一種肺炎支原體核酸快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肺炎支原體核酸快速檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，MP)，直徑為125-150 nm，與黏液病毒的大小相仿，含DNA和RNA，缺乏細(xì)胞壁，呈球形、桿狀、絲狀等多種形態(tài)，革蘭染色陰性。肺炎支原體(MP)是處于嬰幼兒、青少年期容易出現(xiàn)的一種由于呼吸道感染而引發(fā)的一種主要危害其身體健康的病原體之一。目前市面上MP診斷方法主要包括經(jīng)典的培養(yǎng)法、血清學(xué)體檢測(cè)法和核酸檢測(cè)方法等。分離培養(yǎng)法是診斷MP感染最可靠的方法，但MP分離培養(yǎng)需
3-4周，且靈敏度低、耗時(shí)長(zhǎng)、技術(shù)要求高。血清學(xué)檢測(cè)(包括冷凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、金標(biāo)免疫斑點(diǎn)法和免疫熒光法等)需等到機(jī)體產(chǎn)生抗體后才能應(yīng)用具有一定的滯后性。目前多用ELISA測(cè)定抗MP抗體，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)快速簡(jiǎn)便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定的單克隆抗體，否則準(zhǔn)確性不夠，僅能作為輔助檢測(cè)手段。因此能否提供快速、高敏、特異、簡(jiǎn)便、可靠、適合臨床應(yīng)用的檢測(cè)技術(shù)已成為國(guó)內(nèi)外研宄的重點(diǎn)。核酸檢測(cè)常見的有核酸雜交試驗(yàn)和PCR技術(shù)，前者靈敏感度、特異度強(qiáng)，但需要應(yīng)用較多的設(shè)備輔助，故難以推廣，后者對(duì)檢測(cè)MP DNA的靈敏度、特異度高，但因其程序相對(duì)復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求高，熒光PCR方法設(shè)備昂貴等問題，也使得該技術(shù)推廣進(jìn)展緩慢。因此，尋找一種簡(jiǎn)便、快速、有效、適于基層推廣的早期診斷方法非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種肺炎支原體核酸快速檢測(cè)方法，檢測(cè)方法步驟如下:
(1)樣本處理，估計(jì)痰液樣本的量，加入2-4倍體積的4%的NaOH溶液，充分混勻，室溫靜置液化10 min-20 min，使其充分液化；拭子樣本直接保存于拭子保存液中；
(2)樣本洗滌，取液化的痰液(或拭子沖洗液)樣本轉(zhuǎn)移到離心管中，離心去除上清液收集沉淀，用樣本洗滌液洗滌沉淀，離心收集沉淀；
(3)核酸提取，用樣本裂解液重懸上述沉淀，混勻，100°C溫浴裂解5- 15 min，立即置于冰上，然后離心，上清液即為樣本模板DNA ；
(4)加樣反應(yīng)，取出檢測(cè)管，分別標(biāo)記陰性對(duì)照管、檢測(cè)管和陽性對(duì)照管，依次分別加入陰性溶液、步驟(3)上清液和陽性溶液；
(5)上機(jī)運(yùn)行，將步驟(4)的實(shí)驗(yàn)管混勻后放入熒光讀數(shù)儀，設(shè)定60- 65°C條下件保溫30 -60 min;擴(kuò)增體系中預(yù)先加入熒光染料，因擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光染料結(jié)合后會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，通過檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)讀取熒光信號(hào)，根據(jù)擴(kuò)增讀數(shù)判讀結(jié)果；
(6)結(jié)果判讀，如果儀器擴(kuò)增讀數(shù)呈“S”型或不完整“S”型，則結(jié)果判讀為陽性；如果儀器擴(kuò)增讀數(shù)為“一”型，則結(jié)果判讀為陰性。
[0004]在上述步驟中，結(jié)果判讀時(shí)應(yīng)依照陽性對(duì)照管儀器擴(kuò)增讀數(shù)呈“S”型，陰性對(duì)照管儀器擴(kuò)增讀數(shù)為呈“一”型，否則應(yīng)判定該實(shí)驗(yàn)無效。
[0005]該發(fā)明的有益之處是:本發(fā)明試劑盒程序化了操作步驟，實(shí)現(xiàn)了對(duì)痰液和拭子樣本中肺炎支原體的檢測(cè)，使操作過程簡(jiǎn)便和可控，檢測(cè)過程采用閉管檢測(cè)同時(shí)又加入了穩(wěn)定液防治氣溶膠的形成，解決了污染問題，結(jié)果更可靠。本發(fā)明試劑盒因快速、高敏、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)適合檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)和基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0006]下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述:
本發(fā)明方法的技術(shù)方案是:本發(fā)明提供了一種肺炎支原體核酸快速檢測(cè)方法，檢測(cè)方法步驟如下:
(1)樣本處理，估計(jì)痰液樣本的量，加入2-4倍體積的4%的NaOH溶液，充分混勻，室溫靜置液化10 min-20 min，使其充分液化；拭子樣本直接保存于拭子保存液中；
(2)樣本洗滌，取液化的痰液(或拭子沖洗液)樣本轉(zhuǎn)移到離心管中，離心去除上清液收集沉淀，用樣本洗滌液洗滌沉淀，離心收集沉淀；
(3)核酸提取，用樣本裂解液重懸上述沉淀，混勻，100°C溫浴裂解5- 15 min，立即置于冰上，然后離心，上清液即為樣本模板DNA ；
(4)加樣反應(yīng)，取出檢測(cè)管，分別標(biāo)記陰性對(duì)照管、檢測(cè)管和陽性對(duì)照管，依次分別加入陰性溶液、步驟(3)上清液和陽性溶液；
(5)上機(jī)運(yùn)行，將步驟(4)的實(shí)驗(yàn)管混勻后放入熒光讀數(shù)儀，設(shè)定60- 65°C條下件保溫30 -60 min;擴(kuò)增體系中預(yù)先加入熒光染料，因擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光染料結(jié)合后會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，通過檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)讀取熒光信號(hào)，根據(jù)擴(kuò)增讀數(shù)判讀結(jié)果；
(6)結(jié)果判讀，如果儀器擴(kuò)增讀數(shù)呈“S”型或不完整“S”型，則結(jié)果判讀為陽性；如果儀器擴(kuò)增讀數(shù)呈“一”型，則結(jié)果判讀為陰性。
[0007]在上述步驟中，結(jié)果判讀時(shí)應(yīng)依照陽性對(duì)照管儀器擴(kuò)增讀數(shù)呈“S”型，陰性對(duì)照管儀器擴(kuò)增讀數(shù)呈“一”型，否則應(yīng)判定該實(shí)驗(yàn)無效。
[0008]本發(fā)明中試劑盒使用的恒溫?cái)U(kuò)增法是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，可在15-60分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)19-1Oltl倍的擴(kuò)增，擴(kuò)增體系中預(yù)先加入熒光染料，因擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光染料結(jié)合后會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，通過檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)讀取熒光信號(hào)，根據(jù)擴(kuò)增讀數(shù)判讀結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中肺炎支原體的測(cè)定，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。本試劑盒利用恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，選取肺炎支原體基因保守區(qū)的六個(gè)不同的區(qū)域，設(shè)計(jì)4條引物，結(jié)合具有鏈置換功能的DNA聚合酶，實(shí)現(xiàn)核酸恒溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光染料結(jié)合后會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，通過檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)讀取熒光信號(hào)，根據(jù)擴(kuò)增曲線判讀結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中肺炎支原體的測(cè)定。
[0009]本發(fā)明試劑盒程序化了操作步驟，實(shí)現(xiàn)了對(duì)痰液和拭子樣本中肺炎支原體的檢測(cè)，使操作過程簡(jiǎn)便和可控，檢測(cè)過程采用閉管檢測(cè)同時(shí)又加入了穩(wěn)定液防治氣溶膠的形成，解決了污染問題，結(jié)果更可靠。本發(fā)明試劑盒因快速、高敏、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)和基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種肺炎支原體核酸快速檢測(cè)方法，其特征是:檢測(cè)方法步驟如下: (1)樣本處理，估計(jì)痰液樣本的量，加入2-4倍體積的4%的NaOH溶液，充分混勻，室溫靜置液化10 min-20 min，使其充分液化；拭子樣本直接保存于拭子保存液中； (2)樣本洗滌，取液化的痰液(或拭子沖洗液)樣本轉(zhuǎn)移到離心管中，離心去除上清液收集沉淀，用樣本洗滌液洗滌沉淀，離心收集沉淀； (3)核酸提取，用樣本裂解液重懸上述沉淀，混勻，100°C溫浴裂解5- 15 min，立即置于冰上，然后離心，上清液即為樣本模板DNA ； (4)加樣反應(yīng)，取出檢測(cè)管，分別標(biāo)記陰性對(duì)照管、檢測(cè)管和陽性對(duì)照管，依次分別加入陰性溶液、步驟(3)取得的上清液和陽性溶液； (5)上機(jī)運(yùn)行，將步驟(4)的檢測(cè)管混勻后放入熒光讀數(shù)儀，設(shè)定60- 65°C條件下保溫30 -60 min;擴(kuò)增體系中預(yù)先加入熒光染料，擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光染料結(jié)合后會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，通過檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)讀取熒光信號(hào)，根據(jù)擴(kuò)增讀數(shù)判讀結(jié)果； (6)結(jié)果判讀，如果儀器擴(kuò)增讀數(shù)呈“S”型或不完整“S”型，則結(jié)果判讀為陽性；如果儀器擴(kuò)增讀數(shù)為“一”型，則結(jié)果判讀為陰性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肺炎支原體核酸快速檢測(cè)方法，其特征是:所述的結(jié)果判讀步驟6中，應(yīng)依照陽性對(duì)照管擴(kuò)增反應(yīng)儀器讀數(shù)呈“S”型，陰性對(duì)照管擴(kuò)增反應(yīng)儀器讀數(shù)呈“一”型，否則應(yīng)判定該實(shí)驗(yàn)無效。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種肺炎支原體核酸快速檢測(cè)方法，利用恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，選取肺炎支原體基因保守區(qū)的六個(gè)不同的區(qū)域，設(shè)計(jì)4條引物，結(jié)合具有鏈置換功能的DNA聚合酶，實(shí)現(xiàn)核酸恒溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光染料結(jié)合后會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，通過檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)讀取熒光信號(hào)，根據(jù)擴(kuò)增曲線判讀結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中肺炎支原體的測(cè)定。本發(fā)明試劑盒程序化了操作步驟，實(shí)現(xiàn)了對(duì)痰液和拭子樣本中肺炎支原體的檢測(cè)，使操作過程簡(jiǎn)便和可控，檢測(cè)過程采用閉管檢測(cè)同時(shí)又加入了穩(wěn)定液防治氣溶膠的形成，解決了污染問題，結(jié)果更可靠。本發(fā)明試劑盒因快速、高敏、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)適合檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)和基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12R1/35, C12Q1/04, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN104988237
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510436255
【發(fā)明人】楊帆, 綦洪敏, 邱青芳, 綦松妮, 劉曉娟
【申請(qǐng)人】青島漢唐生物科技有限公司
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月23日