專利名稱：：甘氨酸n-甲基轉(zhuǎn)移酶動(dòng)物模型的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種有關(guān)甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(GlycineN-Methyltransferas;GNMT)的動(dòng)物模型的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種將GNMT產(chǎn)物應(yīng)用于預(yù)防或治療癌癥的方法，以肝癌效果為佳。
背景技術(shù)：
：癌癥又稱為惡性腫瘤，是人體內(nèi)一些不正常的細(xì)胞，因?yàn)樯L速度快，而去影響及侵犯到正常的組織器官，導(dǎo)致出血、疼痛或器官功能喪失等癥狀。并會(huì)隨著血液及淋巴轉(zhuǎn)移，影響其它器官組織的疾病。癌癥是目前世界上最常見的、由于細(xì)胞異常所造成的人類疾病之一，也是現(xiàn)今人類死亡的主要原因之一。癌癥是完全發(fā)展的腫瘤(又稱惡性腫瘤)，其具有特殊的侵入及破壞基礎(chǔ)間葉組織(mesenchyme)能力，例如局部侵犯(localinvasion),在某些案例中，侵入的腫瘤細(xì)胞可以在新形成的腫瘤內(nèi)進(jìn)一步產(chǎn)生淋巴管或者血管，然后可能將該腫瘤細(xì)胞運(yùn)輸至其它器官，而形成第二腫瘤(轉(zhuǎn)移；metastasis)。腫瘤通常被認(rèn)為是那些不再受到正常生長控制機(jī)制調(diào)控而因此發(fā)生異常生長的細(xì)胞，而該細(xì)胞可源于任何組織。除了癌癥之外，腫瘤可以僅在原處發(fā)展而不成為惡性腫瘤，例如良性腫瘤；或者，腫瘤細(xì)胞可以僅有癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)上的外表，但是其停留在原來的位置，例如原位腫瘤，雖然在很多案例中該腫瘤常常發(fā)展成原位癌。目前并沒有診斷或者評(píng)估腫瘤惡性程度的絕對(duì)方法。在各種方法中，顯微鏡組織檢查仍然是常規(guī)使用的最可靠的方法。在病理學(xué)研究方面，一個(gè)腫瘤可以根據(jù)其由顯微鏡檢察所得知的組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)上結(jié)構(gòu)逆分化的程度(退行分化;anaplasia)來分級(jí)。但是，某些細(xì)胞可能失去了特定結(jié)構(gòu)的特征，但是仍然保留分化上的生化特征，而其它細(xì)胞可能仍然表現(xiàn)結(jié)構(gòu)上分化的樣子但已失去其正常功能；另一方面，在同一區(qū)域的腫瘤細(xì)胞不一定都是同一等級(jí)的，因此，一個(gè)已發(fā)展的腫瘤可能包含多種不同的結(jié)構(gòu)、功能、生長潛力、藥物或X光抗性以及不同的侵犯和轉(zhuǎn)移能力。上述兩限制都降低了腫瘤組織檢查的效力，再者，通過取樣樣本的檢查也不適合大規(guī)模的檢查。長期以來，科學(xué)家們嘗試過許多尋找惡性腫瘤絕對(duì)標(biāo)記的方法，如試圖確定腫瘤特定或者腫瘤相關(guān)的蛋白，然后直接測(cè)量或者用此蛋白發(fā)展專一性抗體，不僅提供診斷方法還進(jìn)一步提供破壞癌細(xì)胞的策略，但這些技術(shù)都還在發(fā)展中。某些有關(guān)癌癥的報(bào)導(dǎo)已經(jīng)揭露許多物質(zhì)在活體中與癌癥有相關(guān)性，如腫瘤胎抗原(OncofetalAntigen),像a-胎甲球蛋白(Alpha-fetoprotein);血清蛋白，像鐵蛋白(Ferritin);酶、多胺體(polyamines)、異構(gòu)的荷爾蒙、細(xì)胞表面標(biāo)志、受體或者腫瘤相關(guān)病毒抗原等，但是，大部分用于診斷癌癥的方法主要還是根據(jù)前述的組織顯微鏡檢查，目前仍缺乏癌癥的絕對(duì)標(biāo)記。近年來的研究結(jié)果提供了尋找與癌化作用有關(guān)的物質(zhì)的一些新想法癌癥的起因與許多基因的不正常表達(dá)有關(guān)，這些基因造成致癌基因的活化或是腫瘤抑制基因的不活化，此外，這些與致癌基因相關(guān)的基因其表現(xiàn)程度與正常細(xì)胞的差異性能夠由信使RNA(messengerribonucleicacid;mRNA)的表達(dá)量反映，為了從大量mRNA有效率地篩選出變異基因的mRNA，使用差異顯示技術(shù)(DifferentialDisplay)可用來分離出一小部分的基因，其為正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞在表現(xiàn)層面上不同的基因(LiangCancerResearch52，6966-6968，1992)。肝癌(HCC)是世界的最普遍的癌癥之一，肝癌通常由化學(xué)致癌物引起肝硬化和病毒感染從慢性發(fā)炎的肝疾病發(fā)展而成(Yu，M.W.etal.，CW/ev.Ozco/〃e脂/o/'17，71-91，1994;Schafer，D.F.etal.，""ce/353，1253-1257，1999;Williams，丄H.etal.，Az.J.C7/力.80，1106-1122，2004)。在某些地區(qū)(例如中國和非洲)肝癌的形成主要?dú)w因于B型和C型肝炎，或是被黃曲毒素(aflatoxin)污染的食物，以及其它形式的黃曲毒素?cái)z取(Williams，丄H.etal.，ZI/t.J.C///7./V〃/廠.80，1106-1122，2004;Chen，C丄，〃e/^to/og/16，1150-1155，1992)。黃曲毒素是由曲菌屬黃曲菌(Aspergillusflavus)及曲菌屬寄生曲菌(Aspergillusparasiticus)在潮濕的環(huán)境下所產(chǎn)生的二級(jí)代謝產(chǎn)物，這些菌被發(fā)現(xiàn)普遍存在于像米這樣的飲食的纖維、谷物、木薯、堅(jiān)果、花生、辣椒和香料等上(McLean，M.&Dutton，M.F.，P力a廠脂co/廠力e廠.65，163-192,1995)?；瘜W(xué)制品或者異種生物素(xenobiotics)等，例如黃曲毒素，在生物體內(nèi)可能會(huì)在代謝過程中改變本身的性質(zhì)，因而產(chǎn)生毒性。舉例來說，在解毒路徑(detoxificationpathway)的第一階段(phasel)中，細(xì)胞色素P450(cytochromeP450;CYP)異構(gòu)酶(由多環(huán)芳香烴和氯化烴所誘發(fā))會(huì)將一個(gè)氧原子加到受質(zhì)上；此時(shí)生物活化作用(bioactivation)是偶發(fā)的并發(fā)現(xiàn)象(Hsieh，D.P.H.，ElsevierScientificPublishers,Amsterdam,1986;Hsieh，D.P.H.，Academic,Cambridge,1987;Aoyama,T.etal.，戶廠oc.顏A^.Sc/:〃.<S./487，4790-4793，1990;Swenson，D.H.etal"^c/7e/77.S/ip/7/s.Zes.Co/77/77〃".60，1036-1043，1974)，而解毒路徑中的中間產(chǎn)物黃曲毒素B18，9—環(huán)氧化合物(epoxide)(由C丫P異構(gòu)酶，例如細(xì)胞色素P450IA2和P450川A4產(chǎn)生)對(duì)于很多動(dòng)物是一種致癌因子；它能夠與肝細(xì)胞的脫氧核糖核酸(deoxyribonudeicacid;DNA)結(jié)合，此步驟被證明是在肝細(xì)胞癌化(hepatocarcinogenesis)中的關(guān)鍵步驟(Forrester，LM.，etal.，戶廠oc.A:3d/Sc/:"S./187，8306-8310，1990;Koser，P丄.etal.，JS/b/.C/7e爪263，12584-12595，1988)。在第二階段(phaseII)反應(yīng)中主要作用的酶是屬于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)族，它們負(fù)責(zé)催化具有潛在毒性的親電子化合物(electrophiles)與還原型谷胱甘肽(GSH)三勝肽接合，使其不具毒性(Degen，G.H.&Neumann，H.G.，C/7e/77.S/b//〃/e/sc/.22，239-255，1978;Hayes,丄D.etal.，戶/7a廠mac0/7"力e/:50，443-472，1991)。然而，該反應(yīng)中的黃曲毒素B18，9一環(huán)氧化合物卻會(huì)損壞DNA，其損壞原因主要是在活體內(nèi)形成AFB^DNA加合物，更精確的來講，為形成AFB1-N7鳥嘌呤(guanine)加合物(Croy，R.G.et.al.，P廠oc./Va"/leadSc/:d/S./175，1745-1749，1978;Kensler，T.W.etal.，Cs〃ce廠/es.46，3924-3931，1986)。目前有至少兩份研究指出AFB1與DNA共價(jià)結(jié)合會(huì)引起p53第249堿基對(duì)G:C到T:A的轉(zhuǎn)換(transversion)，是AFB1造成變異的發(fā)生(mutagenesis)(Bressac，B.et.al.，/Va/"廠e350，429-431，1991;Hsu,I.C.etal.，/Vs/〃廠e350，427-428)。甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(GlycineN-Methyltransferas;GNMT)是一種細(xì)胞內(nèi)的酶，能夠?qū)⒏翁谴x為肌氨斷sarcosine)，其代謝機(jī)制為肝糖可通過GNMT從S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine;SAM)得到一甲基，肝糖就能轉(zhuǎn)變成肌氨酸，肌氨酸能再被肌氨酸脫氫酶(sacrossinedehydrogenase)氧化轉(zhuǎn)換回肝糖。在GNMT將肝糖代謝為肌氨酸的過程中會(huì)釋放能量，并且SAM會(huì)失去一個(gè)碳原子成為腺甘高半胱胺酸(S-adenosylhomocysteine;SAH),因此，GNMT在人體細(xì)胞內(nèi)SAM與SAH的濃度調(diào)節(jié)中扮演很重要的角色。GNMT在大鼠肝臟中的特性指出它也能調(diào)節(jié)甲硫氨酸的新陳代謝以及SAM在組織中的濃度(Ogawa，H.etal.，丄Biol.Chem"257:3447-3452，1982)，例如GNMT的活性隨著飲食中甲硫氨酸的量而波動(dòng)，且易被含有高甲硫氨酸的飲食所誘發(fā)。不過，GNMT被發(fā)現(xiàn)僅與體內(nèi)20yo的甲硫氨酸新陳代謝有關(guān)(Caseetal.，丄Nutr.106:1721-1736，1976)，但是GNMT在成年大鼠或成年小鼠的肝臟中表達(dá)量非常多，幾乎是肝臟中所有蛋白質(zhì)的1%到3%(Headyetal.，丄Biol.Chem.，248:69-72,1973)。因此，GNMT可能有其它重要的生理功能，其中之一與從大鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)中純化出的葉酸結(jié)合(folate-binding)蛋白相似((Cook，R.丄etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3631-3634，1984)，最近，羅發(fā)(Raha)等人(丄Biol.Chem.，269:5750-5756)證明了GNMT是一種4S多環(huán)芳香碳水化合物結(jié)合(4Spolycyclicaromatichydrocarbon-binding)蛋白，它會(huì),與細(xì)胞色素P4501A1基因的5端側(cè)邊區(qū)域(5'-flanking)作用。而且，GNMT是在肝臟細(xì)胞里的最豐富和有效率的甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)，GNMT的活性可以影響其它的甲基轉(zhuǎn)移酶，例如，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transferribonucleicacid;tRNA)甲基轉(zhuǎn)移酶的活性可以被GNMT抑制(Kerretal.,丄Biol.Chem.，247:4248-4252,1972)。來自各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果指出抗脂肪肝(lipotropic)的化合物，例如SAM和它的前驅(qū)物甲硫氨酸，膽堿及甜菜堿，能防止在大鼠或小鼠模型內(nèi)各種致癌物引起的肝腫瘤的發(fā)展。由于GNMT在肝臟細(xì)胞里與SAM表現(xiàn)量高度相關(guān)，并且它的酶活性可能可以被SAM活化，因此，GNMT可能與肝癌形成機(jī)制有關(guān)(Pascaleetal.，AnticancerRes.，13:1341-1356'1993)。已有研究結(jié)果顯示，在人類肝癌細(xì)胞株和腫瘤組織中，GNMT的表現(xiàn)量都有顯著的下降(Liu，H.H.etal，乂S/b/7edSc/:10，87-97，2003;Chen，Y.M.etal.,///乂Ca/7ce廠75，787-793，1998)。人類GNMT基因座落于染色體6p12并且有基因多形性(polymorphism)(Chen，Y.M.etal.，Ge/70/77/bs66，43-47，2000)。人類的基因型分析顯示出GNMT基因的基因多形性在肝癌組織中36%~47%的遺傳標(biāo)記(geneticmarker)中缺少異型合子性(Tseng，T丄.etal.,Cs/7ce廠/es.63:647-654，2003)，另夕卜，亦有研究結(jié)果指出，GNMT參與苯并蒎(benzo(a)pyrene;BaP)解毒路徑以及減少在有GNMT表現(xiàn)的細(xì)胞中的苯并芘環(huán)氧化合物-DNA加合物(benzo(a)pyrenediolepoxide-DNA;BPDE-DNA)產(chǎn)生(Chen，S.Y.etal.，Ca/ce廠/es.64，3617-3623,2004)。先前的研究結(jié)果顯示，有許多蛋白質(zhì)能夠與在大鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)中的黃曲毒素B1(AFB"結(jié)合(Taggart，P.etal.，P/"ocEv.5/》/182，68-72，1986)，而那些能夠與AFB!結(jié)合的細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)很可能作用于傳送、代謝甚至活化致癌因子(Dirr，H.W.&Schabort,丄C.，^/bc/;e/77,///.14，297-302，1987)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種基因剔除小鼠的制備方法，是用基因重組的方法破壞所述小鼠染色體上GNMT的基因座，其中所述破壞位置位于SEQNO.8的547-4875，所述基因剔除小鼠相較于野生型具有不正常的肝功能表現(xiàn)型。其中，優(yōu)選所述破壞位置位于GNMT基因的外顯子1至4及外顯子5的部分序列。其中，所述基因剔除小鼠的表現(xiàn)型缺乏GNMT活性或其GNMT活性低于野生型小鼠。其中，所述GNMT基因是利用與異源核酸序列重組的方式破壞。其中，所述的異源核酸序列是抗新霉素的基因序列。其中，所述的不正常肝臟功能包括SAM、ALT或AST的上升。本發(fā)明還提供一種預(yù)測(cè)備選化合物對(duì)預(yù)防或治療肝癌或其它肝臟疾病的治療效果的方法，其包括下列步驟(1)以備選化合物對(duì)權(quán)利要求1制備的基因剔除小鼠給藥，并且，(2觀察該基因剔除小鼠的肝功能變化。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種篩選能預(yù)防或治療肝癌或其它肝臟疾病的試劑的方法，其包括以下步驟-(1)以備選化合物對(duì)權(quán)利要求1制備的基因剔除小鼠給藥，并且，(2)觀察該基因剔除小鼠的肝功能變化，并且，(3)挑選出能預(yù)防或治療肝癌或其它肝臟疾病的試劑。其中所述的其他肝臟疾病為肝糖儲(chǔ)積癥、肝臟發(fā)育不良或脂肪肝。本發(fā)明還提供一種細(xì)胞，其由基因剔除小鼠制備，所述基因剔除小鼠的染色體上GNMT的基因座是用基因重組的方式破壞，其中所述破壞位置位于序列8的547-4875，所述基因剔除小鼠相較于野生型具有不正常的肝功能表現(xiàn)型。其中，所述細(xì)胞為未分化的細(xì)胞群，如干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞或者胚胎細(xì)胞。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供一種預(yù)防或治療黃曲霉素所引發(fā)的疾病的試劑，其含有有效劑量的GNMT蛋白質(zhì)或含有GNMT基因的載體。其中，所述GNMT為雙體或四體結(jié)構(gòu)。其中，所述的黃曲霉引起的疾病為肝癌。本發(fā)明在發(fā)明過程中發(fā)現(xiàn)GNMT基因的表現(xiàn)量是在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中一個(gè)重要的區(qū)別。所以，本發(fā)明目標(biāo)的其中之一是通過確定GNMT基因表現(xiàn)的相關(guān)水平提供一種異常(癌化)細(xì)胞的檢測(cè)方法；此外，本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供一種通過把GNMT轉(zhuǎn)基因入異常細(xì)胞來修復(fù)細(xì)胞癌化的方法。本發(fā)明提供一種非人類基因轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，其可用于篩選精神性藥物，該基因轉(zhuǎn)移動(dòng)物已具有從基因?qū)用娓淖兊腉NMT基因。對(duì)該基因的改變包括刪除或者其它功能喪失的突變，或者植入外來基因其具有特定或者隨機(jī)的突變的核苷酸順序，或者植入一種其它種類動(dòng)物的外來基因，或者可為上述各種方法的結(jié)合，而且該基因轉(zhuǎn)移動(dòng)物可以是同型合子或者異型合子。目前已知，GNMT在經(jīng)過AFB!處理之后，會(huì)經(jīng)歷核轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象，根據(jù)本發(fā)明的試驗(yàn)結(jié)果，AFBi系與SAM競(jìng)爭(zhēng)GNMT上同一個(gè)結(jié)合位置，而實(shí)驗(yàn)證據(jù)也顯示增加GNMT的量可降低AFBLDNA加合物的形成以對(duì)抗AFB^萬引起的細(xì)胞毒性，并且可提高經(jīng)八「81處理過的細(xì)胞的存活率。此外，由基因轉(zhuǎn)移小鼠模型所顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出GNMT的過量表現(xiàn)對(duì)于AFB1所引發(fā)的肝癌具有預(yù)防作用。本發(fā)明提供一種治療因AFB1引發(fā)之疾病的方法，其為提供病患有效數(shù)量的GNMT或者包含GNMT的載體，而此治療方法以治療肝癌為佳。目前，此治療或預(yù)防的方法是阻止AFB^DNA加合物的形成。然而，對(duì)于基因治療來說，載體可以是當(dāng)今基因治療技術(shù)直接注入患者體內(nèi)的質(zhì)粒疫苗。本發(fā)明提供一種基因剔除小鼠，其染色體上GNMT的基因座已被利用基因重組的方式破壞，其中該破壞位于序列8之547-4875，該破壞造成一相較于野生型具有不正常肝臟功能的性狀。再者，本發(fā)明的創(chuàng)造性在于其以基因重組破壞的GNMT核酸序列位于外顯子(exon)1-4部分的外顯子5。本發(fā)明的基因剔除小鼠缺乏GNMT活性的表現(xiàn)型(phenotype)是因?yàn)橄噍^于野生型小鼠其有較少的成熟GNMT蛋白質(zhì)表現(xiàn)數(shù)量。在本發(fā)明的基因剔除小鼠的制備過程中，GNMT基因通過與外來的核酸序列(例如:新霉素)重組而遭到破壞。此處的專有名詞"肝功能異常"(abnormalliverfunction)包含但不限于SAM、ALT或者AST表現(xiàn)量的升高。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(TRANSGENICANIMALS)"轉(zhuǎn)基因"(transgene)—詞此被用于描述一遺傳物質(zhì)被人工插入一哺乳動(dòng)物的細(xì)胞的染色體中，特別是指一活體哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因是用來轉(zhuǎn)化(transform)細(xì)胞，利用與外來DNA的結(jié)合造成一種永久或者暫時(shí)性的遺傳(genetic)變化，盡可能一種永久的基因型變化。永久的遺傳變化一般是利用注入一種DNA到細(xì)胞的染色體而實(shí)現(xiàn)。能夠穩(wěn)定攜帶遺傳物質(zhì)至宿主細(xì)胞的載體包括質(zhì)粒(plasmid)、反轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)和其它動(dòng)物病毒或是人工酵母菌染色體(yeastartificialchoromosome;YAC)等等。目前常用于轉(zhuǎn)基因的哺乳動(dòng)物包括牛、豬、山羊、馬以及最常使用的嚙齒類動(dòng)物如大鼠、小鼠等等。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括一種表現(xiàn)如自身染色體或是穩(wěn)定融合入該動(dòng)物所有或是部分細(xì)胞，尤其是生殖腺細(xì)胞的外來核酸序列。除非另作指出，否則將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將被認(rèn)為包含有生殖腺細(xì)胞核酸序列的穩(wěn)定變異。在一開始建立該動(dòng)物的時(shí)候，先制作出"嵌合體"(chimera)，或是稱為"嵌合動(dòng)物"(chimeraanimal),其中只有一部份的細(xì)胞具有被改變的基因，培育嵌合體的主要目的是為了產(chǎn)生目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，當(dāng)嵌合體的培育產(chǎn)生一具有異型合子的基因變異的動(dòng)物時(shí)，雄性和雌性異型合子通常被用于繁殖產(chǎn)生同型合子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分成兩組，一般稱之"基因剔除動(dòng)物"(knockouts)和"基因楔入動(dòng)物"(knockins)。本發(fā)明所提供的基因剔除動(dòng)物的GNMT基因在其中一個(gè)或兩個(gè)對(duì)偶基因(allele)上有部分或完整功能喪失；基因楔入動(dòng)物是有加入一已改變序列或功能的內(nèi)生基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，此兩動(dòng)物模型可以結(jié)合以供研究使用，如同病人先天上在基因型具有缺陷或者變異。在基因剔除的過程中，盡可能使目標(biāo)基因的表現(xiàn)量降低至無法探測(cè)或是無顯著意義。GNMT的基因剔除代表GNMT基因的功能已經(jīng)被實(shí)質(zhì)上減少，因?yàn)槠浔憩F(xiàn)量已降低至無法探測(cè)或是無顯著意義。此目的可由多種途徑達(dá)到，包括加入一個(gè)破壞性的序列至目標(biāo)基因，例如插入一個(gè)或多個(gè)的終止碼(stopcodon)、插入一DNA片段、刪除部分的目標(biāo)基因序列或是利用終止碼代替目標(biāo)基因的一般密碼子等等，而在某些例子中，外來的基因轉(zhuǎn)移序列最終會(huì)被刪除，留下已被改變的原序列。另外，還有許多不同的方法可以用來達(dá)到"基因剔除"的效果，例如一原基因所在的染色體部分或全部的刪除，包括非密碼(non-coding)區(qū)域的刪除，尤其是啟動(dòng)子(promotor)區(qū)域、3端調(diào)節(jié)(regulatory)序列、增強(qiáng)子(enhancer)或是刪除某些能夠活化GNMT表現(xiàn)的基因。有效的"基因剔除"也可以用給動(dòng)物。反義(anti-sense)人造核苷酸來阻止目標(biāo)基因的表現(xiàn)。此外，"基因剔除"也包括"條件式基因剔除"(conditionalknock-out)，例如將動(dòng)物暴露于可以促使目標(biāo)基因變異的物質(zhì)下而發(fā)生目標(biāo)基因變異、加入一個(gè)可以促使目標(biāo)基因重組的酶(例如Cre-lox系統(tǒng)中的Cre)或其它可在動(dòng)物出生后(postnatal)引導(dǎo)目標(biāo)基因變異的方法等。在本發(fā)明中，目標(biāo)基因的"基因楔入"意為宿主細(xì)胞的染色體改變導(dǎo)致GNMT的表現(xiàn)量或是功能發(fā)生變異。于動(dòng)物的染色體額外加入一份(copy)的目標(biāo)基因可以提升(包括外加的；ectopic)或者降低該目標(biāo)基因的表現(xiàn)量，或是以人工插入，可提升或降低內(nèi)生(endogenous)目標(biāo)基因表現(xiàn)量的調(diào)節(jié)序列，例如活化子(activitor)與抑制子(r印resser)，亦可改變目標(biāo)基因的表現(xiàn)量。而上述變異可以是組成性的(constitutive)或者有條件性的。通常用于轉(zhuǎn)基因的外來基因是來自于與宿主不同種類的動(dòng)物，或者以其它方法改變其密碼子或非密碼子，用于載體構(gòu)建(constmct)的基因可以是一野生型而具有基因多形性(polymorphism)的基因，或者是一人工造成變異的基因，例如在密碼子或非密碼子區(qū)域刪除(deletion)、取代(substitution)或者插入(insertion)部分序列，用于載體構(gòu)建的基因可以是GNMT的基因。此外，當(dāng)用于載體構(gòu)建的基因是一個(gè)密碼子序列時(shí)，其通常會(huì)以"可操作的連結(jié)"(operablylinked)接著一個(gè)啟動(dòng)子或者其它目標(biāo)基因表現(xiàn)時(shí)需要的調(diào)節(jié)序列。"可操作的連結(jié)"意為核酸序列或者調(diào)節(jié)序列以適當(dāng)?shù)膬啥涡蛄薪Y(jié)合而能使基因表現(xiàn)，例如轉(zhuǎn)錄活化蛋白(transcriptionalactivatorprotein)與調(diào)節(jié)序歹U的連結(jié)。本發(fā)明可用于載體構(gòu)建的目標(biāo)基因包含但不限于能抑制GNMT表達(dá)的反義GNMT基因、GNMT負(fù)面顯性突變的序列(dominantnegativemutation)以及能造成GNMT的過量表達(dá)的序列，而上述的序列通常會(huì)加入一個(gè)可探測(cè)的標(biāo)記(marker)(例如:lacZ)，其過量表達(dá)會(huì)造成易于探測(cè)的表現(xiàn)型改變。GNMT基因中，不同外顯子的功能可以利用一系列的小量序列刪除和/或替代來判定，例如制造提供DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的外顯子，或是制造轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的外顯子等等。另外，提供給平常不表達(dá)或是不正常表達(dá)GNMT的細(xì)胞GNMT蛋白質(zhì)，可能可以造成該細(xì)胞的行為改變，亦可據(jù)此來了解完整GNMT或者GNMT部份外顯子的功能。用于載體構(gòu)建的基因可以包含至少一部分具有預(yù)期修飾的GNMT基因片段，與一部分和目標(biāo)基因座(locus)相同(homology)的區(qū)域，以便插入正確區(qū)域。而隨機(jī)插入性的重組DNA建立并不需要包含上述和目標(biāo)基因座相同的部分來控制插入位置。另夕卜，構(gòu)建包含有正向和負(fù)向篩選標(biāo)記(selectionmarker)的載體，能使篩選出含有目標(biāo)基因的細(xì)胞較為方便，是在此技藝中為人熟知的。對(duì)于胚胎干(embryonicstem;ES)細(xì)胞來說，單一ES細(xì)胞株，或者從活體宿主(例如小鼠、大鼠、天竺鼠等)身上取得的胚胎細(xì)胞都可被應(yīng)用。上述細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)以適當(dāng)?shù)睦w維母細(xì)胞作為喂養(yǎng)細(xì)胞，或是以適當(dāng)?shù)纳L因子培養(yǎng)，例如白血病抑制因子(leukemiainhibitorfactor;LIF)。當(dāng)ES細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化(transform)時(shí)，便可以用來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在形變之后，細(xì)胞被培養(yǎng)在一含有適當(dāng)培養(yǎng)液(medium)的喂養(yǎng)層(feederlayer)上，包含該目標(biāo)載體的細(xì)胞可以過提供依選擇性培養(yǎng)液(selectionmedium)而被探測(cè)到。經(jīng)過足夠的培養(yǎng)時(shí)間，使該含有目標(biāo)載體的細(xì)胞群落(colony)成長，便可挑出細(xì)胞以供分析該目標(biāo)載體的重組方式或是插入方式，以確認(rèn)該目標(biāo)載體是否包含本發(fā)明所需的序列，若包含本發(fā)明所需的序列，則該載體可用于胚胎處理(embryomanipulation)禾口囊胚注射(blastocystinjection),囊胚可由經(jīng)過超級(jí)排卵(superovulate)處理過的4到6周大的母鼠取得，ES細(xì)胞經(jīng)過胰蛋白酶(trypsin)處理過后便注射入囊胚腔(blastocoel)，注射之后，將囊胚送至假孕(pseudopregnant)的代理孕母的的子宮角(uterinehom)，代理孕母便可進(jìn)入懷孕期，所繁殖出的后代(resultinglitter)經(jīng)過篩選后便可得知是否帶有含目標(biāo)載體的突變細(xì)胞，若目標(biāo)載體能給予囊胚或是.ES細(xì)胞不同的表現(xiàn)型，該后代便可以很容易的被探測(cè)到。另外，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種細(xì)胞或者細(xì)胞株，其為從本發(fā)明的基因剔除小鼠制備而得。在較佳的實(shí)施方式中，該細(xì)胞或者細(xì)胞株是從其細(xì)胞群集中挑出的未分化者，例如干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、卵母細(xì)胞(oocyte)或者胚胎細(xì)胞。前述的嵌合動(dòng)物會(huì)經(jīng)過是否表現(xiàn)被修飾的基因及是否由含有被修飾的基因的父母所產(chǎn)生的同型合子的篩選。若該基因變異會(huì)在發(fā)育過程中造成死亡(lethality),該動(dòng)物的組織或者器官仍可作為同種異體(allogeneic)或是同基因型(cogenic)的移植，或是體外培養(yǎng)。本發(fā)明之發(fā)明人感興趣的核酸序列，其介于起始密碼子與終止密碼子之間，包含所有正常表現(xiàn)于野生型動(dòng)物染色體的內(nèi)含子，該序列可能進(jìn)一步包含在成熟(mature)mRNA中發(fā)現(xiàn)的3端到5端未轉(zhuǎn)譯區(qū)域，或者專一性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序歹!j(transcriptionalregulatorysequence)或轉(zhuǎn)譯調(diào)控序歹U(translationalregulatorysequence)(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等等)，或者染色體側(cè)翼區(qū)3端或5端(約1Kb或者大于1Kb)的轉(zhuǎn)錄區(qū)域。然而，該序列可能被孤立為一100Kb或者更小的片段，并且實(shí)質(zhì)上不位于染色體側(cè)翼區(qū)。.本發(fā)明進(jìn)一步提供一種篩選預(yù)防或治療肝癌或其它疾病的候選試劑(agent)的方法，其包含1.一種基因剔除小鼠；2.提供給該基因剔除小鼠一種候選試劑;及3.比較已提供受試藥物及未提供候選試劑的基因剔除小鼠的肝臟功能，其中該候選試劑若能改善肝臟功能，則可被篩選出為預(yù)防或治療肝癌或其它疾病的有效試劑。通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或者其細(xì)胞的使用，可鑒定與GNMT多肽鏈接合的配體(ligand)或受質(zhì)的功能為調(diào)節(jié)(modulate)、對(duì)抗(antagonize)或者促進(jìn)(agonize)等等。篩選對(duì)GNMT多肽鏈沒有影響的試劑也是本方法的應(yīng)用之一，例如:用于篩選對(duì)人類毒性較低的試劑。目前有許多分析可用于此目的，包括試劑的活體內(nèi)行為研究、服用后試劑的體內(nèi)定位、體外的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合分析、蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合分析、電泳遷移率檢測(cè)(ElectrophoreticMobilityShiftAssay;EMSA)、蛋白質(zhì)免疫結(jié)合分析等等，根據(jù)不同的分析方法，可能會(huì)用到整只動(dòng)物體或者只用到其細(xì)胞，當(dāng)需要用到其細(xì)胞時(shí)，該細(xì)胞可從活體內(nèi)取出，或者從以獲得永生(immortalized)生長能力的細(xì)胞株取出，其中優(yōu)選的細(xì)胞為從腦組織或神經(jīng)組織中取出的細(xì)胞。該專有名詞"試劑"(agent)在本說明書中意指所有分子，例如:蛋白質(zhì)或其它藥物性分子，其具有影響GNMT多肽鏈在生物體內(nèi)的任何活動(dòng)行為的能力的試劑。通常來說，實(shí)驗(yàn)者會(huì)同時(shí)利用許多分析，并且以不同濃度的試劑來測(cè)試，并且會(huì)有設(shè)定一個(gè)濃度做為負(fù)向控制組，例如:濃度為0或是一個(gè)低到無法探測(cè)的濃度。在較佳的實(shí)施方式中，該試劑是用于預(yù)防或治療肝癌、肝糖儲(chǔ)積癥、肝發(fā)育不良或者脂肪肝等。上述的候選試劑包括許多化學(xué)制劑，其大部分為有機(jī)分子，且較佳為50至2500道爾頓的小分子，候選試劑具有能與蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上交互作用的必要官能團(tuán)(founctiongroup),尤其是能形成氫鍵的官能團(tuán)，例如:胺基(amine)、羰基(carbonyl)、羥基(hydroxyl)以及羧基(carboxyl)等等，其中以羥基及羧基最易形成氫鍵。候選試劑也可以從(但不限于)下列生物性分子中尋找多肽鏈、糖類、脂肪酸、固醇類、嘌呤、嘧啶等，及生物性分子的衍生物、結(jié)構(gòu)類似物(analog)或其組合物等。該候選試劑可從許多途徑取得，包括各種合成或天然的化合物，例如用各種化學(xué)合成方法取得，像是寡核苷酸(oligonucleotide)或寡肽鏈(oligop印tide);或是由細(xì)菌、真菌、植物，或動(dòng)物體內(nèi)萃取得來。此外，化學(xué)合成或自然產(chǎn)生的候選試劑可以被化學(xué)、物理或生化方法來修飾，例如酰基化(acylation)、烷化(alkylation)、酯化(esterification)以及酰胺化(amidification)等等，可用于產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。通過篩選，可直接了解具藥物活性的化合物及其化學(xué)類似物，而本發(fā)明所提供的方法主要可應(yīng)用但不限于已知抗肝癌藥物或其它具顯著保肝(hepatoprotective)效果的藥物。本發(fā)明進(jìn)一步提供一對(duì)引物(primer)以用于制造于基因剔除小鼠，其為(1)SEQID1禾卩2或(2)SEQID3禾口4。本發(fā)明進(jìn)一步提供一個(gè)GNMT基因剔除小鼠的調(diào)節(jié)基因數(shù)據(jù)庫，包含上調(diào)節(jié)(up-regulatory)和下調(diào)節(jié)(down-regulatory)。本發(fā)明進(jìn)一步提供一個(gè)肝癌訊息傳遞基因數(shù)據(jù)庫，其包含1.有關(guān)生存及生長(proliferation)的基因PTEN、PI3K、Akt1、GSK3P或3-連鎖蛋白2.致癌基因CyclinD1、C-myc者C-Jun;及3.腫瘤抑制基因Rb者p53。其中PTEN(phosphataseandtensinhomolog)為同源性磷酸酶及張力蛋白；PI3K(phosphatidylinosito13—kinase)為磷脂酰肌醇-3-激酶；GSK3P(glycogensynthasekinase)為肝糖合成酶；Rb(retinoblastoma)為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步提供一組合物，其包含GNMT蛋白質(zhì)與藥物或食物性載體，可用于預(yù)防或治療AFBV萬以起的疾病，在較佳的實(shí)施方式中，GNMT是以雙體(dimeric)或者四體(tetrameric)的形式使用。本發(fā)明所提供的組合物可應(yīng)用作為一般食物添加物(例如米、谷物、木薯、堅(jiān)果、花生、辣椒或香料等)。本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的任何特定方法、配方、細(xì)胞株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、構(gòu)建的載體、試劑等等，本領(lǐng)域的技術(shù)人員皆可做適當(dāng)?shù)淖兓?，所作的變化仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外，本說明書中所使用到的專有名詞僅為描述特定的實(shí)施方式，其并不限制本發(fā)明應(yīng)用范圍。本說明書中所使用到的任何專有名詞，除非另行做定義，否則其意義皆與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
相關(guān)的技術(shù)人員所理解的專有名詞相同。同時(shí)，本說明書所記載的實(shí)施方式僅揭露實(shí)行或測(cè)試本發(fā)明較佳的方法、器材和材料，但是任何相似或等同于本說明書所所記載的實(shí)施方式揭露的方法、器材和材料皆可用于實(shí)行或測(cè)試本發(fā)明。本說明書所有提及的參考文獻(xiàn)皆用于描述或揭露與本發(fā)明所屬領(lǐng)域相關(guān)的知識(shí)，例如細(xì)胞株、載體構(gòu)建及各種方法等，且該參考文獻(xiàn)皆于本發(fā)明申請(qǐng)?jiān)恢皢为?dú)揭露其所屬領(lǐng)域相關(guān)的知識(shí)，因此本發(fā)明的技術(shù)及發(fā)明成果并非顯而易見。下列的實(shí)施方式用于解釋和詳細(xì)介紹本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。本發(fā)明的實(shí)施方式已盡力使所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(例如數(shù)量、溫度、濃度等)達(dá)到最精確，但是仍然具有許多不可抗的因素所產(chǎn)生的誤差，該誤差是被允許的。另外，除非另作解釋，否則本發(fā)明所提及的百分比皆為重量百分比、分子量皆為平均分子量、溫度皆為攝氏溫度以及壓力皆為位于大氣壓力下所計(jì)算的壓力。圖1為目標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建的流程圖，10為TK載體；11為入噬菌體殖株3-2;20為pNeo載體；50為已接合右段(rightarm)的TK載體；60為已接合左段(leftarm)的pNeo載體;70為完成的目標(biāo)載體;80為目標(biāo)載體的直線型。圖2GNMT基因座重組修飾概要說明圖，(90為原內(nèi)生等位基因；100為目標(biāo)等位基因)(A)目標(biāo)質(zhì)粒被設(shè)計(jì)為以抗新霉素(新霉素)基因置換GNMT外顯子1-4及部份外顯子5。正向選擇(positiveselection)指標(biāo)抗新霉素基因夾于兩GNMT同源區(qū)域之間，整個(gè)GNMT同源區(qū)域的3端尾端接著一個(gè)負(fù)向選擇(negativeselection)指標(biāo)胸苷激酶(ThymidineKinase;TK)。(B)胚胎干細(xì)胞的Southen雜交分析。由BamHI-BamHI限制酶酶切而得的脫氧核糖核酸(DNA)片段由7.9kb(kilobasepair)減小至5.3kb。(C)GNMT基因剔除小鼠基因型的聚合酶連鎖反應(yīng)(polymerasechainreaction;PCR)分析。正常GNMT基因產(chǎn)生一772bp(basepair)的DNA片段，被破壞的GNMT基因產(chǎn)生一個(gè)409bp的DNA片段。+/+為野生型；+/-為GNMT異型合子；-/-為GNMT-/-同型合子。(D)GNMT蛋白質(zhì)表現(xiàn)量之Western雜交分析。每條泳道含有10微克的肝臟細(xì)胞(lysate)。GNMT蛋白質(zhì)重量為32千道耳吞(KDa)。甘油醛磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphotatedehydrogenase;GAPDH)為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)部控制變因(intemalcontrol)。圖3為參與單碳代謝途徑的基因在信使RNA(messengerribonucleicacid;mRNA)層面表現(xiàn)量的定量聚合酶連鎖反應(yīng)(real-timePCR)分析柱狀圖，圖中WTM代表野生型雄性小鼠；KOM代表GNMT-/-同型合子雄性小鼠；KOF代表GNMT-Z-同型合子雌性小鼠。單星號(hào)處("P值小于0.05。Ahcy為S-腺同半胱胺酸水解酶(S-adenosylhomocysteinehydrolase);Ms為甲硫胺酸合成酶(methioninesynthase);Cbs為胱硫醚貝塔合成酶(cystathioninebeta隱synthase);Mthfr為5，10甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolatereductase);Mthfdl為甲基四氫葉酸去氫酶(methylenetetrahydrafolatedehydrogenase);Aldh1M為醛類去氫酶(aldehydedehydrogenase)家族的L1成員；Atic為5-胺基脒脞-4-羧鹽胺核糖核苷酸甲?；D(zhuǎn)移酶/肌核苷單磷酸鹽環(huán)化水解酶(5-aminoimidazole-4-carboxamideribonucleotideformyltransferase/IMPcyclohydrolase);Shmt2為絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2(serinehydroxymethyltransferase2);Mthfs為5,10甲基四氫葉酸合成酶(5，10-methenyltetrahydrofolatesynthetase);Ftcd為亞氨甲基轉(zhuǎn)移酶環(huán)化脫胺酶(formiminotransferasecyclodeaminase)。圖4顯示出GNMT-/-同型合子小鼠在肝臟血清中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase;ALT)蛋白質(zhì)表現(xiàn)量有顯著增加。(A)肝臟重量與體重的比例(B)野生型小鼠、GNMT+/-異型合子小鼠與GNMT-/-同型合子小鼠的ALT蛋白質(zhì)表現(xiàn)量。單星號(hào)處f)P值小于0.05;雙星號(hào)處(")P值小于0.05。(圖中Wildtypemice即為野生型小鼠；GNMT+/-mice即為GNMT+/-異型合子小鼠；GNMT-/-mice即為GNMT-/-同型合子小鼠)圖五為野生型小鼠與GNMT-Z-同型合子小鼠肝臟切片比較圖，肝臟切片來自于(A)野生型雄性小鼠、(B)GNMT+A異型合子雄性小鼠、(C)GNMT-/-同型合子雄性小鼠及(D)GNMT-Z-同型合子雌性小鼠。所有小鼠在犧牲之前都經(jīng)過節(jié)食八小時(shí)。肝臟組織切片的蘇木紫-伊紅染色(H-EStain)如(E)及(l)為11周大野生型雄性小鼠；(F)及(J)為GNMT+/-異型合子雄性小鼠；(G)及(K)為GNMT-Z-異型合子雄性小鼠；(H)及(L)為6閃1/1丁-/-同型合子雌性小鼠；以及(Q)9個(gè)月大的GNMT-/-同型合子雄性小鼠與(S)9個(gè)月大的GNMT-/-同型合子雌性小鼠。肝臟組織切片的過碘酸希夫氏染色(PeriodicAcid-Sch肝;PASStain)如(M)為11周大野生型雄性小鼠;(N)為11周大野生型雌性小鼠；(O)為GNMT-Z-同型合子雄性小鼠;以及(R)9個(gè)月大的GNMT-/-同型合子雄性小鼠與(丁)9個(gè)月大的GNMT-/-同型合子雌性小鼠。(P)為無效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，(E)至(H)的放大倍率為IOO倍；(I)至(T)的放大倍率為400倍。圖6為野生型小鼠與GNMT-/-同型合子小鼠之肝臟血液分析圖。(A)野生型小鼠(實(shí)心圓)與GNMT-/-同型合子小鼠(空心圓)的白細(xì)胞(whitebloodcell)、嗜中性粒細(xì)胞(neutrophils)、嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophile)、嗜堿性粒(basophlis)、淋巴細(xì)胞(lymphocyte)及單核細(xì)胞(monocyte)的細(xì)胞數(shù)目，水平桿(horizontalbar)為平均數(shù)目。(B)野生型小鼠(實(shí)心圓)與GNMT-Z-同型合子小鼠(空心圓)的血清中葡萄糖(glucose)、膽固醇(cholesterol)及三酸甘油脂(triglyceride)的濃度，水平桿為平均濃度。單星號(hào)處("P值小于0.05;雙星號(hào)處(")P值小于0.05，兩者皆與野生型小鼠比較。(圖中GNMT-/-mice即為GNMT-/-同型合子小鼠)圖7為與肝糖儲(chǔ)積癥(GlycogenStorageDisease;GSD)相關(guān)蛋白質(zhì)的mRNA層面表現(xiàn)量的定量PCR(real-timePCR)分析柱狀圖。圖中的mRNA表現(xiàn)量都將野生型小鼠定為1.0做為基準(zhǔn)來比較。(A)11周齡的大鼠；(B)9個(gè)月齡的大鼠。單星號(hào)處("P值小于0.05;雙星號(hào)處(")P值小于0.05。Gys2為肝糖合成酶2(glycogensynthase2);G6Pase為6-磷酸葡萄糖磷酸酶(glucose-6-phosphatase);G6PT為6-磷酸葡萄糖磷酸酶運(yùn)輸?shù)鞍?transporter);Gaa為a-葡萄糖酶(a-glucosidase);Agl為淀粉1，6糖甘酶(amylo隱1，6-glucosidase);Gbe1為分支酶1(branchingenzyme1);Pygl為肝糖磷解酶(glycogenphosphorylase);Phka2為磷解酶激酶a2(phosphorylasekinasea2);Fbp1為果糖1,6雙磷解酶(fructose1，6—bisphosphatase);以及PEPCK為磷酸酰醇丙酮酸羧基激酶(phosphoenolpyruv3tecarboxykinase)。圖8為雄性和雌性GNMT-/-大鼠的超音波、核磁共振攝影(MRI)，H-EStain和網(wǎng)硬蛋白染色(reticulinstain)分析圖。(A)與(G)分別為雄性與雌性GNMT-/-大鼠的肝臟超音波分析結(jié)果；(B)、(C)與(H)、(l)分別為雄性與雌性GNMT-/-大鼠的肝臟MRI分析結(jié)果；(D)與(J)分別為雄性與雌性GNMT-/-大鼠的肝臟解剖;(E)與(K)分別為雄性與雌性GNMT-/-大鼠的肝臟^1-￡Stain分析結(jié)果；(F)與(I)分別為雄性與雌性GNMT-/-大鼠的肝臟和網(wǎng)硬蛋白染色分析結(jié)果。圖9為野生類型和GNMT-/-大鼠早期肝癌診斷標(biāo)志一聚糖蛋白3(glypican-3)、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體1(LYVE1)、凋亡抑制蛋白(survivin)和甲胎蛋白(a-fetoprotein)的定量聚合酶連鎖反應(yīng)分析柱狀圖。圖10為(A-B)GNMT經(jīng)過黃曲毒素B1的處理后的核轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象(nucleartranslocation)。(A)為HA22T細(xì)胞經(jīng)過使用5ugGNMT-Flag質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染并溶于二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide;DMSO)溶液中固定，或者(B)在被固定之前先加入40"M的黃曲毒素隨后與R4(兔子抗GNMT之抗體)血清反應(yīng)。免疫染色法(immunofluorescent)使用與異硫氰酸熒光素(FITC)共軛的山羊抗兔子抗體，細(xì)胞核則利用HoechstH33258染色。Bars為20M。(C至E)為苯并漲(benzo(a)pyrene;BaP)以及黃曲毒素B1(AFB"利用拉馬克(Lamarckian)遺傳算法推測(cè)出與GNMT四級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)接(docking)方式。(C)為BaP(綠色)及AFB乂紅色)分子與大鼠的具有與S-腺苷同半胱胺酸(S-adenosylhomocystine)結(jié)合的形式的GNMT四級(jí)結(jié)構(gòu)(cyan)(PDB代碼1D2H)的對(duì)接方式。(B)為一單體顯示BaP(綠色)及AFB乂紅色)分子。根據(jù)GNMT結(jié)構(gòu)(PDB代碼1D2H)與GNMT-AFB1的對(duì)接方式模型指出GNMT中的幾個(gè)氨基酸殘基(Ala64，Va舊9，Leu136，Gly137和Ser139)與許多AFB!碳原子位置極為接近。(E)為AFB乂左)及BaP(右)的結(jié)構(gòu)。圖11顯示GNMT能對(duì)抗(antagonize)AFB1的細(xì)胞毒素(cytotoxicity)。(A至C)為GNMT的過量表達(dá)(overexpression)降低了AFB1所引起的細(xì)胞毒性。此分析系利用細(xì)胞活性測(cè)試(MTTAssay)來確定AFB1處理過的HuH-7細(xì)胞的生存百分比。(A)為HuH-7細(xì)胞在一系列時(shí)間點(diǎn)用不同量的AFB1處理的存活曲線。50%的抑制性濃度是根據(jù)處理時(shí)間而定的。AFB1在HuH-7細(xì)胞上作用72小時(shí)的50%抑制性濃度(1050)大約為12M。(B)為利用帶有GNMT基因或是控制組綠色熒光蛋白(GFP)基因的腺病毒感染16小時(shí)的HuH-7細(xì)胞，經(jīng)過AFB1處理72小時(shí)后，再由MTTassay測(cè)試。HuH-7細(xì)胞的存活率隨著GNMT重組腺病毒(Ad-GNMT)的劑量的增加而稍微增加；在用8MAFB1處理的HuH-7細(xì)胞中，HuH-7細(xì)胞的存活率隨著Ad-GNMT的劑量的增加而顯著增加。(C)相同的結(jié)果在另一個(gè)測(cè)試系統(tǒng)中亦被發(fā)現(xiàn)HuH-7細(xì)胞通過一個(gè)慢病毒載體(lentiviralvector;LV)將GNMT基因轉(zhuǎn)入(transduct)。單星號(hào)處f)P值小于0.05;雙星號(hào)處(")P值小于0.05。(D至E)為GNMT的過量表達(dá)降低了AFB1DNA加合物(adduct)的形成。(D)SCG2-neg和SCG2-1-1細(xì)胞利用DMSO處理或者在萃取DNA顯示AFB1的濃度。AFB1—DNA加合物以競(jìng)爭(zhēng)性酶連結(jié)免疫吸附分析(enzyme-linkimmunosorbentassay;ELISA)測(cè)量。白色長條和灰色長條分別代表SCG2-neg和SCG2-1-1。數(shù)據(jù)以平均士標(biāo)準(zhǔn)差表示。單星號(hào)處r)P值小于0.05;雙星號(hào)處(")P值小于0.05。(E)為利用附加GFP重組腺病毒(Ad-GFP)和Ad-GNMT感染的GNMTHepG2細(xì)胞來執(zhí)行分析。白色長條指出Ad-GNMT感染的H印G2細(xì)胞；灰色長條指出5MOIAd-GNMT感染的HepG2細(xì)胞；黑色長條指出50MOIAd-GNMT的HepG2細(xì)胞。單星號(hào)處("為利用單因子變異數(shù)分析(One-wayANOVA)。圖12說明GNMT-轉(zhuǎn)基因(transgentic;TG)小鼠和野生型小鼠體內(nèi)GNMT表達(dá)的時(shí)間和酶的活性。(A)圖中，1(中空菱形)為野生型雄性小鼠體內(nèi)GNMT蛋白質(zhì)表現(xiàn)水平;2(實(shí)心菱形)為GNMT-TG的雄性小鼠；3(中空正方形)為野生型雌性小鼠及4(實(shí)心正方形)為GNMT-TG的雌性小鼠，以上以為Western雜交分析(上排組合)以定量數(shù)據(jù)(下排組合)來確定表達(dá)量。結(jié)果顯示GNMT-TG的動(dòng)物比在5周大之前野生類型有更多的GNMT蛋白質(zhì)表現(xiàn)量。(B)為在1野生型雄性；2GNMT-TG雄性；3野生型雌性和4GNMT-TG雌性之間比較GNMT的酶活性。圖13為4組雄性小鼠肝臟的H-Estain和免疫組織化學(xué)染色(lmmunohistochemicalStain;IHCstain)以及通過H-Estain染色的致癌物處理過的小鼠肝臟顯微照片。(A)為AFB1處理過的野生型小鼠，倍率為放大200倍;(B)為用AFB!處理的GNMT-TG小鼠，倍率為放大200倍。GNMT表現(xiàn)在以石蠟油固定的組織內(nèi)以IHCstain來分析，(C)為AFB1處理過的野生型小鼠，倍率為放大200倍;(D)為用AFB1處理的GNMT-TG小鼠，倍率為放大200倍。(E)為從非腫瘤組織(N)以及腫瘤組織(T)中抽提的細(xì)胞萃取物Western雜交分析，結(jié)果顯示在腫瘤組織里的GNMT表達(dá)量比在其它三組小鼠的非腫瘤的組織低。圖14為pPEPCKex-flGNMT質(zhì)粒的構(gòu)建。(A)pPEPCKex(載體)以及pSK-flGNMT(插入片段)以限制酶NotI及XhoI酶切后再黏合以構(gòu)建pPEPCKex-flGNMT。(B)野生型小鼠或GNMT-TG小鼠內(nèi)生(endogenous)的和人類的GNMTmRNA在各種器官內(nèi)的表達(dá)量以Northen雜交分析。(1)GNMT-TG小鼠的腎臟RNA;(2)GNMT-TG的小鼠肝臟RNA;(3)野生型小鼠的大腦RNA。(4)野生型小鼠的腎臟RNA。(5)野生型小鼠的肝臟RNA。結(jié)果顯示GNMT-TG小鼠在肝臟和腎臟里有表現(xiàn)人類GNMT基因(transgene)。附圖標(biāo)記說明10:TK載體；11:人噬菌體殖株3-2;20:pNeo載體；50:己接合右段(rightarm)的TK載體；60:已接合左段(leftarm)的pNeo載體；70:目標(biāo)載體；80:目標(biāo)載體的直線型。90:原內(nèi)生等位基因100:目標(biāo)等位基因具體實(shí)施方式實(shí)施例一如圖1所示，本發(fā)明利用入噬菌體植株(clones)3-2和5-3的DNA片段插入plasmid-pBluescripIIKS中來構(gòu)建目標(biāo)載體，左段(leftarm)部分為通過限制酶PstI從入噬菌體殖株5-3酶切并插入pNeo載體；右段(rightarm)部分為通過限制酶HincII從入噬菌體殖株3-2酶切并插入TK載體，再利用限制酶NotI酶切包含右段部分和TK基因的片段插入帶有左段部份的pNeo載體，進(jìn)而產(chǎn)生目標(biāo)載體?？剐旅顾鼗?用于替換小鼠GNMT基因外顯子1-4和部份外顯子5)在目標(biāo)載體中被夾于兩段DNA片段(3.1kb和3.7kb)之間，胸苷激酶(thymidinekinase;TK)基因被作為負(fù)向選擇標(biāo)記(如圖2中A圖所示)。利用限制酶Ascl將40微克的目標(biāo)載體線狀化(linearize)后利用電穿孔法(electroporation)送入胚胎干細(xì)胞(129/Sv-衍生品系)，經(jīng)過Southen雜交篩選278個(gè)胚胎干細(xì)胞殖株后(如圖2中B圖所示)，得到一個(gè)目標(biāo)殖株，該目標(biāo)殖株被分離后利用顯微注射注入囊胚，獲得4只雄性嵌合小鼠，并且用其繁殖雌性小鼠(C57BL/6品系)。本實(shí)驗(yàn)利用PCR探測(cè)刺鼠(Agouti)的第一子代(F1offspring)是否具有該受破壞基因的性腺遺傳能力(germlinetransmission),將同型合子的F1雄性小鼠與野生型雌性小鼠(C57B/6品系)回交(backcross)后產(chǎn)生品系C57BL/6的小鼠。PCR技術(shù)被用于分辨+/+野生型小鼠、GNMT+Z-異型合子小鼠及GNMT-/-同型合子小鼠，并使用下列引物對(duì)探測(cè)GNMT基因使用GNMT-F(5—'GCGGCGGCCGCATGCTGGTGGAAGAGGGC)及GNMT隱R(5'TTGCAGTCTGGCAAGTGAGC);對(duì)探測(cè)抗新霉素基因使用新霉素-F(5—'GTTCCTTGCGCAGCTGTGCT)及新霉素-R(5'CGGCCACAGTCGATGAATCC)利用上述的GNMT引物，正常的GNMT等位基因會(huì)產(chǎn)生一772bp的片段;而利用上述的新霉素引物，被破壞的GNMT基因產(chǎn)生一個(gè)409bp的片段(如圖2中C圖所示)。利用Western雜交分析肝臟中的GNMT蛋白質(zhì)表現(xiàn)量，相較于野生型小鼠的表現(xiàn)量，GNMT+/-異型合子小鼠的表現(xiàn)量約減少了50%，而GNMT-Z-同型合子小鼠的表現(xiàn)量低至無法探測(cè)(如圖2中D圖所示)。犧牲11周齡大的小鼠用以做表現(xiàn)型分析，其包含雄性和雌性的野生型、GNMT+Z-異型合子、6閃1/1丁-/-同型合子(每組大于等于6只小鼠)。利用高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography;HPLC)分析月干臟中SAM和SAH的濃度。相較于相同性別的野生型小鼠，雄性及雌性6問1/1丁-/-同型合子小鼠肝臟中的SAM濃度都有顯著的增加(P值小于0.05);反之，GNMT+Z-異型合子小鼠肝臟中的SAM濃度比野生型小鼠低2.8倍，而雄性或雌性GNMT-Z-同型合子小鼠肝臟中SAH的濃度與野生型小鼠的差不多。因此，SAM/SAH比值在雄性及雌性GNMT-/-同型合子小鼠的肝臟中分別增加42倍和67倍(如表1所示)。高半胱氨酸的量6組小鼠中都沒有顯著變化，甲硫胺酸的量則是在GNMT-/-同型合子小鼠中相較于野生型多了1.9至2.4倍。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>、注):濃度為每克肝臟中含有的納摩爾數(shù)(nmo1)"(注):濃度為每100毫升含有的毫克數(shù)(mg/dl)為了解在GNMT-/-同型合子小鼠中肝臟腫瘤的自然生成情況，在其12個(gè)月大后，本發(fā)明利用核磁共振(MRI)及超音波每兩周追蹤一次其表現(xiàn)型，在7只雌性GNMT-/-同型合子小鼠中，全部都有大于0.5公分的肝臟腫瘤生成(平均生成年齡為16.1個(gè)月)，相較之下，在6只我們已追蹤觀察21個(gè)月的雄性GNMT-Z-同型合子小鼠中，2只有肝臟腫瘤、2只在13個(gè)月大時(shí)死亡，因此，在14至15周大的雌性小鼠中，有50%(1/2)的小鼠有肝臟腫瘤生成，在21至22周大時(shí)，有100%(6/6)的生成率，而在雄性GNMT-/-同型合子小鼠中，在18至21個(gè)月大的小鼠中有75%(3/4)產(chǎn)生肝臟結(jié)節(jié)。以上結(jié)果指出在雌性小鼠中肝臟腫瘤的自然生成比在雄性小鼠中更嚴(yán)重，此夕卜，有37.5%(3/8)的雌性小鼠產(chǎn)生血管瘤，所有的雌性小鼠皆產(chǎn)生脂肪變性但只有1/3的雄性小鼠有產(chǎn)生脂肪變性掉果如表2所示)。表2GNMT-/-同型合子小鼠在13至21個(gè)月大時(shí)肝臟腫瘤形成的狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>KO-F2-591214KO-F2-3514152KO-F2-1617212雌KO-F2-93142215KO-F2-961922KO-F2-105182111KO畫F2-10618214KO-F2-1201520104210.62%脂肪變性、肝癌122119396.23%5.94%7.73%21.21%6.64%7.78%6.64%功能退化、脂肪變性發(fā)育不良的結(jié)節(jié)、脂肪變性、肝癌、血管瘤發(fā)育不良的結(jié)節(jié)、脂肪變性、肝癌標(biāo)記腫瘤壞死及退化、脂肪變性、肝癌脂肪變性、肝癌、肝壞死脂肪變性、肝癌、血管瘤脂肪變性、肝癌、血管瘤a.處死小鼠以供實(shí)驗(yàn)。b.在化周大時(shí)，有2只雄性小鼠的腫瘤結(jié)節(jié)小于0.6公分，一只雄性小鼠沒有腫瘤結(jié)節(jié)。c.此兩只小鼠過于瘦弱而無法產(chǎn)生腫瘤結(jié)節(jié)。d.此小鼠在進(jìn)行MRI檢查時(shí)，因麻醉而死亡。e.在21周大時(shí)，被超聲波探測(cè)到一個(gè)0.5公分大的肝臟結(jié)節(jié)。f.在18周大時(shí)并沒有被探測(cè)到任何結(jié)節(jié)。g.在18周大時(shí)被探測(cè)到1個(gè)結(jié)節(jié)。h.資料不足。利用微陣列(Microarray)基因分析來觀察GNMT基因剔除小鼠與野生型小鼠之間新陳代謝的差別，在雄性GNMT基因剔除小鼠有1896個(gè)基因在mRNA層面上較野生型表現(xiàn)的多；而在雌性GNMT基因剔除小鼠有2429個(gè)基因在mRNA層面上較野生型表現(xiàn)的多。在這些基因當(dāng)中，雄性與雌性的分別有543與843個(gè)基因表現(xiàn)量差異達(dá)到2倍以上，其被選擇出做更進(jìn)一步的測(cè)試。上述基因系利用CrossPath程序(http:〃ibs.sinica,edu.tw/crosspath/)藉由參考KEGG反應(yīng)路徑料庫來對(duì)其功能進(jìn)行分類。表格3及表格4依其反應(yīng)路徑分類顯示有多少基因表現(xiàn)量差異在2倍以上，根據(jù)該表格，在雄性及雌性GNMT基因剔除小鼠中mRNA表現(xiàn)量增加最顯著的為參與PPAR訊息傳遞路徑及細(xì)胞周期的反應(yīng)路徑的基因。另外，細(xì)胞素(cytokine)-細(xì)胞素受器的作用和MAPK訊息傳遞路徑的基因表現(xiàn)量在雌性和雄性GNMT基因剔除小鼠中都是減少的。表5顯示利用real-timeRCR分別分析在不同訊息傳遞路徑、不同組織中，GNMT-Z-同型合子小鼠與相同年齡的野生型小鼠其基因mRNA表現(xiàn)量的比值。該結(jié)果顯示:在GNMT-Z-同型合子小鼠中，有許多與生存和生長相關(guān)的基因mRNA表現(xiàn)量顯著的降低，而有三個(gè)致癌基因mRNA表現(xiàn)量顯著提升。表3(A)11周大的雄性及雌性GNMT基因剔除小鼠，在特定分類中，mRNA表現(xiàn)量增加的基因個(gè)數(shù)。(此表參考KEGG反應(yīng)途徑數(shù)據(jù)庫來對(duì)其功能進(jìn)行分類)于雌性GNMTV-小鼠產(chǎn)生上調(diào)節(jié)作用的反應(yīng)途徑個(gè)數(shù)*PPAR訊息傳遞路徑(PPARsignalingpathway)17固醇類的合成(Biosynthesisofsteroids)11MAPK訊息傳遞路徑10(MAPKsignalingpathway)谷胱甘肽的新陳代謝(Glutathionemetabolism)9丙酮酸的新陳代謝(Pyruvatemetabolism)細(xì)胞色素P450的異生物反應(yīng)(XenobioticsbycytochromeP450)脂肪細(xì)胞素訊息傳遞路徑(Adipocytokinesignalingpathway)胰島素訊息傳遞路徑(Insulinsignalingpathway)6Jak-STAT訊息傳遞路徑(Jak-STATsignalingpathway)6結(jié)腸直腸癌(Colorectalcancer)6于雄性GNMTV-小鼠產(chǎn)生上調(diào)節(jié)作用的反應(yīng)途徑個(gè)數(shù)*細(xì)胞周期(Cellcycle)16間隙連接(Gapjunction)13PPAR訊息傳遞路徑(PPARsignalingpathway)12嘧啶的新陳代謝(Pyrimidinemetabolism)12<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>(Neuroactivateligand陽receptorinteractio11n)鈣離子訊息傳遞路徑(Calciumsignalingpathway)11Wnt訊息傳遞路徑(Wntsignalingpathway)11造血細(xì)胞體系(Hematopoieticcelllineage)11胰島素訊息傳遞路徑(Insulinsignalingpathway)10Jak-STAT訊息傳遞路徑(Jak-STATsignalingpathway)10于雄性GNMT-P」、鼠產(chǎn)生下調(diào)節(jié)作用的反應(yīng)途徑個(gè)數(shù)*MAPK訊息傳遞路徑(MAPKsignalingpathway)24細(xì)胞素-細(xì)胞素受器交互作用(Cytokine-cytokinereceptorinteraction)16局部附著(Focaladhesion)15肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)控(Regulationofactincytoskeleton)13補(bǔ)體與血液凝集連鎖反應(yīng)(Complementandcoagulationcascades)12Wnt訊息傳遞路徑12(Wntsignalingpathway)細(xì)胞色素P450的異生物反應(yīng)(XenobioticsbycytochromeP450)12胰島素訊息傳遞路徑(Insulinsignalingpathway)12鈣離子訊息傳遞路徑(Calciumsignalingpathway)12亞麻油酸的新陳代謝(Linoleicacidmetabolism)花生四烯酸的新陳代謝(Arachidonicacidmetabolism)10、注)其個(gè)數(shù)為GNMT基因剔除小鼠與野生型小鼠mRNA層面表現(xiàn)量差異在2倍以上的基因個(gè)數(shù)。表格3(B)14至18周大之雄性及雌性GNMT基因剔除小鼠的腫瘤和腫瘤鄰近組織在特定分類中，mRNA表現(xiàn)量增加的基因個(gè)數(shù)。(此表參考KEGG反應(yīng)途徑數(shù)據(jù)庫來對(duì)其功能進(jìn)行分類)于雌性GNMT-Z-小鼠產(chǎn)生上調(diào)節(jié)作用的反應(yīng)途徑個(gè)數(shù)*PPAR訊息傳遞路徑(PPARsignalingpathway)17固醇類的合成(Biosynthesisofsteroids)11<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>神經(jīng)活化性配體-受器的交互作用(Neuroactivateligand-receptorinteractio11n)12鈣離子訊息傳遞路徑(Calciumsignalingpathway)11Wnt訊息傳遞路徑(Writsignalingpathway)11造血細(xì)胞體系(Hematopoieticcelllineage)11胰島素訊息傳遞路徑(Insulinsignalingpathway)10Jak-STAT訊息傳遞路徑(Jak-STATsignalingpathway)10于雄性GNMT一小鼠產(chǎn)生下調(diào)節(jié)作用的反應(yīng)途徑個(gè)數(shù)*MAPK訊息傳遞路徑(MAPKsignalingpathway)24細(xì)胞素-細(xì)胞素受器交互作用(Cytokine-cytokinereceptorinteraction)16局部附著(Foc3l3dhesi0n)15肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)控(Regulationofactincytoskeleton)13補(bǔ)體與血液凝集連鎖反應(yīng)(Complementandco3gul3tioncascades)12<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>*(注)其個(gè)數(shù)為GNMT基因剔除小鼠與野生型小鼠的腫瘤和腫瘤鄰近組織中mRNA層面表現(xiàn)量差異在2倍以上的基因個(gè)數(shù)。表格4雄性及雌性GNMT基因剔除小鼠，在特定分類中，mRNA表現(xiàn)量降低的基因個(gè)數(shù)。(此表參考KEGG反應(yīng)途徑數(shù)據(jù)庫來對(duì)其功能進(jìn)行分類)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)控(Regulationofactincytoskeleton)13補(bǔ)體與血液凝集連鎖反應(yīng)(Complementandcoagulationcascades)12Wnt訊息傳遞路徑(Wntsignalingpathway)12細(xì)胞色素P450的異生物反應(yīng)(XenobioticsbycytochromeP450)12胰島素訊息傳遞路徑(Insulinsignalingpathway)12鈣離子訊息傳遞路徑(Calciumsignalingpathway)12亞麻油酸的新陳代謝(Linoleicacidmetabolism)11花生四烯酸的新陳代謝(Arachidonicacidmetabolism)10*(注)GNMT基因剔除小鼠與野生型小鼠的mRNA層面表現(xiàn)量差異在2倍以上的基因個(gè)數(shù)。表5利用real-timeRCR分別分析在不同訊息傳遞路徑、不同組織中，GNMT-Z-同型合子小鼠與相同年齡的野生型小鼠其基因mRNA表現(xiàn)量的比值11周大GNMT-Z-小鼠18個(gè)月大GNMT-/-小鼠14個(gè)月大6"1/1丁-/-小鼠基因分類雄性雌性雄性雌性KO/WTaKO層aTA/WTbT/WTCTA/WTbt/WTc有關(guān)生存與生長的基因PTEN1.321.070.600.370.560.08<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>生的GAPD為比較標(biāo)準(zhǔn)。為了證實(shí)本發(fā)明的GNMT-A小鼠模型較一般野生型小鼠對(duì)致癌物質(zhì)更為敏感，本發(fā)明利用供給AFB!來作為測(cè)試，AFB1以下列劑量做兩次腹膜內(nèi)注射在小鼠7天大時(shí)，以體重計(jì)算，每公克注射10微克；在小鼠9周大時(shí)，每公克注射40微克。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在被注射ABF1的GNMT-Z-小鼠中，所有的(5/5)雌性小鼠及57.1%(4/7)的雄性小鼠被探測(cè)到有肝臟結(jié)節(jié)，然而在被注射ABF1的野生型小鼠及其它只注射溶液(三辛酸甘油酯；tricaprylin)的小鼠中，在13至14周大時(shí)皆沒有出現(xiàn)肝臟腫瘤(如表6所示)。表6在兩種不同基因型，13周大的小鼠中，分別注射溶劑(控制組)及AFB1后，其肝臟腫瘤的形成狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>利用H-Estain分析小鼠肝臟后，發(fā)現(xiàn)野生型小鼠在注射AFB1過后并沒有任何不正?，F(xiàn)象，但是，在注射過AFB1的雄性GNMT-/-小鼠肝臟內(nèi)卻發(fā)現(xiàn)發(fā)育不良的結(jié)節(jié)、早期肝癌癥狀及脂肪結(jié)節(jié)(圖九八3);而在雌性0閃1/1丁-/-小鼠肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)Sclenosing肝癌及局部脂肪變性的發(fā)育不良的結(jié)節(jié)(圖九C,D)。實(shí)施例二肝癌細(xì)胞株[HA22T/VGH]的制備是參考Waxman，D.丄&O'Connor,C.GrowthHormoneRegulationofSex-DependentLiverGeneExpression.MolecularEndocrinology20，2613(2006);從人類肝母細(xì)胞瘤(hepatoblastoma)取出的穩(wěn)定表現(xiàn)的細(xì)胞株H印G2的的制備方法是參考Mode,A.&Gustafsson，丄A.SexandtheLiver-AJourneyThroughFiveDecades.DrugMetabolismReviews38，197-207(2006);論文Chen，S.Y.etal.GlycineN-methyltransferasetumorsusceptibilitygeneinthebenzo(a)pyrene-detoxificationpathway.CancerRes.64，3617-3623(2004)中的[SCG2在本發(fā)明的實(shí)施方式中有被使用到。本發(fā)明所使用到的細(xì)胞皆以含有100/o胎牛血清蛋白(Hyclone)的DMEM(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)(G舊COBRL，Grandlsland，NY)培養(yǎng)，另夕卜，ABF1保存于DMSO中，欲處理細(xì)胞時(shí)則溶于培養(yǎng)液中。免疫熒光染色法和共軛焦顯微鏡技術(shù)HA22T/VGH細(xì)胞被放置于蓋玻片上并以20uM的ABF1或0.1°/。的DMSO處理3小時(shí)，隨后利用pH值7.4含有40/。三聚甲酸(paraformaldehyde)的磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline;PBS)(溶液1)在室溫下固定20分鐘。在利用透化(permeablization)溶液(溶液加上0.5%TritonX-100)于室溫中培養(yǎng)5分鐘后，將蓋玻片培養(yǎng)于阻緩溶液(blockbuffer)(含有5%BSA的PBS)室溫中一小時(shí)，隨后再加入兔子的抗GNMT抗體(1:200)培養(yǎng)一小時(shí)，再加入第二抗體一連接FITC的山羊抗兔子免疫球蛋白G(FITC-conjugatedgoatanti-rabbitIgG)(Chemicon,Temecula，CA，USA)。復(fù)染細(xì)胞核是利用HoechstH33258(Sigma-Aldrich)。共軛焦顯微鏡則是使用一裝配OlympusFlowview氬/氪描激光系統(tǒng)和Fluoview圖像分析軟件(Olympus，Melville,NY)的OlympusIX70倒置熒光顯微鏡。LGA對(duì)接方式推測(cè)丄GA用來闡明在GNMT與AFB1在各種形式間的相互作用位置。Autodock3.0軟件用來鑒定最適的配體連結(jié)作用。因?yàn)榇笫驡NMT與人類GNMT在氨基酸序列上有91。/。相似，所以，大鼠GNMT的X光晶體繞射數(shù)據(jù)被用于推測(cè)對(duì)接位置(Pakhomova，S.etal.，ProteinsStructureFunctionandBioinformatics57，331-337，2004)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)包含10run、大小50的population以及arunterminationcriterionof27,000generationsor2.5x105energyevaluations(無論何者先)。構(gòu)型叢集的均方根偏差值容許范圍0.5埃是從配體的晶體坐標(biāo)計(jì)算而得，過程的細(xì)節(jié)可從之前報(bào)告得知(MorrisGMetal.JCo/77yDt//C/7e/77l9，1639-1662，1998)。細(xì)胞毒性分析細(xì)胞活性測(cè)試(MTTAssay)被用來測(cè)試AFB1的細(xì)胞毒性。細(xì)胞被培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)盤中，在進(jìn)行分析時(shí)，每孔培養(yǎng)液換成含有10微升MTT保存溶液(5毫克/毫升)的100微升新鮮培養(yǎng)液，四小時(shí)后，細(xì)胞已被M丌標(biāo)記，將上述培養(yǎng)液再換成100微升的DMSO并在攝氏37度下培養(yǎng)10分鐘，隨后混合均勻測(cè)其540納米的吸光值。根據(jù)半數(shù)細(xì)胞會(huì)死亡的濃度(halflethalconcentration;LC50)，96孔盤培養(yǎng)7000個(gè)HuH-7細(xì)胞18小時(shí)。細(xì)胞分別以不同濃度的AFB1及取一系列時(shí)間點(diǎn)來測(cè)試，并且每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次以AFB，處理72小時(shí)。生存百分比是以實(shí)驗(yàn)組的吸光值除以只加溶液的控制組織吸光值來計(jì)算。為了進(jìn)行此細(xì)胞毒性測(cè)試，利用不同量帶有GNMTcDNA的腺病毒或者慢病毒感染5000個(gè)HuH-7細(xì)胞8小時(shí)，隨后將培養(yǎng)液換成新鮮培養(yǎng)液再培養(yǎng)10小時(shí)。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性的酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linkimmunosorbentassay;ELISA)來對(duì)AFB1-DNA加合物定量為了評(píng)估GNMT對(duì)細(xì)胞的保護(hù)能力，本發(fā)明利用培養(yǎng)在10公分培養(yǎng)盤的穩(wěn)定細(xì)胞株SCG2-1-1或是受GNMT重組腺病毒(Ad-GNMT)感染的HepG2細(xì)胞，以AFB1或是0.1%DMSO處理16小時(shí)后，萃取其DNA。所有的樣本皆以15mM碳酸鈉及30mM碳酸氫鈉(pH9.6)于攝氏37度處理2小時(shí)，用以中和所有開環(huán)(ring-openedform)的加合物，所有ELISA測(cè)試都重復(fù)三次，并且測(cè)其490納米的吸光值。在本發(fā)明應(yīng)用的ELISA中，以6A10抗體來測(cè)量AFB1-DNA加合物的量，如同論文Hsieh，LL.etal.，ImmunologicaldetectionofaflatoxinB1-DNAadductsformedinvivo.Ca/7ce廠48，6328-6331(1988)所述。pPEPCKex-flGNMT-TG轉(zhuǎn)殖基因載體構(gòu)建使用一個(gè)特定在肝臟表現(xiàn)的基因轉(zhuǎn)移載體，pPEPCKex，其包含小鼠的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase;PEPCK)啟動(dòng)子(Valera，A.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A91，9151-9154,1994)、一0.3kb的合成內(nèi)含子以及一0.6kb的人類生長荷爾蒙多腺嘌呤訊號(hào)(polyAsignal)。pPEPCKex-flGNMT基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒是經(jīng)過插入1.2kb人類GNMTcDNA(源自于9-1-2plasmid;Chen，Y.M.etal.，//7/."Cs/7ce廠75，787-793，1998)至pPEPCKex載體的Notl與Xhol限制酶作用位置之間構(gòu)建而成。隨后，pPEPCKex-flGNMT基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒將以限制酶Ascl作用后成為4.3kb直線狀片段，并應(yīng)用于顯微注射。產(chǎn)生GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠是對(duì)FVB小鼠的受精卵進(jìn)行配子和顯微注射而產(chǎn)生的，該小鼠被飼養(yǎng)在特殊處理的無菌設(shè)備里，并在其3周大斷奶時(shí)剪下一部分的尾巴，隨后利用蛋白酶K/SDS(Promaga)處理與酚/氯仿萃取出小鼠的DNA，并以PCR鑒定其基因型。該P(yáng)CR為利用引物GNMT-F5'-GCGGCGGCCGCATGCTGGTGGAAGAGGGC-3'與GNMT-R5'-GCGCTCGAGTCAGTCTGTCCTCTTGAGCAC-3'反應(yīng)攝氏94度30秒、攝氏60度30秒、攝氏72度60秒30循環(huán)，隨后偵側(cè)小鼠是否帶有668bp的人類GNMTDNA片段。AFB1測(cè)試本發(fā)明使用的AFBi(SigmaCo，StLouis，MO)溶于0.2毫克/毫升的三辛酸甘油酯(Sigma)。對(duì)每組至少6.只7天大的小鼠，施以AFB1復(fù)膜內(nèi)注射(每公斤體重注射10毫克)，且兩個(gè)月后再次注射，此注射劑量是根據(jù)論文Ghebranious，N.&Sell，S.H印atology27，383-391,1998。待小鼠九個(gè)月大后進(jìn)行病理實(shí)驗(yàn)，五分之二的器官(包括肝臟、肺臟及腎臟)利用10%?，斄止潭ㄒ怨┙M織病理實(shí)驗(yàn)，剩下的器官則存于攝氏負(fù)80度以供之后實(shí)驗(yàn)使用(如DNA、RNA、蛋白質(zhì)分析)。RNA分析本發(fā)明利用TRIzol試劑(lnvitrogen，Carlsbad,CA)從冷凍封存的組織中萃取全RNA，并以分光光度計(jì)定量，隨后利用Northen雜交分析RNA。cDNA探針(probe)是從質(zhì)粒9-1-2的人類GNMT基因制作而成，互補(bǔ)DNA是利用SuperscriptIIRNaseH-ReverseTranscriptaseKit(lnvitrogen)從月干臟RNA制作而成。GNMT的引物為F1:GCGGCGGCCGCATGCTGGTGGAAGAGGGC及R1:GCGCTCGAGTCAGTCTGTCCTC丌GAGCAC，P肌動(dòng)蛋白的引物為F2:GTGGGGCGCCCCAGGCACCA及R2:CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC。PCR步驟則是攝氏94度5分鐘的預(yù)先變性(pre-denaturation)，緊接著30循環(huán)的擴(kuò)增(amplication)…攝氏94度30秒、攝氏60度30秒的、攝氏72度60秒，最后是攝氏72度10分鐘的延伸(extension)。Western雜交分析進(jìn)行Western雜交時(shí)，樣本為10微克之肝臟蛋白萃取，利用10%SDS-PAGE分開后，轉(zhuǎn)印到PVDF(polyvinylidenedifluoride)膜(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)，其步驟詳細(xì)敘述于Waxman，DJ.&O'Connor，C.GrowthHormoneRegulationofSex-DependentLiverGeneExpression.A^o/ec〃/a廠￡>7ofc>c〃>7o/o5720，2613(2006)。另夕卜，在本發(fā)明所應(yīng)用的Western雜交是使用小鼠抗GNMT單株抗體(mAB)14-1來探測(cè)GNMT。GNMT的酶活性分析:GNMT的酶活性分析方法是根據(jù)論文Cook，R丄&Wagner,C.GlycineN-methyltransferaseisafolatebindingproteinofratlivercytosol.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A81，3631-3634(1984)的步驟略作修改而應(yīng)用于本發(fā)明，該方法被用來測(cè)試GNMT轉(zhuǎn)殖基因鼠肝臟組織內(nèi)的GNMT酶活性。其分析步驟如下部分肝臟利用三倍體積含有0.25M蔗糖、1mMEDTA、1mM疊氮化鈉(sodiumazide)及0.1mM苯甲基磺氟(phenymethylsulfonylflouride)的冰磷酸緩沖液(10mM，pH7.0)均質(zhì)化，再離心20，000G30分鐘后，除去上清液并加入2-硫氫乙醇(2-mercaptoethanol)至最終濃度為10mM。測(cè)量過蛋白質(zhì)的濃度后，取250微克蛋白質(zhì)加入至包含100mMTris緩沖液(pH7.4)、50mM甘氨酸、0.23mMSAM及2.16uMS-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-[methyl-3H]-methionine)(甲基以氳標(biāo)定)(76.4Ci/微摩爾)的100微升反應(yīng)混合劑，隨后培養(yǎng)在攝氏37度30分鐘，接著以含有10%三氯乙酸(trichloroaceticacid)與5Q/。的活性碳的50微升混合劑終止反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)都重復(fù)三次以求數(shù)據(jù)精準(zhǔn)。免疫組織化學(xué)染色法本發(fā)明所應(yīng)用的免疫組織化學(xué)染色法是利用一單株抗體(mAB)14-1(稀釋200倍)來探測(cè)GNMT蛋白質(zhì)的表現(xiàn)。被石蠟油嵌入的部分(4微米)肝臟與抗GNMT抗體培養(yǎng)后以DABkit(DakoCytomation)探測(cè)。實(shí)施例3AFB!所引發(fā)的GNMT核轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象用ABF1或是DMSO(純?nèi)芤簩?duì)照組)處理已以GNMTcDNA轉(zhuǎn)染的HA22T/VGH細(xì)胞16小時(shí)(圖10中，圖A和圖B所示)。如同圖10所示，GNMT的分布一開始被限制在細(xì)胞質(zhì)里(圖10中A圖所示)，但是在AFB1處理過后，有部分的GNMT轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中(圖10中B圖所示)，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AFB1與BaP—樣能引起GNMT的核轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在被AFB，處理過的細(xì)胞中，GNMT會(huì)發(fā)生核轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象(圖10)，也顯示GNMT能夠減少AFB1-DNA加合物的形成及增加被AFB1處理過的細(xì)胞的存活率。有研究證據(jù)指出AFB1-DNA加合物的形成與肝臟的化學(xué)致癌作用(carcinogeneesis)有關(guān)(Bressac，B.etal.，/Vs/〃廠e350，429-431，1991;Hsu'l.C.etal.，/Va/〃re350，427-428，1991);亦有研究證實(shí)，當(dāng)肝臟中的GNMT減少時(shí)，肝臟對(duì)致癌物質(zhì)的敏感度會(huì)提升。因此，GNMT可能參與在細(xì)胞防環(huán)境中的防御致癌物質(zhì)的機(jī)制中。實(shí)施例4推測(cè)GNMT-AFB1的交互作用利用拉馬克(Lamarckian)遺傳算法結(jié)合X光晶體繞射的數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)出GNMT與AFB1的物理性交互作用。由于大鼠GNMT蛋白質(zhì)與人類GNMT蛋白質(zhì)在氨基酸序列上有91。/o的相似度，所以本發(fā)明的實(shí)施方式為利用大鼠GNMT蛋白質(zhì)的X逛晶體繞射數(shù)據(jù)來進(jìn)行AFB1對(duì)接位置的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)表格七所示的數(shù)據(jù)，AFB卩在低結(jié)合能(bingenergy)時(shí)，分別會(huì)與雙體結(jié)構(gòu)(ProteinDataBank編碼1D2C)(接合能-9.41千卡/摩爾)及四體結(jié)構(gòu)(1D2G)(接合能-10.06千卡/摩爾)的GNMT結(jié)合。表7利用拉馬克遺傳算法評(píng)估的GNMT蛋白質(zhì)與AFB1的對(duì)接關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>比較在沒有SAM(-9.85千卡/摩爾)的情況下與GNMT雙體已和SAM結(jié)合(53.25千卡/摩爾)的情況下，AFB1與GNMT雙體(1XVA)的結(jié)合能，結(jié)果顯示AFB，會(huì)競(jìng)爭(zhēng)掉SAM而與GNMT結(jié)合，由于分子取向(molecularorientation)只有輕微的不同，AFB1與BaP同是坐落于GNMT雙體或四體的分子筐(molecularbasket)內(nèi)，GNMT氨基酸殘基與AFBi氨基酸殘基(Ala64，Leu36，Gly137和Ser139)非常接近(如圖十一B所示)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):(a)在GNMT之SAM結(jié)合位置亦有一個(gè)AFB1的結(jié)合位置，以及(b)AFB1會(huì)與GNMT的雙體或四體結(jié)構(gòu)結(jié)合。本發(fā)明的實(shí)施方式為利用GNMT四體(1D2G)的突變體R175K證實(shí)在結(jié)合位置的附近(大約5埃)的R/K殘基對(duì)于GNMT-AFB1加合物的產(chǎn)生是沒有影響的(表7)，此結(jié)果符合GNMT是一個(gè)分子筐的論點(diǎn)，此獨(dú)特的結(jié)構(gòu)亦與GNMT除了和SAM結(jié)合亦可與多環(huán)芳香族碳?xì)浠衔?polycyclicaromatic.Hydrocarbons;PAHs)分子(例如BaP)結(jié)合的事實(shí)相符。根據(jù)GNMT的晶體結(jié)構(gòu)顯示:GNMT有許多酪氨酸殘基(33，44，177，194,220，242，283)座落活化位置的內(nèi)表面，該殘基與其它殘基可能提供一個(gè)與致癌物質(zhì)交互作用的場(chǎng)所，如此一來，GNMT能與AFB1結(jié)合亦是合理的。實(shí)施例5GNMT對(duì)抗AFB1所引起的細(xì)胞毒性MTT分析可被用來確認(rèn)細(xì)胞的存活率，為了使細(xì)胞毒性分析更精確，本發(fā)明之實(shí)施方式為以不同濃度的AFB卩分別取一系列的時(shí)間點(diǎn)來處理HuH-7細(xì)胞，如圖11中圖A所示，LC50是根據(jù)處理時(shí)間而定的。以高達(dá)16uMAFB卩處理所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，在24小時(shí)內(nèi)無顯著影響，但是若處理時(shí)間超過48小時(shí)，即使該組細(xì)胞只用4"M，HuH-7細(xì)胞的存活率就會(huì)有顯著的下降，而處理72小時(shí)的LC50AFB1的濃度大約是12uM。為了確定GNMT對(duì)于以AFB1處理過的細(xì)胞的影響，本發(fā)明利用帶有GNMTcDNA的腺病毒感染HuH-7細(xì)胞，使其能夠表現(xiàn)GNMT蛋白質(zhì)，隨后與被帶有GFP的腺病毒感染的HuH-7細(xì)胞(對(duì)照組)比較，在相同都被AFB!處理過的情況下，其存活率稍微增加(如圖11中圖B所示)。利用慢病毒載體系統(tǒng)使細(xì)胞能表現(xiàn)GNMT蛋白質(zhì)也有相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如圖十一C)，該結(jié)果證實(shí)GNMT能夠?qū)笰FB1所引起的細(xì)胞毒性。實(shí)施例6抑制GNMT對(duì)AFB1-DNA加合物的影響為了確定GNMT對(duì)AFB1-DNA加合物的影響，本發(fā)明的實(shí)施方式為以競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫分析法(competitiveenzymeimmunoassay;EIA)(其使用抗體6A10、從H印G2細(xì)胞SCG2-1-1株及SCG2-neg得到的穩(wěn)定細(xì)胞株及被帶有GNMT重組DNA的腺病毒感染的H印G2細(xì)胞)測(cè)量AFB1-DNA加合物形成的量。利用DMSO及不同濃度的AFB1于DNA萃取前處理細(xì)胞16小時(shí)，然而并沒有觀察到細(xì)胞毒性。SCG2-neg細(xì)胞中AFBLDNA加合物的量減少大約50。/。(圖11中圖D所示)，此外，被帶有GNMTcDNA的腺病毒(Ad-GNMT)感染的細(xì)胞所產(chǎn)生的GNMT過量表現(xiàn)也減少AFBMDNZ加合物的形成(圖11中圖E所示)，相較于被Ad-GFP感染的細(xì)胞，被5MOIAd-GNMT感染的HepG2細(xì)胞在兩個(gè)AFB1濃度下，AFB!-DNA加合物的形成都減少40%，另外，在50MOI感染的H印G2細(xì)胞則減少約70Q/。。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果是以抑制百分比來計(jì)算AFB1-DNA加合物形成的量，其指出相較于控制組的細(xì)胞(SCG2-neg細(xì)胞與被Ad-GFP感染的細(xì)胞)，AFB1-DNA加合物形成的量在能表現(xiàn)GNMT的細(xì)胞中有顯著的下降，其進(jìn)一步證明GNMT借著漸少AFB1-DNA加合物形成的量來保護(hù)受到AFB1處理的細(xì)胞。實(shí)施例7產(chǎn)生GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠為了確定GNMT在活體內(nèi)對(duì)于AFB1所引起的癌化作用的影響，本發(fā)明建立一種轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其使用圖14中A圖的pPEPCKex-flGNMT質(zhì)粒建立，該質(zhì)粒能以PEPCK啟動(dòng)子(Valera，A.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A91，9151-9154，1994)表現(xiàn)人類的GNMT蛋白質(zhì)，該GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠是利用FVB小鼠的受精卵進(jìn)行配子合顯微注射而產(chǎn)生的。Northen雜交的分析證實(shí)該小鼠的肝臟及腎臟內(nèi)會(huì)表現(xiàn)人類的GNMT蛋白質(zhì)(如圖14中圖B所示)。本發(fā)明利用RT-PCR及Western雜交分析GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠如何表現(xiàn)GNMT蛋白質(zhì)。如圖12中圖A所示，野生型小鼠的GNMTmRNA表現(xiàn)隨著年齡而增加，而在7周大時(shí)達(dá)到一高峰，而GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠的GNMTmRNA表現(xiàn)量比野生型高，尤其是在1至3周大的階段。此外，根據(jù)Western雜交的分析，雄性野生型小鼠在1至3周大時(shí)，其GNMT蛋白質(zhì)表現(xiàn)量極低(低至無法探測(cè))，然而雌性野生型在1周大時(shí)有可探測(cè)到的低表現(xiàn)量；相較之下，雄性與雌性的GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠在1周大時(shí)即有高GNMT蛋白質(zhì)表現(xiàn)量(如圖12中圖A所示)。這些結(jié)果顯示GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠在1至3周大時(shí)，GNMT的表5見程度高于野生型小鼠。再者，本發(fā)明同時(shí)也測(cè)量了GNMT的酶活性，GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠在9至11周大時(shí)，GNMT的酶活性顯著地高于野生型小鼠(P值小于0.05)(除了9周大的雄性)(如圖12中圖B所示)。在這次試驗(yàn)過程中，并沒有供給GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠特殊的飲食，GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中的GNMT的基因表現(xiàn)程度高于野生型小鼠，尤其是1至3周大時(shí)(如圖12中圖A所示)，然而其在7周大時(shí)達(dá)到一高峰。實(shí)施例8AFB1引起的肝臟腫瘤在GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)被抑制GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠在腹膜內(nèi)注射AFB，后，于11個(gè)月大時(shí)犧牲以做病理實(shí)驗(yàn)，其與肝臟腫瘤相關(guān)之實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于表8。表8以溶液及AFB1處理兩種表現(xiàn)型的小鼠，其肝臟腫瘤形成的狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>不論在被AFB1處理的雄性或雌性GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，都沒有肝臟腫瘤形成；而6只被AFB1處理的雄性野生型小鼠中有4(67%)只發(fā)展出肝臟腫瘤，另外，被溶液(三辛酸甘油酯)處理(對(duì)照組)的小鼠體內(nèi)皆沒有腫瘤產(chǎn)生。本發(fā)明以測(cè)量ALT的量來監(jiān)控GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠在11個(gè)月大時(shí)的肝臟功能，在被處理AFB卩的組別中，雄性野生型小鼠血清內(nèi)的ALT量高于雄性GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠；但在雌性GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠與雌性野生型小鼠中則沒有差別。病理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示被處理AFB!的雄性野生型小鼠出現(xiàn)肝臟發(fā)育不良及肝癌的癥狀(如圖13中圖A所示)，然而被處理AFB，的GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠卻是正常的(如圖13中圖B所示)。免疫組織化學(xué)染色法證實(shí)在正常肝臟細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的GNMT蛋白質(zhì)表現(xiàn)(如圖13中圖D所示)，然而其在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)量降低(如圖13中圖C所示)，此現(xiàn)象亦由Western雜交證實(shí)(如圖13中圖E所示)，其亦被發(fā)現(xiàn)于人類肝癌之中。在以AFBi處理的實(shí)驗(yàn)中，在被注射AFBi的小鼠之中，GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠的GNMT表現(xiàn)量高于野生型小鼠，該結(jié)果顯示GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠不論雄性或雌性體內(nèi)，都沒有肝臟腫瘤形成；而6只雄性野生型小鼠中有4(67%)只發(fā)展出肝臟腫瘤(如表8所示)，在該實(shí)驗(yàn)中，肝臟腫瘤形成的機(jī)率在雄性野生型從10%增加到67%，而同樣的實(shí)驗(yàn)中GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠沒有肝臟腫瘤形成。而且，雖然表現(xiàn)量低，但是GNMT蛋白質(zhì)在1周大的母小鼠肝臟內(nèi)是可藉由Western雜交發(fā)現(xiàn)的，這些GNMT蛋白質(zhì)能夠在雌性野生型小鼠體內(nèi)預(yù)防AFB1引發(fā)肝臟腫瘤形成(沒有被AFB1處理的雌性小鼠發(fā)展出肝臟腫瘤)，此結(jié)果亦證實(shí)GNMT能夠在雄性GNMT轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)預(yù)防AFB1引發(fā)肝臟腫瘤形成。病理實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步地確認(rèn)該被AFB1處理的野生型小鼠形成的肝臟腫瘤是肝癌(如圖13中圖A所示)，而免疫組織化學(xué)染色與Western雜交的結(jié)果顯示在腫瘤組織中的GNMT表現(xiàn)量降低(如圖13中圖C和圖E所示)，此結(jié)果與目前在人類肝癌的研究結(jié)果相同，其進(jìn)一步解釋人類與小鼠在GNMT調(diào)控癌化作用所扮演的角色非常相似，因此，GNMT可以有效的預(yù)防癌化作用。序列表.txt序列表<110>陳宜民〈120甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶動(dòng)物模型的制備方法及其用途<160>8<170>PatentIn3.4版<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>1gcggcggccgcatgctggtggaagagggc29<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ttgcagtctggcaagtgagc<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3gttccttgcgcagctgtgct<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4cggccacagtcgatgaatcc<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5202020gcgctcgagtcagtctgtcctcttgagcac30<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6Stggggcgccccaggcacca20<210>7<211>24<212〉DNA<213>人工序列<400>7ctccttaatgtcacgcacgatttc24<210>8<211>14777<212>DNA<213>入噬菌體<220><221>misc—feature<222>(5953，13551)<223>n=c或t<400>8tctctgtgagttcaaggccagccaagactatacagagaaaccttgtctcaaaaaacaaac60aaacaaacaaacaaaatgcaccaccatgcctggttccccagttttaaaaaccctaagtaa120ataaaagataccacttaagatgctgagatgagatttgaaaaaagtctaggattgataggt180ttaccccccaaatgctttgatatgtggcattggatttacttgaaattcccaaatacagtt240tctcctctctgctttgtctccacagggactgatgtagcccagatttgccttgaagtctat300gtaccctagaatatctttgaactccagcttttctgttctcagctgccaagtacaggactt360acaggcacacaccatcacactcagcctcgagaatctttctgagcatagtgtcagaggcct420gtgtgtagggacattgagtccccaagactgagcctggtcagaaccatttgagattggcgc480tgtgctaacaaaagtttaaaaatgtgggctggagagataggtcagceattaaaagcccta540tctgcagctagggtcgtagcgcacacttttagccctagcccttgggaggcagaggcagtt600ggatctctgagttcgaggccagcctggtttacagagtgaattctaggacagccagagaaa660ccctttctcacaaaaaccaaaccaaaccaaacaaaccacttggtcctctgtggggttcag720tgtcctcagcaccacccagtggctccccactgtctacaactgcaggttcagggtatctga780agctctcgattctgggctccatgggcgtcagacacatactgacatctatgaagtcaaaac840agccatacccactataagaaggttaagtcacacaactgtgggcctccttccatctccagg900gttcaccctgcattgggaaggcgaagggcgggcgggcgggcgggatgctccctgtcttct,ctcttctttccacgtaacgagtgttcacagagttggaagtgtgtgggcaggcggggcagg1020cggggcaggcttctcgttgctcacacgcatcttccagagccgactttagcccggctggga1080tcttgtccttggtggggtaaaaagggtgagcgggt肌cacga犯cggaccctcaggttat1140acagtgacgctagcccgagegggcgccatgagcaccttccctgccgacccccaactttcc1200tctctgaaggtgctcccatggaaagcagatggaaggcttgctatgtctcccacattgttc1260actaattcattgagcactaataatcctcctgtctcaccttactacacccagcctttaaga1320gattgcagagtataaagcccatggattggaaggcccaggctaccttaggaggctcctggc1380tggtatgggggaggggaagagagacacgcctatctccaggtgtactcttgtacttggatg1440agcatctttctcaaagactgttcataatgtcccgacacagtggctctctttagcggagtg1500ttccctccactaaatgataagcagtgttgtgtagacactgtgctgggctgggcatgtaat1560aattctgttttgggtggatttcaggcttettccccttcctccttgggtaggggtggagtg1620atctctcattgctttactttgtgagttcctcccggccaccctggcgagtcctatctgacc1680tgtcttactaagccaggtccaggattgctgtgctgagccatcctcaaggcagaggcagca1740agcctggctctgggcceagggcccagcaggggcgtgtccctgctctcacctgccattggc1800caggtgggactgccttgccagaggattataagtgcggatcgcgtggcctgagagccaggc1860gccggtcaggatggtggacagcgtgtaccgtacccgctccctgggggtggcggccgaagg1920gctcccggaccagtatgcagatggggaggccgcac卿gtggcagctgtacatcgggga1980cacccgcagccgtaccgcagagtacaaggcgtggttgcttgggctgttgcgccagcacgg2040gtgccacagggtgctggacgtagcctgtggcacagggtgagtceaa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