專利名稱：一種鏈霉菌、用其產生他克莫司的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的鏈霉菌、通過培養(yǎng)該菌產生他克莫司的方法 及其應用。
背景技術：
1983年，環(huán)孢霉素A通過了美國FDA的認證。該藥是一種能有 效抗排斥的、由真菌產生的藥物，從而給器官移植和自體免疫疾病的 治療帶來了巨大的變革。環(huán)孢霉素A通過抑制依靠鈣激活的途徑從而 在激活T細胞的早期階段發(fā)揮抑制作用。環(huán)孢霉素A可以有效地提高 移植病人的存活率。但是，環(huán)孢霉素A由于高劑量的使用而引起不少 的副作用，例如腎毒性、神經毒性、肝毒性、高血壓、腸胃痙攣、 血鉀過多、多毛癥、牙齦腫大等。
作為更有效的、低副作用的免疫抑制劑藥物，日本的Fujisawa在 美國專利4,894,366中公開了一種新的大環(huán)內脂的免疫抑制劑他克 莫司。他克莫司比環(huán)孢霉素A的藥效高IOO倍。這種大環(huán)內脂化合物 由鏈霉菌屬菌5Vr印tom;;cM "t^b/k^^^發(fā)酵產生。和環(huán)孢霉素A的 作用機制相似，他克莫司的免疫抑制作用是通過抑制依靠釣激活的途 徑從而在激活T細胞的早期階段發(fā)揮抑制作用。他克莫司的第一次在 人的治療功效表現(xiàn)在肝臟的移植手術中?，F(xiàn)在，他克莫司已被廣泛應 用，尤其是針對那些對環(huán)孢霉素A耐受性低的病人。他克莫司的結構 式如下
3V bCH3 OCH3
此外，美國專利4,894,366公開了兩種他克莫司產生菌種 5Vr一畫yc&s1加A:w^e腦S No. 9993和6Vr一蘭ycas1 /^t/roscop/cm swfe/ . ，ib^&mam^No. 7238。美國專利5,116,756和5,194,378 ^>開了另一 個屬于鏈霉菌屬的他克莫司產生菌種5Vreptom少c^ ATCC No. 55098。
目前，尋找能夠產生免除或降低環(huán)孢霉素A的副作用的免疫抑制 劑他克莫司和其相關的自發(fā)的類似物的新的微生物的工作仍然正在 繼續(xù)進行中。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種新的能產生他克莫司或其相關 的自發(fā)的類似物的微生物。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種新的鏈霉菌T300 (CGMCC1779 ) (5^eptom_ycas ^p. T300 )，其可以應用于產生他克莫司 或其類似物，或者應用于產生含有他克莫司的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種采用鏈霉菌T300 (CGMCC1779)制備他克莫司或其類似物的方法。該方法包括采用4連 霉菌T300 ( CGMCC1779 )在含有可同化的碳、氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基里， 有氧發(fā)酵的步驟。
在一個實施方案中，所述可同化的碳源可以是葡萄糖、淀粉、甘
:CH2油、木糖、木聚糖、糊精、麥芽糖、海藻糖、肌醇、菊糖、水楊苷， 或上述物質的組合。
在一個實施方案中，所述可同化的氮源可以是棉籽餅粉、酵母抽 提粉、蛋白胨、谷蛋白、黃豆粉、玉米漿、花生粉、小麥粉、干酵母、 尿素氨基酸、硝酸鹽，或上述物質的組合。也可以選擇其它的無機氮 源和有才幾氮源。
在一個實施方案中，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基可以是營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、國
際鏈霉菌計劃培養(yǎng)基l (ISP1)、國際鏈霉菌計劃培養(yǎng)基2 (ISP2)或 查氏培養(yǎng)基等，優(yōu)選營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。
在一個實施方案中，尤其是在泡沫嚴重的時候，在培養(yǎng)基中加入 消泡劑，該消泡劑可以是植物油、液體石蠟、脂肪油、礦物油或硅油， 或它們的組合。
在一個實施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20°C-40°C,優(yōu)選25 °C-37°C, pH為6.5-7.5之間，優(yōu)選7左右，培養(yǎng)時間為120-240 小時。氧通量為0.5 - l.OVVM。
在一個實施方案中，所述發(fā)酵方式包括固體發(fā)酵和液體發(fā)酵， 優(yōu)選為深層液體發(fā)酵。
在一個實施方案中，所采用的他克莫司產生菌還可以為鏈霉菌 T300 (CGMCC1779)自發(fā)的突變抹或通過常規(guī)的誘變得到突變抹。
鏈霉菌T300 ( CGMCC1779 )的微生物菌種于2006年8月14日 保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(現(xiàn)地址北 京朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCC1779,并登記入冊，證明存活。
本發(fā)明描述了 5^印tow;;c^罕.T300的形態(tài)學、生理生化和分子水 平上的特征，經過和已知的他克莫司產生菌進行形態(tài)學、生理生化的 比較，可以認定5^eptom少c^印.T300屬于鏈霉菌屬，但它不同于已 ^口的4也克莫司產生菌5^eptowyces1 /^c/rascop/ct^ ， 5". ^^A:M6aew57's 、 5V，tomjc^s取5Vra/wMA6858和5^邵to，cas ATCC No. 55098,而 是一個全新的菌種；并且本發(fā)明的S^ptomycM取T300在發(fā)酵過程 中不產生有毒的H2S氣體。
5他克莫司和其相關的自發(fā)的類似物主要存在于培養(yǎng)的菌絲體中，
菌絲體可以通過離心或過濾所得。然后按照US 4,894,366實施例1
詳細的分離純化方法。通過減壓濃縮、冷凍干燥、有機溶劑抽提、調
節(jié)pH、樹脂交換、解吸、結晶、重結晶等一系列過程可得他克莫司
和其相關的類似物。
本領域技術人員在閱讀本說明書后可以理解，本發(fā)明鏈霉菌T300
(CGMCC1779 ) ( Streptomyces sp. T300 ),不僅可以生產他克莫司，
還可以產生他克莫司類似物，這些類似物具有本發(fā)明他克莫司的類似
性質并可以實現(xiàn)本發(fā)明目的。此外，根據(jù)本發(fā)明的生產他克莫司的方
法不僅可以生產他克莫司，還可以產生他克莫司類似物，這些類似物
具有本發(fā)明他克莫司的類似性質并可以實現(xiàn)本發(fā)明目的。
本發(fā)明人已經通過大量實-險證實，由6Vre/7tom;;c^ T300 (CGMCC1779 )產生的他克莫司具有所需的性質，包括免疫抑制活性。
具體實施方式
實施例1:菌一朱來源
5Vrepto^yc^ T300從中國西部的云南省的土壤中分離得到，并 通過誘變選育得到生產菌林。將在ISP2 3(TC培養(yǎng)8天成熟后的斜面 孢子，用0.85%NaCl的無菌生理鹽水洗下，懸浮于裝有玻璃珠的無 菌小三角瓶中，經旋轉式搖床振蕩30分鐘，使孢子均勻分散，然后 用四層無菌紗布過濾，以除去菌絲體及孢子團，即得孢子懸浮液，供 誘變處理使用。
稱取NTG (亞硝基胍)晶體10mg,溶解在10ml的無菌Tris緩 沖液(pH8.0)中，再用移液管加入lml孢子懸浮液，而置于28。C培 養(yǎng)室中的旋轉式或往復式搖床上振蕩處理30min。將處理過的抱子懸 浮液，經適當稀釋后涂布在ISP2平板上。未作誘變處理的孢子懸浮 液，亦經適當稀釋涂布于ISP2平板上作為對照。30°C培養(yǎng)8天后，檢查菌落數(shù)，并計致死率。
挑選其中經過NTG誘變后的菌落351林，進行搖瓶發(fā)酵，評估 產生FK506 (他克莫司)的能力。結果發(fā)現(xiàn)有6抹能夠產生較好水平 的菌抹，為5^eptom;;c^ T300的突變才朱。
實施例2: 5Vr甲tom;;c^ T300的形態(tài)學和培養(yǎng)學特征
實-驗方法參照Shirling和Gottlieb (Shirling E.B. and Gottlieb D. 1966. Methods for characterization of 5Vr一函yc&s1 species. Int. J. Systematic Bacteriol.， 16, 313-340)。通過對在麥芽-酵母瓊脂培養(yǎng)基上 3(TC培養(yǎng)8天的培養(yǎng)物光學和掃描電鏡的觀察，孢子橢圓形，大小為 0.65-0.99jamx 1.01-1.23 |um,成孢子《連；孢子《連上有大于20個孢子， 未成熟時成明顯的結狀。
實驗方法參照上述的Shirling和Gottlieb。采用ISP1 、 ISP2、 ISP3 、 ISP4等十種培養(yǎng)基，30。C培養(yǎng)14天后，觀察菌絲體的顏色及色素情 況。結果見表1 。在ISP3、 ISP4、 ISP6和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的生長菌 落屬于灰白色系列。
表1 T300培養(yǎng)物的表觀特征
培養(yǎng)基生長情況菌落背部色素氣絲顏色可溶性色素
ISP13米白色米白色無
ISP24橙紅色深灰色無
ISP33粉紅色灰白色無
ISP44灰褐色灰白色無
ISP52粉白色粉白色無
ISP64褐黃色灰白色無
ISP73蛋黃色蛋黃色暗黃色
PDA1白色無無
營養(yǎng)瓊脂4灰褐色灰白色無查氏培養(yǎng)基
無色
無
無
實施例3:細胞壁組分分析和生理生化特征
采用Hasegawa, T. ( 1983 )等與王平(1986)改進的快速薄層層析法(TLC)進行全細胞氨基酸及全細胞水解液糖型的分析。菌林細胞壁化學組分分析菌林T-300細胞含有L, L-DAP和甘氨酸，胞壁類型為I型；無特征性糖(糖型為C)。
14°C到37。C均能夠生長，最適合溫度為28°C。 pH4.5-7.5均能夠生長，最適合pH為6.5-7.0之間?！?。/。NaCl能夠生長。其他的見表2-表4。
表2 菌林-T-300的碳源和氮源的利用情況
碳源D-葡萄糖D-棉子糖D-木糖D-山梨醇L-阿拉伯糖甘油麥芽糖D-果糖D-蔗糖糊精
生長情況 碳源 生長情況
+
+
+
水楊苷D-乳糖
半乳糖
肌醇甘露醇甘氨酸木聚糖菊粉鼠李糖
無機氮源硫酸銨硝酸鉀
生長情況
+
+
+
+
+
表3 菌抹T-300的降解試驗結果
降解物
降解物濃度
結果^
降解物
降解物濃度
結果
腺噪呤鳥噪呤
0.5%0.5%
+
酪蛋白酪氨酸
1.0%1.0%黃口票呤 0.4% + Tween-40 1.0% +
次黃噪呤 0.4% + Tween-80 1.0% +
表4菌林T-300主要的生理生化特征
試驗項目結果試驗項目結果試驗項目
明膠液化+牛奶胨化+纖維素利用
淀粉水解+硝酸鹽還原+氧化酶
牛奶凝固+石克化氳產生-過氧化氫酶
M.R實馬全+V. P實驗—黑色素產生
實施例4: 16SrDNA序列分析以及與已知的他克莫司產生菌的比較
收集待測菌林的新鮮菌體，采用溶液菌酶法改進的Pitcher法(Pitcher等，198提取總DNA模板，采用通用引物(27F和1495R)進行16S rRNA基因擴增，PCR產物經檢測純化后，TA克隆后進行序列測定，測序由上海生工生物工程技術有限公司進行。所測的16SrDNA序列經校對后與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關種、屬的序列進行同源序列BLAST比較，以確定該菌4朱的分類地位。與GenBank中相關序列進行BLAST比較的結果見表5 (表中只列出同源性較高的菌抹)。
表5 菌抹T-300和相關菌株的同源性
種名GenBank No.堿基差異數(shù)同源性(％)
AY 1270793697.4
AF4558133697.4
AB0880693697.4
AY2076054097.2
S鄉(xiāng)tom戸s取5799AJ3918144297.0
AJ3150724596.8
AY1776624796.7
9結果發(fā)現(xiàn)T300弁的16sDNA測序結果比較發(fā)現(xiàn)和6V";^^yc^ NRRL 30562、/SV"/ tow;;c&s1 / ada""51和6V廠eptow;;cas1 >sp. TP-A0274的同 源性達到了 97.4%。
T-300和已知的他克莫司產生菌的比較
T-300菌落屬于灰色群，《4。/。NaCl能夠生長。14°C到37。C均能 夠生長，最適合溫度為28°C。明膠液化，淀粉水解，牛奶凝固且胨化， 硝酸鹽還原，纖維素利用，M.R實驗和過氧化氬酶均為陽性。能夠利 用葡萄糖、木糖、麥芽糖、糊精、肌醇和木聚糖，部分利用半乳糖。 可以利用硝酸鉀為唯一無4幾氮源。
T-300菌落屬于灰色群，不產生HzS; Strain MA
6858屬于黃色群，產生H2S。 ^"/7tom;;cM取ATCC No. 55098屬于
黃色群，產生仏S。
T-300能夠利用麥芽糖、肌醇和木糖，不能利用果糖，乳糖； 5V^ptom;;cMw. Strain MA 6858不能利用麥芽糖、肌醇和木糖，能夠 利用果糖。T-300最適合溫度為28°C,在37。C能夠生長；
Strain MA 6858最適合溫度為27°C ,在37。C不能生長。5V"/ tom;;c^ /i>;cfrascop/cus No. 7238可以利用乳斗唐。S&e^cwyc&s sp. ATCC No. 55098不能利用麥芽糖，能夠利用果糖，乳糖。
T-300可以使淀粉水解，牛奶凝固，硝酸鹽還原；5". toiw6"m^ 不能。T-300能夠利用肌醇、木糖和部分利用半乳糖，不利用甘氨酸； X ^^t/Zww^不能利用肌醇、木糖和半乳糖，利用甘氨酸。 ^reptom;;ces /y^raycc^c"^ No. 7238不能使牛奶凝固，硝酸鹽還原。
綜上所述，T-300屬于鏈霉菌屬，但它不同于已知的他克莫司產 生菌iSVr一麵少c^ /zj^/rc^cop,cws, S. 加AwZ ae肌S 、 6Y廠一o，c^y取 5Vrafw MA 6858和5^eptowtyces s卩ATCC No. 55098。 T-300是一個全 新的菌種。
實施例5:
種子培養(yǎng)基(葡萄糖1.5%、酵母抽提粉0.3%、黃豆粉1%、 CaC030.2%， pH為6.7),裝量為25ml/250ml搖瓶，120。C滅菌30min。從T-300的斜面挖一塊接入種子培養(yǎng)基，置于搖床上25。C培養(yǎng)2天。然后1.25ml的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基(糊精6.0%,葡萄糖0.5%,酵母抽提粉1.0%，花生粉2.0%, NaCl 0.35%, K2HPO40.5%, pH為7.3,裝量為25ml/250ml搖瓶，120。C滅菌30min),置于搖床上25。C培養(yǎng)6天。他克莫司通過有機溶劑從發(fā)酵液中萃取所得，(去除多余空格)HPLC測定。其含量為250 pg/ml。取發(fā)酵液32L，發(fā)酵液過濾得濕菌絲。用4倍重量的丙酮萃取。萃取液加水至丙酮含量為50%(注明各百分比是質量百分比還是體積百分比)，上HP20大孔吸附樹脂，再用75%丙酮洗脫，得洗脫液1L。濃縮去丙酮后再加乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取液600ml。再上硅膠柱。用正已烷乙酸乙酯=1: 2展層。收集純組份洗脫液800ml,濃縮干。再用乙腈溶解，降溫至4。C,結晶48小時。過濾得FK506濕品。烘干后得3.5克FK506成品。結構鑒定紅外IR: 3457.51, 2935.75, 1741.37， 1694.07, 1640.71,1450.83, 1384.07, 1193.91, 1090.64 cm畫l;紫外UV: Xmax 203.40 nm;高分辨質i普HRMS: 826.4702 ( C44H69N012), M+Na。
實施例6:
種子培養(yǎng)基(淀粉1.5%、干酵母1.2%、大豆蛋白胨1%、CaCO30.3%, pH為7.0 ),裝量為20ml/250ml搖瓶，120。C滅菌30min。從T-300的斜面挖一塊接入種子培養(yǎng)基，置于搖床上25。C培養(yǎng)42hr。然后1.50ml的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基(淀粉7.0。/Q,葡萄糖1.0%,棉籽餅粉1.0%,花生粉2.5%, NaC10.50%, K2HPO40.5%, pH為7.0,裝量為25ml/250ml搖瓶，120。C滅菌30min),置于搖床上25。C培養(yǎng)7天。HPLC測定。其含量為300 pg/ml。分離純化按照實施例5進行。
實施例7:
種子培養(yǎng)基(淀粉1.5%、干酵母1.2%、牛肉浸出粉1.2%、 CaC030.3%， pH為7.0),裝量為25ml/250ml搖瓶，120。C滅菌30min。從
iiT-300的斜面挖一塊接入種子培養(yǎng)基，置于搖床上25。CTC培養(yǎng)42hr。然后1.25ml的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基(淀粉6.5%，乳糖1.0%,棉籽餅粉1.0%,玉米漿2.5%, KH2PO40.5%, K2HPO40.5%, pH為7.0,裝量為25ml/250ml搖瓶，120。C滅菌30min)，置于搖床上25。C培養(yǎng)6天。他克莫司通過有機溶劑從發(fā)酵液中萃取所得，HPLC測定。其含量為175 pg/ml。分離純化按照實施例5進行。
上述實施例僅供說明本發(fā)明之用，而并非是對發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以對其作出各種變化和修改，因此所有等同的技術方案也應落在本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明的專利保護范圍應由所附的權利要求書限定。
權利要求
1、一種鏈霉菌T300(CGMCC1779)，其具有產生他克莫司或其類似物的能力。
2、 根據(jù)權利要求1所述的鏈霉菌T300 (CGMCC1779)在制備他克 莫司或其類似物中的應用。
3、 一種制備他克莫司或其類似物的方法，其特征在于包括采用鏈 霉菌T300 (CGMCC1779)在含有可同化的碳源和氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基里， 有氧發(fā)酵的步驟。
4、 根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述可同化的碳 源選自葡萄糖、淀粉、甘油、木糖、木聚糖、糊精、麥芽糖、海藻糖、 肌醇、菊糖、水楊苷，或上述物質的組合。
5、 根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述可同化的氮 源為選自棉籽餅粉、酵母抽提粉、蛋白胨、谷蛋白、黃豆粉、玉米漿、 花生粉、小麥粉、干酵母、尿素氨基酸、硝酸鹽，或上述物質的組合。
6、 根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)基中還 包括消泡劑，該消泡劑選自植物油、液體石蠟、脂肪油、礦物油、硅油， 或上述物質的組合。
7、 根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的 溫度為20°C-40°C， pH為6.0-8.0,培養(yǎng)時間為120-240小時。
8、 根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于其中所采用的他 克莫司產生菌還可以為鏈霉菌T300 (CGMCC1779)自發(fā)的突變抹或通 過常規(guī)的誘變得到突變林。
9、 根據(jù)權利要求3~8所述的制備方法在制備含有他克莫司的藥物 組合物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的鏈霉菌、通過培養(yǎng)它制備他克莫司的方法及其應用。本發(fā)明的鏈霉菌Streptomyces sp.T300(CGMCC1779)是一個全新的菌種，且在發(fā)酵過程中不產生有毒的H₂S氣體。其在含有可同化的碳和氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基里并在通氧的條件下通過發(fā)酵培養(yǎng)下制得他克莫司，并可應用于制備含有他克莫司的藥物組合物。
文檔編號C12N1/20GK101486975SQ200810001069
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月18日 優(yōu)先權日2008年1月18日
發(fā)明者葉美麗, 林劍秋, 丹 潘, 驊 白, 胡建紅, 詹佩君, 馬海霞 申請人:浙江海正藥業(yè)股份有限公司