一種pcr引物及其修飾方法及基于平行高通量單分子高保真擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及PCR擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種PCR引物修飾方法及基于平行高 通量單分子高保真擴(kuò)增方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 過去幾十年里，隨著DNA技術(shù)水平的提高，人類基因工程以及千人基因組計劃、癌 癥基因組計劃、Meta-Hit計劃等重大國際合作項目的相繼開展，基因組研宄日漸被推向高 潮。單分子DNA擴(kuò)增在基因組測序中的應(yīng)用日趨重要，幾乎所有的測序技術(shù)都需要擴(kuò)增單 分子DNA片段。目前，所有的單分子DNA模板擴(kuò)增所使用的各種合成酶中，有錯誤率較高 的 Taq 家族、高保真的 Klenow Fragment (DNA Polymerase I)、KAPA HiFi 家族、高保真的 Phusion家族以及高保真的Q5家族等。
[0003] 對于普通的酶合成鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)來說，以上DNA合成酶都可以較好的擴(kuò)增DNA 模板，達(dá)到大量擴(kuò)增DNA的作用。但是對于基因組測序來說，對單分子平行高效高保真擴(kuò)增 提出更為嚴(yán)格的要求。目前大部分PCR擴(kuò)增方法都采用錯誤率較高的Taq家族合成酶，而 對于使用高保真的合成酶來擴(kuò)增單分子DNA片段，目前仍尚未得到技術(shù)解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于平行高通量單分子高保真擴(kuò)增 方法，解決了擴(kuò)增單分子不能使用高保真合成酶的技術(shù)缺陷，該方法能夠有效的進(jìn)行單分 子擴(kuò)增，提供足夠量的DNA為后續(xù)檢測使用。相比PCR的方法，該方法降低了誤差率，方法 操作簡便，更便于臨床檢測采用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種PCR引物，所述PCR引物的3'末端的堿基具有硫代磷酸根。
[0007] 所述的PCR引物，具有硫代磷酸根的堿基個數(shù)為1-4個。
[0008] 一種PCR引物修飾方法，對PCR引物3'末端的堿基進(jìn)行修飾，用硫代磷酸根取代 磷酸根。
[0009] 所述的PCR引物修飾方法，用硫代磷酸根取代磷酸根的方法為：在合成PCR引物 時，3'末端的堿基用硫代磷酸根鏈接的堿基進(jìn)行合成。
[0010] 對PCR引物3'末端的硫代磷酸根鏈接的堿基具有1-4個。
[0011] 比如，引物序列為NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN (N表示A/T/C/G)，將最后2個堿 基用硫代磷酸根保護(hù)后，引物為：NNN NNN NNN NNN NNN NNN N * N * N(其中*表示硫代 磷酸根修飾）。修飾的方法可以選擇修飾至少最后1位，一般建議修飾倒數(shù)2-4位。比如： NNN NNN NNN NNN NNN NNN N * N * N ;或者 NNN NNN NNN NNN NNN NNN * N * N * N ;或 者 NNN NNN NNN NNN NNN NN ★ N ★ N ★ N ★ N。
[0012] -種基于平行高通量單分子高保真擴(kuò)增方法，對PCR引物3'末端的堿基進(jìn)行修 飾，用硫代磷酸根取代磷酸根，得到修飾PCR引物；用修飾PCR引物，DNA模板和高保真合成 酶進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
[0013] 所述高保真合成酶選自高保真的Klenow Fragment (DNA Polymerase I)、KAPA HiFi家族、高保真的Phusion家族或高保真的Q5家族。
[0014] 用硫代磷酸根替代核苷酸的磷酸根，可以阻礙高保真酶對模版的外切。比如新英 格蘭生物實(shí)驗(yàn)的熱電Phusion高保真DNA聚合酶，具有5' 一3'聚合酶活性，3' 一5'外切 酶活性，并會產(chǎn)生平端產(chǎn)品。將引物3 '端堿基中的磷酸根用硫代磷酸根替代，Phusion高 保真DNA聚合酶將不再發(fā)揮3' 一5'外切酶活性將從引物降解3 '端降解，從而起到保護(hù)引 物的作用。該保護(hù)在微量模版、單分子模版的PCR反應(yīng)中至關(guān)重要，決定了 PCR的成敗。
[0015] 一種用上述 PCR 引物的 emulsion PCR0
[0016] Emulsion PCR主要涉及到兩相，一相為PCR Mix的水相，該部分包含PCR所需要的 各種試劑；另一相為油相，一般有幾種油組成。通過兩相混合，形成油包水的反應(yīng)體系。每 個液滴都是一個獨(dú)立的反應(yīng)室，所以emulsion PCR可以實(shí)現(xiàn)高通量平行PCR，而且每個PCR 相互隔離互不干擾，不受影響。emulsion PCR廣泛用于二代測序的樣本制作。在emulsion PCR中，由于反應(yīng)需要優(yōu)化趨于但分子模版PCR反應(yīng)，所以如果利用高保真酶作為反應(yīng)的合 成酶，同樣會遇到模版太少時，引物會被錯誤的當(dāng)作錯誤產(chǎn)物被高保真酶切掉的情況。所 以，也需要將引物的3 '末端進(jìn)行修飾，將磷酸根替換為硫代磷酸根，從而保護(hù)引物，使得反 應(yīng)可以利用高保真酶，提高準(zhǔn)確度，降低PCR所引入的錯誤。
[0017] 一種用上述 PCR 引物的 ddPCR or dPCR(Digital Droplet PCR)。
[0018] 在Digital PCR中，由于反應(yīng)需要優(yōu)化趨于但分子模版PCR反應(yīng)，所以如果利用高 保真酶作為反應(yīng)的合成酶，同樣會遇到模版太少時，引物會被錯誤的當(dāng)作錯誤產(chǎn)物被酶切 掉。因此，如果該反應(yīng)要使用高保真酶的話，也需要將雙向引物的3 '末端進(jìn)行修飾，將磷 酸根替換位硫代磷酸根，從而保護(hù)引物，使得反應(yīng)可以利用高保真酶，提高準(zhǔn)確度，降低PCR 所引入的錯誤。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明所述擴(kuò)增方法對平行高通量單分子擴(kuò)增反應(yīng)中的引 物做了精密設(shè)計，在普通的單分子擴(kuò)增PCR反應(yīng)中，對其引物進(jìn)行3'末端修飾，用硫代磷酸 取代原有的磷酸根，從而保護(hù)3'末端，在DNA模板量非常少的情況下，避免高保真合成酶錯 誤的將引物作為合成錯誤的片段進(jìn)行消化碎化，阻止擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。做此修飾之后，以上 各種高保真合成酶均可作為單分子擴(kuò)增的DNA合成酶使用，可以達(dá)到超低錯誤率和足夠量 的DNA，供后續(xù)研宄使用。
【附圖說明】：
[0020] 圖1，使用修飾PCR引物和沒修飾PCR引物進(jìn)行ePCR的產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0022] 實(shí)施例1 :
[0023] 一種PCR引物，所述PCR引物序列如下：
[0024] SEQ ID NO. 1(5' -3,）：CTC TGA ATG TGA CCA GAC CTG * C * C
[0025] SEQ ID NO. 2(5' -3'）：CTA CGA GAC GCA ACC GCA ATC * A * G
[0026] 所述PCR引物的修飾方法如下：
[0027] 上述PCR引物3'末進(jìn)行修飾，用硫代磷酸根取代磷酸根，其中" "表示硫代磷酸 根。具體而言，上述PCR引物在合成時，3'末端的堿基用硫代磷酸根鏈接的堿基替代磷酸根 鏈接的堿基進(jìn)行合成。
[0028] 實(shí)施例2 :
[0029] 一種PCR引物，所述PCR引物序列如下：
[0030] SEQ ID NO. 3(5' -3,）：CTC TGA ATG TGA CCA GAC CT * G * C * C
[0031] SEQ ID NO. 4(5' -3,）：CTA CGA GAC GCA ACC GCA AT * C * A * G
[0032] 所述PCR引物的修飾方法如下：
[0033] 上述PCR引物3'末進(jìn)行修飾，用硫代磷酸根取代磷酸根，其中" "表示硫代磷酸 根。具體而言，上述PCR引物在合成時，3'末端的堿基用硫代磷酸根鏈接的堿基替代磷酸根 鏈接的堿基進(jìn)行合成。
[0034] 實(shí)施例3
[0035] -種基于平行高通量單分子高保真擴(kuò)增方法，PCR擴(kuò)增體系為Pusion High-Fidelity PCR Kit，所用修飾PCR引物如下：
[0036] 硫代磷酸根修飾的引物：
[0037] Forward Primer :SEQ ID NO. 5(5' -3'）：CCGGTAATGAAAAAGGCGAAC * T * G
[0038] Reverse Primer :SEQ ID NO. 6(5' -3'）：CGCCGAAGTAGGAAAGC * T * C0
[0039] 同時，以相同序列的沒有修飾的PCR引物作為對照進(jìn)行擴(kuò)增：
[0040] 未經(jīng)硫代磷酸根修飾的引物：
[0041] Forward Primer :SEQ ID NO. 7(5' -3'）：CCGGTAATGAAAAAGGCGAACTG
[0042] Reverse Primer :SEQ ID NO. 8(5' -3'）：CGCCGAAGTAGGAAAGCTC〇
[0043] PCR擴(kuò)增體系如下：
[0044] 5XPus i on H-F or GC buffer 4ul IOmMdNTPs 0.4ul IOuM Forward primer Iul IOuM Reverse primerlul E colmk (NEBiolab) 5ng DMSO 0 6υ1 Pus i on DNA Po Iyme rase 0. 2ul Nuclease-free water 補(bǔ)至 20ul。
[0045] PCR 循環(huán)條件為：98 °C，lmin，l 個循環(huán)；98 °C， 5-lOs，45-72°C，10-30s，72°C，15-30s，30個循環(huán)；4°C保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳，如圖1所示。其中泳道M是DNA marker,泳道1是使用修飾PCR引物的ePCR產(chǎn)物， 而泳道2是使用未經(jīng)修飾引物的ePCR產(chǎn)物。從圖中可見，使用未經(jīng)修飾引物的ePCR未產(chǎn) 生正確的產(chǎn)物。
[0046] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其架構(gòu)形式能夠靈活多變，可以派生系列產(chǎn)品。只是做出若干 簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明由所提交的權(quán)利要求書確定的專利保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種PCR引物，其特征在于，所述PCR引物的3'末端的堿基具有硫代磷酸根。
2. 如權(quán)利要求1所述的PCR引物，其特征在于，具有硫代磷酸根的堿基個數(shù)為1-4個。
3. -種PCR引物修飾方法，其特征在于，對PCR引物3'末端的堿基進(jìn)行修飾，用硫代磷 酸根取代磷酸根。
4. 如權(quán)利要求3所述的PCR引物修飾方法，其特征在于，用硫代磷酸根取代磷酸根的方 法為：在合成PCR引物時，3'末端的堿基用硫代磷酸根鏈接的堿基進(jìn)行合成。
5. 如權(quán)利要求1所述的PCR引物修飾方法，其特征在于，對PCR引物3'末端的硫代磷 酸根鏈接的堿基具有1-4個。
6. -種基于平行高通量單分子高保真擴(kuò)增方法，其特征在于，對PCR引物3'末端的堿 基進(jìn)行修飾，用硫代磷酸根取代磷酸根，得到修飾PCR引物；用修飾PCR引物，DNA模板和高 保真合成酶進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
7. 如權(quán)利要求6所述的基于平行高通量單分子高保真擴(kuò)增方法，其特征在于，所述高 保真合成酶選自高保真的Klenow Fragment (DNA Polymerase I)、KAPA HiFi家族、高保真 的Phusion家族或高保真的Q5家族。
8. -種用權(quán)利要求1-2所述PCR引物的emulsion PCR0
9. 一種用權(quán)利要求 1-2 所述 PCR 引物的 ddPCR or dPCR(Digital Droplet PCR)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于平行高通量單分子高保真擴(kuò)增方法。PCR引物進(jìn)行3’末端為磷酸根，對PCR引物3’末端進(jìn)行修飾，用硫代磷酸取代磷酸根，得到修飾PCR引物。所述基于平行高通量單分子高保真擴(kuò)增方法，解決了擴(kuò)增單分子不能使用高保真合成酶的技術(shù)缺陷，該方法能夠有效的進(jìn)行單分子擴(kuò)增，提供足夠量的DNA為后續(xù)檢測使用。相比PCR的方法，該方法降低了誤差率，方法操作簡便，更便于臨床檢測采用。
【IPC分類】C12N15-10, C12N15-11
【公開號】CN104560972
【申請?zhí)枴緾N201410709579
【發(fā)明人】許明炎
【申請人】深圳市海普洛斯生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年11月28日