專利名稱：：線粒體測序用26對pcr引物及基于該引物的分型方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種核酸檢測方法，特別是一種線粒體全部堿基序列分型及其測定方法，，具體而言是線粒體測序用26對PCR引物及基于該引物的分型方法。
背景技術(shù)：
：線粒體(mtDNA)堿基分型，目前最常用的是應(yīng)用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出需要的DNA片斷，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，并根據(jù)片段的堿基序列與線粒體標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對得到結(jié)果。對于PCR產(chǎn)物的直接測序可用PAGE結(jié)合銀染，以及熒光標(biāo)記序列儀自動(dòng)分析系統(tǒng)。對線粒體的研究在國內(nèi)還集中于線粒體特定高變區(qū)，目前國際上線粒體已完成了全部堿基序列測定并予以公布，但在生物醫(yī)學(xué)研究及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用實(shí)踐中存在以下問題(1)已有的線粒體堿基序列測定方法沒有統(tǒng)一的方案，需要人為選擇。(2)這些線粒體堿基序列都是基于中國群體以外的群體(主要是白人群體)測定而獲得的資料，其中有些基因位點(diǎn)，在中國群體的基因頻率分布較差，并不能反映出中國群體的線粒體序列特點(diǎn)。(3)國外公布的線粒體測定方法仍在改進(jìn)，不同實(shí)驗(yàn)室之間無法達(dá)到結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化。上述缺點(diǎn)限制了線粒體遺傳標(biāo)記在國內(nèi)的應(yīng)用，不利于進(jìn)一步在基層推廣。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供適合中國群體的線粒體測序用PCR引物，以及基于所述線粒體測序用PCR引物的分型方法，該方法方便進(jìn)行中國群體遺傳學(xué)及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究。線粒體是人類第二套基因組，mtDNA具有嚴(yán)格的母系遺傳特點(diǎn)，線粒體DNA的突變率高于核DNA的510倍，因此，線粒體DNA與核DNA序列相比，可以在較短進(jìn)化時(shí)期內(nèi)積累更多的核苷酸變化的信息，在追蹤民族起源方面有著其它遺傳標(biāo)記無法比擬的優(yōu)勢，為現(xiàn)代人類的起源、人類遷移規(guī)律和進(jìn)化提供了大量的證據(jù)。另外，線粒體DNA全序列僅一萬多個(gè)堿基，其多態(tài)性集中體現(xiàn)在D-環(huán)區(qū)，僅1100多個(gè)堿基，DNA序列測定較為簡便，成為法醫(yī)檢案中一種新的檢測手段。在法醫(yī)學(xué)個(gè)體識別中，通過mtDNA序列分析可實(shí)現(xiàn)一定程度的認(rèn)定作用，尤其在特定人群的個(gè)體識別中(空難、遺骸的鑒定)發(fā)揮重要作用。本發(fā)明提供了一種線粒體測序用26對PCR引物，選用的26對PCR引物覆蓋了線粒體基因組全長(表l)，其中引物15-1、15-2、15-3、24-1、24-2針對中國人群重新設(shè)計(jì)，對中國人群的分型具有針對性；引物24-1對應(yīng)的擴(kuò)增片段最小，為420bp;引物22對應(yīng)的擴(kuò)增片段最大，為1162bp;所有PCR片段大小適中，均適宜PCR擴(kuò)增。表lPCR引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明所選26對PCR引物已在西安交通大學(xué)衛(wèi)生部法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于中華民族群體遺傳資料調(diào)查，經(jīng)數(shù)據(jù)處理證明，應(yīng)用所提供的26對PCR引物擴(kuò)增目的片段，通過直接測序的方法可以得到中國人群線粒體全堿基序列資料。另外在新設(shè)計(jì)引物區(qū)域，使用國外己有的線粒體序列測定方法無法獲得中國人群穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示出中國人群存在獨(dú)特的線粒體序列特點(diǎn)，根據(jù)本發(fā)明所述線粒體分型方法得到的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室已向GENEBANK數(shù)據(jù)庫提交了中國人群線粒體全序列資料共6條(檢索號DQ519035、DQ462234、DQ462233、DQ462232、DQ418488、DQ437577)。結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的線粒體測序用PCR引物和基于所述線粒體測序用PCR引物的分型方法完全可以應(yīng)用在法醫(yī)學(xué)、人類學(xué)、遺傳學(xué)和疾病等領(lǐng)域的個(gè)體識別、親子鑒定以及基因診斷等方面。本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)方案是:基于所述線粒體測序用26對PCR引物的分型方法，其特征在于，包括以下步驟選用所述線粒體測序用26對PCR引物，將上下游引物稀釋成10(VMOL/L，作為母液，取出l(V1稀釋到5pMOL/L，作為工作液；PCR擴(kuò)增體系的體積為20^L，含lx反應(yīng)緩沖液，1.5mMOL/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25nMOL/L引物，200^iMOL/LdNTP，DNA20200ng;引物的PCR擴(kuò)增基礎(chǔ)參數(shù)為95'C變性30s，根據(jù)PCR引物不同確定退火溫度進(jìn)行30s，72。C延伸60s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；測序反應(yīng)體系為1(^1，反應(yīng)混合物中含純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10ng、Big-DyeTerminatorReadyReactionmix(ver.3.1，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)0.7|il，測序引物0,3pM;測序PCR條件為96'C變性10秒，50'C退火5秒，60'C延伸4分鐘，共循環(huán)25次；純化測序反應(yīng)產(chǎn)物；純化后的測序反應(yīng)產(chǎn)物使用直接測序法檢測；將26對PCR引物測序獲得的堿基序列拼接得到樣本線粒體全堿基序列，將樣本堿基序列與線粒體標(biāo)準(zhǔn)序列比對即可獲得樣本堿基序列差異，從而完成線粒體分型。本發(fā)明帶來的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是，利用給定的引物直接擴(kuò)增結(jié)合直接測序的方法進(jìn)行分型，所需儀器和設(shè)備及操作均可達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化，且方案成熟，適合應(yīng)用于中國人群。本發(fā)明可以填補(bǔ)國內(nèi)沒有實(shí)用化的線粒體全序列檢測技術(shù)和方案的空白，并在中國多個(gè)民族中獲得滿意的結(jié)果，利用這種技術(shù)制備的線粒體全序列分型試劑盒，可進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)并推廣為國內(nèi)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用。該技術(shù)克服了需要人為選擇線粒體堿基序列測定方法，對實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)要求較高的缺陷，可以應(yīng)用于親子鑒定、個(gè)體識別、線粒體遺傳致病基因定位、易感基因的檢出、發(fā)病的分子遺傳機(jī)理研究、藥物的設(shè)計(jì)及使用等方面，具有廣泛的應(yīng)用前景。圖1為線粒體測序用26對PCR引物對應(yīng)位點(diǎn)示意圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明線粒體測序用PCR引物見表1。本發(fā)明基于所述線粒體測序用PCR引物的分型方法，利用覆蓋線粒體基因組全長的26對PCR引物擴(kuò)增目的片段，直接測序檢觀!l，并進(jìn)行分型。1.設(shè)計(jì)引物序列PCR引物序列設(shè)計(jì)參照Genebank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)發(fā)布的線粒體標(biāo)準(zhǔn)序列，上下游引物序列見表l。線粒體DNA序列為環(huán)形，引物設(shè)計(jì)策略見圖1。選用所述線粒體測序用26對PCR引物，將上下游引物稀釋成100nMOL/L，作為母液，取出10pl稀釋至U5^MOL/L，作為工作液。2.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系總體積20p1，含lx反應(yīng)緩沖液，1.5mMol/LMgCl2，0.5U丁aq酶，0.25liMol/L引物，200^Mol/LdNTP，DNA20200ng。使用PE9600擴(kuò)增儀，PE9700擴(kuò)增儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，其它類型擴(kuò)增儀也可以得到較好的結(jié)果。目前各種方法提取的DNA模板，均適合線粒體堿基序列的擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)PCR反應(yīng)所用試劑均為通用試劑，PCR產(chǎn)物的檢測采用常規(guī)的方法。PCR擴(kuò)增參數(shù)見表2。表2PCR擴(kuò)增條件引物名稱變性溫度/時(shí)間退火溫度/時(shí)間延伸溫度/時(shí)間循環(huán)次數(shù)195。C30s54。C30s72。C60s35295'C30s56。C30s72。C60s35395。C30s56。C30s72。C60s35495。C30s54。C30s72。C60s3595。C30s56。C30s72。C60s35695。C30s54。C30s72。C60s35795。C30s55。C30s72。C60s35895'C30s55。C30s72。C60s35995。C30s56'C30s72。C60s351095'C30s54。C30s72。C60s35"95。C30s52。C30s72。C60s351295。C30s56。C30s72。C60s351395。C30s56。C30s72。C60s351495。C30s56。C30s72。C60s3515-195。C30s55'C30s72。C60s3515-295。C30s55。C30s72。C60s3515-395。C30s55。C30s72。C60s351795。C30s56'C30s72。C60s351895。C30s52'C30s72。C60s351995。C30s54。C30s72。C60s352095。C30s57。C30s72。C60s352195。C30s52。C30s72'C60s352295。C30s56。C30s72。C60s352395。C30s52。C30s72。C60s3524-195。C30s53。C30s72。C60s3524-295。C30s58。C30s72。C60s353.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化使用Multiscreen%PCRpurificationplate(美國密理博公司)純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。4.mtDNA的測序反應(yīng)反應(yīng)體系為1(^1，反應(yīng)混合物中含純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10ng、Big-DyeTerminatorReadyReactionmix(ver.3.1)0,7pl，測序引物(使用相應(yīng)的PCR引物，即相應(yīng)工作液)0.3pM。測序反應(yīng)使用PE9600擴(kuò)增儀，PE9700擴(kuò)增儀，PCR條件為變性96°C10秒，退火50'C5秒，延伸60。C4分鐘，循環(huán)次數(shù)為25次。5.測序反應(yīng)后產(chǎn)物的純化使用酒精沉淀的方法純化測序產(chǎn)物。6.mtDNA測序分析上樣每個(gè)純化后的測序產(chǎn)物使用10^1高純度甲酰胺(Hi-DiFormamide)溶解，95。C變性10分鐘后，立即放置于冰上,5分鐘后將每個(gè)樣本移至序列分析儀專用96孔上樣板中。電泳檢測將96孔上樣板放入3730型DNA序列分析儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，儀器設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)測序程序(默認(rèn)值)，上樣電泳。電泳結(jié)束后，即得到電泳掃描結(jié)果。在其它類型DNA序列分析儀上操作也可獲得同樣的掃描結(jié)果。7.序列分析使用SequenceAnalysis5.1軟件(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)處理電泳掃描結(jié)果，得到堿基序列文件。將26對PCR引物測序獲得的堿基序列文件拼接起來即可得到樣本線粒體全堿基序列文件。將樣本堿基序列與線粒體標(biāo)準(zhǔn)序列比對即可獲得樣本堿基序列差異，從而完成線粒體分型。綜上所述，利用本發(fā)明所述的26對PCR引物將線粒體全堿基序列分段擴(kuò)增，直接測序檢測，拼接獲得的堿基序列文件即可得到線粒體全堿基序列文件，與線粒體標(biāo)準(zhǔn)序列比對即可獲得樣本堿基序列差異，從而完成線粒體分型。權(quán)利要求1、線粒體測序用26對PCR引物，包括引物11FCTCCTCAAAGCAATACACTG3′結(jié)合位點(diǎn)6111RTGCTAAATCCACCTTCGACC3′結(jié)合位點(diǎn)1411引物22FCGATCAACCTCACCACCTCT3′結(jié)合位點(diǎn)12452RTGGACAACCAGCTATCACCA3′結(jié)合位點(diǎn)2007引物33FGGACTAACCCCTATACCTTCTGC3′結(jié)合位點(diǎn)18543RGGCAGGTCAATTTCACTGGT3′結(jié)合位點(diǎn)2669引物44FAAATCTTACCCCGCCTGTTT3′結(jié)合位點(diǎn)24994RAGGAATGCCATTGCGATTAG3′結(jié)合位點(diǎn)3346引物55FTACTTCACAAAGCGCCTTCC3′結(jié)合位點(diǎn)31695RATGAAGAATAGGGCGAAGGG3′結(jié)合位點(diǎn)3961引物66FTGGCTCCTTTAACCTCTCCA3′結(jié)合位點(diǎn)37966RAAGGATTATGGATGCGGTTG3′結(jié)合位點(diǎn)4854引物77FACTAATTAATCCCCTGGCCC3′結(jié)合位點(diǎn)44857RCCTGGGGTGGGTTTTGTATG3′結(jié)合位點(diǎn)5420引物88FCTAACCGGCTTTTTGCCC3′結(jié)合位點(diǎn)52558RACCTAGAAGGTTGCCTGGCT3′結(jié)合位點(diǎn)6031引物99FGAGGCCTAACCCCTGTCTTT3′結(jié)合位點(diǎn)58559RATTCCGAAGCCTGGTAGGAT3′結(jié)合位點(diǎn)6642引物1010FCTCTTCGTCTGATCCGTCCT3′結(jié)合位點(diǎn)646910RAGCGAAGGCTTCTCAAATCA3′結(jié)合位點(diǎn)7315引物1111FACGCCAAAATCCATTTCACT3′結(jié)合位點(diǎn)714811RCGGGAATTGCATCTGTTTTT3′結(jié)合位點(diǎn)8095引物1212FACGAGTACACCGACTACGGC3′結(jié)合位點(diǎn)793712RTGGGTGGTTGGTGTAAATGA3′結(jié)合位點(diǎn)8797引物1313FTTTCCCCCTCTATTGATCCC3′結(jié)合位點(diǎn)862113RGTGGCCTTGGTATGTGCTTT3′結(jié)合位點(diǎn)9397引物1414FCCCACCAATCACATGCCTAT3′結(jié)合位點(diǎn)923014RTGTAGCCGTTGAGTTGTGGT3′結(jié)合位點(diǎn)10130引物1717FTCACTCTCACTGCCCAAGAA3′結(jié)合位點(diǎn)1131417RGGAGAATGGGGGATAGGTGT3′結(jié)合位點(diǎn)12076引物1818FTATCACTCTCCTACTTACAG3′結(jié)合位點(diǎn)1194818RAGAAGGTTATAATTCCTACG3′結(jié)合位點(diǎn)12772引物1919FAAACAACCCAGCTCTCCCTAA3′結(jié)合位點(diǎn)1257119RTCGATGATGTGGTCTTTGGA3′結(jié)合位點(diǎn)13507引物2020FACATCTGTACCCACGCCTTC3′結(jié)合位點(diǎn)1333820RAGAGGGGTCAGGGTTCATTC3′結(jié)合位點(diǎn)14268引物2121FGCATAATTAAACTTTACTTC3′結(jié)合位點(diǎn)1400021RAGAATATTGAGGCGCCATTG3′結(jié)合位點(diǎn)14998引物2222FTGAAACTTCGGCTCACTCCT3′結(jié)合位點(diǎn)1485622RAGCTTTGGGTGCTAATGGTG3′結(jié)合位點(diǎn)15978引物2323FTCATTGGACAAGTAGCATCC3′結(jié)合位點(diǎn)1581123RGAGTGGTTAATAGGGTGATAG3′結(jié)合位點(diǎn)5其特征在于，還包括引物15-115-1FCTTCTATTGATGAGGGTCTT3′結(jié)合位點(diǎn)999115-1RGGTGTTGAGGGTTATGAGA3′結(jié)合位點(diǎn)10622引物15-215-2FAAGGATTAGACTGAACCGAA3′結(jié)合位點(diǎn)1040415-2RCTGATTGTGAGGGGTAGGA3′結(jié)合位點(diǎn)10992引物15-315-3FCAACCACCCACAGCCTAA3′結(jié)合位點(diǎn)1085715-3RTTGAGAATGAGTGTGAGGCG3′結(jié)合位點(diǎn)11512引物24-124-1FCATTATCCCGCACAAGAGTG3′結(jié)合位點(diǎn)1641924-1RTGGAAAGTGGCTGTGCAGACAT3′結(jié)合位點(diǎn)250引物24-224-2FCTTTGATTCCTGCCTCATCC3′結(jié)合位點(diǎn)13224-2RTAGAAAGGCTAGGACCAAACCT3′結(jié)合位點(diǎn)652該26對PCR引物覆蓋了線粒體基因組全長，其中引物15-1、15-2、15-3、24-1、24-2對中國人群的分型具有針對性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述用于線粒體測序的26對PCR引物，其特征在于，所述26對PCR引物中，引物24-l對應(yīng)的擴(kuò)增片段最小，為420bp;引物22對應(yīng)的擴(kuò)增片段最大，為1162bp;并且所有PCR引物片段大小適中，均適宜PCR擴(kuò)增。3、基于權(quán)利要求1所述線粒體測序用26對PCR引物的分型方法，其特征在于，包括以下步驟選用所述線粒體測序用26對PCR引物，將上下游引物稀釋成100pMOL/L，作為母液，取出10n1稀釋到5^iMOL/L，作為工作液；PCR擴(kuò)增體系的體積為20pL，含lx反應(yīng)緩沖液，1.5mMOL/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25^iMOL/L引物，200pMOL/LdNTP，DNA20200ng;引物的PCR擴(kuò)增基礎(chǔ)參數(shù)為95。C變性30s,根據(jù)PCR引物不同確定退火溫度進(jìn)行30s，72'C延伸60s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；測序反應(yīng)體系為10pl，反應(yīng)混合物中含純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10ng、Big-DyeTerminatorReadyReactionmix(ver.3.1)0.7pl，測序引物0.3nM;觀!j序PCR條件為96'C變性10秒，50。C退火5秒，6(TC延伸4分鐘，共循環(huán)25次；純化測序反應(yīng)產(chǎn)物；純化后的測序反應(yīng)產(chǎn)物使用直接測序法檢測；將26對PCR引物測序獲得的堿基序列拼接得到樣本線粒體全堿基序列，將樣本堿基序列與線粒體標(biāo)準(zhǔn)序列比對即可獲得樣本堿基序列差異，從而完成線粒體分型。全文摘要本發(fā)明涉及一種核酸檢測方法，特別是公開了一種線粒體全部堿基序列分型及其測定方法，具體而言是線粒體測序用26對PCR引物及基于該引物的分型方法。本發(fā)明選用的26對PCR引物覆蓋了線粒體基因組全長，其中引物15-1、15-2、15-3、24-1、24-2針對中國人群重新設(shè)計(jì)，對中國人群的分型具有針對性；引物24-1對應(yīng)的擴(kuò)增片段最小，為420bp；引物22對應(yīng)的擴(kuò)增片段最大，為1162bp；所有PCR片段大小適中，均適宜PCR擴(kuò)增。本發(fā)明的26對PCR引物已在申請人的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于中華民族群體遺傳資料調(diào)查，已向GENEBANK數(shù)據(jù)庫提交了中國人群線粒體全序列資料。結(jié)果表明，本發(fā)明完全可以應(yīng)用在法醫(yī)學(xué)、人類學(xué)、遺傳學(xué)和疾病等領(lǐng)域的個(gè)體識別、親子鑒定以及基因診斷等領(lǐng)域。文檔編號C12N15/11GK101270390SQ20081001797公開日2008年9月24日申請日期2008年4月15日優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日發(fā)明者劉清波,張洪波,李生斌,麗楊,賴江華申請人:西安交通大學(xué)