專利名稱：鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素(PEB)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。根據(jù)其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin,簡稱CPE)、藻紅藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍(lán)蛋白(all叩hycocyanin，簡稱APC)。藻紅蛋白、藻紅藍(lán)蛋白、藻藍(lán)蛋白和變藻藍(lán)蛋白含alpha(a )禾B beta ( e )亞基，每個(gè)亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價(jià)結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得藻紅蛋白主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約580nin的熒光；藻紅藍(lán)蛋白吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；藻藍(lán)蛋白吸收約620 的可見光，發(fā)射約640mn的熒光；變藻藍(lán)蛋白吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。藻紅蛋白結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB);藻紅藍(lán)蛋白的alpha亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB);藻紅藍(lán)蛋白的beta亞基結(jié)合的輔基色素為藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB);藻藍(lán)蛋白和變藻藍(lán)蛋白結(jié)合的輔基色素都為藻藍(lán)膽素PCB。
鏈霉親和素可以跟生物素特異結(jié)合，通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)信號放大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)檢測和醫(yī)療檢測等領(lǐng)域。目前主要是通過化學(xué)交聯(lián)實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對目標(biāo)的標(biāo)記。
在/!/7atee/ a sp. PCC7120中a^W〃基因和5y"ec/ oc;^tis sp. PCC 6803中sJ/^。必基因分別編碼beta裂合酶，在其它藍(lán)藻中也存在同源的beta裂合酶。這些beta裂合酶能催化藻藍(lán)膽素與別藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白及其同源蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，從而生成具有優(yōu)良熒光性質(zhì)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)，beta裂合酶還能催化藻紅膽素(PEB)與別藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白及其同源蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，生成新型的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。藻紅膽素 PEB 可由 HOI 、 PebA 、 PebB 協(xié)同催化生成(Alvey, R. M., Karty， J"丄etc. Lesions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis inFremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and PigmentBiosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10)， 2448-2463 (2003))。通過基因工程技術(shù)，把鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白基因拼接，可以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)得到鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的連接，而不需要通過化學(xué)交聯(lián)等方法來實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素標(biāo)記。
藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，通過直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的連接，可用于生物學(xué)檢測以及醫(yī)療檢測領(lǐng)域。本發(fā)明為別藻藍(lán)蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料應(yīng)用于醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域，特別是檢測領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素(PEB)的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，它是應(yīng)用beta裂合酶催化藻紅膽素與鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，從而制備鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；將含有beta裂合酶基因、鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白拼接的基因、藻紅膽素生物合成酶基因的表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入宿主菌，得到相應(yīng)的工程菌，通過這種方法得到的基因工程菌生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的 一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于包括下述步驟
(1) 用基因工程的方法，將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到beta
裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 用基因工程的方法，將鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和peZ^或其同源基因克隆于第三個(gè)表達(dá)載體中，得到力o7和peZ^表達(dá)質(zhì)粒；
(4) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆于第四個(gè)表達(dá)載體中，得到peW表達(dá)質(zhì)粒；
(5) 將beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、Z o7和peZ^表達(dá)質(zhì)粒及/^M表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
上述鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法中，所述的宿主菌為大腸桿菌；所述的beta裂合酶基因是指與力朋力ae"a sp. PCC7120中a7/^《77基因或5)77ec/ ocyWA sp. PCC 6803中W/^似^基因同源的基因；所述的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是指與力"a/bae/7a sp. PCC7120或6>/7ec/ ocj^^^ sp, PCC 6803中別藻藍(lán)蛋白基因同源的基因。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，大腸桿菌繁殖快，可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細(xì)胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；
3、 通過大腸桿菌生產(chǎn)，目標(biāo)蛋白含量高，有His-tag標(biāo)記，且體系中幾乎沒有性質(zhì)類似的蛋白，提取方便；
4、 生成結(jié)合PEB的新型別藻藍(lán)蛋白，具有與天然別藻藍(lán)蛋白不同的光譜特性，為發(fā)展熒光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料提供更多選擇。
5、 產(chǎn)物中鏈霉親和素與熒光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)直接結(jié)合，不需額外進(jìn)行處理，有利于發(fā)展熒光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)在檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。


圖l為本發(fā)明制備的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)ApcA的吸收
與熒光光譜；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜；
圖2為本發(fā)明制備的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)ApcA2的吸收與熒光光譜；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜；
圖3為本發(fā)明制備鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)ApcB的吸收與熒光光譜；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜；
圖4為本發(fā)明制備鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)ApcD的吸收與
熒光光譜；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜；
圖5為本發(fā)明制備鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)ApcF的吸收與
熒光光譜；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜；
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1
(1 )從GeneBank中可以査到，藻種力朋6ae"a sp. PCC7120和分/ ec力ocj^"^sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成。力朋6朋朋sp.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019 ，5>"ec/wcy"j's sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022,可從全序列中找到所需基因；&7"/ n>sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679,可從所查到序列中找到所需基因(/ e似和peM)。通過基因工程方法，將/l朋tee朋sp. PCC7120中的a7/t W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-a^^W7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2)將」朋6ae朋sp.PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因apd和鏈霉親和素基因(簡稱sa)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sa-邵c/1,鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白A。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和pe65)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-; e似，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵"在pET30中是在fcoRV和i7 o1兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素基因幼在f/wl和《^n兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因aZrt 《77在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Wofe I和J7wl ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶/ e似和/ e力必，力o7和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和尸W I之間，； eM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和J力o I之間，在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和i7 o1之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-aZrOW;; pET30-sa^a; d、 pCDFDuet-ho1-pebB和pACYCDuet-pebA轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-[3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A。其吸收與熒光光譜見圖1中所示；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)過夜；取100pL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0. 3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心l分鐘(10000g， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體,離心30秒(10000g，4'C)去上清，菌體沉淀用100pL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰上，加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42。C熱休克90秒，冰浴5分鐘后加入300pL LB培養(yǎng)基，37。C低速振蕩培養(yǎng)45分鐘，無菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37 °C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。
提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；分 別從中取lOOpL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中；37。C振蕩培養(yǎng)至OD,-O. 5-0. 7時(shí)， 冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；避光、20°C、 150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約12小時(shí)。離心收集 細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行大量 表達(dá)。
實(shí)施例2
(1 )從GeneBank中可以査至U，藻禾中/J/ aZ^e/M sp. PCC7120禾口 6y/7ec力ocys"s sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成；^ ate朋a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019 ， S>77ec/ ocy"is sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022,可從全序列中找到所需基 因；CsJ"/ n>sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679, 可從所查到序列中找到所需基因(peM和peZw )。通過基因工程方法，將,4"sfee"a sp. PCC7120 中的alrt ^^基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-aZrt W7,在 大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將/(/2a6se/7a sp. PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因鄰wA和鏈霉親和素基 因(簡稱ss)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-s『apcA,鏈霉 親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和 別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白A2。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力W-;^M，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因apc^在pET30中是在fcoRV和i7w I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因幼在J/v I和5^1I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因alrt 《77在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是We I和J7w I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶peZ^和pe65)， 力W和peZ 5在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力W在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和&t I之間，peM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)7Vyel和i7 o1之間，peZ^在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5《/11和 T力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-alrt^77、 pET30-sa^邵cA、 pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A2;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A2。其吸收與熒 光光譜見圖2中所示；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例3
(1 )從GeneBank中可以査到，藻種力/ 3力ae/ a sp. PCC7120和5"/z7ec力oc/sf/ssp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成；/ly atee朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019 ， 5"/加c力ocj^"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022,可從全序列中找到所需基 因；Ca7"力r&sp.PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679， 可從所査到序列中找到所需基因(peM和peM)。通過基因工程方法，將^a&e朋sp. PCC7120 中的WrOW7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-aJz^W7,在 大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將七a6朋77a sp.PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵c5和鏈霉親和素基 因(簡稱幼)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sa-邵cA鏈霉 親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和 別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(戶eM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe似，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。即脫輔基蛋白基因邵c5在pET30中是在^boRV和i7 o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因sa在^ /j I和^711兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a^Y W7在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Afafe I和J力o I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o/、 pe/M和/7eZ^)， 力o/和pe/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和尸st I之間，peZ^ 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)We I和I之間，； e似在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5g7II和 i7wl之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-alrW7八pET30-sa-邵c仏pCDFDuet-hol-pebB和pACYCDuet-pebA轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2CTC至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B。其吸收與熒 光光譜見圖3所示；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例4
(1 )從GeneBank中可以査到，藻種A3a6ae/7a sp. PCC7120和5>/7ec/ oc_^fys sp. PCC 6803 的全序列己經(jīng)測定完成；力朋力ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5)77ec力ocj^"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基 因；Ca7"/^izsp.PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679， 可從所査到序列中找到所需基因。e/^和peM)。通過基因工程方法，將^7a力3e朋sp. PCC7120 中的aJrtf^ 7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-a7i^^ 7，在 大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2)將^7a&e/7a sp.PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因apc/ 和鏈霉親和素基 因(簡稱sa)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-stapcA鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和 別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白D。 鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/ o7-;;eZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因spc"在pET30中是在feoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因ss在化/; I和^JII兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因aJ7^W7在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是y^/e I和Z力o I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o入和； eZ^)， 力o7和/ eZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o/在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和尸st I之間，/)e力A 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)Mfe I和/力o I之間，pe似在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)3^11和 勘I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-aZrt & 7、 pET30-sa-邵c從pCDFDuet-ho1-pebB和pACYCDuet-pebA轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代_|3-0-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside'簡稱IPTG)至終濃度為lmraol/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Nr親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D。其吸收與熒 光光譜見圖4所示；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例5
(U從GeneBank中可以查到，藻種力朋6ae"a sp. PCC7120和分/ ec/ ocys"5 sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成。^s&e朋sp.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 6>/7ec/ oc_r"j\ sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基 因；CaA^力rjisp.PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679, 可從所査到序列中找到所需基因(pe^和pe幼)。通過基因工程方法，將^a力a朋a sp. PCC7120中的a7r^《77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-aZrt 677，在 大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將勘W朋朋sp.PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵c,和鏈霉親和素基 因(簡稱sa)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sa^a/ c尸，鏈霉 親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和 別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白F。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(Zw7和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o卜pe/^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe/W，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c尸在pET30中是在y5boRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因sa在y^/ I和《WII兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因aZrt W7在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是AW I和J力o I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶/ e/^和/ e力5), 力o7和； eM在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和/^t I之間，peM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWeI和之間，pe似在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5^11和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收，所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-a2/^W7、 pET30--apc,、 pCDFDuet-ho1-pebB和pACYCDuet-pebA轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0仏。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F，離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F。其吸收與熒 光光譜見圖5所示；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例6
(1 )從GeneBank中可以查到，藻種A a6ae朋sp. PCC7120和6y/7ec力oc7"is sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成，^33力朋"a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019 ， 5y/7ec力ocy"/s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022,可從全序列中找到所需基 因；6^o&rixsp.PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679， 可從所査到序列中找到所需基因(peW和； e/^)。通過基因工程方法，將6y/7ec力ocy"issp. PCC 6803中的WriY 必基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-sJ/^ W，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段；通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^7a6ae朋sp.PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵M和鏈霉親和素基 因(簡稱M)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-鏈霉 親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和 別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白A。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(Zw7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c力在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因sa在《p/71和5^711兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因sZriY^9在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是AWeI和; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o入和pe6i9)， 力o7和； eZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力W在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和戶"I之間， 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)We I和i7 o I之間，pe似在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^ 7II和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet- slri^必、pET30-sa -apcA pCDFDuet-ho1-pebB禾卩pACYCDuet-pebA轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0
的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0Ds。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-卩-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例7
(1 )從GeneBank中可以查到，藻種/!"sAae朋sp. PCC7120和5y/ ec力ocy"/s sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成，」朋6ae朋sp.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019 ， 6y/ ec/wcj^z^^ sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基 因；CaJ"Arjisp.PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679， 可從所査到序列中找到所需基因(pe^和/ eZ^)。通過基因工程方法，將5y/7ec力ocys"ssp. PCC 6803中的sZri^必基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-Wr^似ft在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，禾擁相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段；通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^7a6se/7s印.PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因鄰xA和鏈霉親和素基 因(簡稱sa)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sa"邵cA,鏈霉 親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和 別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白A2。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ W和pe^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe力A在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵cA在pET30中是在fcoRV和兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因sa在1和^^1I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因W/^似9在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是AWe I和J力o I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o人pe似和pe力5)， 力o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力W在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和尸W I之間，peM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)7VWe I和J力o I之間，pe/^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《g7II和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet- WriY^久pET30-ss-a; cA、 pCDFDuet-ho1-pebB和pACYCDuet-pebA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-卩-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37'C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A2;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A2。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例8
(1 )從GeneBank中可以查到；藻種/!朋6朋朋sp. PCC7120和5y/ ec/wcys"'s sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成；^/ aZ ae/ s sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019 ， 5)7 ec/ oc;^"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基 因；(^Z"/ n';f sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679， 可從所査到序列中找到所需基因(/ eW和peM)。通過基因工程方法，將5y"ec力ocy"is sp. PCC 6803中的s7ri^必基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-sZr^似9，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段；通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^朋6ae朋sp.PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因apc^和鏈霉親和素基 因(簡稱M)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-s『a; cA鏈霉 親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和 別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-;5eZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ e力A在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵"在pET30中是在fcoRV和i7w I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素基因sa在,/^I和5^II兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因Wri"似9在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是AWeI和; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o7、 pe^和peZ^)， 力o/和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和尸W I之間，/ eZ^ 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)7fefe I和J力o I之間，在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5^711和 i7 o1之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet- slriW必、pET30--pCDFDuet-ho1-pebB禾B pACYCDuet-pebA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例9
(1 )從GeneBank中可以查到，藻種力朋6ae/7a sp. PCC7120和5y/ ec力oc/"j's sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成；^a6ae朋sp.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019 ， 6y/7ec力oc/"is sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022,可從全序列中找到所需基 因；CaA^/ ri;srsp.PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679, 可從所査到序列中找到所需基因。eM和/ e/^)。通過基因工程方法，將5y/ ec/ ocy"Asp. PCC 6803中的sZri"似9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-si/^似《在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段；通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2)將力/7^朋朋sp.PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因apc"和鏈霉親和素基 因(簡稱幼)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-s纊邵c"，鏈霉 親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和 別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白D。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c"在pET30中是在化oRV和J/wI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因^在I和^71I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因W/^似^在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是7Vfafe I和i7w I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶peM和pe力幼， 力o7和/ eZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)I和尸W I之間，/ e65 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)/fete I和Wo I之間，； eW在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《《711和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet- WriV^久pET30-sa -邵c從pCDFDuet-hol-pebB禾tl pACYCDuet-pebA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-卩-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N;T親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例10
(l)從GeneBank中可以查歪lj，藻種勘a&je朋sp. PCC7120和分"ec/ 0c7"is sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成；sp.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019 ， 6>/ ec/ oc7"is sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022,可從全序列中找到所需基 因；CaA^/ n>sp.PCC7601己經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679， 可從所査到序列中找到所需基因(/^^和peM)。通過基因工程方法，將5y/7ec/ ocy"issp. PCC 6803中的W/^似9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-Wri%^，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將力朋6ae朋sp.PCC7120中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵c,和鏈霉親和素基 因(簡稱幼)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sta々c尸，鏈霉 親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和 別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白F。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ eM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe力A在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵C在pET30中是在i5boRV和i7 o1兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因sa在I和^^1I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因WriY 必在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Afefe I和i7w I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶peZ^和pe65)， 力o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和尸W I之間，peM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yVofe I和i7 o I之間，/ e/W在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《gill禾口 Z/wI之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet- W/^似P、 pET30-ss -邵C、 pCDFDuet-hol-pebB禾B pACYCDuet-pebA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D印。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-卩-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例11
(1 )從GeneBank中可以查到，藻種^朋6ae朋sp. PCC7120和5y/ ec/ oc/s"s sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成。力朋6ae朋sp.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019 ，5y"ec/ ocj^^'s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基 因；^A t力r^sp.PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679， 可從所查到序列中找到所需基因(peM和p^5)。通過基因工程方法，將j/73力ae773sp. PCC7120 中的s7r^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-aZr郎77，在 大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將Synechocystis sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵"和鏈霉親 和素基因(簡稱克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-幼-apcA 鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和 素和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白A。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和/ eZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe/W，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c力在pET30中是在fcoRV和兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因幼在A>/71和^^1I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因W/^W7在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Wc/e I和i7w I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o7、 peM和peZ 5)， Zw7和pe65在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和尸"I之間，peM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)I和i7w I之間，pe/W在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《§711和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-alrt^77、 pET30-sa"a; cA pCDFDuet-ho1-pebB和pACYCDuet-pebA轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D明。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例12
(1 )從GeneBank中可以查到，藻種^朋6ae朋sp. PCC7120和5>y7ec/wc>^z^ sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成；^/7a力ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5y/7ec/wcys"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基 因；C^ot力ri義sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679， 可從所查到序列中找到所需基因(pe^和peZ^)。通過基因工程方法，將A7aAge/73 sp. PCC7120 中的aZrt 《/7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-aZr?！?7，在 大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將Synechocystis sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵c萬和鏈霉親 和素基因(簡稱克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sa -鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和 素和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和pe力5)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/w7-/ eZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c5在pET30中是在fcoRV和兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因sa在1和^^1I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因sZrt W7在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是yVofe I和J力o I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o人pe^和pe力5)， Z o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，Z o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)；Vco I和尸"I之間，peM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yVote I和屈o I之間，peM在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5^11和 Wol之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-alrt W7、 pET30-sa-鄰c厭pCDFDuet-ho1-pebB和pACYCDuet-pebA轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l誦ol/L， 2(TC至37'C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例13
(1 )從GeneBank中可以査到，藻種^ a力朋/ a sp. PCC7120和■Sy/jec/wc/Wis sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成；^朋te朋a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5y/ ec/ oc7"A sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基 因；"7"力ryjrsp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679， 可從所查到序列中找到所需基因(pe^和peM)。通過基因工程方法，將^7a6ae朋sp. PCC7120 中的aZrt^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-3Zrt W7，在 大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將Synechocystis sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因即c"和鏈霉親 和素基因(簡稱sa)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-s『apcZ ， 鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和 素和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白D。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和/7e6幼克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c"在pET30中是在fcoRV和i7w I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因sa在1和i^7II兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因aZrt W7在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是M/e I和iZw I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶peM和peZ^)， 力o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)/Vbo I和,W I之間，peM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yVA I和i7w I之間，pe似在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5《711和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-aZrW77、 pET30-sa-apcZ 、 pCDFDuet-ho1-pebB和pACYCDuet-pebA轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至OD,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例14
(1 )從GeneBank中可以查到，藻種力/ja力ae"3 sp. PCC7120和5>77ec/wc;^"\ssp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成。印.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019 ， 5y/ ec力oc/Wis sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基 因；Ca7"力7^ysp.PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679, 可從所查到序列中找到所需基因(pe/^和peM)。通過基因工程方法，將力朋力ae朋sp. PCC7120 中的37/^W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-Wj^W7,在 大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將Synechocystis sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因apc尸和鏈霉親 和素基因(簡稱sa)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sa~apcF， 鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和 素和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白F。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-; eM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe/W，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵cF在pET30中是在fcoRV和i%o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因sa在A^ I和《^n兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a^Y W7在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是AWeI和; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o入/ eW和peZ i9)， 力o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)7feo I禾Q尸st I之間，peM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yVofe I和J力o I之間，pe/W在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)7%"711和 X/wI之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收，所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-aZrW77、 pET30-sa-邵c尸、pCDFDuet-ho1-pebB和pACYCDuet-pebA轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至006。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20'C至37'C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F，離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例15
(1 )從GeneBank中可以査到，藻種J朋&3e朋sp. PCC7120和5y/7ec/ ocys"s sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成，^朋力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5y/7ec/ ocy"is sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基 因；6^ot/ r/;rsp.PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679， 可從所査到序列中找到所需基因(/ e^和peZ^)。通過基因工程方法，將5)77ec力ocy"issp. PCC 6803中的Wr^似^基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-Wr^似A在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段；通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2)將Synechocystis sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵d和鏈霉親 和素基因(簡稱sa)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sa^spcA鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和 素和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白A。 鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe力A在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵"在PET30中是在fcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因幼在,p/71和^71I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因sZr^似9在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是AWe I和Z力o I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o7、 和pe力5)，
力o/和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)I和/^t I之間，； eM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)嚴(yán)fe I和J/w I之間，在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5^11和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet- sZriW4久pET30-sa -a/ M、 pCDFDuet-ho1-pebB和pACYCDuet-pebA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-f5-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白A。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例16
(1 )從GeneBank中可以查到；藻種^朋tee朋sp. PCC7120和5y/ ec/ ocys"s sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成；^a&朋a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019 ， 6y/7ec/ ocy"A sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基 因；CaJo"r^sp. PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679， 可從所查到序列中找到所需基因(peW和pe/^)。通過基因工程方法，將6y"ec力ocj^"s sp. PCC 6803中的s7/^ 必基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-Wr^似^在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段；通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將Synechocystis sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因邵c萬和鏈霉親 和素基因(簡稱sa)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sa~s; c& 鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和 素和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-/7eW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因apc^在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因幼在和WWn兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因W/^似9在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是7We I和i7 o I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶和pe6S)， Z o7和/ eM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)yVco I禾卩尸W I之間，peM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)We I和i7 o I之間，pe^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5《711和 屈ol之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet— sZr^似久pET30-sa -a/ c仏pCDFDuet-hol-pebB禾B pACYCDuet-pebA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-{3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純 得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例17(1 )從GeneBank中可以査到，藻種^朋力ae朋sp. PCC7120和5>77ec/ ocj^z^ sp. PCC 6803 的全序列已經(jīng)測定完成；力/7atee/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019, 5y/7ec/wcy"/s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基 因；Ca7"力ri,sp.PCC7601已經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679， 可從所査到序列中找到所需基因(peM和peZ^)。通過基因工程方法，將5y/ ec力ocys"ssp. PCC 6803中的Wri，似9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-57ri"似A在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到所需片段；通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒 中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將Synechocystis sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因spcZ 和鏈霉親 和素基因(簡稱幼)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sa"3/ cA 鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和 素和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白D。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-; eZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-z e力A在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c/ 在pET30中是在AcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素 基因sa在I和A^II兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因WriY^9在pETDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是We I和X/w I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶和peZ^)， 力o7和/ e力i5在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Abo I和尸W I之間，/5eZy9 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和/力o I之間，pe^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《g^II和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet- WriW4久pET30-_s/ cZ 、 pCDFDuet-hoi-pebB和pACYCDuet-pebA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 2(TC至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N;T親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白D。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例18
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力/7a6ae/7asp. PCC7120和5y/ ec/ ocy"is sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成；J/7a6朋/3a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019 ，5y/7ec力oty^"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基因；"7"力r/;rsp. PCC7601己經(jīng)部分測序，所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679,可從所查到序列中找到所需基因。eM和pe/^)。通過基因工程方法，將6y/ ec力ocys^^sp.PCC 6803中的sZriY 必基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-^ri^似A在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將Synechocystis sp. PCC 6803中的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因av9c,和鏈霉親和素基因(簡稱M)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-s^apc尸，鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白別藻藍(lán)蛋白F。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力W-; eM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因邵c尸在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素基因幼在I和^^1I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因Wri"似^在pETDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Ato I和I ; PEB合成酶基因是3個(gè)(力o人和peM)，Z o7和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I禾Q尸Wl之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)vVt/e I和J/w I之間，； eW在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^ 7II和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet- sZriY 必、pET30-幼-邵c,、 pCDFDuet-ho1-pebB和pACYCDuet-pebA轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-別藻藍(lán)蛋白F。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。上述制備方法適用于采用各種藍(lán)藻中的beta裂合酶、別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白、藻紅膽素生物合成酶基因或其同源基因以及鏈霉親和素基因來制備鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，但涉及到微生物菌種公開的問題，本發(fā)明只選用了 GenBank中已公開全序列的藍(lán)藻力朋6ae朋sp.PCC7120和5yy ec力ocyWis sp. PCC 6803和部分測序的sp. PCC7601為例對本發(fā)明方法加以說明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開的內(nèi)容采用其它原料實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1. 一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包括下述步驟(1)用基因工程的方法，將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；(2)用基因工程的方法，將鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(3)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因hol和pebB或其同源基因克隆于第三個(gè)表達(dá)載體中，得到hol和pebB表達(dá)質(zhì)粒；(4)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四個(gè)表達(dá)載體中，得到pebA表達(dá)質(zhì)粒；(5)將beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、hol和pebB表達(dá)質(zhì)粒及pebA表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的beta裂合酶基因是指與」朋力ae/7a sp. PCC7120中alrt (W7基因或分朋c/ oc/stis sp. PCC 6803中sh^ 必基因同源的基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是指 與^ afe朋ssp. PCC7120或分/ ec/ oc/"J's sp. PCC 6803中別藻藍(lán)蛋白基因同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，是通過應(yīng)用藻膽蛋白beta裂合酶催化藻紅膽素(PEB)與鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，制備鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；本發(fā)明的方法應(yīng)用生物過程生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法；別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)能應(yīng)用于食品、保健與醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應(yīng)用為生物和醫(yī)學(xué)分子檢測領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號C12N15/60GK101481699SQ20081002574
公開日2009年7月15日 申請日期2008年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月10日
發(fā)明者佟順剛, 坤 夏 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司