專利名稱：：凝血酶原分離及其激活的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物工程
技術領域：
，尤其涉及一種凝血酶原分離及其激活的方法。
背景技術：
：凝血酶是在血液凝固系統(tǒng)中起重要作用的絲氨酸蛋白水解酶，具有較高的專一性，是一種新型速效局部止血藥。1939年Seegers等從血清中成功分離了凝血酶，用于肝臟實質(zhì)性出血和骨髓出血止血取得顯著效果，隨后Rogers使用凝血酶進行消化道止血獲得良好效果，凝血酶制劑開始廣泛使用，應用領域不斷擴大，外傷出血止血，手術中不易結扎小血管的止血等均有應用。我國于二十世紀八十年代后期使用豬血中提取的國產(chǎn)凝血酶治療重型肝炎、肝炎后肝硬化、上消化道出血等。隨后凝血酶又應用于急性上消化道出血，鼻出血、扁桃腺摘除、牙出血、手術中毛細管滲血及外傷出血等，并收錄于中國藥典1995年版、2000年版和2005年版。人們通常先提取凝血酶原，再將凝血酶原激活成凝血酶，然后進一步分離純化，凝血酶原的制備方法通常有等電點沉淀法、吸附洗脫法、丙酮沉淀法、硫酸銨鹽析法等，在實際操作中往往合用以上幾種方法；另外也有層析法聯(lián)合其他方法、也有釆用親和層析法純化凝血酶原等。凝血酶原的激活多采用檸檬酸鈉、組織凝血活酶、CaCl2。目前凝血酶原分離及其激活的方法較復雜，有的需要在低溫條件下完成，有的要采用有機溶劑，操作繁瑣，而且，所得的凝血酶產(chǎn)品的比活力也不是很高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種工藝方法簡單、操作容易的凝血酶原分離及其激活的方法，該方法避免了使用有機溶劑，而且所得到的凝血酶產(chǎn)品的比活力要明顯優(yōu)于現(xiàn)有方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的凝血酶原分離及其激活的方法，其步驟為a.將新鮮血液加入0.38wtn/。檸檬酸鈉作抗凝劑，離心取上清液得抗凝血漿；b.將血漿稀釋10倍后，調(diào)節(jié)pH至5.05.5進行等電點沉淀，收集凝血酶原粗品沉淀；c.用濃度為0.075wt。/。的草酸鉀和0.85wtT。的氯化鈉混合液溶解粗品沉淀，進行提??；d.用透析或超濾方法降低提取液中的電導率到400ns/cm，離心，除去沉淀物，將清液繼續(xù)透析或超濾使其電導率進一步下降到1505ps/cm，離心取沉淀物即為凝血酶原沉淀；e.用0.9wt。/。的NaCl溶液對凝血酶原沉淀進行溶解，離心除去不溶物，得凝血酶原溶液；f.加入pH6.88.0的Tris-HCl緩沖液，使其終濃度達到00.2mol/L，再加入0.252.0wt%CaCO3于545。C激活溫度下激活113分鐘后，離心除去沉淀，所得清液即為凝血酶溶液。本發(fā)明的凝血酶原分離及其激活的方法其所述新鮮血液可為豬血、牛血或人血。本發(fā)明方法利用透析或超濾控制凝血酶原粗提液的電導率的方法，使凝血酶原粗提液中的雜蛋白和凝血酶原在不同的電導率下發(fā)生沉淀，從而使凝血酶原和雜蛋白分離。將凝血酶原的提取液用透析法透析，可以用透析袋進行透析，也可以用透析器進行透析，截流分子量為530000，使凝血酶原提取液的電導率降低。也可用超濾法來降低凝血酶原提取液的電導率用超濾法濃縮凝血酶提取液，超濾膜的截流分子量為530000，濃縮后加入純水進行稀釋，再進行超濾濃縮，再稀釋；反復進行濃縮一稀釋，使凝血酶原提取液的電導率降低。當用透析法或超濾法使含有不同種類鹽離子的凝血酶原提取液的電導率達到15(^s/cm5ns/cm范圍時，凝血酶原便會沉淀，得到的凝血酶比活力更佳。碳酸銬(CaC03)作為凝血酶原的激活劑是有效而可行的。終濃度為0.252.0wtn/o范圍的CaC03用量都能夠起到激活凝血酶原的作用，優(yōu)選CaC03用量為0.51.5wt%,進一步優(yōu)選CaC03用量為1.0wt%。545'C的溫度范圍都可以激活凝血酶原，優(yōu)選激活溫度為1535°C，最優(yōu)選激活溫度為35'C。激活時間在113分鐘范圍都可以較好地激活凝血酶原，優(yōu)選的激活時間在410分鐘，最優(yōu)選的激活時間為7分鐘。Tris-HCl緩沖液對碳酸鈣(CaC03)激活凝血酶原具有良好的促進作用，較適的Tris-HCl濃度為0.050.1mol/L，pH為7.4。按本發(fā)明的凝血酶原分離及其激活的方法所得到的凝血酶產(chǎn)品比活力(即每lmg的效價)可以達到150u/mg，產(chǎn)量可以達到9500u/L(血漿)以上；若按中國藥典的比活力指標計，產(chǎn)量可達到15000u/L(血漿)以上，比活力大大超過中國藥典(2005版)規(guī)定的10.0u/mg。本發(fā)明提供的凝血酶原分離及其激活的方法，避免了使用有機溶劑，使操作簡便，成本低，所得到的凝血酶產(chǎn)品的比活力要明顯優(yōu)于現(xiàn)有方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。具體實施例方式實施例l將新鮮牛血加入0.38%檸檬酸鈉作抗凝劑，4000轉/分鐘，離心510分鐘，取上清液，以蒸餾水或純水稀釋10倍，用2X醋酸調(diào)pH至5.05.5，4'C放置過夜。去掉上清液，取出沉淀，4000轉/分鐘，離心5分鐘，收集沉淀。用草酸鉀和氯化鈉的混合液溶解沉淀，進行提取，其中混合液中重量百分比濃度草酸鉀為0.075%，氯化鈉為0.85%。提取過程中用1.0%NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH,使其維持在6.5左右。提取約1小時后，提取液經(jīng)4000轉/分鐘，離心5分鐘，棄去沉淀，得清液。利用超濾方法使凝血酶原提取液濃縮，濃縮后加入蒸餾水或純水(加入水后的總體積不超過原來的總體積)繼續(xù)超濾濃縮，再加入蒸餾水或純水，監(jiān)測其電導率，當被超濾的提取液的電導率達到設定的值400ns/cm時，離心去除沉淀物；離心得到的清液繼續(xù)超濾濃縮，濃縮后再加入蒸餾水或純水，監(jiān)測其電導率，當被超濾的提取液的電導率達到設定的值150ps/cm時，離心得到的沉淀物即為凝血酶原，留下的清液可以轉入到實施例2之中。所得凝血酶原用0.9。/。的NaCl溶液溶解，再離心除去沉淀物后即為凝血酶原溶液。取一定體積的凝血酶原溶液，加入0.1mol/LpH=7.4的Tris-HCl緩沖液，預熱到35°C;稱取CaC03加入到凝血酶原溶液中，使其濃度達到1.0wt%，35'C下保溫激活7分鐘，4000轉/分鐘，離心5分鐘后收集上清液，置冰箱冷藏(一18'C),以測定酶活力。實施例2將新鮮豬血加入0.38%檸檬酸鈉作抗凝劑，4000轉/分鐘，離心510分鐘，取上清液，以蒸餾水或純水稀釋10倍，用2X醋酸調(diào)pH至5.05.5,4'C放置過夜。去掉上清液，取出沉淀，4000轉/分鐘，離心5分鐘，收集沉淀。用草酸鉀和氯化鈉的混合液溶解沉淀，進行提取，其中混合液中重量百分比濃度草酸鉀為0.075%，氯化鈉為0.85%。提取過程中用1.0%NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH,使其維持在6.5左右。提取約1小時后，提取液經(jīng)4000轉/分鐘，離心5分鐘，棄去沉淀，得清液。將清液注入透析袋或透析機中，對04'C純水進行透析，監(jiān)測其電導率，當被透析的提取液的電導率達到設定的值400ns/cm時，離心除去沉淀物；離心得到的清液繼續(xù)透析，當被透析的提取液的電導率達到設定的值150ias/cm時，離心得到沉淀為凝血酶原1;得到的清液繼續(xù)透析，當被透析的提取液的電導率達到設定的值10ps/cm時，離心得到的沉淀物即為凝血酶原2。所得凝血酶原1和2都用0.9%的NaCl溶液溶解，再離心除去沉淀物后即分別為凝血酶原1和凝血酶原2溶液。取一定體積的凝血酶原2溶液,加入O.lmol/LpH=6.8的Tris-HCl緩沖液，預熱到35'C;稱取CaC03加入到凝血酶原溶液中，使其濃度達到1.0wt%，35'C下保溫激活7分鐘，4000轉/分鐘，離心5分鐘后收集上清液，置冰箱冷藏(一18'C)，以測定酶活力。實施例318的操作方法步驟同實施例2，具體條件參數(shù)見表1所示。表l本發(fā)明實施例采用的不同泰l作條件<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>采用本發(fā)明的凝血酶原分離及其激活的方法制的凝血酶，為說明其效果，我們參照中國藥典(2005版)對其活力進行測定，測定方法如下(1)纖維蛋白原溶液的配制纖維蛋白原溶液的配制參考中國藥典(2005版)。稱取0.1g的纖維蛋白原(瑞士Fluka公司產(chǎn)品)，先加0.9%NaCl溶液50ml，用0.05mol/L磷酸二氫鈉或0.05mol/L磷酸氫二鈉調(diào)pH至7.0-7.4溶解，再稀釋至100ml，即為纖維蛋白原溶液。(2)酶活標準曲線的繪制取凝血酶標準品(美國sigma公司產(chǎn)品)，用0.9%氯化鈉溶液分別制成每ml中含10.0、8.0、6.4、5.0個活力單位的標準品溶液。另取內(nèi)徑lcm、長度10cm的試管4支，各精密加入纖維蛋白原溶液0.9ml，置37'C水浴中保溫5分鐘，再分別精密量取上述4種濃度的凝血酶標準品溶液各O.lml,迅速加入上述各試管中，立即搖勻并計時,觀察纖維蛋白原的初凝時間,每種濃度測5次,求平均值(5次測定最大值與最小值的差不得超過平均值的10%)。標準品溶液的濃度定為控制凝結時間在14-60秒內(nèi)。在雙對數(shù)坐標上，以每管中標準品實際活力單位數(shù)(U)為橫坐標,凝結時間(sec)為縱坐標,繪制標準曲線。(3)樣品酶活測定取待測凝血酶樣品液，按酶活標準曲線繪制中的方法求出凝結時間均值，在酶活標準曲線上或用直線回歸方程求得酶活單位數(shù)。(4)凝血酶溶液中蛋白質(zhì)含量的測定牛血漿清白蛋白標準曲線的繪制蛋白質(zhì)含量測定采用福林一酚試劑法，標準蛋白質(zhì)溶液0.3mg/ml牛血清蛋白。試劑甲10mg/ml硫酸銅溶液和20mg/ml酒石酸鉀鈉溶液1:1混合液，取20g無水碳酸鈉、4g氫氧化鈉溶于1L蒸餾水中制得混合液，兩種混合液以1:50混合均勻，放置30分鐘后使用。(試劑甲只能用一天)。試劑乙福林試劑(酚試劑)。取內(nèi)徑lcm,長10cm的試管6支，分別加入O、0.2、0.4、0.6、0.8、l.Oml的牛血清白蛋白標準品溶液，再用蒸餾水補足為l.Oml，配成不同濃度的標準蛋白溶液。然后加入5ml福林試劑甲，迅速混勻，靜置10分鐘；加入0，5ml福林試劑乙，迅速混勻，靜置15分鐘，見表l。用分光光度計測定上述6種濃度的標準蛋白溶液在750nm處吸光度，以每管中標準蛋白溶液的相對濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，繪制標準曲線。表2福林一酚試劑法測蛋白的方法<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>凝血酶樣品的蛋白含量的測定用分光光度計測定凝血酶樣品液的吸光度，在牛血清白蛋白標準曲線上或用回歸方程査出其相應的蛋白質(zhì)含量，從而計算出凝血酶樣品液的蛋白質(zhì)濃度(pg/ml)。(5)凝血酶比活的測定用單位體積內(nèi)酶活單位數(shù)除以單位體積凝血酶樣品液的蛋白質(zhì)含量，計算出單位蛋白質(zhì)含量中的酶活力單位數(shù)(u/mg)。根據(jù)上述測試方法，我們測到各實施例的凝血酶活力數(shù)值如表3所示。表3本發(fā)明實施例的凝血酶活力數(shù)值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表中可以看出，用透析法或超濾濃縮后進行稀釋等方法使含有不同種類鹽的凝血酶原提取液的電導率達到400ns/cm時，離心，除去沉淀物，將清液繼續(xù)透析或超濾使其電導率進一步下降到1505ns/cm，離心取沉淀物即為凝血酶原沉淀。電導率在150fis/cm5ps/cm范圍的沉淀物激活后得到的凝血酶比活力可達到150.0u/mg，得率為55.9%。碳酸鈣(CaC03)作為凝血酶原的激活劑是有效而可行的，它的激活效果明顯優(yōu)于常用的激活劑氯化鈣(CaCl2)的激活效果(比活力為ll.lu/mg)。0-0.2mol/L的Tris-HCl濃度，0.25~2.0wt%CaC03，545'C激活溫度，113分鐘的激活時間也都是適合的操作條件。上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權利要求的保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。權利要求1、一種凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于其步驟為a.將新鮮血液加入0.38wt％檸檬酸鈉作抗凝劑，離心取上清液得抗凝血漿；b.將血漿稀釋10倍后，調(diào)節(jié)pH至5.0～5.5進行等電點沉淀，收集凝血酶原粗品沉淀；c.用濃度為0.075wt％的草酸鉀和0.85wt％的氯化鈉混合液溶解粗品沉淀，進行提??；d.用透析或超濾方法降低提取液中的電導率到400μs/cm，離心，除去沉淀物，將清液繼續(xù)透析或超濾使其電導率進一步下降到150～5μs/cm，離心取沉淀物即為凝血酶原沉淀；e.用0.9wt％的NaCl溶液對凝血酶原沉淀進行溶解，離心除去不溶物，得凝血酶原溶液；f.加入pH6.8～8.0的Tris-HCl緩沖液，使其終濃度達到0～0.2mol/L，再加入0.25～2.0wt％CaCO3于5～45℃激活溫度下激活1～13分鐘后，離心除去沉淀，所得清液即為凝血酶溶液。2、根據(jù)權利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述新鮮血液為豬血、牛血或人血。3、根據(jù)權利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟d中清液繼續(xù)透析或超濾使其電導率降低到10ns/cm。4、根據(jù)權利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟沖加入的Tris-HCl緩沖液其pH7.4，終濃度達到0.050.1mol/L。5、根據(jù)權利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟f中CaC03加入量為0.51.5wt%。6、根據(jù)權利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟沖激活溫度為1535'C。7、根據(jù)權利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟沖激活時間為410分鐘。8、根據(jù)權利要求5所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟f中CaC03加入量為lwt。/。。9、根據(jù)權利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟沖激活溫度為35'C。10、根據(jù)權利要求l所述的凝血酶原分離及其激活的方法，其特征在于所述步驟沖激活時間為7分鐘。全文摘要本發(fā)明涉及一種凝血酶原分離及其激活的方法，該方法利用透析或超濾控制凝血酶原粗提液的電導率的方法，使凝血酶原粗提液中的雜蛋白和凝血酶原在不同的電導率下發(fā)生沉淀，從而使凝血酶原和雜蛋白分離。另一方面，選用碳酸鈣(CaCO₃)作為激活劑對凝血酶原進行激活。本發(fā)明工藝方法簡單、操作容易，避免了使用有機溶劑，而且所得到的凝血酶產(chǎn)品的比活力要明顯優(yōu)于現(xiàn)有方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號C12N9/74GK101182505SQ200710156430公開日2008年5月21日申請日期2007年10月29日優(yōu)先權日2007年10月29日發(fā)明者張連波,章慧益,童微星申請人:浙江大學寧波理工學院