專利名稱：一種節(jié)旋藍細菌質(zhì)粒的分離與純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于節(jié)旋藍細菌分離與純化的技術 背景技術節(jié)旋藍細菌Urt/wMp('raqya"oto戰(zhàn)n'a)是一種由多個細胞串連成絲狀不分枝、呈規(guī)則螺線 形、光合放氧、古老的原核微生物，不僅是開展物種起源與演化、形態(tài)建成、光合作用、抗 逆機制等重大生物學課題研究的理想材料，而且因其生長快、培殖設施簡便、生產(chǎn)成本低、 食用安全、富含蛋白質(zhì)和多糖等多種營養(yǎng)與生物活性物質(zhì)而在全球得以大規(guī)模開發(fā)利用。與 生理生化、培殖生產(chǎn)技術、營養(yǎng)保健、藥理學等相比，有關節(jié)旋藍細菌的分子遺傳學方面的 研究相對不足，嚴重影響著當前節(jié)旋藍細菌的深入研究與開發(fā)利用。DNA是生物的遺傳物質(zhì)，研究并揭示DNA的遺傳信息，以及結(jié)構(gòu)與功能關系等對全面推進節(jié)旋藍細菌的基礎研究與 開發(fā)應用具有重要意義。與其它生物一樣，節(jié)旋藍細菌中除有基因組DNA外，還有一些被稱 作質(zhì)粒的小分子DNA，它們呈環(huán)狀或線狀，不僅擔負著重要的生物學功能，而且也是構(gòu)建轉(zhuǎn) 基因載體的理想元件。建立質(zhì)粒高效、高質(zhì)量的分離與純化方法，是開展其序列、結(jié)構(gòu)、功能、轉(zhuǎn)基因載體構(gòu) 建等后續(xù)研發(fā)的基礎。秦松等(海洋與湖沼，1994， 25(5): 560-563)、 Lee等(Plant Sci， 1995， 106: 99~105)、 Kojima等(Chin J Oceanol Limnol， 1998， 16: 30~39)對藍細菌中質(zhì)粒的分 離純化及特性等作了一些研究，但由于節(jié)旋藍細菌的蛋白質(zhì)和多糖含量高，用SDS法或CTAB 法等常規(guī)提取方法均難以獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒，國內(nèi)外尚未見有關解決這一難題的報道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術的問題建立一種簡便、高效分離與純化高質(zhì)量節(jié)旋藍細菌質(zhì) 粒的方法。本發(fā)明是在CTAB提取液和第一次沉淀后的DNA溶解液即TE緩沖液中加入適量的蛋白 酶K;進而利用凝膠凍融-高速離心法，對質(zhì)粒作進一步的高效富集與純化，以此獲得高質(zhì)量、 結(jié)構(gòu)完整的節(jié)旋藍細菌質(zhì)粒。我們利用常規(guī)的CTAB法和SDS法分別提取節(jié)旋藍細菌品系Ap-2mz的總DNA并經(jīng)電 泳分析發(fā)現(xiàn)，用兩種方法都能提得清晰的基因組DNA，但用SDS法提不到質(zhì)粒，而用CTAB 法只能提到隱約可見、模糊的質(zhì)粒，也不能滿足進一步研究所需(圖l)。在此基礎上，我們 將CTAB法與酶法有機結(jié)合，首次建立了節(jié)旋藍細菌DNA提取的CTAB-蛋白酶K法，在電泳圖上不僅能看到清晰的基因組DNA，而且還有一條清晰、分子量約0.75kb的質(zhì)粒帶(圖1)。 通過VersaDoc Imaging System 3000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad, USA)的Quantity One軟件分 析表明，在節(jié)旋藍細菌裂解液CTAB及第一次沉淀后的DNA溶解液中加入適量的蛋白酶K， 可將質(zhì)粒的提取率提高近3倍，從而電泳條帶清晰、能滿足后續(xù)研究現(xiàn)需。同時，為滿足節(jié)旋藍細菌質(zhì)粒的測序、結(jié)構(gòu)與功能等后續(xù)研究需要，有必要對其作進一 步富集與純化。我們試用了一些常用的純化與回收試劑盒，但純度和回收率等均不理想。經(jīng) 反復試驗與改進，我們建立了一種將凝膠凍融與高速離心等技術相結(jié)合的方法，即凝膠凍融-高速離心純化法。用此法純化的質(zhì)粒(圖1)，電泳條帶的單一，說明純度高；形狀與位置 不發(fā)生變化，說明分子結(jié)構(gòu)完整；用凝膠成像系統(tǒng)對純化前后質(zhì)粒電泳條帶作檢測分析表明， 回收效率高達90%以上。本發(fā)明的顯著優(yōu)點本發(fā)明所建立的節(jié)旋藍細菌質(zhì)粒分離與純化方法與常規(guī)方法相比，具有操作簡便、得率 高、質(zhì)量好、結(jié)構(gòu)完整等特點。


圖1為利用不同提取方法提得節(jié)旋藍細菌品系Ap-2mz總DNA的電泳圖，其中M為標 準分子量1表示CTAB-蛋白酶K法；2表示CTAB法；3表示SDS法；圖2為從節(jié)旋藍細菌品系Ap-2mz中純化的質(zhì)粒的電泳圖；其中M為標準分子量l表 示純化的質(zhì)粒；圖3為利用CTAB-蛋白酶K法從被試節(jié)旋藍細菌品系Ap-JS10m中提取的總DNA和純 化的質(zhì)粒的電泳圖，其中M為標準分子量1表示總DNA; 2表示純化的質(zhì)粒。
具體實施方式
本發(fā)明的詳細技術方案可以通過以下步驟實施1、 選用材料為公知的節(jié)旋藍細菌品系Ap-2mz、 Ap-JS10m (浙江大學原子核農(nóng)業(yè)科學 研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存)。2、 試劑和儀器瓊脂糖、CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)、SDS (十二垸基磺酸鈉)、微孔離心柱 (SK131/132柱)為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；蛋白酶K為Merck公司產(chǎn)品；RNaseA均 為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；其它試劑均為分析純。凝膠電泳分析系統(tǒng)為美國Amersham公司 產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。3、 節(jié)旋藍細菌質(zhì)粒的分離提取(1)取約250 mg新鮮藻泥或冰凍保存的藻泥(或冰凍保存的干燥藻粉約15 mg)于滅 菌的5ml離心管中，先用液氮對樣品凍融處理3 5次后，加入2ml預熱至65'C的CTAB提取液[2。/oCTAB， 50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) ， 10 mmol/L EDTA， 0.7 mol/L NaCl， 1% (V/V) i8-巰基乙醇(使用前加入)]，并加入適量的蛋白酶K溶液至終濃度300 ng/ml;再將樣 品顛倒混合均勻，于62'C水浴lh，期間每隔10min左右將樣品輕輕搖勻一次。(2) 室溫下10,000 rpm離心5 min除去細胞碎片等雜質(zhì)，上清液加入等體積氯仿/異戊 醇(24 : 1)，輕輕反復顛倒混勻后于12,000 rpm離心10min。(3) 取上清液于另一滅菌離心管中，加入3倍體積的-2(TC預冷無水乙醇及1/10體積的 3mol/LNaAc (pH4.8)，輕輕顛倒數(shù)次后于-20。C下放置1 h,使DNA充分沉淀。(4) 12,000 rpm離心10 min。第一次沉淀后DNA用70%的乙醇洗漆，真空抽干，溶于 500 ^ TE-蛋白酶K緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L EDTA，加入蛋白酶K至終濃度 200pg/ml， pH 8.0)，于50'C水浴1 h并不時輕輕搖動，直至溶液澄清。(5) 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)，輕輕顛倒混勻，12,000 rpm離心10min。(6) 取上清液，加入1/10體積的3 mol/LNaAc和3倍體積-20。C預冷的無水乙醇，于-20 。C放置1 h。(7) 12,000 rpm 4。C離心10 min，第二次沉淀后DNA用70%的乙醇洗滌2次，真空抽 干，加入100plTE-RNase緩沖液(10腿ol/LTris-HCl， lmmol/LEDTA， 50 ng/ml RNase， pH8.0)，在37。C水浴中保溫30min，使DNA溶解。4、 電泳分析和觀察將提得的DNA在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，電壓4 V/cm。爾后用EB染色約30 min，再 在VersaDoc Imaging System 3000凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad， USA)觀察并照相。5、 節(jié)旋藍細菌質(zhì)粒的純化法(1) 在紫外燈長波段割下質(zhì)粒所在的瓊脂糖凝膠塊，放入滅菌離心管中，約加膠塊體積 1倍的TE緩沖液，-20。C冷凍60 min。(2) 取出冷凍的離心管，待膠融化后，將膠與溶液一起轉(zhuǎn)移至鋪有一層滅菌脫脂棉(或 玻璃棉)的微孔離心柱中，13,000rpm離心15min，質(zhì)粒即在離心管中收集到的溶液中。(3) 在回收液中加入等體積酚/氯仿/異戊醇，混勻后于室溫下12,000 rpm離心5 min。(4) 取上清，加入0.1倍體積3 mol/LNaAc及2.5倍體積預冷無水乙醇，-201:放置30 min， 12,000 rpm離心10 min，沉淀用70%的乙醇洗滌2次，真空抽干，加入20 ul雙蒸水溶 解，于-2(TC保存。(5) 電泳分析和觀察。方法同4中所述。結(jié)果與分析研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)的CTAB法和SDS法雖然可提得清晰的節(jié)旋藍細菌的基因組DNA，但 都不能提得高質(zhì)量的質(zhì)粒(圖1)。我們根據(jù)CTAB法略優(yōu)于SDS法，并將其與酶法相結(jié)合， 首次建立了節(jié)旋藍細菌DNA提取的CTAB-蛋白酶K法，即在節(jié)旋藍細菌裂解液CTAB及第 一次沉淀后的DNA溶解液中加入適量的蛋白酶K，則可在提得高質(zhì)量基因組DNA的同時， 獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒(圖l)。該方法的關鍵要點在于利用蛋白酶K酶解節(jié)旋藍細菌中大量的 蛋白質(zhì)，從而使DNA與蛋白質(zhì)解離并被分離。同時，我們所建立節(jié)旋藍細菌質(zhì)粒的凝膠凍 融-高速離心純化法，所得質(zhì)粒的純度與回收率高、結(jié)構(gòu)完整(圖2)。作為實例，我們選取了節(jié)旋藍細菌品系Ap-JS10m來驗證本發(fā)明的實用性。利用CTAB-蛋白酶K法提取其總DNA并作電泳分析，如附圖3所示，利用所建方法可提得清晰、高質(zhì) 量的基因組DNA和一條分子量約為1300 bp的質(zhì)粒。進一步用所建的凝膠凍融-高速離心純 化法，得到了條帶單一、清晰的質(zhì)粒。此外，從研究結(jié)果可知，不同品系間節(jié)旋藍細菌的質(zhì) 粒不盡相同，這也體現(xiàn)了其生物多樣性及研究的必要性。
權(quán)利要求
1、一種節(jié)旋藍細菌質(zhì)粒的分離與純化方法，其特征是在CTAB提取液和第一次沉淀后的DNA溶解液即TE緩沖液中加入適量的蛋白酶K；進而利用凝膠凍融-高速離心法，對質(zhì)粒作進一步的高效富集與純化，以此獲得高質(zhì)量、結(jié)構(gòu)完整的節(jié)旋藍細菌質(zhì)粒。
2、 按權(quán)利要求1所述節(jié)旋藍細菌質(zhì)粒的分離與純化方法，其特征是采用下列操作步驟(1) 選用材料為公知的節(jié)旋藍細菌品系Ap-2mz、 Ap-JS10m;(2) 試劑和儀器瓊脂糖、CTAB即十六垸基三甲基溴化銨、SDS即十二垸基磺酸鈉、微孔 離心柱即SK131/132柱為上海生工生物工程公司產(chǎn)品，蛋白酶K為Merck公司產(chǎn)品，RNase A均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品，其它試劑均為分析純，凝膠電泳分析系統(tǒng)為美國Amersham 公司產(chǎn)品，凝膠成像分析系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；(3) 節(jié)旋藍細菌質(zhì)粒的分離提取取約250 mg新鮮藻泥或冰凍保存的藻泥或冰凍保存的干燥藻粉約15 mg于滅菌的5 ml 離心管中，先用液氮對樣品凍融處理3 5次后，加入2ml預熱至65'C的CTAB提取液包括 2%CTAB， pH8.0的50mmol/LTris-HCl， 10 mmol/L EDTA， 0.7 mol/LNaCl， 1% (V/V)》 -巰基乙醇于使用前加入，并加入適量的蛋白酶K溶液至終濃度300 pg/ml，再將樣品顛倒混 合均勻，于62。C水浴1 h，期間每隔10 min左右將樣品輕輕搖勻一次；室溫下10,000 rpm離 心5min除去細胞碎片等雜質(zhì)，上清液加入等體積氯仿/異戊醇(24 : 1)，輕輕反復顛倒混勻 后于12,000 rpm離心10 min;取上清液于另一滅菌離心管中，加入3倍體積的-2(TC預冷無水 乙醇及1/10體積的pH 4.8的3 mol/LNaAc輕輕顛倒數(shù)次后于-2(TC下放置1 h，使DNA充分 沉淀；12,000 rpm離心10 min。第一次沉淀后DNA用70%的乙醇洗滌，真空抽干，溶于500 Hl TE-蛋白酶K緩沖液即10 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L EDTA，加入蛋白酶K至終濃度200 pg/ml， pH8.0，于50'C水浴1 h并不時輕輕搖動，直至溶液澄清；加入等體積的酚/氯仿/異 戊醇25 : 24 : 1，輕輕顛倒混勻，12,000 rpm離心10min;取上清液，加入1/10體積的3 mol/L NaAc和3倍體積-20。C預冷的無水乙醇，于-20。C放置1 h; 12,000 rpm4。C離心10 min，第二 次沉淀后DNA用70%的乙醇洗滌2次，真空抽干，加入100 pl TE-RNase緩沖液即10 mmol/L Tris-HCl， lmmol/LEDTA， 50嗎/ml RNase， pH 8.0，在37。C水浴中保溫30 min，使DNA 溶解；(4) 電泳分析和觀察將提得的DNA在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，電壓4V/cm。爾后用EB染色約30 min，再在VersaDoc Imaging System 3000凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad, USA)觀察并照相； (5)利用凝膠凍融-高速離心法純化節(jié)旋藍細菌的質(zhì)粒在紫外燈長波段割下質(zhì)粒所在的瓊脂糖凝膠塊，放入滅菌離心管中，約加膠塊體積l倍 的TE緩沖液，-20^冷凍601!1;取出冷凍的離心管，待膠融化后，將膠與溶液一起轉(zhuǎn)移至 鋪有一層滅菌脫脂棉或玻璃棉的微孔離心柱中，13,000 rpm離心15 min，質(zhì)粒即在離心管中 收集到的溶液中；在回收液中加入等體積酚/氯仿/異戊醇，混勻后于室溫下12,000 rpm離心5 min;取上清，加入0.1倍體積3 mol/L NaAc及2.5倍體積預冷無水乙醇，-20°。放置30 min， 12,000rpm離心lOmin,沉淀用70%的乙醇洗滌2次，真空抽干，加入20 ul雙蒸水溶解， 于-2(TC保存；按(4)所述方法進行電泳分析和觀察。
全文摘要
一種分離與純化節(jié)旋藍細菌質(zhì)粒的方法。常規(guī)的CTAB法或SDS法雖均能提取出清晰的基因組DNA，但用SDS法提不到質(zhì)粒，用CTAB法也只能提到隱約可見、模糊的質(zhì)粒，不能滿足研究需要。本發(fā)明的CTAB-蛋白酶K法，即在CTAB提取液及第一次沉淀后的DNA溶解液中加入適量的蛋白酶K，不僅能提得清晰的基因組DNA，而且還能得到清晰的質(zhì)粒；進一步用本發(fā)明的凝膠凍融-高速離心純化法，即將質(zhì)粒所在的凝膠帶切入滅菌離心管中，加入約與膠塊等體積的TE緩沖液并于-20℃冷凍60min后取出并融化，轉(zhuǎn)至鋪有滅菌脫脂棉或玻璃棉的微孔離心柱中13,000rpm離心15min，質(zhì)粒即在離心管底部的溶液中，能得到高質(zhì)量、完整的質(zhì)粒。
文檔編號C12N15/10GK101215559SQ20081005908
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月9日
發(fā)明者徐步進, 曹學成, 楊靈勇, 汪志平, 潘劍用 申請人:浙江大學