專利名稱：一種快速提取植物根際土中am真菌環(huán)境dna的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種快速提取植物根際土中AM真菌環(huán)境DNA的方法，屬于分子生 物學和應用微生物學領域。
背景技術：
叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungus, AMF)是自然界中一類分布廣泛 的土壤微生物，它可以與約90%以上的陸生維管束植物的根系形成一種互惠共生 體一一叢枝菌根(Arbuscular Mycorrhiza， AM)。越來越多的研究表明根際土中大 量的AMF根外菌絲在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生態(tài)學功能，發(fā)現(xiàn)土壤中AMF 的種類和組成已成為影響植物群落定居、演替、植物區(qū)系組成的一個重要因素，進 而也是影響生態(tài)系統(tǒng)中資源配置、生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、物種多樣性和生產力的重要 因素。叢枝菌根表現(xiàn)出可以在不同組織水平上(Hierarchical Organizational Levels) 影響生命系統(tǒng)的過程和功能。因此，AM已成為生態(tài)系統(tǒng)中一個重要的功能類群。基 于菌根的古老起源及其分布的普遍性、生態(tài)功能的多樣性和重要性，球囊霉門真菌 國際菌種庫(The International Bank for the Glomeromycota, BEG)管理委員會提出"嚴 格地講，自然界中的多數(shù)植物沒有傳統(tǒng)意義上的根系，只有菌根。因此，有關植物 的研究如果不考慮菌根或者菌根的影響就不能全面反映植物生長的真實情況"。因此，開展AMF群落結構特征及其生態(tài)分布調查研究一直是AM研究領域的一 個熱點。然而，由于AM真菌絕對活體營養(yǎng)這一生物學特性使得目前還無法對其進 行傳統(tǒng)意義上的純培養(yǎng)，AM真菌這一特性極大地阻礙了 AM真菌群落生態(tài)學的調 查研究。自Simon等1992年首次報道了用特定的PCR引物對AMF的18S核糖體基 因進行擴增得到AM真菌的第一條DNA序列以來，分子生物學這一有力工具在菌根 研究領域初歩顯現(xiàn)出獨特的魅力。因此，如何有效、快捷地從根際土或少量的新鮮 根樣中獲得一定量的AM真菌目的DNA是開展AM真菌分子生態(tài)學及其應用研究的 核心問題。目前，從根際土(或植物根樣)中獲得AM真菌目的DNA的方法主要包括CTAB
法、Chelex-100樹脂法以及DNA提取試劑盒等。然而，以上三種方法都不能完全 有效地解決從混有大量雜質的根際土中獲得一定純度的、有代表性的DNA。因此' 從適量的根際土中獲得AMF環(huán)境DNA對開展AMF分子生態(tài)分布特點研究顯得尤為 重要。經文獻檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內容相同文獻的公開報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術之不足，通過發(fā)明一種快速提取植物根際土中 AM真菌環(huán)境DNA方法，迅速擴增根際土中AM真菌目的DNA片段，從分子生態(tài) 學層面上更準確、全面地了解AM真菌在根際土中的生態(tài)學地位和功能。本發(fā)明利用根際土中AMF相關結構可以懸浮在水面的特點，結合CTAB法和 Chelex-100樹脂(Chelex-100 resin，以亞氨二乙酸為吸附的苯乙烯與二乙基苯的共聚 物)方法并加以改進，解決了從大量的(100g或更多)根際土樣品中獲得AM真菌 環(huán)境DNA的問題。土壤中存在許多影響PCR效率的制約因子，如何有效去除這些制約因子是開展 土壤生物分子生物學研究的首要問題。本發(fā)明根據(jù)根際土中AM真菌通?？梢孕纬?較大的厚垣孢子且能懸浮在水表面的特性，采用濕篩沉淀法初歩去除土壤中大部分 PCR制約因子，收集根際土壤中AM真菌相關結構(如AMF厚垣孢子、AMF根外 菌絲等)作為提取AM真菌環(huán)境DNA的樣品，從而有效解決市售試劑盒只能從痕量 樣品提取DNA而缺乏代表性的不足(如美國EPICENTRE SoilMaster提取試劑盒， 只能提取0.10 g 土壤)。通過濕篩傾析法收集到AMF孢子等結構經過CTAB試劑提 取后， 一方面，CTAB促進DNA的釋放并減少機械破壁過程中如內源核酸酶對目的 DNA的降解作用；另一方面，利用首輪有機溶劑(如等體積苯酚和氯仿混合液)初 步去除大部分有機雜質，然后用Chelex-100樹脂代替CTAB法中后續(xù)的多次有機溶 劑的純化過程。聯(lián)合應用Chelex-100法及CTAB法可以有效地減少CTAB法在多輪有 機試劑純化過程中造成目的DNA片段損失。同時，由于CTAB法的引入可以促進目的 DNA分子從大量樣品中釋放，并經過首輪有機試劑純化后去除溶液中大量的蛋白質、 脂肪等雜質。然后利用Chelex-100樹脂對多價金屬離子的整合作用，可防止DNA在 煮沸加熱時被降解，同時在高溫低離子強度下還有催化DNA釋放的作用，這樣既可以 減少DNA的損失，又可以消除擴增中的一些抑制因子。
聯(lián)合應用Chelex-100法及CTAB法，綜合了二種DNA提取方法方便、簡單、快速 及DNA提取量多、可濃縮純化等優(yōu)點，提高了 PCR擴增成功率。采用本發(fā)明可以快速 從大量的根際土中獲得AM真菌目的DNA，利用AM真菌特異性引物結合巢式PCR (nested-PCR)技術可以對根際土中定殖AMF相關分子標記片段進行快速擴增。本 發(fā)明同時還適用研究大量根系內AM真菌DNA的提取。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的從適量根際土 (100 g)中提取AM真菌DNA，利用AMF特異性引物通過巢式 PCR擴增AM真菌目的片段，通過轉化、克隆以及擴增片段測序，測序結果在NCBI 中利用Blasto工具(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行檢索，根據(jù)檢索結果 判斷擴增序列的性質。1. 根際土中AM真菌相關結構的收集稱取根際土壤樣品100 g，放入250 ml燒杯中，加水至120 150 ml浸泡，以便 土壤顆粒充分溶解，然后在磁力攪拌器上慢速攪拌10 20分鐘，使土壤顆粒進一步 分散；讓土壤溶液通過一組20目和200目的分樣篩(篩孔直徑分別為卯0 pm和70 Hm)，用自來水反復沖洗，濾去土壤顆粒；洗凈后用洗瓶將200目篩面上的篩出物沖 洗到200 ml小燒杯中，靜置5 min后將上清液倒入100 ml量筒中，保留燒瓶底部的 篩出物與水約25 ml;量筒靜置約5 min后，上清液分別轉入500 ml梨形分液漏斗中， 全部過程重復三次；分液漏斗靜置15min后，打開漏斗底部活塞，使水成滴滴下， 待漏斗中剩下約40ml時，關閉活塞；收集漏斗內AMF土壤相關結構(主要是AM 真菌厚垣孢子、根外菌絲等)和部分雜質。經真空抽濾去除多余水分用于提取根際 土 AM真菌環(huán)境DNA。2. AM真菌環(huán)境DNA提取1) .將收集到AM真菌相關結構移到無菌的研缽中，用液氮冷卻材料，待水份蒸 發(fā)后，加入少量石英砂，充分研磨材料使之呈粉末狀，然后迅速將粉末狀的材料轉 入2ml的離心管中；2) .在裝有材料的離心管中加入65 。C水浴預熱的2xCTAB提取液1 ml，使材料完 全分散在提取液中，在65 。C水浴鍋中溫浴1小時,期間每20分鐘搖勻1次；
3) .將溫浴的材料取出置于室溫下，待冷卻至室溫后加入300)al等體積的苯酚-氯 仿顛倒混勻，然后6500轉/分鐘離心20 min;4) .取上清液10 ial轉移到另一 0.5 ml的離心管中，再加入300 (al 20% CheIex-IOO 樹脂(Sigma, USA)混勻，置于99.9 。C的PCR儀上煮沸15 min;5) .待樣品冷卻至室溫，瞬時離心30 s，取上清液稀釋20-100倍后置于-20 'C冰 箱中保存?zhèn)溆没蛑苯幼鳛镈NA模板進行PCR擴增。3. nested-PCR擴增把提取的環(huán)境DNA稀釋20-100倍(視提取質量而定)，根據(jù)下表配制PCR反應體 系進行PCR擴增。首先使用外側引物對--引物LR1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GA-3，)和FLR2 ( 5'-GTC GTT TAA AGC CAT TAC GTA-3')進行第一次PCR 擴增。對First PCR反應所得產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測若無條帶出現(xiàn)則以First PCR產物直接作為Second PCR反應的模板(若有條帶出現(xiàn)將其稀釋50-100倍后作 為Second PCR反應的模板)。以AM真菌專一性相對較強的寡核苷酸FLR3 (5'-TTG AAA GGG AAA CGA TTG AAG T-3')和FLR4 (5，-TAC GTC AAC ATC CTT AAC GAA-3，)為內側引物進行Second (nested) PCR，獲得長300至380 bp的LSU基因片 段。10xPCR buffer 5pl 25mM MgCI2 3pl 10mMdNTPmix 1|jl Taq Polymerase 0.5pl Primeri (10 pmol/)jl) 1pl Primer2 (10 pmol/卩l(xiāng)) DNA (20ng) 1 |j|細20_37.5|jlTotal 50(jl4. PCR擴增片段測序對PCR擴增所得片段進行電泳純化回收并進行連接產物的轉化和重組實驗，挑選 陽性克隆提取質粒直接進行測序。5. 測序結果分析運用 NCBI 上的核苷酸序列同源性分析工具 Blasto (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對測序所得的DNA序列進行分析，根據(jù)檢 索結果判斷擴增序列是否是AM真菌目的片段。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有準確、快捷、簡便、經濟等優(yōu)點。
具體實施例方式利用以上方法，結合nested-PCR技術，對擴增片段測序，測序結果在NCBI中利 用Blastn (http:Vwww.ncbi.nIm.nih.gov/BLAST/)進行檢索，根據(jù)檢索結果判斷擴增 序列的性質。以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內容并不局限于此，同樣適用于 根樣內定殖AM真菌DNA提取、土壤內其他絲狀真菌DNA的提取等。實施例1:坡柳(Z)ocfo"aea v^co化)根際土中AMF基因組DNA提取稱取坡柳植物根際土100 g，通過濕篩傾析法收集AM真菌相關結構(AMF孢 子、根外菌絲等)，經液氮冷卻研磨成粉狀，依據(jù)本發(fā)明方法加1000 pl CTAB液和 20% Chelex-100樹脂進行DNA提取，并進行nested-PCR,經克隆、測序獲得AMF 目的基因。并將獲得的基因遞交到GenBank，序列登錄號為EU118739。實施例2:扭黃茅(/fetox^ogo" coMtortws)根際土中AM真菌基因組DNA提?。?基本同實施例一，并將獲得的基因遞交到GenBank，序列登錄號為EU118750。實施例3:坡柳(￡ . v/sowe)根內AM真菌基因組DNA提取稱取新鮮坡柳根系2g，用75%乙醇進行表面消毒后，經液氮冷卻研磨成粉狀， 依據(jù)本發(fā)明方法加1000 pi CTAB液和20% Chelex-100樹脂進行DNA提取，并進 行nested-PCR，經克隆、測序獲得AM真菌目的基因。并將獲得的基因遞交到 GenBank，序列登錄號為EU118692。實施例4:扭黃茅(H c朋fwtM)植物根內AM真菌基因組DNA提取基本同實施例三，并將獲得的基因遞交到GenBank,序列登錄號為EU118712。
附圖
基因序列.txtSEQUENCE LISTING<110〉 云南大學<120〉 一種快速提取植物根際土中AM真菌環(huán)境DNA的方法<130> 1<160> 1<170> Patentln version 3.1<210> 1<211> 373〈212> DNA<213〉 Uncultured Glomeromycota <220>_<221〉 gene<222〉 (1)..(373) <223><400> 1ttg犯3ggg3aacgattgaagtcagtcgtactggcgaaaa atcaactactcgagtgagta60cttgtgggcgtacgtgagcttcacggccgcgttgtttgca atgttcgtgctcttgtggtg120tactttttcgtgtggtaggtcaatgtcggttttgaacgcc ataaaatgatcggaggaatg180tagcttcgacctcgttgaagtgttatagcctttggtagat atggtgtttgggatcgagga240ttgcaacgaataccttttgggctatccgtctgacctctga tggttagctgggtgccg纖300gcatgcttacggttatccaagttgactgtcaatagattag aacgtgatta cattcgttaa360ggatgttgac373SEQUENCE LISTING〈110〉 云南大學<120〉 一種快速提取植物根際土中AM真菌環(huán)境DNA的方法及應用<130〉. 1 -<160> 1<170> Patentln version 3.1<210> 1<211> 373〈212〉 DNA<213> Uncultured Glomeromycota 〈220〉<221〉 gene<222〉 (1)..(373) 〈223〉〈400> 1ttgaaagggetaacgattgaagtcagtcgtacttgcgggtaatcEigccttttgggtgtgat60tctgtggagtgtgaggagttaaacgccttcatgcctgcatattcgtgcactttgggtgta120cttgcccgtgtggttagttaacatcaattttgg"tcgttataaaatggctggaggaatgta180gcttcgatctcgtattgaagtgttatagccttcggtagatgtgatgatcgggattgagga240ttgcaacggatacccttcggggctacctgtctgatctrtga/tcgttgctctggtgccgaa300agcgtgcttacggtcatcaaagtcgatggtcaataggttagaacgggttaaattcgttaa360ggatgttgacgta373SEQUENCE LISTING<110>云南大學<120〉 一種快速提取植物根際土中AM真菌環(huán)境DNA的方法及應用<130> 1<160> 1<170> Patentln version 3. 1<210> 1<211〉 374<212> DNA<213> Uncultured Glomeromycota <220〉<221〉 gene<222> (1)..(374) 〈223><400〉 1Ugaaagggaaacgeittg犯gtcagtcgtaccgacgagtaatcagcctttcgggtgtgat60tttgccggacacggagagctttaccgcsttcgtgcttgtaaatttgtgccctttgggtgt120actttctcgtatggttEigttaacatcaattttgatcgttataaaatgactggagtaatgt180agcttcgatcttgtattgaagtgttatagactttggtagatgtaacgatc3gg3ttg3gg240attgcaacgaatacccttcgggctatccgtctggcctctgaaagttgtcttggtgccgaa300agcgtgcttacggttatcgaggctgacggtc犯aaggttagaacgcgattaaattcgtta360aggstgUgacgta374SEQUENCE LISTING<110>云南大學<120> —種快速提取植物根際土中AM真菌環(huán)境DNA的方法及應用<130> 1<160〉 1<170〉 Patentln version 3.1<210〉 1 '〈211〉 375<212> DNA<213> Uncultured Glomeromycota<220> '<221> gene<222> (1)..(375) <223><■> 1Ug謹ggga朋Cg3ttgElElgtcagtcgtactcatgggtaatcaacctttctggcgcgat60tatgtgggcgtgttggagcctaaccggtcctcgcgtttttatattcgttcctcttgggtg120tacttgcccgtgtggtaggt"ttcggacgtcataaaatgacgggaggaatg180tagctttggtctcgtactgaagtgttatagcctctggtagatgtgacgtttgggattgeig240gattgcaacggatacctctcggggctacctgtctggcctctgatgattgctatggtgccg300aaagcttgcttatggtcatcaaagttgattgtcaaaaggttagaacgggttaaattcgtt360aaggatgttgacgta37權利要求
1、一種快速提取植物根際土中AM真菌環(huán)境DNA的方法，包括根際土中AM真菌相關結構的收集、真菌基因組DNA的提取、用AM真菌特異性引物進行nestedPCR擴增、及擴增片段測序及測序結果分析步驟，其特征在于本方法中所用根際土AM真菌DNA由下列方法得到a.稱取100g根際土壤樣品，經濕篩傾析法收集AMF厚垣孢子及根外菌絲結構，并將其置于無菌的研缽中，用液氮冷卻材料，待水份蒸發(fā)后，加入少量石英砂，充分研磨材料使之呈粉末狀，然后迅速將粉末狀的材料轉入2ml的離心管中；b.在裝有材料的離心管中加入65℃水浴預熱的2×CTAB提取液1ml，使材料完全分散在提取液中，在65℃水浴鍋中溫浴1小時，期間每20分鐘搖勻1次；c.將溫浴的材料取出置于室溫下，待冷卻至室溫后加入300μl等體積的苯酚-氯仿顛倒混勻，然后6500轉/分鐘離心20min；d.取上清液10μl轉移到另一0.5ml的離心管中，再加入300μl 20％Chelex-100樹脂混勻，置于99.9℃的PCR儀上煮沸15min；e.待樣品冷卻至室溫，瞬時離心30s，取上清液稀釋20-100倍置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆没蛑苯幼鳛镈NA模板進行PCR擴增。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速擴提取植物根際土中AM真菌環(huán)境DNA的方法，屬于分子生物學和應用微生物學領域。本發(fā)明設計一種用于快速從大量有代表性的根際土提取AM真菌基因組DNA方法。首先通過濕篩法去除根際土大量的PCR擴增制約因子，收集根際土中AM真菌相關結構用于DNA的提取，經機械破壁后加入CTAB促進DNA釋放，經Chelex-100樹脂的進一步純化。本提取方法具有方便、簡單、快速的特點，并且DNA提取量多、具可濃縮純化等優(yōu)點，提高了PCR擴增成功率。通過本發(fā)明成功地從100g根際土中提取到AM真菌的環(huán)境DNA，以此為模板通過nested-PCR克隆到根際土中AM真菌目的基因片段。本發(fā)明能夠快速提取植物根際土中叢枝菌根真菌環(huán)境DNA，具有良好的應用前景。
文檔編號C12N15/31GK101148677SQ20071006621
公開日2008年3月26日 申請日期2007年9月19日 優(yōu)先權日2007年9月19日
發(fā)明者濤 李, 趙之偉 申請人:云南大學