專利名稱：中華絨螯蟹與日本絨螯蟹的分子遺傳鑒別技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳學(xué)、生物多樣性保護(hù)學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及中華絨 螯蟹、中國(guó)南方水系(廣東珠江、廣西南流江)絨螯蟹與日本絨螯蟹的分子遺傳 鑒別方法。
背景技術(shù)：
中華絨螯蟹(^Woc力ej'r幻'/3e; sis)和日本絨螯蟹(^rioc力eir j'apo/n'ca)同 屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustaceae)、十足目(Decapoda)、方蟹 科(Grapsidae)、絨螯蟹屬C&kc力e&)。絨螯蟹屬通常包括四個(gè)種中華絨螯 蟹、日本絨螯蟹、直額絨螯蟹和狹額絨螯蟹。另外，中國(guó)南方水系還有南流江 絨螯蟹。直額絨螯蟹和狹額絨螯蟹個(gè)體很小，無(wú)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。中華絨螯蟹和日本 絨螯蟹的個(gè)體較大，是經(jīng)濟(jì)性種類，其中中華絨螯蟹的經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高，在中國(guó) 的年產(chǎn)值達(dá)300億元以上。中華絨螯蟹是中國(guó)的土著種，主要分布于中國(guó)南至 北諱24° ，北至北諱42° 43° ，東至東經(jīng)124。的鴨綠江口，西至東經(jīng)112 °的湖北沙市的廣大地區(qū)。日本絨螯蟹主要分布于日本和朝鮮半島等地，而一 種觀點(diǎn)認(rèn)為中國(guó)南方的南流江水系(廣西壯族自治區(qū))、珠江水系(廣東省)的絨 螯蟹也屬日本絨螯蟹。本發(fā)明人將分布于日本的絨螯蟹歸為日本絨螯蟹，將中 國(guó)南流江水系(廣西壯族自治區(qū))、珠江水系(廣東省)的絨螯蟹歸為南方絨螯 蟹。
由于中華絨螯蟹的巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場(chǎng)潛力，目前已形成了規(guī)模龐大的產(chǎn) 業(yè)。隨著中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，出現(xiàn)了不同水系絨螯蟹苗種相互混雜、 交流的現(xiàn)象。因此研究和開(kāi)發(fā)不同水系絨螯蟹的鑒別方法與技術(shù)對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展至 關(guān)重要。
從形態(tài)標(biāo)記上1999年《水產(chǎn)學(xué)報(bào)》23巻第4期337-342報(bào)道了中國(guó)北 方四水系(遼河、黃河、長(zhǎng)江、甌江)和南方兩水系(珠江、南流江)六個(gè)絨鰲蟹 群體形態(tài)多元分析結(jié)果，提供了判別南北水系絨螯蟹準(zhǔn)確率達(dá)100%的判別函數(shù)；2002年《上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)》第11巻第2期110-113頁(yè)報(bào)道了一只日本 絨螯蟹樣本與中國(guó)不同水系中華絨螯蟹的形態(tài)描述性區(qū)別方法；2003年《大連
水產(chǎn)學(xué)報(bào)學(xué)報(bào)》第18巻第4期273-276對(duì)IO只日本絨螯蟹與一只中華絨螯蟹 的形態(tài)主成分分析，發(fā)現(xiàn)兩者存大明顯的形態(tài)差異。在形態(tài)標(biāo)記上，形態(tài)性狀 的可塑性較大，存在一定的測(cè)量主觀性差異。
從核型標(biāo)記上1986年《動(dòng)物學(xué)研究》第7巻第3期293-296頁(yè)報(bào)道中 華絨鰲蟹的染色體為146(2n=146， n=73) 。 2004年《Fisheries Science》第 70巻21卜214報(bào)道的中華絨螯蟹和日本絨螯蟹的染色體數(shù)目均為146(2n=146， n=73)，認(rèn)為從染色體水平上不能鑒別這兩種絨螯螯。
從生化遺傳標(biāo)記上1999年《水產(chǎn)學(xué)報(bào)》23巻第4期331-336對(duì)遼河， 黃河，長(zhǎng)江，甌江，珠江，南流江等六個(gè)絨鰲蟹群體的17種同工酶進(jìn)行了電 泳分析，發(fā)現(xiàn)遼河，黃河，長(zhǎng)江，甌江水系絨鰲蟹與珠江、南流江水系絨鰲蟹 在SOD同工酶表型上有明顯差異，SOD-2位點(diǎn)僅在遼河，黃河，長(zhǎng)江中華絨鰲 蟹中表達(dá)，而S0D-4位點(diǎn)僅在珠江和南流江水系的絨鰲蟹中表達(dá)，這些可作為 中國(guó)南北絨鰲蟹區(qū)分的生化遺傳標(biāo)志。
從分子遺傳標(biāo)記上1999年《水產(chǎn)學(xué)報(bào)》23巻第4期3257-3302用RAPD 標(biāo)記發(fā)現(xiàn)引物Z2擴(kuò)增的830bp片斷為珠江蟹和南流江蟹所特有，700bp片斷則 為長(zhǎng)江蟹，遼河蟹，黃河蟹所特有，南北兩大區(qū)域的絨鰲蟹存在截然不同的分 子標(biāo)記；2002年《自然科學(xué)進(jìn)展》第12巻第5期485-490頁(yè)對(duì)長(zhǎng)江、遼河、 甌江、閩江、九龍江(福建)和南流江絨螯蟹16SrDN的PCR/RFLP分析結(jié)果，發(fā) 現(xiàn)兩個(gè)單倍型可作為鑒定長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹與南流江水系絨螯蟹的分子遺 傳標(biāo)記；2005年《動(dòng)物學(xué)報(bào)》第51巻第5期862-866頁(yè)對(duì)中華絨螯蟹與合浦 絨螯蟹兩地理亞種的線粒體DNA序列變異進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹與合浦 絨螯蟹兩亞種在17條Cyt b全序列上以40個(gè)固定的堿基變異位點(diǎn)相區(qū)別。
以上背景資料均為中國(guó)不同水系的絨螯蟹研究，均未包括分布于日本河流 中的日本絨螯蟹。2000年《水產(chǎn)學(xué)報(bào)》第24巻第5期412-416頁(yè)分析了中華 絨鰲蟹與日本絨鰲蟹的線粒體12SrRNA基因片段，發(fā)現(xiàn)了區(qū)別這兩種絨鰲蟹的 5個(gè)變異位點(diǎn)。2001年《青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)》，第31巻第6期861-866頁(yè)報(bào) 道了中華絨螯蟹與日本絨螯蟹的線粒體COI基因序列差異，但只分析了 2只中 華絨螯蟹樣本，日本絨螯蟹的序列采自GeneBank中收錄的序列。但二項(xiàng)背景 資料中并未分析中國(guó)南方水系，尤其是南流江水系的絨螯螯。目前本領(lǐng)域還沒(méi)有
公開(kāi)日本絨螯蟹以及中國(guó)南方水系絨螯蟹線粒體con的序列。
綜上，目前尚缺乏鑒別絨螯蟹的不同物種/地理群體的分子標(biāo)記技術(shù)和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定絨螯蟹，特別是中華絨螯蟹、中國(guó)南方水系 絨螯蟹和/或日本絨螯蟹的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供中華絨螯蟹、中國(guó)南方水系絨螯蟹和日本絨螯蟹的 基因序列及其用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種絨螯蟹線粒體COII基因的用途，用于鑒定中
華絨螯蟹、日本絨螯蟹、和/或中國(guó)南方水系絨螯蟹。
在另一優(yōu)選例中，所述的絨螯蟹線粒體COII基因具有SEQIDNO: 1、 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的中國(guó)南方水系絨螯蟹是廣西南流江、廣東珠江絨螯蟹。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種鑒定中華絨螯蟹、日本絨螯蟹、和/或中國(guó)南方 水系絨螯蟹的方法，所述方法包括
(1) 測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一個(gè)位 點(diǎn)的堿基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450位、第 579位、第594位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn)的 堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是中華絨螯蟹；否則，進(jìn)行步驟(2);
(2) 測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一個(gè)位 點(diǎn)的堿基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531位、第 564位、第600位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn)的 堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是日本絨螯蟹；否則， 該待測(cè)絨螯蟹是中國(guó)南方水系絨螯蟹；或者，所述方法包括-
(r)測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體con基因的核苷酸序列中選自以下的至少一個(gè)
位點(diǎn)的堿基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531位、 第564位、第600位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn)的 堿基不同，則該待測(cè)絨螯蟹是中國(guó)南方水系絨螯蟹；否則，進(jìn)行步驟(2');
(2')測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一個(gè) 位點(diǎn)的堿基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450位、 第579位、第594位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn)的 堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是中華絨螯蟹；否則，該待測(cè)絨螯蟹是日本絨螯蟹。
在另一優(yōu)選例中，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因。
在另一優(yōu)選例中，采用以下引物對(duì)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng) 具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物；和 具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)或步驟(2)或步驟(1')或步驟(2')中，測(cè)定待測(cè)絨螯蟹 的線粒體COII基因的核苷酸序列中的至少兩個(gè)所列位點(diǎn)的堿基。
更優(yōu)選的，測(cè)定至少3個(gè)所列位點(diǎn)的堿基，進(jìn)一步優(yōu)選的，測(cè)定3個(gè)以上所列 位點(diǎn)的堿基；最優(yōu)選的，測(cè)定所有所列位點(diǎn)的堿基。
在另一優(yōu)選例中，堿基位數(shù)從絨螯蟹線粒體COII基因的"ATG"密碼子起算， 以堿基"A"為第l位。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種鑒定中華絨螯蟹、日本絨螯蟹、和/或中國(guó)南方 水系絨螯蟹的方法，所述方法包括-
測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列， 若其具有SEQIDNO: 1所示的序列，則該待測(cè)絨螯蟹是中華絨螯蟹； 若其具有SEQ ID NO: 2所示的序列，則該待測(cè)絨螯蟹是中國(guó)南方水系絨螯蟹； 若其具有SEQ ID NO: 3所示的序列，則該待測(cè)絨螯蟹是日本絨螯蟹。在本發(fā)明的第四方面，提供一種試劑盒，所述的試劑盒用于鑒定中華絨螯蟹、 日本絨螯蟹、和/或中國(guó)南方水系絨螯蟹，并且所述試劑盒中含有
容器，以及位于容器中的可特異性擴(kuò)增絨螯蟹線粒體COII基因的引物。 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中含有-
容器a，以及位于容器a中的具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物；和 容器b，以及位于容器b中的具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而 易見(jiàn)的。
具體實(shí)施例方式
針對(duì)目前不同水系絨螯蟹相互混雜、交流的現(xiàn)象，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛的研 究，首次揭示一種鑒別中華絨螯蟹、日本絨螯蟹和中國(guó)南方水系絨螯蟹的方法。 采用所述的方法可有效、準(zhǔn)確地進(jìn)行鑒別，所需的樣本量少。并且，采用所述 方法，可在蟹苗時(shí)期就準(zhǔn)確地鑒定出屬于哪種絨螯蟹，擇優(yōu)養(yǎng)殖，從而為中國(guó) 河蟹產(chǎn)業(yè)提供種源保障。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明基于不同種絨螯蟹之間線粒體COII基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP) 而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，絨螯蟹的線粒體COII基因中的一些堿基位點(diǎn)可準(zhǔn)確 地反映不同種的絨螯蟹之間的差異，而在同一種中保持特別高的穩(wěn)定性，即使 是在屬于同一種的不同群體(例如來(lái)自不同的水系的同種絨螯蟹)之間也是非常 穩(wěn)定的。因而，通過(guò)鑒別絨螯蟹線粒體COII基因上一個(gè)或多個(gè)特定堿基就可 準(zhǔn)確地得知該絨螯蟹的種類。
因此，本發(fā)明提供了一種鑒定中華絨螯蟹、日本絨螯蟹、中國(guó)南方水系絨螯 蟹的方法，所述方法包括檢測(cè)待測(cè)蟹的線粒體COII基因中以下位點(diǎn)的一個(gè) 或多個(gè)第45位、第78位、第135位、第156位、第186位、第231位、第 270位、第315位、第375位、第402位、第450位、第531位、第564位、 第579位、第594位、第600位、第612位、第621位的堿基，通過(guò)分析所述 位點(diǎn)上堿基的多態(tài)性情況，從而得知待測(cè)蟹的品種。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，以SEQIDNO: l所示的核苷酸序列(即中華絨螯蟹
的COII基因序列)作為參照來(lái)進(jìn)行比較，所述方法包括
(1) 測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一 個(gè)位點(diǎn)的堿基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn) 的堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是中華絨螯蟹；否則進(jìn)行步驟(2);
(2) 測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一 個(gè)位點(diǎn)的堿基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531 位、第564位、第600位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn) 的堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是日本絨螯蟹；否則，該待測(cè)絨螯蟹是中國(guó) 南方水系絨螯蟹；
或者，所述方法包括
(1，)測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一 個(gè)位點(diǎn)的堿基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531 位、第564位、第600位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn) 的堿基不同，則該待測(cè)絨螯蟹是中國(guó)南方水系絨螯蟹；否則，進(jìn)行步驟(2');
(2')測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一 個(gè)位點(diǎn)的堿基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn) 的堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是中華絨螯蟹；否則，該待測(cè)絨螯蟹是曰本 絨螯蟹。
作為本發(fā)明的另一優(yōu)選方式，還可以SEQIDNO:2所示的核苷酸序列(即中 國(guó)南方水系絨螯蟹的COII基因序列)作為參照來(lái)進(jìn)行比較，所述方法包括
(1)測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一 個(gè)位點(diǎn)的堿基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531 位、第564位、第600位或第612位；SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn) 的堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是中國(guó)南方水系絨螯蟹；否則，進(jìn)行步驟(2);
(2)測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一 個(gè)位點(diǎn)的堿基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn) 的堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是日本絨螯蟹；否則，該待測(cè)絨螯蟹是中華 絨螯蟹；
或者，所述方法包括
(r)測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一 個(gè)位點(diǎn)的堿基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn) 的堿基不同，則該待測(cè)絨螯蟹是中華絨螯蟹；否則，進(jìn)行步驟(2');
(2，)測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一 個(gè)位點(diǎn)的堿基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531 位、第564位、第600位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn) 的堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是中國(guó)南方水系絨螯蟹；否則，該待測(cè)絨螯 蟹是日本絨螯蟹。
作為本發(fā)明的另一優(yōu)選方式，還可以SEQIDNO:3所示的核苷酸序列(即日
本絨螯蟹的con基因序列)作為參照來(lái)進(jìn)行比較，所述方法包括-
(1) 測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一 個(gè)位點(diǎn)的堿基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531 位、第564位、第600位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn) 的堿基不同，則該待測(cè)絨螯蟹是中國(guó)南方水系絨螯蟹；否則，進(jìn)行步驟(2);
(2) 測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一 個(gè)位點(diǎn)的堿基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位；若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn) 的堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是日本絨螯蟹；否則，該待測(cè)絨螯蟹是中華 絨螯蟹；
或者，所述方法包括
(1，)測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一 個(gè)位點(diǎn)的堿基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位；
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn) 的堿基不同，則該待測(cè)絨螯蟹是中華絨螯蟹；否則，進(jìn)行步驟(2');
(2')測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一 個(gè)位點(diǎn)的堿基
若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn) 的堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是日本絨螯蟹；否則，該待測(cè)絨螯蟹是中國(guó) 南方水系絨螯蟹。
從進(jìn)一步提高鑒定的準(zhǔn)確性考慮，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在測(cè)定待測(cè)絨螯 蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中所列堿基時(shí)，優(yōu)選的是測(cè)定至少兩個(gè)所列 位點(diǎn)(即從第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531位、 第564位、第600位或第612位中至少選擇兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)；以及從第78 位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450位、第579位、第594 位或第612位中至少選擇兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè))的堿基。更優(yōu)選的，測(cè)定至少3個(gè) 所列位點(diǎn)的堿基，進(jìn)一步優(yōu)選的，測(cè)定3個(gè)以上所列位點(diǎn)的堿基；最優(yōu)選的，測(cè)定 所有所列位點(diǎn)的堿基。
在本發(fā)明中，各多態(tài)性位點(diǎn)的堿基位數(shù)從絨螯蟹線粒體COII基因的ATG 密碼子起算，以該密碼子的第l個(gè)堿基"A"為第l位。
各種可鑒定COII基因中特定位點(diǎn)堿基的方法均被包括在本發(fā)明中。作為本 發(fā)明的優(yōu)選方式，也可選擇以下方法進(jìn)行鑒定從以下第一組中選擇至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基，以及從以下第二組中選擇至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基；通過(guò)分析待測(cè)蟹 的COII基因中所選擇的至少兩個(gè)位點(diǎn)的堿基，并與表1所示核苷酸變異位點(diǎn) (見(jiàn)實(shí)施例5)比較，來(lái)判斷待測(cè)蟹的種類。
第一組堿基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531 位、第564位、第600位或第612位；
第二組堿基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位。
制備待測(cè)蟹的基因組DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，例如可 采取傳統(tǒng)的酚-氯仿法。
PCR擴(kuò)增是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，其基本原理是體外酶促合成特異 DNA片段。本發(fā)明的方法可采用常規(guī)的PCR技術(shù)進(jìn)行。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，可通過(guò)提取待測(cè)絨螯蟹的DNA，設(shè)計(jì)可擴(kuò)增引物 線粒體COII基因的引物，從而擴(kuò)增出線粒體COII基因的序列；然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn) 物電泳檢測(cè)、純化、克隆；最后測(cè)序并取序列分析，從而找出區(qū)別不同絨螯蟹 的SNP差異位點(diǎn)進(jìn)行鑒別與判斷。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用簡(jiǎn)并性引物進(jìn)行擴(kuò)增，所述的簡(jiǎn)并性引物是由 具有SEQ ID NO: 4所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序 列的引物構(gòu)成的引物對(duì)。使用該引物對(duì)可特異性從中華絨螯蟹、日本絨螯蟹以 及中國(guó)南方水系絨螯蟹基因組DNA中特異性擴(kuò)增出COII序列，并且擴(kuò)增情況 良好，擴(kuò)增產(chǎn)物多且穩(wěn)定。
另一方面，基于本發(fā)明所提供的中華絨螯蟹、日本絨螯蟹和/或中國(guó)南方水 系絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可通過(guò)直接測(cè) 定待測(cè)蟹的COII基因的核苷酸序列而得知待測(cè)蟹的種類。若待測(cè)蟹的COII具 有SEQIDNO: l所示的序列，則是中華絨螯蟹；若待測(cè)蟹的COII具有SEQ ID NO:2所示的序列，則是中國(guó)南方水系絨螯蟹；若待測(cè)蟹的COII具有SEQ ID NO: 3所示的序列，則是日本絨螯蟹。
本發(fā)明的方法可以鑒定各種生長(zhǎng)時(shí)期的絨螯蟹，包括蟹苗。試劑盒
本發(fā)明還涉及一種用于鑒定中華絨螯蟹、日本絨螯蟹和/或中國(guó)南方水系絨 螯蟹的試劑盒，所述試劑盒中含有
容器，以及位于容器中的可特異性擴(kuò)增絨螯蟹線粒體COII基因的引物。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中含有
容器a，以及位于容器a中的具有SEQ ID NO: 4所示核苷酸序列的引物；
禾口
容器b，以及位于容器b中的具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物。 每種引物或探針均被置于獨(dú)立的容器中。
此外，所述的試劑盒還可含有其它鑒定待測(cè)蟹所需的試劑，如(但不限于)
(A) 各種PCR反應(yīng)用試劑，例如但不限于PCR緩沖液，dNTP， DNA聚 合酶等；或
(B) 各種提取蟹DNA(即制備PCR反應(yīng)模板)所需的試劑，例如但不限于 酚、氯仿等；或
(C) 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑，例如但不限于瓊脂糖粉、電泳緩沖 液、溴化乙啶等。
此外，所述的試劑盒中還可含有鑒定待測(cè)蟹的使用說(shuō)明書(shū)，從而指導(dǎo)技術(shù)人 員正確使用所述試劑盒。
所述的試劑盒可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)、批量檢測(cè)待測(cè)蟹的目的。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
(1) 首次揭示可有效鑒別中華絨螯蟹、日本絨螯蟹和中國(guó)南方水系絨螯蟹 的方法。采用所述的方法可有效、準(zhǔn)確地進(jìn)行鑒別，所需的樣本量少。并且， 采用所述方法，可在蟹苗時(shí)期就準(zhǔn)確地實(shí)施鑒定，擇優(yōu)養(yǎng)殖，從而為河蟹產(chǎn)業(yè) 提供了更好的種源保障。
(2) 本發(fā)明提供的可用于鑒別中華絨螯蟹、日本絨螯蟹和中國(guó)南方水系絨螯 蟹的線粒體COII基因中的堿基位點(diǎn)可準(zhǔn)確地反映不同種的絨螯蟹之間的差異， 而在同一種中保持穩(wěn)定，即使是在屬于同一種的不同群體(例如來(lái)自不同的水系 的同品種絨螯蟹)之間也是穩(wěn)定的。
(2)本發(fā)明為鑒別不同地域來(lái)源的中華絨螯蟹、中國(guó)南方水系絨螯蟹和/或日本絨螯蟹提供了一種有效、準(zhǔn)確的群體鑒別與檢測(cè)技術(shù)。從而克服了目前存 在的不同水系絨螯蟹相互混雜、交流的問(wèn)題。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō) 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠 商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉 的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本 發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例l.樣本選擇
選擇來(lái)自不同水系中華絨螯蟹樣本共125只，來(lái)自中國(guó)南方水系(廣西南 流江和廣東珠江)絨螯蟹樣本40只，來(lái)自日本北海道地區(qū)的日本絨螯蟹樣本 15只，用于后續(xù)試驗(yàn)。本發(fā)明人選擇了足夠數(shù)量的絨螯蟹，因此獲得的結(jié)果具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，準(zhǔn)確可靠。
實(shí)施例2. DNA提取
取每只蟹第三步足的長(zhǎng)節(jié)肌肉0.2g，裝入1.5ml的離心管中，加入40(HxL STE緩沖液(30mmol/L Tris-HC1， p朋.0, 200mmol/L EDTA， 50mmol/L NaCl)。 混勻后加入濃度為10yQ的SDS90pL和20mg/mL的蛋白酶K10nL， 55。C消化8 10h;加入等體積飽和酚于轉(zhuǎn)輪上緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)lh， 10， 000r/min離心8min，吸取 上清液加入等體積的混合液(酚氯仿異戊醇=25 : 24 : 1);緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)30min， 10， 000r/inin離心8min，取上清液加入等體積的氯仿和異戊醇混合液(氯仿 異戊醇=24: 1)，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)5 min， 10, 000r/min離心5min，取上清液后，加 入2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，再用70%的乙醇洗滌，干燥，加入300pL的 TE液溶解備用。
實(shí)施例3. PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物克隆、測(cè)序
根據(jù)2001年南京師范大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版第24巻4期485-490頁(yè)報(bào)道的中華絨螯蟹線粒體con基因序列，設(shè)計(jì)的一對(duì)用于擴(kuò)增con基因的簡(jiǎn)并性引
物為
COII-F: 5' -CATCACCTTGTCAAGGTGAAA-3'(SEQ ID NO: 4); COII-R: 5' - CATGGTCAGTCTCAGGATTCA-3'(SEQ ID NO: 5)。
以實(shí)施例1制備的蟹基因組DNA為模板，以上述COII-F、 COII-R為引物， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體積為50pL，內(nèi)含5pL PCR緩沖液(lOmmol/L Tris-HCL， pH9. 0， 50mmol/L KCL， 30mmol/L MgCL2， 0. 01%的明膠)，2(iL dNTP混合液(每 種dNTP 0.1 mmol/L)， 4(iL的引物(0. 2(imol/L), 2fiL基因組DNA(50ng/|il)， 2|uL Taq酶(2 IU) ， 35jliL的蒸餾水。
擴(kuò)增反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min，接下來(lái)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包 括94。C 30s， 54°C 30s， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)后，72。C延伸5min。
實(shí)施例4.產(chǎn)物克隆、測(cè)序
擴(kuò)增的目的基因產(chǎn)物以常規(guī)的瓊脂糖電泳回收后，純化，連接插入載體 pUC18，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a ，篩選重組子進(jìn)行內(nèi)切酶酶切和PCR檢驗(yàn)。
然后，選取重組子于3730型Bigdye-Terminator全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。 測(cè)序結(jié)果顯示，中華絨螯蟹具有SEQ ID NO: l所示的核苷酸序列；中國(guó)南方 水系絨螯蟹具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；日本絨螯蟹具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
實(shí)施例5.篩選核苷酸變異位點(diǎn)
用BioEdit軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行重排和同源比較，以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG(前 三位核苷酸)中堿基A為位數(shù)計(jì)算的起點(diǎn)，然后根據(jù)位點(diǎn)差異鑒定不同絨螯蟹。 結(jié)果如表l所示。_表l.核苷酸變異位點(diǎn)_
起始位點(diǎn)ATG 第45bp第78bp第135bp第156bp第186bp第231bp 中華絨鰲蟹 T T G C A T
南方水系絨螯蟹C C A T G C
日本絨螯蟹 T C G C A C
起始位點(diǎn)ATG 第270bp第315bp第375bp第4Q2bp第450bp第531bp 中華絨鰲蟹 A T T G C G
南方水系絨螯蟹 G C C A T A
日本絨螯蟹 G T C A T G
起始位點(diǎn)ATG 第564bp第579bp第594bp第600bp第612bp第621bp
中華絨鰲蟹ACACCG
南方水系絨螯蟹GTGTTA
曰本絨螯蟹ATGCCA
實(shí)施例6.待測(cè)蟹的鑒定
方法l.選擇兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行鑒定
根據(jù)表1結(jié)果可鑒別待測(cè)的蟹屬于哪種絨螯蟹。
如實(shí)施例2、實(shí)施例3和實(shí)施例4所述的方法提取待測(cè)蟹的DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。
檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列中第45位和78位的堿基，若第45位和第78位均是T， 則該待測(cè)蟹是中華絨螯蟹；若第45位和第78位均是C，則該待測(cè)蟹是中國(guó)南 方水系絨螯蟹；若第45位為T而第78位是C，則該待測(cè)蟹是日本絨螯蟹。
方法2.以SEQIDN0: 1的序列為參照進(jìn)行鑒定
如實(shí)施例2、實(shí)施例3和實(shí)施例4所述的方法提取待測(cè)蟹的DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。
檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列中第45位的堿基，并與SEQ ID N0: 1所示序列的第45位堿基比較，若待測(cè)蟹的該堿基不同于SEQ ID NO: l所示序列的第45位堿 基，則該待測(cè)蟹是中國(guó)南方水系絨螯蟹；若待測(cè)蟹的該堿基與SEQ ID NO: 1 所示序列的第45位堿基相同，則該待測(cè)蟹是中華絨螯蟹或日本絨螯蟹，需要 進(jìn)行進(jìn)一步鑒定
選擇擴(kuò)增產(chǎn)物中第78位堿基，并與SEQ ID NO: l所示序列的第78位堿基 比較，若待測(cè)蟹的該堿基與SEQ ID NO: 1所示序列的第78位堿基相同，則該 待測(cè)蟹是中華絨螯蟹；若待測(cè)蟹的該堿基與SEQ ID NO: l所示序列的第78位 堿基不同，則該待測(cè)蟹是日本絨螯蟹。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被 單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申 請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表
<110>李思發(fā)
<120>中華絨螯蟹與日本絨螯蟹的分子遺傳鑒別技術(shù)
<130〉 075326
<160> 5
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 693
<212〉 DNA
<213〉 絨螯蟹屬(Eriocheir)
<400〉 1
atggcaacatgagcgtatttgacagagcttctcctcttat agaacaatta60
attttttttcacgateatattatattagtgattgtgttaattgtaacatt tgttggttat120
ataatagcaacattgtttttcaactccctcattaaccgetata^tt3ga 3aatc犯cc3180
atcgaagtaatttgaacatcagttccagcttttattttaatetttattge tttaccatcc240
cttcgcttactttatcttttagatgaagtaaacaatcc11ctat犯ctct taaaacaatt300
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tatatagtacca/tctaatgagctggaagtatcagggttccggctactaga cgtagacaat420
cgtaccgttc11 c c aat aaatactcaaatccgagttctaattacagctgc agatgtcatc480
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<210〉 2
<211〉 693
<212〉 DNA
〈213〉 絨螯蟹屬(Eriocheir)
〈400〉 2
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〈212〉 DNA
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aattgaatttctctatcaattgaagcgtcaccc693
<210〉 4
〈211〉 21
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220>
<221〉 misc—feature
<223〉 引物
<400> 4
catcaccttg tcaaggtgaa a 21
<210〉 5
<211〉 21
<212> DNA <213>人工序列
<220〉
<221> misc—feature
<223〉 引物
<400> 5
catggtcagt ctcaggattc a 2權(quán)利要求
1. 一種絨螯蟹線粒體COII基因的用途，其特征在于，用于鑒定中華絨螯蟹、日本絨螯蟹、和/或中國(guó)南方水系絨螯蟹。
2. 如權(quán)利要求i所述的用途，其特征在于，所述的絨螯蟹線粒體con基因具有SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
3. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的中國(guó)南方水系絨螯蟹是 廣西南流江、廣東珠江絨螯蟹。
4. 一種鑒定中華絨螯蟹、日本絨螯蟹、和/或中國(guó)南方水系絨螯蟹的方法，其特征在于，所述方法包括(1) 測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一個(gè) 位點(diǎn)的堿基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450位、 第579位、第594位或第612位；若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn)的 堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是中華絨螯蟹；否則，進(jìn)行步驟(2);(2) 測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一個(gè) 位點(diǎn)的堿基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531位、 第564位、第600位或第612位；若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn)的 堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是日本絨螯蟹；否則， 該待測(cè)絨螯蟹是中國(guó)南方水系絨螯蟹-, 或者，所述方法包括(r)測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一個(gè) 位點(diǎn)的堿基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531位、 第564位、第600位或第612位；若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn)的 堿基不同，則該待測(cè)絨螯蟹是中國(guó)南方水系絨螯蟹；否則，進(jìn)行步驟(2');(2')測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中選自以下的至少一個(gè) 位點(diǎn)的堿基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450位、第579位、第594位或第612位；若所述至少一個(gè)位點(diǎn)的堿基與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位點(diǎn)的 堿基全部相同，則該待測(cè)絨螯蟹是中華絨螯蟹；否則，該待測(cè)絨螯蟹是日本絨螯蟹。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)獲得待測(cè)絨螯 蟹的線粒體COII基因。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，采用以下引物對(duì)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物；和 具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物。
7. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在步驟(1)或步驟(2)或步驟(1，)或 步驟(2')中，測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列中的至少兩個(gè)所列 位點(diǎn)的堿基。
8. —種鑒定中華絨螯蟹、日本絨螯蟹、和/或中國(guó)南方水系絨螯蟹的方法，其 特征在于，所述方法包括測(cè)定待測(cè)絨螯蟹的線粒體COII基因的核苷酸序列， 若其具有SEQ ID NO: 1所示的序列，則該待測(cè)絨螯蟹是中華絨螯蟹； 若其具有SEQ ID NO: 2所示的序列，則該待測(cè)絨螯蟹是中國(guó)南方水系絨螯蟹; 若其具有SEQ ID NO: 3所示的序列，則該待測(cè)絨螯蟹是日本絨螯蟹。
9. 一種試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒用于鑒定中華絨螯蟹、日本絨螯 蟹、和/或中國(guó)南方水系絨螯蟹，并且所述試劑盒中含有容器，以及位于容器中的可特異性擴(kuò)增絨螯蟹線粒體COII基因的引物。
10. 如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有 容器a，以及位于容器a中的具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物；和 容器b，以及位于容器b中的具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物。
全文摘要
本發(fā)明屬于遺傳學(xué)、生物多樣性保護(hù)學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種線粒體COII基因在鑒定中華絨螯蟹、日本絨螯蟹和/或中國(guó)南方水系絨螯蟹中的用途。本發(fā)明還公開(kāi)了鑒別中華絨螯蟹、日本絨螯蟹和/或中國(guó)南方水系絨螯蟹的方法，采用所述的方法可有效、準(zhǔn)確地進(jìn)行鑒別，所需的樣本量少，從而為蟹的遺傳判別和良種養(yǎng)殖提供了更理想的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101418336SQ20071004732
公開(kāi)日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2007年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月23日
發(fā)明者李思發(fā), 王成輝 申請(qǐng)人:李思發(fā)