專(zhuān)利名稱(chēng)：一種酵母細(xì)胞催化還原芳香酮制備光學(xué)活性醇的方法
一種酵母細(xì)胞催化還原芳香酮制備光學(xué)活性醇的方法技術(shù)領(lǐng)域一種酵母細(xì)胞催化還原芳香酮制備光學(xué)活性醇的方法，屬于生物催化方法 制備光學(xué)活性醇的技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景光學(xué)活性醇是合成手性藥物、農(nóng)藥、食品添加劑等手性化合物的重要的中 間體。用化學(xué)方法對(duì)前手性酮進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)還原是制備光學(xué)活性醇的重要途徑， 但隨著礦石資源的逐漸枯竭和環(huán)境污染的日漸加重，現(xiàn)今具有高效專(zhuān)一和綠色 節(jié)能特點(diǎn)的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在不對(duì)稱(chēng)合成中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。微生物細(xì)胞 中含有許多具有立體選擇性的酶，使用全細(xì)胞催化不對(duì)稱(chēng)還原前手性酮來(lái)制備 光學(xué)活性醇，不但可以省去繁雜的酶分離和純化步驟，而且在催化反應(yīng)過(guò)程中 只需添加廉價(jià)的碳源就能使細(xì)胞再生出催化不對(duì)稱(chēng)還原所需的價(jià)格昂貴的輔 酶，同時(shí)所有的酶和輔酶被保護(hù)在天然的細(xì)胞環(huán)境中，有利于生物催化反應(yīng)的 進(jìn)行。酵母是被廣泛利用的廉價(jià)微生物之一，其細(xì)胞內(nèi)存在著豐富的氧化還原酶， 可催化各種羰基化合物的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)，并對(duì)該類(lèi)反應(yīng)具有高度的立體選擇 性。酵母細(xì)胞在羰基不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)中的應(yīng)用已有研究報(bào)道。但存在一個(gè)普遍 的問(wèn)題就是底物容量小，在底物濃度稍高時(shí)其轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值均有明顯下降，楊忠華等人2007年發(fā)表于精細(xì)化工第1期的文章"酵母細(xì)胞不對(duì) 稱(chēng)還原4-氯苯乙酮合成相應(yīng)手性醇"，該文章研究結(jié)果表明當(dāng)?shù)孜餄舛葹?g/L 時(shí)得率已降至30%以下。因此在體系中加入一定量的能降低底物和產(chǎn)物毒性的 添加劑，應(yīng)能提高底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值。環(huán)糊精是從淀粉得到的6個(gè)以上D-吡喃葡萄糖單元以a-l,4-糖苷鍵連接的 具有環(huán)狀疏水圓錐形結(jié)構(gòu)的低聚糖非還原性化合物系列。在這個(gè)環(huán)糊精系列中， 有6個(gè)D-吡喃葡萄糖單元組成的a-環(huán)糊精，7個(gè)D-吡喃葡萄糖單元組成的J3-環(huán) 糊精，8個(gè)D-吡喃葡萄糖單元組成的Y-環(huán)糊精，還有這些環(huán)糊精的衍生物如羥 丙基-(3-環(huán)糊精、羥乙基-(3-環(huán)糊精等。由于環(huán)糊精的外部親水而內(nèi)腔疏水，因而 它能夠像酶一樣提供一個(gè)疏水的結(jié)合部位，作為主體包結(jié)各種適當(dāng)?shù)目腕w，如 有機(jī)分子、無(wú)機(jī)離子等。這種選擇性的包結(jié)作用即通常所說(shuō)的分子識(shí)別，其結(jié) 果是形成主客體包結(jié)物。環(huán)糊精可提高包結(jié)物在水中的溶解度，構(gòu)筑立體幾何 關(guān)系，形成特殊的手性位點(diǎn)，增強(qiáng)了環(huán)糊精的立體選擇性。已有環(huán)糊精在生物 轉(zhuǎn)化方面的專(zhuān)利申請(qǐng)，天津科技大學(xué)申請(qǐng)的中國(guó)專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?00710056952.5)"一種利用環(huán)糊精的甾醇生物轉(zhuǎn)化方法及其應(yīng)用"，主要針對(duì)甾醇生物轉(zhuǎn)化時(shí)的 轉(zhuǎn)化周期和轉(zhuǎn)化率，并未涉及到立體選擇性的問(wèn)題。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種酵母細(xì)胞催化還原芳香酮制備光學(xué)活性醇的方 法，利用環(huán)糊精的這種特殊結(jié)構(gòu)，將環(huán)糊精添加到酵母細(xì)胞催化不對(duì)稱(chēng)還原芳 香酮的生物轉(zhuǎn)化體系中，針對(duì)不同的底物選用不同的環(huán)糊精或其衍生物，并通 過(guò)調(diào)控底物與環(huán)糊精之間的摩爾比率，可明顯提高底物芳香酮的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物 光學(xué)活性醇的對(duì)映體過(guò)量值。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種酵母細(xì)胞催化還原芳香酮制備光學(xué)活性醇的方法， 在酵母細(xì)胞催化不對(duì)稱(chēng)還原芳香酮制備光學(xué)活性醇的體系中加入適量環(huán)糊精， 催化還原步驟為(1) 干酵母在反應(yīng)介質(zhì)中活化反應(yīng)介質(zhì)為pH 5.8-7.0磷酸鹽緩沖溶液，干酵母為市售面包酵母，干酵母在介質(zhì)中的濃度為100~200g/L，活化溫度為 30~35°C，活化時(shí)振蕩速度為120r/min，活化時(shí)間為0.2~lh;(2) 在活化后的體系中加入芳香酮與環(huán)糊精，進(jìn)行催化不對(duì)稱(chēng)還原芳香酮 的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，底物芳香酮濃度為6 12 g/L，底物芳香酮與環(huán)糊精的摩爾比 為17:1 3:1，干酵母用量為lmol芳香酮用200-400g干酵母，反應(yīng)溫度為30 35 °C，反應(yīng)時(shí)振蕩速度為120r/min，反應(yīng)時(shí)間為20 36h;(3) 反應(yīng)結(jié)束后用溶劑乙酸乙酯萃取分離反應(yīng)物，分析檢測(cè)所得光學(xué)活性 醇。反應(yīng)結(jié)束后用適量溶劑乙酸乙酯萃取后離心分離，萃取液濃縮后加入一定 量的內(nèi)標(biāo)物十三烷，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細(xì)管柱的氣相色譜儀檢 測(cè)，計(jì)算出底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明將環(huán)糊精添加到酵母細(xì)胞催化不對(duì)稱(chēng)還原芳香 酮的生物轉(zhuǎn)化體系中，利用環(huán)糊精或其衍生物與底物芳香酮形成包合物，來(lái)提 高酵母液催化效率，并增加對(duì)底物的立體選擇性，進(jìn)而提高底物芳香酮的轉(zhuǎn)化 率和產(chǎn)物光學(xué)活性醇的對(duì)映體過(guò)量值。本發(fā)明底物的轉(zhuǎn)化率可提高20%以上，產(chǎn) 物光學(xué)活性醇的對(duì)映體過(guò)量值的增幅也超過(guò)20%，同時(shí)還可以提高反應(yīng)速率，縮 短反應(yīng)時(shí)間。利用本發(fā)明在底物濃度為6 12g/L時(shí)，環(huán)糊精用量根據(jù)不同的底物 選擇不同的摩爾比加入，此時(shí)底物芳香酮的轉(zhuǎn)化率為50%~99%，產(chǎn)物光學(xué)活性 醇的對(duì)映體過(guò)量值為75% 99%，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限 制本發(fā)明。實(shí)施例l:在一錐形瓶中加入pH7.0的磷酸鹽緩沖液100mL和17g干酵母， 在33 r條件下于水浴恒溫振蕩儀中振蕩(120r/min) 0.5 h，使面包酵母活化，然后加入lOmmol (3-環(huán)糊精和50mmol (6.0g/L)苯乙酮，在相同溫度下振蕩反應(yīng) 24h。反應(yīng)結(jié)束后，將20mL乙酸乙酯加入到反應(yīng)液中，振蕩萃取后離心分離， 分出萃取液，萃取液濃縮后加入一定量的內(nèi)標(biāo)物十三垸，再用裝有 CP-Chirosil-DexCB手性毛細(xì)管柱的氣相色譜儀檢測(cè)，底物苯乙酮的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn) 物S-l-苯基乙醇的對(duì)映體過(guò)量值分別是95.8%和94.3%。實(shí)施例2:在一錐形瓶中加入pH7.0的磷酸鹽緩沖液100mL和17g干酵母， 在33 。C條件下于水浴恒溫振蕩儀中振蕩(120r/min) 0.5 h，使面包酵母活化， 然后加入3mmo1羥丙基-(3-環(huán)糊精和5Ommo1 (6.6g/L)苯丙酮，在相同溫度下 振蕩反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將20mL乙酸乙酯加入到反應(yīng)液中，振蕩萃取后 離心分離，分出萃取液，萃取液濃縮后加入一定量的內(nèi)標(biāo)物十三烷，再用裝有 CP-Chirosil-DexCB手性毛細(xì)管柱的氣相色譜儀檢測(cè)，底物苯丙酮的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn) 物&l-苯基丙醇的對(duì)映體過(guò)量值分別是81.3%和78.1%。實(shí)施例3:在一錐形瓶中加入pH7.0的磷酸鹽緩沖液100mL和17g干酵母， 在33 "C條件下于水浴恒溫振蕩儀中振蕩(120r/min) 0.5 h，使面包酵母活化， 然后加入15mmo1 f3-環(huán)糊精和50mmo1 (7.8g/L)對(duì)氯苯乙酮，在相同溫度下振蕩 反應(yīng)28h。反應(yīng)結(jié)束后，將20mL乙酸乙酯加入到反應(yīng)液中，振蕩萃取后離心 分離，分出萃取液，萃取液濃縮后加入一定量的內(nèi)標(biāo)物十三烷，再用裝有 CP-Chirosil-DexCB手性毛細(xì)管柱的氣相色譜儀檢測(cè)，底物對(duì)氯苯乙酮的轉(zhuǎn)化率 和產(chǎn)物S-l-對(duì)氯苯基乙醇的對(duì)映體過(guò)量值分別是50.9%和97.4%。實(shí)施例4:在一錐形瓶中加入pH 7.0的磷酸鹽緩沖液100mL和17g干酵母， 在33'C條件下于水浴恒溫振蕩儀中振蕩(120r/min) 0.5 h，使面包酵母活化， 然后加入15mmoip-CD和50mmo1 (6.6g/L)對(duì)甲基苯乙酮，在相同溫度下振蕩 反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將20 mL乙酸乙酯加入到反應(yīng)液中，振蕩萃取后離心 分離，分出萃取液，萃取液濃縮后加入一定量的內(nèi)標(biāo)物十三垸，再用裝有 CP-Chirosil-DexCB手性毛細(xì)管柱的氣相色譜儀檢測(cè)，底物對(duì)甲基苯乙酮的轉(zhuǎn)化 率和產(chǎn)物5M-對(duì)甲基苯基乙醇的對(duì)映體過(guò)量值分別是56.9%和99.2%。實(shí)施例5:在一錐形瓶中加入pH7.0的磷酸鹽緩沖液100mL和17g干酵母， 在33'C條件下于水浴恒溫振蕩儀中振蕩(120r/min) 0.5 h，使面包酵母活化， 然后加入3mmolHP-(3-CD和50mmo1 (6.6g/L)對(duì)甲基苯乙酮，在相同溫度下振 蕩反應(yīng)28h。反應(yīng)結(jié)束后，將20mL乙酸乙酯加入到反應(yīng)液中，振蕩萃取后離心 分離，分出萃取液，萃取液濃縮后加入一定量的內(nèi)標(biāo)物十三垸，再用裝有 CP-Chirosil-DexCB手性毛細(xì)管柱的氣相色譜儀檢測(cè)，底物對(duì)甲基苯乙酮的轉(zhuǎn)化 率和產(chǎn)物S-l-對(duì)甲基苯基乙醇的對(duì)映體過(guò)量值分別是63.4%和95.8%。
權(quán)利要求
1、一種酵母細(xì)胞催化還原芳香酮制備光學(xué)活性醇的方法，其特征是在酵母細(xì)胞催化不對(duì)稱(chēng)還原芳香酮制備光學(xué)活性醇的體系中加入適量環(huán)糊精，催化還原步驟為(1)干酵母在反應(yīng)介質(zhì)中活化反應(yīng)介質(zhì)為pH 5.8～7.0磷酸鹽緩沖溶液，干酵母為市售面包酵母，干酵母在介質(zhì)中的濃度為100～200g/L，活化溫度為30～35℃，活化時(shí)振蕩速度為120r/min，活化時(shí)間為0.2～1h；(2)在活化后的體系中加入芳香酮與環(huán)糊精，進(jìn)行催化不對(duì)稱(chēng)還原芳香酮的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，底物芳香酮濃度為6～12g/L，底物芳香酮與環(huán)糊精的摩爾比為17∶1～3∶1，干酵母用量為1mol芳香酮用200-400g干酵母，反應(yīng)溫度為30～35℃，反應(yīng)時(shí)振蕩速度為120r/min，反應(yīng)時(shí)間為20～36h；(3)反應(yīng)結(jié)束后用溶劑乙酸乙酯萃取分離反應(yīng)物，分析檢測(cè)所得光學(xué)活性醇。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征是底物芳香酮為苯乙酮、苯丙酮、苯 丁酮、對(duì)氯苯乙酮、鄰氯苯乙酮或?qū)谆揭彝?，產(chǎn)物光學(xué)活性醇分別為 苯基乙醇、S-l-苯基丙醇、S-l-苯基丁醇、S-l-對(duì)氯苯基乙醇、S-l-鄰氯苯基乙醇 或S-l-對(duì)甲基苯基乙醇。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征是環(huán)糊精為卩-環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精、 羥丙基-P-環(huán)糊精或羥乙基-(3-環(huán)糊精。
全文摘要
一種酵母細(xì)胞催化還原芳香酮制備光學(xué)活性醇的方法，屬于生物催化方法制備光學(xué)活性醇的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用在酵母細(xì)胞催化不對(duì)稱(chēng)還原芳香酮的生物轉(zhuǎn)化體系中按摩爾比例添加一定量的環(huán)糊精，使環(huán)糊精和芳香酮形成包合物，有效地提高反應(yīng)底物在水中的溶解度并適當(dāng)降低底物和產(chǎn)物對(duì)酶的抑制作用。環(huán)糊精提高了酵母液的催化還原效率，同時(shí)增加了對(duì)底物的立體選擇性，明顯提高了底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值。利用本發(fā)明在底物濃度為6～12g/L時(shí)，環(huán)糊精用量根據(jù)底物的不同選擇不同的摩爾比加入，此時(shí)底物芳香酮的轉(zhuǎn)化率為50％～99％，產(chǎn)物光學(xué)活性醇的對(duì)映體過(guò)量值為75％～99％，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101240299SQ20081001997
公開(kāi)日2008年8月13日 申請(qǐng)日期2008年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月17日
發(fā)明者湘 劉, 劉士榮, 夏詠梅, 張寶立, 張文虎 申請(qǐng)人:江南大學(xué)