Leu Thr Gly Asp Ser Val Glu Val Ala Ala Ala Tyr LysSer 365 370 375Ala Phe Tyr Val Thr Leu lie Gin lie Phe Ala Ala Tyr He Cys 380 385 390Tyr lie Phe Gly LysPhe Ala Cys Lyslle Leu lie Gin Gly Phe 395 400 405Ser Tyr Ala Phe Pro lie Asn Leu Val lie Pro Leu Val Val Asn 410 415 420Leu Leu He Ala Ala Cys Gly lie Arg Asn Gly Asp Thr Cys Phe 425 430 435Phe His Gly Ser Val Pro Asp Tyr Leu Tyr Phe Glu Ser Pro Pro 440 445 450Val Phe Thr Leu Ser Asp Phe lie Ser Arg Gin Met Ala Trp Val455 460 465Trp Leu Leu Trp Leu Leu Ser Gin Thr Trp lie Thr lie His lie 470 475 480Trp Thr Pro LysAla Glu Arg Leu Ala Ser Thr Glu LysLeu Phe 485 490 495Val Leu Pro Met Tyr Asn Gly Leu Leu lie Asp Gin Ser Met Ala 500 505 510Met Asn Arg LysArg Asp Asp Gin LysAsp Val LysThr Glu Asp 515 520 525Leu Ala Glu lie Glu LysGlu LysGly Asp Glu Tyr Tyr Glu Thr 530 535 540lie Ser Val His Thr Asp Asn Thr Gly Ser Ser Pro LysThr Val 545 550 555LysSer Ser Asp Gin lie Thr Arg lie Tyr Ala Cys Ala Thr Met 560 565 570Trp His Glu Thr LysAsp Glu Met Met Ser Phe Leu Thr Ser Val 575 580 585He Arg Ser Asp Asp Asp Gin Ser Ala Arg Arg Val Ala Gin Lys 5卯595 600Tyr Leu Gly lie Val Asp Pro Asp Tyr Tyr Glu Phe Glu Ala Asn 605 610 615lie Phe Met Asp Asp Ser Phe Glu lie Ser Asp His Ser Trp Glu 620 625 630Asp Met Gin Val Asn Arg Phe Val LysCys Leu lie Asp Thr He 635 640 645Asp Asp Ala Val Ser Glu Val His Leu Thr Asn Val Arg Leu Arg 650 655 660Pro Pro LysLysTyr Pro Thr Pro Tyr Gly Gly Arg Leu Val Trp 665 670 675Thr Leu Pro Gly LysAsn LysLeu lie Cys His Leu LysAsp Lys680 685 690Phe Lyslle Arg His Arg LysArg Trp Ser Gin Val Met Tyr Met 695 700 705Tyr Tyr Leu Leu Gly His Arg Leu Met Asp Leu Pro lie Thr Val 710 715 720Asp Arg LysGlu Val He Ala Glu Asn Thr Tyr Leu Leu Ala Leu 725 730 735Asp Gly Asp lie Asp Phe LysPro Asn Ala Val Thr Leu Leu Val 740 745 750Asp Leu Met LysLysAsp LysAsn Leu Gly Ala Ala Cys Gly Arg 755 760 765lie His Pro Val Gly Ser Gly Phe Met Ala Trp Tyr Gin Met Phe 770 775 780Glu Tyr Ala He Gly His Trp Leu Gin LysAla Thr Glu His Met 785 790 795lie Gly Cys Val Leu Cys Ser Pro Gly Cys Phe Ser Leu Phe Arg 訓(xùn)805 810Val LysAla Leu Met Asp Asp Asn Val Met LysLysTyr Thr Leu 815 820 825Thr Ser His Glu Ala Arg His Tyr Val Arg lie Arg Gin Gly Glu 830 835 840Asp Arg Trp Leu Cys Thr Leu Leu Leu Gin Arg Gly Tyr Arg Val 845 850 855Glu Tyr Ser Ala Ala Ser Asp Ala Tyr Thr ffis Cys Pro Glu Gly 860 865 870Phe Asn Glu Phe Tyr Asn Gin Arg Arg Arg Trp Val Pro Ser Thr 875 880 885lie Ala Asn lie Met Asp Leu Leu Ala Asp Tyr LysHis Thr He 890 895 900Lyslle Asn Asp Asn lie Ser Ser Pro Tyr Ik Ala Tyr Gin Met905 910 915Met Leu Met Gly Gly Thr He Leu Gly Pro Gly Thr He Phe Leu 920 925 930Met Leu Val Gly Ala Phe Val Ala Ala Phe Arg He Asp Asn Trp 935 940 945Thr Ser Phe Glu Tyr Asn Leu Tyr Pro lie Leu lie Phe Met Phe 950 955 960Val Cys Phe Thr Met LysSer Asp Tyr Gin Leu Leu Val Ala Gin 965 970 975lie Leu Ser Thr Ala Tyr Ala Met He Met Met Ala Val lie Val 980 985 990Gly Thr Ala Leu Gin Leu Gly Glu Asp Gly Val Gly Ser Pro Ser 995 1000 1005Ala He Phe Leu lie Ser Leu Ser Ser Ser Thr Phe lie Ala Ala 1010 1015 1020Cys Leu His Pro Gin Glu Phe Trp Cys Val Val Pro Gly Val lie 1025 1030 1035Tyr Leu Leu Ser lie Pro Ser Met Tyr Leu Leu Leu lie Leu Tyr 1040 1045 1050Ser lie He Asn Leu Asn Asn Val Thr Trp Gly Thr Arg Glu Val 1055 1060 1065Glu Val LysLysThr LysLysGlu lie Glu Ala Glu LysLysGlu 1070 1075 1080Ala Glu Glu Ala LysLysArg Ala LysGln LysSer Leu Leu Gly 1085 1090 1095Phe Leu Gin Gly Val Asn Ser Asn Glu Glu Glu Gly Ser lie Glu 1100 1105 1110P^ie Ser Phe Ala Gly Leu Phe LysCys Leu Leu Cys Thr His Pro 1115 1120 1125LysGly Asn Glu Glu LysVal Gin Leu Leu His lie Ala Ser Thr1130 1135 1140Leu Asp LysPhe Glu LysLysLeu Glu Thr Val Glu Arg Ala Val 1145 1150 1155Asp Pro His Gly Leu His Arg Gly Arg LysLeu Ser Val Gly Pro 1160 1165 1170Arg Gly Ser Thr Asn Gly Asp His Gly Leu Asp Ala Leu Ala Glu 1175 1180 1185Gly Pro Asp Glu Glu Asn Asp Ser Asp Ser Asp Thr Asp Thr Leu 固1195 1200Ser Thr Glu Pro Arg Glu LysArg Asp Asp Leu He Asn Pro Tyr 1205 1210 1215Trp lie Glu Asp Pro Asp Leu LysLysGly Glu Val Asp Phe Leu 1220 1225 1230Ser Pro Ser Glu He His Phe Trp LysAsp Leu He Asp LysTyr 1235 1240 1245Leu Tyr Pro lie Asp Ala Asp LysGlu Glu Gin Ala Arg He Ser 1250 1255 1260LysAsp Leu LysGlu Leu Arg Asp Ser Ser Val Phe Ser Phe Phe 1265 1270 1275Met lie Asn Ala Leu Phe Val Leu lie Val Phe Leu Leu Gin Leu 1280 1285 1290Asn LysAsp Asn Leu His Val LysTrp Pro Phe Gly Val LysThr 1295 1300 1305Asn lie Thr Tyr Asp Glu Val Thr Gin Glu Val Leu lie Ser Lys 1310 1315 1320Glu Tyr Leu Gin Leu Glu Pro He Gly Leu Val Phe Val Phe Phe 1325 1330 1335Phe Ala Leu He Leu Val lie Gin Phe Thr Ala Met Leu Phe His 1340 1345 1350Arg Phe Gly Thr lie Ser His lie Leu Ser Ser Thr Glu Leu Asn1355 360 1365Trp Phe Cys Thr LysLysSer Asp Asp Leu Ser Gin Asp Ala Leu 1370 1375 1380Leu Asp LysAsn Ala lie Ala lie Val LysAsp Leu Gin LysLeu 1385 1390 1395Asn Gly Leu Asp Asp Asp Tyr Asp Asn Asp Ser Gly Ser Gly Pro 1400 1405 1410His Asn Val Gly Arg Arg LysThr He His Asn Leu Glu LysAla 1415 1420 1425Arg Gin LysLysArg Asn lie Gly Thr Leu Asp Val Ala Phe Lys 1430 1435 1440LysArg Phe Phe Asn Met Asn Ala Asn Asp Gly Pro Gly Thr Pro 1445 1450 1455Val Leu Asn Arg LysMet Thr Leu Arg Arg Glu Thr Leu LysAla 1460 1465 1470Leu Glu Thr Arg Arg Asn Ser Val Met Ala Glu Arg Arg LysSer 1475 1480 1485Gin Met Gin Thr Leu Gly Ala Asn Asn Glu Tyr Gly Val Thr Gly 1490 1495 1500Met Leu Asn Asn Asn Leu Gly Val Val Pro Arg His Arg Pro Ser 1505 1510 1515Asn Ala Asn lie Ser Val LysAsp Val Phe Ala Glu Pro Asn Gly 1520 1525 1530Gly Gin Val Asn Arg Gly Tyr Glu Thr Thr Leu Gly Asp Asp Asp 1535 1540 1545Asp Thr Asn Ser Met Arg Leu Gin Pro Arg Pro Asn Gin Val Ser 1550 1555 1560 Phe Gin Gly Arg Phe 1565SEQ ID No:3 SEQ ID No:4 SEQ ID No:5 SEQ ID No:6 SEQ ID No:7 SEQIDNo:8 SEQIDNo:9 SEQIDNo:lO SEQIDNo:ll SEQIDNo:12 SEQIDNo:13 SEQIDNo:145'-CARGARACRAARGGRTGG5'-TTYTCCCAMMARCC5 ，-C AARYHACBGSNTTYDTYGTNTGG5，- GTCARARAACWNATCATYTC5 ，-AHDYNTGYGCB ACWATGTGG5'-GTCGCYTTTTGCAGCCARTG5 ， -GTCDC ARGTN ATGTAC ATG5，- ARATSARGARCADRTACA5 ，-TTCYKATGWTGGTGGGHGC5'-CCVAABGGCCAYTTNAHGTG (3'RACE inner) 5，- GCTGGACGCGCTGGCTGAA (3'RACE outer) 5，- ACGAGGCGAGGCATTACGTGCSEQIDNo:15 (5'RACE inner) SEQIDNo:16 (5'RACEouter);，-GGGAATAGCGAAAGCAGCCAAGAT ;，-GGG AACGCGTAACTGAACCCTTGSEQIDNo:17 (基因表達(dá)上游引物) SEQIDNo:18 (基因表達(dá)下游引物)，-CGCCGGTCTATTC AAGTGTCTGTT ，-TACGGGCCTGCTCCTCCTTATCA
權(quán)利要求
1、一種茶尺蠖幾丁質(zhì)合成酶基因chsA，其特征是具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
2、 如權(quán)利要求l所述的基因chsA編碼的蛋白質(zhì)，其特征是具有SEQ ID NO: 2所示的氨 基酸序列。
3、 如權(quán)利要求l所述的基因chsA的用途，其特征是利用該基因物調(diào)節(jié)鱗翅目害蟲內(nèi)源 chsA活性，增加鱗翅目害蟲對農(nóng)藥的敏感性。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因chsA的用途，其特征是所述鱗翅目害蟲為茶尺蠖。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因chsA的用途，其特征是將根據(jù)SEQIDNo: l所示的核苷 酸序列設(shè)計的chsA-siRNA注射入茶尺蠖體內(nèi)，使內(nèi)源chsA表達(dá)下調(diào)，抑制茶尺蠖生長發(fā)育， 從而增加其對農(nóng)藥的敏感性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種茶尺蠖幾丁質(zhì)合成酶基因chsA，其具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了上述基因chsA編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了上述基因chsA的用途利用該基因物調(diào)節(jié)鱗翅目害蟲內(nèi)源chsA活性，增加鱗翅目害蟲對農(nóng)藥的敏感性。
文檔編號C12N15/52GK101215570SQ20081005915
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月14日
發(fā)明者晨 林, 梁月榮, 董俊杰, 董占波, 鄭新強, 陸建良 申請人:浙江大學(xué)