中華絨螯蟹白斑癥病毒特異性pcr檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及養(yǎng)殖技術領域，具體設及引起中華絨馨蟹發(fā)病病原白斑癥病毒特異性 PCR快速檢測試劑盒及檢測方法，特別設及一種中華絨馨蟹發(fā)病病原白斑癥病毒的基因檢 測試劑及檢測方法，適用于中華絨馨蟹白斑癥病毒的流行病學監(jiān)測、白斑癥病毒的檢測及 基因工程技術等領域。
【背景技術】
[0002] 白斑癥病毒（WSSV)是一種嚴重危害當前對郵養(yǎng)殖業(yè)的病毒，主要引起對郵甲殼 內(nèi)側白斑病變，并導致大批死亡。其流行范圍廣，在甲殼類、榜足類和昆蟲類中均有敏感宿 主。
[0003] 中華絨馨蟹又稱河蟹，是一種重要的經(jīng)濟蟹類，我國的中華絨馨蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅 速，已成規(guī)?；?。在生產(chǎn)中，為了提高養(yǎng)殖效益，普遍采取多品種混養(yǎng)的養(yǎng)殖模式，如克氏原 馨郵與中華絨馨蟹混養(yǎng)等。但近幾年來，經(jīng)常發(fā)生克氏原馨郵大批量死亡后，處于相同養(yǎng)殖 塘中的中華絨馨蟹同時出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象。薛晤等在2010年對江蘇部分地區(qū)養(yǎng)殖池塘 發(fā)病的克氏原馨郵和中華絨馨蟹進行采樣調(diào)查，證實引起該兩種淡水甲殼類動物發(fā)病死亡 的病原為白斑癥病毒。
[0004]目前對于白斑癥病毒病的診斷手段主要包括病理學方法、生物學方法、免疫學方 法、分子雜交方法及PCR方法等。但是還未見檢測中華絨馨蟹的快速、準確的方法，為了及 早發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖中華絨馨蟹是否被白斑癥病毒感染，有必要建立一種快速、準確、靈敏的檢測方 法。PCR方法具有操作簡單、特異、快速、敏感等優(yōu)點，正逐步應用于病原微生物的檢測與研 究中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是，克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種中華絨馨蟹白斑 癥病毒特異性PCR檢測方法，能快速、高效地用于中華絨馨蟹白斑癥病毒的檢測。
[0006] 本發(fā)明通過下述技術方案實現(xiàn)的。
[0007] 中華絨馨蟹白斑癥病毒的PCR快速檢測試劑盒，所述試劑盒包括：
[000引 （1)2X反應混合緩沖液，包含W下成分；KC1，MgCls，Tris-肥1抑5. 8,dNTP;
[0009] (2)檢測引物的設計合成：根據(jù)GenBank中發(fā)布的白斑癥病毒基因的保守序列， 設計一對特異性檢測引物，上游引物WSSV-F; 5' -GTGTACTAGGAATATTGGAAT-3'，下游引物 WSSV-R;5' -CGGCATTCTTCATGGCTTCTG-3';
[0010] (3)Taq酶；
[0011] (4)滅菌的dd&O;
[001引 妨陽性對照液：白斑癥病毒基因組DNA;
[001引 （6)陰性對照液；dd&O。
[0014] 采用試劑盒檢測中華絨馨蟹白斑癥病毒的方法為：
[0015] (1)中華絨馨蟹白斑癥病毒DM的提??；取中華絨馨蟹的觸、肝膜腺、肌肉組織，加 入滅菌處理的雙蒸水，用玻璃勻漿器充分研磨后，置于-20°C冰箱反復凍融3次，600化pm低 溫離屯、10分鐘，取上清，加入Tris-飽和酪，充分振蕩混勻后，靜置5分鐘，然后1200化pm離 屯、5分鐘，取上清液加入等量的酪；氯仿；異戊醇抽提二次，取上清加入2倍體積的異丙醇， 混勻后，靜置10分鐘，12000rpm離屯、10分鐘，去掉上清后，加入75 %的己醇，靜置5分鐘， 1200化pm離屯、10分鐘，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用d地2〇溶解，即為試驗用DNA 模板，提取的DNA模板置于-70°C保存?zhèn)溆茫?br>[0016] (2)PCR反應體系；采用PCR反應體系，在PCR反應管內(nèi)分別加入2X反應混合緩沖 液，上游引物、下游引物，5U/yLTaqDNA聚合酶，DNA模板，加滅菌超純水，同時分別用陽性 對照液和陰性對照液作為模板，設置陽性和陰性對照組，混合均勻后離屯、數(shù)秒，置于PCR反 應儀上；
[0017] (4)PCR反應條件；95°C預變性5分鐘；然后95°C變性30秒，56°C退火30秒，72°C 延伸40秒，共循環(huán)30次；72 °C延伸10分鐘，最后4°C保存；
[001引 巧)PCR擴增產(chǎn)物的檢測；PCR反應結束后，取產(chǎn)物在1. 5 %瓊脂糖凝膠（含漠化己 錠0. 5yg/mL)上，使用TAE緩沖液進行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物 的預期大小；
[0019] (6)結果與判定；在紫外燈下觀察并與標準分子量相對照，若檢測樣品在44化P處 出現(xiàn)明亮的條帶，而陰性對照沒有目的條帶，則為白斑癥病毒陽性；若陽性對照可見目的條 帶，而檢測樣品無目的條帶出現(xiàn)，則為陰性，沒有或不是所要檢測的目的白斑癥病毒。
[0020] 優(yōu)選的試劑盒包括：
[0021] (3) 2X反應混合緩沖液1. 0血，包含W下成分：
[0022]
[0023]
[0024] (4)檢測引物的設計合成：根據(jù)GenBank中發(fā)布的白斑癥病毒基因的保守序列， 設計一對特異性檢測引物，上游引物WSSV-F;5' -GTGTACTAGGAATATTGGAAT-3'，下游引物 WSSV-R;5' -CGGCATTCTTCATGGCTTCTG-3'，濃度為 10yM;
[00巧]0)Taq酶 5U/yL;
[0026] (4)滅菌的(1地2〇 1.0血；
[0027] 妨陽性對照液：白斑癥病毒基因組DNA;
[0028] (6)陰性對照液；d地2〇。
[0029] 優(yōu)選的采用試劑盒檢測中華絨馨蟹白斑癥病毒的方法為：
[0030] (1)中華絨馨蟹白斑癥病毒DNA的提取：取50-100mg中華絨馨蟹的觸、肝膜腺、肌 肉組織，加入600yL滅菌處理的雙蒸水，用玻璃勻漿器充分研磨后，置于-20°C冰箱反復凍 融3次，6000巧m低溫離屯、10分鐘，取上清，加入200化Tris-飽和酪，充分振蕩混勻后，靜 置5分鐘，然后1200化pm離屯、5分鐘，取上清液加入等量的酪；氯仿；異戊醇抽提二次，取 上清加入2倍體積的異丙醇，混勻后，靜置10分鐘，12000rpm離屯、10分鐘，去掉上清后，加 入ImL預冷的75 %的己醇，靜置5分鐘，12000巧m離屯、10分鐘，去掉上清，置于真空干燥箱 干燥后，用100yL的d地2〇溶解，即為試驗用DNA模板，提取的DNA模板置于-70°C保存?zhèn)?用；
[0031] (2)PCR反應體系；采用20yL的PCR反應體系，在0. 2血PCR反應管內(nèi)分別加入 2X反應混合緩沖液10化，上游引物、下游引物各0. 5化，抓/化TaqDNA聚合酶0. 5化，DNA模板3. 0yL，用滅菌超純水加至總體積，同時分別用陽性對照液和陰性對照液作為模 板，設置陽性和陰性對照組，混合均勻后離屯、數(shù)秒，置于PCR反應儀上；
[003引 （4)PCR反應條件；95°C預變性5分鐘；然后95°C變性30秒，56°C退火30秒，72°C 延伸40秒，共循環(huán)30次；72 °C延伸10分鐘，最后4°C保存；
[003引 巧)PCR擴增產(chǎn)物的檢測；PCR反應結束后，取10化產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠（含 漠化己錠0. 5yg/血）上，使用TAE緩沖液進行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物的預期大?。?br>[0034] (6)結果與判定；在紫外燈下觀察并與標準分子量相對照，若檢測樣品在44化P處 出現(xiàn)明亮的條帶，而陰性對照沒有目的條帶，則為白斑癥病毒陽性；若陽性對照可見目的條 帶，而檢測樣品無目的條帶出現(xiàn)，則為陰性，沒有或不是所要檢測的目的白斑癥病毒。
[0035] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所述的中華絨馨蟹白斑癥病毒的特異性PCR快速檢測試 劑盒及其檢測方法具有W下特點及優(yōu)點：
[0036] (1)本發(fā)明采用聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR)技術檢測中 華絨馨蟹白斑癥病毒的方法，適用于對中華絨馨蟹白斑癥病毒進行快速檢測。
[0037] (2)與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果包括；①檢測快速、效率高；從核酸提取、 聚合酶鏈反應（PCR)到結果判定僅需要3小時；一次可W進行多個樣品的檢測，具有高效 性。②檢測準確：檢測引物只與中華絨馨蟹白斑癥病毒特異性地結合，與其他病原都沒有交 叉反應。⑨檢測靈敏度高，適合用于中華絨馨蟹白斑癥病毒的早期監(jiān)控。
【附圖說明】
[0038] 圖1為感染白斑癥病毒中華絨馨蟹觸、肝膜腺、肌肉組