專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于擴(kuò)增核酸的組合物、方法和試劑盒的制作方法用于擴(kuò)增核酸的組合物、方法和試劑盒領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及用于擴(kuò)增核酸同時(shí)減少非特異性熒光和不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物的組合物、方法和試劑盒。介紹盡管聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及相關(guān)的技術(shù)對(duì)于各種應(yīng)用是高度有用的，但是由于不理想的副反應(yīng)而引起的非耙核酸的擴(kuò)增可能存在顯著的問(wèn)題。這樣的副反應(yīng)可以作為非靶核酸的錯(cuò)誤引發(fā)和/或引物寡聚化(有時(shí)也叫作引物二聚體形成)，以及這些引發(fā)的假體(artifacts)的后續(xù)擴(kuò)增的結(jié)果而發(fā)生。在使用具有顯著的背景核酸而耙核酸以低拷貝數(shù)存在的核酸混合物進(jìn)行PCR的應(yīng)用中，這是特別實(shí)際的(參見(jiàn)，例如，Chou等,Nud.AcidsRes.(核酸研究)20:1717-1723(1992))。非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生己經(jīng)至少部分歸因于延長(zhǎng)非特異性退火的引物的環(huán)境溫度下的DNA聚合酶活性(參見(jiàn)，例如，z(Li等，Proc.Natl.Acad.Sd.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))87:4580(1990))。因此，在環(huán)境溫度下抑制DNA聚合酶的活性有利于控制次級(jí)擴(kuò)增子的產(chǎn)生。已經(jīng)描述了一些技術(shù)，據(jù)說(shuō)其減少不需要的次級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。按照某些"手工熱啟動(dòng)"技術(shù)，直到混合物的溫度足夠高足以防止非特異性引物退火時(shí)才加入對(duì)DNA聚合酶活性重要的成分(例如，二價(jià)離子和/或DNA聚合酶本身)到反應(yīng)混合物中(參見(jiàn)，例如，Chou等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)20:1717-1723(1992);禾BD，Aquila等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)19:3749(1991))。較少勞動(dòng)力-密集型技術(shù)應(yīng)用擴(kuò)增反應(yīng)的至少一種成分的物理分離或可逆失活。例如，鎂或DNA聚合酶可以隔離在蠟珠中，當(dāng)反應(yīng)溫度升高時(shí)蠟珠熔化，只在升高的溫度釋放所隔離的成分。按照其它的技術(shù)，對(duì)DNA聚合酶進(jìn)行可逆地失活或修飾，例如，通過(guò)DNA聚合酶的可逆的化學(xué)修飾或與抗體的結(jié)合(參見(jiàn)，例如，Birch等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,677,152)。在升高的反應(yīng)溫度，所述化學(xué)修飾被逆轉(zhuǎn)，或者所述抗體分子變性，釋放出功能性DNA聚合酶。然而，一些這樣的技術(shù)似乎是有漏洞的，原因在于在更低的反應(yīng)溫度，一些DNA聚合酶活性是可檢測(cè)到的，或者它們需要將反應(yīng)混合物延長(zhǎng)暴露于高溫才能完全使得DNA聚合酶失活。某些目前所用的核酸擴(kuò)增技術(shù)包括檢測(cè)和/或定量擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟，其包括核酸染料，例如但不限于，SYBRGreenI(分子探針(MolecularProbes)，Eugene,OR),包括某些實(shí)時(shí)和/或終點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)(參見(jiàn)，例如，Ririe等，Analyt.Biochem.(分析生物化學(xué))245:154-60(1997))。典型地，所述核酸染料與擴(kuò)增產(chǎn)物的雙鏈片段和/或引物-模板雙鏈體締合，并且在特別的核酸染料所特有的波長(zhǎng)發(fā)射可撿測(cè)的熒光信號(hào)。某些擴(kuò)增方法包括評(píng)估擴(kuò)增產(chǎn)物的純度的檢測(cè)步驟，其包括核酸染料，例如但不限于，PCR后解離曲線(xiàn)分析，其也叫作解鏈曲線(xiàn)分析。由于擴(kuò)增子的解鏈曲線(xiàn)特別取決于它的長(zhǎng)度和序列，所以擴(kuò)增子通常可以通過(guò)它們的解鏈曲線(xiàn)而區(qū)分(參見(jiàn)，例如，Zhang等,H印atology(肝臟病學(xué))36:723-28(2002))。解離或解鏈曲線(xiàn)可以在特定的擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中當(dāng)反應(yīng)溫度經(jīng)過(guò)所述擴(kuò)增子的解鏈溫度時(shí)通過(guò)檢測(cè)核酸染料的熒光而獲得。雙鏈擴(kuò)增子的解離觀察為在所述核酸染料特征性發(fā)射波長(zhǎng)的熒光的突然減少。按照某些解離曲線(xiàn)分析技術(shù)，當(dāng)解鏈曲線(xiàn)表現(xiàn)出單一的、一致的解鏈溫度時(shí)，有時(shí)在熒光強(qiáng)度的負(fù)導(dǎo)數(shù)相對(duì)溫度(-dF/dt相對(duì)T)的圖上繪圖性表示為一個(gè)峰，那么將擴(kuò)增產(chǎn)物分類(lèi)為"純的"。例如，在來(lái)自單叢擴(kuò)增的這樣的解離曲線(xiàn)中出現(xiàn)多個(gè)峰典型地表明存在不需要的副反應(yīng)產(chǎn)物。當(dāng)應(yīng)用這樣的基于核酸染料的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)技術(shù)時(shí)，通常理想地1)至少減少并且優(yōu)選地消除不需要的副反應(yīng)產(chǎn)物的形成，和2)至少減少并且優(yōu)選地消除由其它核酸，即非擴(kuò)增產(chǎn)物的雙鏈片段的變性導(dǎo)致的熒光峰。除此之外，由于引物、連接探針、裂解探針、啟動(dòng)子-引物等的非特異性退火，以及隨后在亞最佳溫度的酶活，某些其它擴(kuò)增技術(shù)也可以產(chǎn)生不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，盡管反應(yīng)成分通常是室溫下結(jié)合，或者盡管反應(yīng)組合物被加熱到需要的反應(yīng)溫度。這些技術(shù)中至少有一些可以受益于背景熒光的減少。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增靶核酸同時(shí)減少非特異性熒光和不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物的組合物、方法和試劑盒，所述不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物在本領(lǐng)域中有時(shí)叫作次級(jí)擴(kuò)增子或假性副產(chǎn)物。本發(fā)明公開(kāi)了包括核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑。所述公開(kāi)的抑制劑設(shè)計(jì)成抑制酶的至少一種酶活性。在某些實(shí)施方案中，所述酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。在一些實(shí)施方案中，酶抑制劑包括能夠形成至少一個(gè)雙鏈片段的適體(參見(jiàn)，例如，Yakimovich等，Biochem.(Mosc.)(生物化學(xué)(莫斯科))68(2):228-35(2003);Nickens等，RNA9:1029-33(2003);Nishikawa等，Oligonucleotides(寡核苷酸)14:114-29(2004);和Umehara等，J.Biochem.(生物化學(xué)雜志)137:339-74(2005))。在一些實(shí)施方案中，酶抑制劑包括多樣的不同的猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，所述酶抑制劑可以呈現(xiàn)出一種構(gòu)象，所述構(gòu)象在第一溫度包括至少一個(gè)雙鏈片段，但是當(dāng)加熱到第二溫度時(shí)，是單鏈的或基本上單鏈的。按照某些實(shí)施方案，包括至少一個(gè)雙鏈片段的酶抑制劑可以與下列各項(xiàng)中的至少一種形成復(fù)合體DNA聚合酶，包括但不限于反轉(zhuǎn)錄酶；RNA聚合酶；裂解酶，包括但不限于，結(jié)構(gòu)-特異的核酸酶；解旋酶；和連接酶。在某些實(shí)施方案中，酶抑制劑是相對(duì)應(yīng)的酶的無(wú)效底物，原因在于所述抑制劑包括封閉基團(tuán)、核苷酸類(lèi)似物、不可裂解的核苷酸間連接或它們的組合。本發(fā)明公幵了包括核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑。一些DNA聚合酶抑制劑包括兩種或多種猝滅劑，其可以是相同的猝滅劑或不同的猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結(jié)合物，其在一些實(shí)施方案中包括猝滅劑。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列的3，-端不能被DNA聚合酶延伸，這典型地是由于封閉基團(tuán)或非延伸核苷酸的存在。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括能夠形成至少一個(gè)雙鏈片段的適體(參見(jiàn)，例如，Yakimovich等，Biochem.(Mosc.)(生物化學(xué)(莫斯科))68(2):228-35(2003))。本發(fā)明提供包含酶和酶抑制劑的復(fù)合物。某些復(fù)合物包含DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑；連接酶和連接酶抑制劑；RNA聚合酶和RNA聚合酶抑制劑；裂解酶和裂解酶抑制劑；或解旋酶和解旋酶抑制劑。某些復(fù)合物還包含脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，核苷酸類(lèi)似物，輔助蛋白，例如但不限于單鏈結(jié)合蛋白(SSB)或增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，或它們的組合。典型地，所述酶-酶抑制劑復(fù)合物可以在第一溫度形成，并且當(dāng)與在所述復(fù)合物中的抑制劑締合時(shí)，所述酶的至少一種催化活性被抑制。當(dāng)將所述復(fù)合物加熱到第二溫度時(shí)，所述復(fù)合物解離，釋放所述酶。在某些實(shí)施方案中，酶-酶抑制劑復(fù)合物包括DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑。在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶-DNA聚合酶抑制劑復(fù)合物還包括核苷酸三磷酸(NTP)和/或核苷酸類(lèi)似物。某些復(fù)合物實(shí)施方案包括與DNA聚合酶締合的以莖-環(huán)構(gòu)象存在的DNA聚合酶抑制劑，并且任選地，NTP和/或核苷酸類(lèi)似物。某些復(fù)合物實(shí)施方案包括與DNA聚合酶抑制劑締合的DNA聚合酶，并且任選地，NTP和/或核苷酸類(lèi)似物，所述DNA聚合酶抑制劑包括退火形成包含至少一個(gè)雙鏈片段的雙鏈體的至少兩個(gè)寡核苷酸。典型地，當(dāng)它與本發(fā)明的DNA聚合酶抑制劑，并且任選地，NTP和/或核苷酸類(lèi)似物復(fù)合時(shí)，所述DNA聚合酶的DNA合成活性被抑制。本發(fā)明公開(kāi)減少非特異性熒光的方法，其包括本發(fā)明的酶抑制劑。按照某些方法，在適合形成酶-酶抑制劑復(fù)合物的條件下，將酶與酶抑制劑接觸。當(dāng)所述酶存在于所述復(fù)合物中時(shí)，所述酶的至少一種酶促活性被抑制。當(dāng)將所述酶-酶抑制劑復(fù)合物加熱到適當(dāng)?shù)牡诙囟葧r(shí)，所述復(fù)合物解離，將所述酶釋放。一些減少非特異性熒光的方法包括本發(fā)明的DNA聚合酶抑制劑。按照某些這樣的方法，反應(yīng)組合物在第一溫度形成，其包括DNA聚合酶，包括核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，NTP和/或核苷酸類(lèi)似物，靶核酸，引物和核酸染料。在某些實(shí)施方案中，所述引物包括引物對(duì)。在第一溫度，所述DNA聚合酶抑制劑包括至少一個(gè)雙鏈片段，并且可以與所述DNA聚合酶形成復(fù)合物。DNA聚合酶抑制劑的猝滅劑可以吸收與所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料的至少一些熒光信號(hào)。將所述反應(yīng)組合物加熱到第二反應(yīng)溫度，所述第二反應(yīng)溫度典型地接近、處于或者高于所述DNA聚合酶抑制劑的解鏈溫度，這引起至少一些所述DNA聚合酶抑制劑-DNA聚合酶復(fù)合物的解離。將所述反應(yīng)組合物進(jìn)行至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，并且產(chǎn)生擴(kuò)增子的多樣性。由于與所述擴(kuò)增子締合的核酸染料的熒光，在"實(shí)時(shí)"或在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，可以檢測(cè)到雙鏈擴(kuò)增子，但是與所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料的熒光至少被猝滅劑減少。本發(fā)明還公開(kāi)了擴(kuò)增靶核酸的方法，其使用本發(fā)明的酶抑制劑。按照某些這樣的方法，反應(yīng)組合物在第一溫度形成，其包括DNA聚合酶，包括核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，NTP，靴核酸，引物，和核酸染料。在某些實(shí)施方案中，所述引物包括引物對(duì)。在第一溫度，所述DNA聚合酶抑制劑包含至少一個(gè)雙鏈片段，并且可以與DNA聚合酶形成形成復(fù)合物。所述DNA聚合酶抑制劑的猝滅劑可以吸收由與所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料發(fā)射的至少一些熒光。將所述反應(yīng)組合物加熱到第二反應(yīng)溫度，所述第二反應(yīng)溫度典型地接近、處于或者高于所述DNA聚合酶抑制劑的解鏈溫度，這引起至少一些所述DNA聚合酶抑制劑-DNA聚合酶復(fù)合物的解離。將所述反應(yīng)組合物進(jìn)行至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，并且產(chǎn)生擴(kuò)增子的多樣性。在某些實(shí)施方案中，由于在所述反應(yīng)組合物中存在DNA聚合酶抑制劑，所產(chǎn)生的擴(kuò)增子的量增加。按照某些方法，反應(yīng)組合物包括靶核酸，酶，酶抑制劑，核酸染料和下列各項(xiàng)中的至少一種NTP，核苷酸類(lèi)似物，引物，連接探針對(duì)，裂解探針對(duì)，啟動(dòng)子-引物，輔因子，例如但不限于包含NAD+的物質(zhì)，和輔助蛋白，其包括但不限于PCNA和/或SSB。按照某些方法，將連接酶與連接酶抑制劑接觸，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，形成連接酶-連接酶抑制劑復(fù)合物。按照某些方法，將裂解酶與裂解酶抑制劑接觸，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，形成裂解酶-裂解酶抑制劑復(fù)合物。按照某些方法，將解旋酶與解旋酶抑制劑接觸，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，形成解旋酶-解旋酶抑制劑復(fù)合物。按照一些方法，將RNA聚合酶與RNA聚合酶抑制劑接觸，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，形成RNA聚合酶-RNA聚合酶抑制劑復(fù)合物。本發(fā)明還公開(kāi)用于進(jìn)行某些本發(fā)明方法的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括包含核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括兩種或多種不同的酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，酶抑制劑可以與RNA聚合酶、解旋酶、裂解酶或連接酶形成復(fù)合物。某些試劑盒實(shí)施方案還包括裂解探針組、連接探針組、引物、啟動(dòng)子-引物或它們的組合。某些試劑盒實(shí)施方案包括包含核苷酸序列和猝滅劑的至少一種DNA聚合酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括兩種或多種DNA聚合酶抑制劑。在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶抑制劑包括小溝結(jié)合物。某些試劑盒實(shí)施方案還包括下列各項(xiàng)中的至少一種引物，引物對(duì)，核酸染料,DNA聚合酶，和報(bào)道探針。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括DNA-依賴(lài)型DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶。在本文中描述了本發(fā)明的這些和其它特征。附圖熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解下文所述的附圖只是舉例說(shuō)明的目的。這些附圖并不意欲以任何方式限制本發(fā)明的范圍。圖1:示意性描述包含單一寡核苷酸的某些代表性酶抑制劑的示例實(shí)施方案。圖2:示意性描述包含多樣性寡核苷酸的某些代表性酶抑制劑的示例實(shí)施方案。圖3:描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制劑獲得的解離曲線(xiàn)，其作為熒光的負(fù)導(dǎo)數(shù)(-dF/dt)相對(duì)于溫度°C繪圖。圖4:描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制劑獲得的解離曲線(xiàn)，其作為熒光的負(fù)導(dǎo)數(shù)相對(duì)于溫度'C繪圖。圖5:描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制劑獲得的解離曲線(xiàn)，其作為熒光的負(fù)導(dǎo)數(shù)相對(duì)于溫度"C繪圖。圖6:描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制劑獲得的解離曲線(xiàn)，其作為熒光的負(fù)導(dǎo)數(shù)相對(duì)于溫度'C繪圖。圖7:描述瓊脂糖凝膠的照片。將包含在不同濃度的代表性酶抑制劑中產(chǎn)生的擴(kuò)增子的系列熱循環(huán)反應(yīng)組合物的等分試樣在非變性瓊脂糖凝膠的分開(kāi)泳道中進(jìn)行電泳，并且用溴化乙錠顯現(xiàn)，如在實(shí)施例2中所述。泳道A和J:大小梯度，包括1200堿基對(duì)，800堿基對(duì)，400堿基對(duì)，200堿基對(duì)，和100堿基對(duì)大小標(biāo)準(zhǔn)物；泳道B-G:分別為包含5，10,25，50,75或100nMDNA聚合酶抑制劑E的熱循環(huán)反應(yīng)組合物的等分試樣；泳道H:包含50nMDNA聚合酶抑制劑E的無(wú)模板對(duì)照反應(yīng)組合物；泳道I:空白。aiLJS述瓊脂糖凝膠的照片。將包含在不同濃度的代表性DNA聚合酶抑制劑中產(chǎn)生的擴(kuò)增子的系列熱循環(huán)反應(yīng)組合物的等分試樣在非變性瓊脂糖凝膠的分開(kāi)泳道中進(jìn)行電泳，并且用溴化乙錠顯現(xiàn)，如在實(shí)施例3中所述。泳道A和J:大小梯度，包括1200堿基對(duì)，800堿基對(duì)，400堿基對(duì),200堿基對(duì)，和IOO堿基對(duì)大小標(biāo)準(zhǔn)物；泳道B-H:分別為包含0,5,10，25，50，75或100nMDNA聚合酶抑制劑E的熱循環(huán)反應(yīng)組合物的等分試樣；泳道I:包含50nMDNA聚合酶抑制劑E的無(wú)模板對(duì)照反應(yīng)組合物。圖9:描述非變性瓊脂糖凝膠的照片，表現(xiàn)出由于存在代表性的DNA聚合酶抑制劑而導(dǎo)致的次級(jí)擴(kuò)增子的減少，如在實(shí)施例4中所述。1_1^_描述按照本發(fā)明的代表性方法產(chǎn)生的代表性解離曲線(xiàn)，如在實(shí)施例5中所述。示例性實(shí)施方案的描述應(yīng)該理解，前文的概括描述和下述詳細(xì)描述都只是示例性的和解釋性的，并不是意欲限制本發(fā)明的范圍。當(dāng)用于本說(shuō)明書(shū)中時(shí)，詞語(yǔ)"a(—個(gè))"或"an(—種)"意指至少一個(gè)，除非特別另外闡明。在本說(shuō)明書(shū)中，單數(shù)的應(yīng)用包括復(fù)數(shù)，除非特別另外闡明。例如但不是作為限制，"一種靶核酸"意指可存在不止一種靶核酸；例如，一個(gè)或多個(gè)拷貝的特別的靶核酸種類(lèi)，以及兩種或多種不同種類(lèi)的靶核酸。此夕卜，使用"comprise(包括)","comprises(包括)，，，"comprising(包括)"，"contain(含有)，，，"contains(含有)，，，"containing(含有)","include(包含)","includes(包含)"，和"including(包含)"并不意欲限制。術(shù)語(yǔ)"和域"意指前和后的術(shù)語(yǔ)可以一起或分幵采用。出于舉例說(shuō)明的目的，而不是作為限制，"X和/或Y"可以意指"X"或"Y"或者"X和Y"。本文所用的部分標(biāo)題只是出于組織的目的，并不是解釋為以任何方式限制所述的主題。在本說(shuō)明書(shū)中引用的所有文獻(xiàn)，包括但不限于專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、論文、書(shū)和論述都通過(guò)引用完全清楚地結(jié)合用于任何目的。在任何所結(jié)合的文獻(xiàn)與本說(shuō)明書(shū)中定義的任何術(shù)語(yǔ)相抵觸的事件中，由本說(shuō)明書(shū)控制。盡管本發(fā)明與許多實(shí)施方案結(jié)合進(jìn)行描述，但是并不傾向于本發(fā)明應(yīng)該被所述的實(shí)施方案所限制。相反，本發(fā)明包括各種備選方案、修改和等價(jià)物，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的。JohnW.Brandis的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)10/762,222,題目為"CompetitiveKineticNucleicAcidDNApolymeraseinhibitors(競(jìng)爭(zhēng)性云力力學(xué)核酸DNA聚合酶抑制劑)"，其與2004年1月11日提交，通過(guò)引用完全清楚地結(jié)合于此用于任何目的。一些定義當(dāng)參考從核酸染料發(fā)射的熒光信號(hào)應(yīng)用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"吸收至少一些"是指由于酶抑制劑的一種或多種猝滅劑的存在而導(dǎo)致的可檢測(cè)的熒光的減少。吸收由與酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料發(fā)射的熒光中的至少一些，意指相對(duì)于在除了所述酶抑制劑不包括猝滅劑之外包括相同的成分的反應(yīng)組合物中的可檢測(cè)的熒光，在所述核酸染料特有的發(fā)射波長(zhǎng)處的可檢測(cè)的熒光中存在可測(cè)量的減少。在一些實(shí)施方案中，在可檢測(cè)的熒光中的可測(cè)量的減少意指在熒光中的30°/。，40%,50%,60%,70%，80%,90%,95%,97%,98%,99%或大于99%的相對(duì)減少。在某些實(shí)施方案中，其中所述至少一種猝滅劑包括熒光猝滅劑，在所述核酸染料特有的波長(zhǎng)處的可檢測(cè)的熒光中可存在可測(cè)量的減少，并且在所述酶抑制劑的至少一種熒光猝滅劑的特征發(fā)射波長(zhǎng)處的可檢測(cè)的熒光中可存在可測(cè)量的減少。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增子"和"擴(kuò)增產(chǎn)物"通常是指擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物。擴(kuò)增子可以是雙鏈的或單鏈的，并且可以包括通過(guò)將雙鏈的擴(kuò)增產(chǎn)物變性而獲得的分開(kāi)的組成鏈。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增子包括連接產(chǎn)物(例如但不限于連接的探針)，連接產(chǎn)物的至少部分的補(bǔ)體，或二者。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的擴(kuò)增子可以作為后續(xù)擴(kuò)增循環(huán)的模板。術(shù)語(yǔ)"退火(annealing)"和"雜交(hybridizing)",包括但不限于源單詞雜交(hybridize)和退火(anneal)的變化，是可以互換地使用的，并且意指一種核酸與另一種核酸的核苷酸堿基-配對(duì)的相互作用，其導(dǎo)致形成雙鏈體、三鏈體或其它更高級(jí)的結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，退火或雜交是指在相同的酶抑制劑的至少兩個(gè)區(qū)域中的至少一些核苷酸之間的相互作用，以形成發(fā)夾或莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，有時(shí)稱(chēng)為自我退火。一級(jí)相互作用典型地是核苷酸堿基特異性的，例如，A:T,A:U,和G:C，通過(guò)沃森-克里克和Hoogsteen-型氫鍵作用。在某些實(shí)施方案中，堿基-堆積和疏水相互作用還可以有助于雙鏈體穩(wěn)定性。引物和探針退火成為互補(bǔ)序列的條件是本領(lǐng)域公知的，例如，如在NucleicAcidHybridization,APracticalApproach(核酸雜交，實(shí)用方法)，Hames和Higgins，編，IRL出版，Washington,D.C.(1985)和Wetmur和Davidson,Mol.Biol.(分子生物學(xué))31:349，1968中所述。通常，這樣的退火是否發(fā)生特別受下列各項(xiàng)的影響某些酶抑制劑的相對(duì)應(yīng)的第一和第三區(qū)域和/或第四和第六區(qū)域的互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度，引物與它們?cè)诎信詡?cè)序列和/或擴(kuò)增子中的相對(duì)應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度，裂解探針或連接探針和靶核酸或擴(kuò)增子的相對(duì)應(yīng)的結(jié)合部分的互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度，或者報(bào)道探針與其結(jié)合位點(diǎn)的相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度；pH;溫度；單價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子的存在；在雜交區(qū)域的G和C核苷酸的比例；介質(zhì)的粘度；以及變性劑的存在。這樣的變量影響雜交所需要的時(shí)間。在某些酶抑制劑實(shí)施方案中，在所述抑制劑、探針和/或引物中存在特定的核苷酸類(lèi)似物或小溝結(jié)合物還可以影響雜交條件。因此，優(yōu)選的退火條件將取決于具體的應(yīng)用。然而，這樣的反應(yīng)條件可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員常規(guī)確定，無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。優(yōu)選地，選擇退火條件，以在第二反應(yīng)溫度允許所述引物和/或探針選擇性地與反應(yīng)組合物中相對(duì)應(yīng)的靶旁側(cè)序列或擴(kuò)增子中的互補(bǔ)序列雜交，而不以任何顯著的程度與反應(yīng)組合物中的不同的靶核酸或非靶序列雜交。術(shù)語(yǔ)"選擇性雜交"及其變化意指，在適當(dāng)?shù)膰?yán)格條件下，給定的序列(例如但不限于引物)與包含核苷酸的互補(bǔ)片段(string)(例如但不限于，靶旁側(cè)序列或擴(kuò)增子的引物-結(jié)合位點(diǎn))的第二種序列退火，但是不與不需要的序列如非靶核酸、探針或其它引物退火。典型地，當(dāng)反應(yīng)溫度升高到特別的雙鏈序列的解鏈溫度時(shí)，選擇性雜交的相對(duì)量通常增加，并且錯(cuò)位引發(fā)(mispriming)通常減少。在本說(shuō)明書(shū)中，一種序列與另一種序列雜交或選擇性雜交的敘述包括兩種所述序列完全彼此雜交或選擇性雜交的情形，以及只有所述序列中的一種或兩種的部分與完整的另一種序列或其它序列的部分雜交或選擇性雜交的情形。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格性"用來(lái)定義在將形成包括兩個(gè)互補(bǔ)核苷酸序列的雜合體的雜交和后續(xù)處理步驟中存在的溫度和溶劑組成。嚴(yán)格性還定義同源性的量，需要的條件，和在兩種核苷酸序列之間形成的雜合體的穩(wěn)定性。當(dāng)嚴(yán)格性條件升高時(shí)，對(duì)選擇性雜交是有利的，并且對(duì)非特異性交叉雜交是不利的。相對(duì)于更低的嚴(yán)格性條件，其中更可能發(fā)生錯(cuò)誤的引發(fā)，包括但不限于，連接探針和/或裂解探針的錯(cuò)誤退火，增加的嚴(yán)格性條件典型地對(duì)應(yīng)更高的溫育溫度，更低的鹽濃度，和/或更高的pH。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員理解，能夠使得引物或引物對(duì)、連接探針對(duì)和/或裂解探針對(duì)與相對(duì)應(yīng)的靶旁側(cè)序列和/或擴(kuò)增子選擇性雜交的適當(dāng)?shù)膰?yán)格性條件可以使用己知的技術(shù)無(wú)需不必要的實(shí)驗(yàn)而常規(guī)確定(參見(jiàn)，例如，PCR:TheBasicsfrombackgroundtobench(PCR:從后臺(tái)到工作臺(tái)的基礎(chǔ))，McPherson和Moller,BiosScientificPublishers(生物科學(xué)出版社)(2000;以下為"McPherson"))。在本說(shuō)明書(shū)中，一種核酸序列與另一種核苷酸序列相同或基本上相同的敘述包括兩種核苷酸序列與另一種序列完全相同或者基本上相同的情形，以及所述核苷酸序列中的一種只有部分與完整的另一種序列的部分相同或基本上相同的情形。同樣地，一種核酸序列與另一種核苷酸序列互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的敘述包括兩種核苷酸序列彼此完全互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的情形，以及所述序列中的一種只有部分與完整的另一種序列的部分互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的情形。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"適體"是指DNA或RNA寡核苷酸，其1)使用體外選擇方法，例如但不限于"通過(guò)指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)(SELEX)"方法或其變化，典型地首先得到鑒定，并且2)以高特異性、構(gòu)象-依賴(lài)性方式識(shí)別并且結(jié)合配偶體，例如但不限于酶。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"或它們的組合"是指在先術(shù)語(yǔ)所列條目的所有排列和組合。例如，"A,B,C或它們的組合"意欲包括下述的至少一種A,B，C,AB，AC，BC，或ABC，并且如果在特別的情形中順序是重要的，還包括BA,CA，CB,ACB,CBA,BCA，BAC，或CAB。繼續(xù)使用這一實(shí)例，清楚地包括包含一個(gè)或多個(gè)條目或項(xiàng)目的重復(fù)，諸如BB,AAA,AAB,BBC,AAABCCCC,CBBAAA，CABABB等的組合。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解，典型地，在任何組合中對(duì)條目或項(xiàng)目的數(shù)目沒(méi)有限制，除非另外從上下文中顯而易見(jiàn)。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)(complementary)"和"互補(bǔ)性(complementarity)"參考通過(guò)堿基-配對(duì)法則而相關(guān)的至少兩種核酸而應(yīng)用。例如但不限于，序列"A-C-T"與序列"T-G-A"互補(bǔ)?；パa(bǔ)可以是部分的，在這種情形中只有一些核苷酸按照堿基-配對(duì)法則而匹配?；蛘?，在核酸之間可以存在完全的或全部的互補(bǔ)性。核酸鏈之間的互補(bǔ)性的程度對(duì)所述核酸鏈之間的雜交的效率和強(qiáng)度有顯著的影響。對(duì)于穩(wěn)定的雙鏈體的形成，互補(bǔ)性不必是全部的，即，穩(wěn)定的雙鏈體可以包含錯(cuò)配的堿基對(duì)或不匹配的堿基。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)考慮許多變量，包括但不限于，核酸的長(zhǎng)度、堿基組成和核酸的序列、離子強(qiáng)度和錯(cuò)配堿基對(duì)的發(fā)生率，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定雙鏈體的穩(wěn)定性。核酸雙鏈體的穩(wěn)定性典型地通過(guò)其解鏈溫度、、當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"復(fù)合物"和"酶抑制劑-酶復(fù)合物"是指在本發(fā)明的酶抑制劑和相對(duì)應(yīng)的酶之間的締合。在一些實(shí)施方案中，酶抑制劑-酶復(fù)合物包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，連接酶，裂解酶，或解旋酶。術(shù)語(yǔ)抑制(inhibit)，抑制(inhibits)或其變化，當(dāng)參考酶應(yīng)用時(shí)，是相對(duì)的術(shù)語(yǔ)，并且是指與所述酶在相同的擴(kuò)增條件但是不存在酶抑制劑時(shí)的活性相比，酶活性的可測(cè)量的減少。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與酶抑制劑復(fù)合時(shí)，通過(guò)在存在和不存在酶抑制劑的平行的擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的需要的擴(kuò)增子的量而確定，所述酶的酶活性減少約40%，約50%,約60%，約70%，約80%,約85%，約90%,約95%,約96%，約97%,約98%,約99%,或大于99%。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)所述復(fù)合物還包含輔助蛋白、NTP、核苷酸類(lèi)似物、包含NAD+的物質(zhì)、或它們的組合時(shí)，獲得最佳抑制。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"相對(duì)應(yīng)"是指在所述術(shù)語(yǔ)涉及的要素之間的至少一種具體的關(guān)系。出于舉例說(shuō)明的目的而不是作為限制，特定引物對(duì)的至少一種正向引物對(duì)應(yīng)同一引物對(duì)的至少一種反向引物；將至少一種引物設(shè)計(jì)成與相對(duì)應(yīng)的靶核酸的旁側(cè)區(qū)域和/或至少一種相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增子的引物-結(jié)合部分退火；連接探針組的第一探針與靶核酸和/或連接位點(diǎn)上游、以及典型地鄰近連接位點(diǎn)的擴(kuò)增子退火，并且相對(duì)應(yīng)的第二連接探針與耙核酸和/或連接位點(diǎn)的下游、以及典型地鄰近連接位點(diǎn)的擴(kuò)增子退火；在特定的酶抑制劑實(shí)施方案中，第一寡核苷酸與相對(duì)應(yīng)的第二寡核苷酸退火，形成包含至少一個(gè)雙鏈片段的雙鏈體；等等。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"使變性(denaturing)"和"變性(denaturation)"是指這樣的任何過(guò)程，其中適當(dāng)?shù)貙㈦p鏈多核苷酸轉(zhuǎn)化成兩個(gè)單鏈多核苷酸或者單鏈的或基本上單鏈的多核苷酸，所述雙鏈多核苷酸包括但不限于，包括至少一種靶核酸的gDNA片段，雙鏈擴(kuò)增子，或包括至少一個(gè)雙鏈片段的多核苷酸，例如但不限于在第一溫度的酶抑制劑。使雙鏈多核苷酸或酶抑制劑的雙鏈片段變性包括但不限于，各種熱和化學(xué)技術(shù)，其使得雙鏈核酸或酶抑制劑的雙鏈片段成為單鏈的或基本上單鏈的，例如但不限于，釋放雙鏈多核苷酸或者包含兩個(gè)寡核苷酸的雙鏈體的兩個(gè)個(gè)體單鏈成分。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，所用的變性技術(shù)通常沒(méi)有限制，除非它顯著妨礙后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)的退火或酶促步驟，或者在某些方法中，干擾熒光信號(hào)的檢測(cè)。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"雙鏈的"是指沿著至少它們的長(zhǎng)度的部分雜交的一個(gè)或兩個(gè)核酸鏈。因此，在某些情形中，"雙鏈的"可以指這樣的單一寡核苷酸的部分，即，其可以折疊，以致所述寡核苷酸的第一區(qū)域的至少一個(gè)片段與同一寡核苷酸的第三區(qū)域的至少一個(gè)片段雜交，所述寡核苷酸的第四區(qū)域的至少一個(gè)片段與所述寡核苷酸的第六區(qū)域的至少一個(gè)片段雜交，或者二者，由此形成一個(gè)或多個(gè)雙鏈片段和一個(gè)或多個(gè)單鏈的部分。因此，單一的核酸鏈可以形成具有雙鏈和單鏈片段的發(fā)夾或莖-環(huán)構(gòu)象(參見(jiàn)，例如，圖l)。類(lèi)似地，兩個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸可以彼此雜交，以形成雙鏈體(參見(jiàn)，例如，圖2)。因此，"雙鏈的"并不意味著核酸必須是完全雙鏈的。相反，雙鏈的核酸可以具有一個(gè)或多個(gè)單鏈片段和一個(gè)或多個(gè)雙鏈片段。術(shù)語(yǔ)"第一溫度"是指可以形成酶-酶抑制劑復(fù)合物的溫度，通常是溫度范圍。術(shù)語(yǔ)"第二溫度"是指酶-酶抑制劑復(fù)合物解離或不形成的溫度，通常是溫度范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，第二溫度典型地處于或者接近所述酶抑制劑的Tm，而第一溫度典型地低于所述酶抑制劑的Tm，以允許所述酶抑制劑呈現(xiàn)包括至少一個(gè)雙鏈片段的構(gòu)象。一種示例性的第一溫度可以是環(huán)境溫度或"室溫"。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"Tm"參考解鏈溫度應(yīng)用。解鏈溫度是大量的雙鏈核酸分子半解離成單鏈的溫度。"微觀流體裝置"是一種反應(yīng)容器，其包括至少一個(gè)微通道，所述微通道通常包括l毫米或更小的內(nèi)部尺寸。微觀流體裝置典型地應(yīng)用非常小的反應(yīng)體積，通常在一個(gè)或幾個(gè)微升(^iL)、毫微升(nanoliter)或兆分之一升(picoliter)的數(shù)量級(jí)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，微觀流體裝置的大小、形成和組成通常不限于本發(fā)明。相反，可以應(yīng)用任何適當(dāng)?shù)奈⒂^流體裝置進(jìn)行所公開(kāi)的方法的一個(gè)或多個(gè)步驟。除其它地方之外，示例性的微觀流體裝置及其應(yīng)用的描述可以特別見(jiàn)于在Fiorini和Chki,BioTechniques(生物技術(shù))38:429-46(2005);Kelly和Woolley,Analyt.Chem.(分析化學(xué))77(5):96A-102A(2005);Cheuk-WaiKan等，Electrophoresis(電泳)25:3564-88(2004);和Yeun等，GenomeRes,(基因組研究)11:405-12(2001)。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"小溝結(jié)合物"是指匹配雙鏈DNA中的小溝的小分子，有時(shí)以序列特異的方式匹配。通常，小溝結(jié)合物是長(zhǎng)的、平的分子，其可以采用月牙樣的形狀，并且因此貼切地匹配到雙螺旋的小溝中，通常替代水。小溝結(jié)合分子典型地包括通過(guò)具有扭轉(zhuǎn)自由度的鍵連接的一些芳香環(huán)，例如但不限于，呋喃、苯或吡咯環(huán)。"錯(cuò)誤引發(fā)"或"錯(cuò)誤引發(fā)的"，當(dāng)用于本文時(shí)，是指引物或探針與非靶核酸的雜交。如本領(lǐng)域內(nèi)已知的，引物(不包括隨機(jī)引物)通常設(shè)計(jì)成與側(cè)連靶核酸的選擇序列雜交或與擴(kuò)增子的引物-結(jié)合位點(diǎn)雜交，并且設(shè)計(jì)成引導(dǎo)DNA合成或在所述位點(diǎn)的引物延伸起始。當(dāng)引物或探針與非靶核酸雜交，這通常在低或減少的嚴(yán)格性條件下發(fā)生，并且然后作為引物從所述非靶位點(diǎn)延伸的起始點(diǎn)時(shí)，可以發(fā)生錯(cuò)誤-引發(fā)，產(chǎn)生某些不需要的次級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物的合成。連接探針對(duì)和裂解探針對(duì)還可以與非靶核酸錯(cuò)誤退火，這通常在低或減少的嚴(yán)格性條件下發(fā)生，這還可以導(dǎo)致不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。術(shù)語(yǔ)"不可延伸的核苷酸"，當(dāng)用于本文時(shí)，是指基本上沒(méi)有其它核苷酸可以通過(guò)聚合酶添加到其上的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述不可延伸的核苷酸是不具有與另一個(gè)核苷酸形成磷酸二酯連接的最適官能團(tuán)的核苷酸類(lèi)似物。在某些實(shí)施方案中，所述不可延伸的核苷酸是本質(zhì)上不允許引物延伸的鏈-終止核苷酸，例如二脫氧核苷酸(ddNs)，諸如ddA,ddC,ddG,ddl,ddT,和ddU。在一些實(shí)施方案中，聚合酶可以將其它核苷酸連接到不可延伸的核苷酸上，但是以緩慢的速率進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)"非特異性的"或"背景"，當(dāng)參考熒光應(yīng)用時(shí)，是指從與雙鏈核酸締合的核酸染料分子而不是需要的擴(kuò)增子發(fā)射的可檢測(cè)的信號(hào)。需要的擴(kuò)增子包括靶核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物，在一些實(shí)施方案中包括內(nèi)標(biāo)或?qū)φ招蛄?，所述?nèi)標(biāo)或?qū)φ招蛄锌梢园诒景l(fā)明的特定反應(yīng)組合物中，特別用于標(biāo)準(zhǔn)化和/或定量目的。因此，由核酸染料分子與假的、次級(jí)擴(kuò)增子的締合產(chǎn)生的熒光信號(hào)是非特異性熒光的一個(gè)來(lái)源，所述假的、次級(jí)擴(kuò)增子通常是錯(cuò)誤引發(fā)、錯(cuò)誤連接和/或引物二聚體形成的結(jié)果。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，當(dāng)本發(fā)明的酶抑制劑在第一溫度包括核酸染料分子可以締合的至少一種雙鏈片段時(shí)，所述抑制劑的猝滅劑部分可以吸收來(lái)自締合的核酸染料，背景的次級(jí)來(lái)源的可檢測(cè)的熒光信號(hào)中的至少一些，由此減少所述反應(yīng)組合物的非特異性熒光。術(shù)語(yǔ)"核苷酸堿基"，有時(shí)叫作含氮堿基或氮雜環(huán)堿基，是指可以作為核苷酸成分的取代的或未取代的一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)。在某些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)包含氮原子。在某些實(shí)施方案中，所述核苷酸堿基能夠與互補(bǔ)的核苷酸堿基形成沃森-克里克或Hoogsteen-型氫鍵。示例性的核苷酸堿基及其類(lèi)似物包括天然存在的核苷酸堿基腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧徒、5甲基胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶，以及天然存在的核苷酸堿基的類(lèi)似物，其包括7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮-8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤、N6-A2-異戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-A2-異戊烯基-2-甲硫基腺嘌呤(2ms6iA)、N2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤(dmG)、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤、假尿苷、假胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、異胞嘧啶、異鳥(niǎo)嘌呤、2-硫嘧啶、6-硫鳥(niǎo)嘌呤、4-硫胸腺嘧啶、4-硫尿嘧啶、06-甲基鳥(niǎo)嘌呤、N、甲基腺嘌呤、04-甲基胸腺嘧啶、5,6-二氫胸腺嘧啶、5，6-二氫尿嘧啶、吡唑并[3,4-D]嘧啶(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，143,877和6,127,121和PCT公布申請(qǐng)WO01/38584)、亞乙烯腺嘌呤、B引哚如硝基吲哚和4-甲基吲哚，和吡咯如硝基吡咯。例如，核苷酸堿基的非限制性實(shí)例可以在Fasman,PracticalHandbookofBiochemistryandMolecularBiology(生物it學(xué)禾口分子生物學(xué)實(shí)踐手冊(cè))，第385-394頁(yè)，CRC出版社，BocaRaton,1&.(1989)及其中引用的參考文獻(xiàn)中找到。術(shù)語(yǔ)"核苷酸"，當(dāng)用于本文時(shí)，是指核苷的磷酸酯，例如，三磷酸酯，其中最常見(jiàn)的酯化位點(diǎn)是附著在戊糖C-5位置的羥基。術(shù)語(yǔ)"核苷酸"還通常用來(lái)指一組包括核苷和核苷酸的化合物，除非另外從上下文顯而易見(jiàn)。術(shù)語(yǔ)"核苷"，當(dāng)用于本文時(shí)，是指包括連接到糖如核糖、阿拉伯糖、木糖、和吡喃糖以及它們的糖類(lèi)似物的C-1'碳上的核苷酸堿基的化合物。所述糖可以是取代的或未取代的。取代的核糖糖包括，但不限于，其中的一個(gè)或多個(gè)碳原子，例如，2'-碳原子，被一個(gè)或多個(gè)相同的或不同的，一R，一OR,^"NR2疊氮化物，氰化物或鹵素基團(tuán)取代的那些核糖，其中每個(gè)R獨(dú)立地是H，d-C6烷基,C2-C7?；駽s-Q4芳基。示例性的核糖包括，但不限于，2'-(Cl-C6)垸氧基核糖，2'-(C5-C14)芳氧基核糖，2，，3，-二脫氫核糖，2，-脫氧-3，-卣核糖，2，-脫氧-3，-氟核糖，2，-脫氧-3，-氯核糖，2，-脫氧-3，-氨基核糖，2'-脫氧-3，-(Cl-C6)烷基核糖，2，-脫氧-3，-((:1《6)垸氧基核糖和2'-脫氧-3，-(C5^C14)芳氧基核糖，核糖，2，-脫氧核糖，2',3，-雙脫氧核糖，2，-鹵核糖,2，-氟核糖，2，-氯核糖，和2，-烷基核糖，例如，2，-0-甲基4，普異頭核苷酸，l，-a-異頭核苷酸，2'-4'-和3'-4'-連接的以及其它"鎖定的(locked)"或"LNA",二環(huán)糖修飾(參見(jiàn)，例如，PCT公布申請(qǐng)?zhí)朩O98/22489,WO98/39352,和WO99/14226;和Braasch和Corey,Chem.Biol.(化學(xué)生物)8:1-7,2001;和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,268，490)。"LNA，，或"鎖定核酸"是這樣的核苷酸類(lèi)似物，即，其構(gòu)象被鎖定，以致所述核糖環(huán)受到例如但不限于2'-氧和3，-或4，-碳或具有2，-5'主鏈的3'-4'LNA之間的亞甲基連接的限制(參見(jiàn)，例如，Imanishi和Obika,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,268,490;和Wengel和Nielsen,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,670,461)。由所述連接施加的構(gòu)象限制通常提高互補(bǔ)序列的結(jié)合親和性，并且提高這樣的雙鏈體的熱穩(wěn)定性。在多核苷酸內(nèi)的示例性LNA糖類(lèi)似物包括下述結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>2'-4'D-形式LNA2，-4'L-形式LNA1'R,3'S,4'Rl'R,3'R,4'S<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>3'-4'D-形式LNA3'-4'L-形式LNA1'R，3'S，4'R1'S,3'R,4'S其中B是任何核苷酸堿基。核糖的2'-或3'-位置可以被修飾，以包括氫、羥基、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、甲氧基乙基、垸氧基、苯氧基、疊氮基、氰基、酰氨基、亞氨基、氨基、垸基氨基、氟、氯和溴。核苷酸包括天然D光學(xué)異構(gòu)體，以及L光學(xué)異構(gòu)體形式(參見(jiàn)，例如，Garbesi等,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)21:4159-65(1993);Fujimori等，J.Amer.Chem.Soc.(美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志)112:7436-38(1990);Urata等，Nucl.AcidsSymposium(核酸研討會(huì))系列號(hào)29:69-70(1993))。當(dāng)核苷酸堿基是嘌呤，例如A或G時(shí)，核糖糖附著到所述核苷酸堿基的N、位置上。當(dāng)核苷酸堿基是嘧啶，例如C、T或U時(shí)，戊糖糖附著到所述核苷酸堿基的N、位置上，除了假尿苷外，其中戊糖糖附著到尿嘧啶核苷酸堿基的C5位置上(參見(jiàn)，例如，Kornberg和Baker,DNAReplication(DNA復(fù)制)，第2版.(1992)，F(xiàn)reeman,SanFrancisco,CA)。核苷酸的一個(gè)或多個(gè)戊糖碳可以用具有下式的磷酸酯取代<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>其中a是從0到4的整數(shù)。在某些實(shí)施方案中，a是2，并且所述磷酸酯附著到戊糖的3'-或5，-碳上。在某些實(shí)施方案中，所述核苷酸是其中所述核苷酸堿基是嘌呤、7-脫氮嘌呤、嘧啶或它們的類(lèi)似物的那些。術(shù)語(yǔ)"核苷酸5'-三磷酸"是指在5，位置具有三磷酸酯基團(tuán)的核苷酸，并且有時(shí)表示為"rNTP",或"dNTP"和"ddNTP"，以特別指出所述核糖糖的結(jié)構(gòu)特征，或者一般表示為"NTP"。三磷酸酯基團(tuán)可以包括用硫取代多個(gè)氧，例如，a-硫-核苷酸5，-三磷酸。除其它地方之外，核苷酸化學(xué)的綜述可以特別在Miller,BioconjugateChem.(生物綴合物化學(xué))1:187-91(1990);Shabarova,Z.禾口Bogdanov,A.AdvancedOrganicChemistryofNucleicAcids(核酸高級(jí)有機(jī)化學(xué))，VCH，紐約(1994);和NucleicAcidsinChemistryandBiology(化學(xué)和生物中的核酸)，第2版，Blackburn和Gait，編，牛津大學(xué)出版(1996;以下為"Blackbum和Gait")中找到。術(shù)語(yǔ)"核苷酸類(lèi)似物"是指合成的類(lèi)似物，其具有修飾的核苷酸堿基部分、修飾的戊糖部分、和/或修飾的磷酸部分，并且在多核苷酸的情形中，修飾的核苷酸之間的連接，如通常在本文和其它地方所描述的(例如，Scheit，NucleotideAnalogs(核苷酸類(lèi)似物),JohnWiley，紐約，1980;Englisch,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.30:613-29，1991;Agarwal,ProtocolsforPolynucleotidesandAnalogs(多核苷酸和類(lèi)似物的方法)，Humana出版社，1994;和S.Verma和F.Eckstein,Ann.Rev.Biochem.(生物化學(xué)綜述年刊)67:99-134,1998)。通常，修飾的磷酸酯部分包括磷酸的類(lèi)似物，其中磷原子處于+5氧化狀態(tài)，并且一個(gè)或多個(gè)氧原子用非氧部分取代，例如但不限于，硫。磷酸酯類(lèi)似物的一些非限制性實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酉旨、硒f^石粦酸酉旨、二硒4戈磷酸酉旨、phosphoroanilothioate、phosphomnilidate、氨基磷酸酯、二羥硼基磷酸酯，包括締合的抗衡離子，例如，H^NH4+,Na+,如果這樣的抗衡離子存在的話(huà)。修飾的核苷酸堿基部分的非限制性實(shí)例包括5-甲基胞嘧啶(5mC);C-5-丙炔基類(lèi)似物，包括但不限于，C-5丙炔基-C和C-5丙炔基-U;2,6-二氨基嘌呤，也叫作2-氨基腺嘌呤或2-氨基-dA;次黃嘌呤，假尿苷，2-硫代嘧啶，異胞嘧啶(異C)，5-甲基異C,和異鳥(niǎo)嘌呤(異G;參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，432，272)。修飾的戊糖部分的非限制性實(shí)例包括LNA類(lèi)似物，其包括但不限于Bz-A-LNA，5-Me-Bz-C-LNA,dmf-G-LNA，和T國(guó)LNA(參見(jiàn)，例如，TheGlenReport(Glen報(bào)道)，16(2):5(2003);Koshkin等，Tetrahedron(四面體)54:3607-30(1998》，禾口2，-或3，-修飾，其中所述2'-或3，-位置是氫、羥基、烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基和戊氧基)、疊氮基、氨基、烷氨基、氟、氯或溴。修飾的核苷酸間連接包括磷酸酯類(lèi)似物、具有非手性和不帶電荷的亞基間連接的類(lèi)似物(例如，Sterchak,E.P.等，OrganicChem.(有機(jī)化學(xué))52:4202(1987))，和具有非手性亞基間連接的不帶電荷的嗎啉代基聚合物(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,034,506)。核苷酸間連接類(lèi)似物的一些非限制性實(shí)例包括morpholidate，乙縮醛和聚酰胺-連接的雜環(huán)。在一類(lèi)叫作肽核酸的核苷酸類(lèi)似物中，包括但不限于假互補(bǔ)性肽核酸(籠統(tǒng)地"PNA")，常規(guī)的糖和核苷酸間連接已被2-氨基乙基甘氨酸酰胺主鏈聚合物取代(參見(jiàn)，例如，Nielsen等，Science(科學(xué)),254:1497-1500(1991);Egholm等，J.Am.Chem.Soc.(美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志)，114:1895-1897(1992);Demidov等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))99:5953-58(2002);PeptideNucleicAcids:ProtocolsandApplications(月太核酸方去禾口應(yīng)用)，Nielsen,編，Horizon生物科學(xué)(2004))。用于酶結(jié)合或化學(xué)合成的寬范圍的核苷酸類(lèi)似物可以用作三磷酸酯、氨基磷酸酯或CPG衍生物，除了其它來(lái)源外，其特別來(lái)自Glen研究，Sterling,MD;LinkTechnologies(連接技術(shù)),Lanarkshire,Scotland,英國(guó)；和TriLinkBioTechnologies(三連接生物技術(shù)),SanDiego,CA。除了其它地方外，關(guān)于寡核苷酸合成和某些核苷酸類(lèi)似物的描述可以特別在S.Verma和F.Eckstein,Ann.Rev.Biochern.(生物化學(xué)綜述年刊)67:99-134(1999);Goodchild,Bioconj.Chem.(生物綴合物化學(xué))1:165-87(1990);CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry(現(xiàn)代核酸化學(xué)方法)，Beaucage等，編，JohnWiley和Sons，紐約，紐約，包括從2005年8月以來(lái)的更新(以下"Beaucage等")；以及Blackbum和Gait中找到。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"引物-結(jié)合位點(diǎn)"是指多核苷酸序列、典型地靶核酸和/或擴(kuò)增子的這樣的區(qū)域，即，其可以直接或者利用其補(bǔ)體作為引物可以在其上退火的模板，以用于本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)囊镅由旆磻?yīng)，例如但不限于PCR。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，當(dāng)在單一多核苷酸上存在兩個(gè)引物-結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，所述兩個(gè)引物-結(jié)合位點(diǎn)的方向通常是不同的。例如，引物對(duì)中的一個(gè)引物與第一引物-結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)，并且可以與之雜交，而所述引物對(duì)的相對(duì)應(yīng)的引物被設(shè)計(jì)成與第二引物-結(jié)合位點(diǎn)的補(bǔ)體雜交。換言之，在一些實(shí)施方案中，第一引物-結(jié)合位點(diǎn)可以是有義方向，并且第二引物-結(jié)合位點(diǎn)可以是反義方向。擴(kuò)增子的引物-結(jié)合位點(diǎn)可以，但不必需包括與靶旁側(cè)序列或其補(bǔ)體的相同的序列或所述序列的至少一些。本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白，當(dāng)靶核酸和/或擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)特定的擴(kuò)增方式擴(kuò)增時(shí)，引物-結(jié)合位點(diǎn)的補(bǔ)體在互補(bǔ)擴(kuò)增子或所述擴(kuò)增子的互補(bǔ)鏈中合成。因此，應(yīng)該理解，當(dāng)用于本文時(shí)，引物-結(jié)合位點(diǎn)的補(bǔ)體清楚地包含在術(shù)語(yǔ)引物-結(jié)合位點(diǎn)的指定的意思之內(nèi)。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"探針-結(jié)合位點(diǎn)"是指多核苷酸序列、典型地靶核酸和/或擴(kuò)增子的這樣的區(qū)域，即，其可以直接或者利用其補(bǔ)體作為探針可以在其上退火的模板。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，用于連接探針對(duì)的探針-結(jié)合位點(diǎn)包括上游探針-結(jié)合位點(diǎn)和下游探針結(jié)合位點(diǎn)，并且這兩個(gè)位點(diǎn)典型地彼此鄰近。在某些實(shí)施方案中，上游連接探針-結(jié)合位點(diǎn)和下游探針結(jié)合位點(diǎn)沒(méi)有彼此鄰近，并且擴(kuò)增步驟可以包括填補(bǔ)缺口的反應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)該理解，裂解探針對(duì)的探針-結(jié)合位點(diǎn)包括上游探針-結(jié)合位點(diǎn)，其鄰近，并且可以但不必需與下游裂解探針-結(jié)合位點(diǎn)的至少部分重疊。本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白，當(dāng)靶核酸和/或擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)特定的擴(kuò)增方式擴(kuò)增時(shí)，探針-結(jié)合位點(diǎn)的補(bǔ)體在互補(bǔ)擴(kuò)增子或所述擴(kuò)增子的互補(bǔ)鏈中合成。因此，應(yīng)該理解，當(dāng)用于本文時(shí)，探針-結(jié)合位點(diǎn)的補(bǔ)體清楚地包含在術(shù)語(yǔ)探針-結(jié)合位點(diǎn)的指定意思之內(nèi)。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸"可以互換地應(yīng)用，并且是指核苷酸單體的單鏈的和雙鏈的聚合物，其包括但不限于，通過(guò)核苷酸間磷酸二酯鍵，或核苷酸間類(lèi)似物，以及締合的抗衡離子如tf、NH4+、三烷基銨、Mg2+、Na+等連接的2，-脫氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。多核苷酸可以完全由脫氧核糖核苷酸、完整核糖核苷酸、或它們的嵌合的混合物組成，并且可以包括核苷酸類(lèi)似物。核苷酸單體單位可以包括本文所述的任何核苷酸，其包括，但不限于，核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物。多核苷酸在大小上典型地從幾個(gè)單體單位，例如5-40個(gè)，當(dāng)它們有時(shí)在本領(lǐng)域中叫作寡核苷酸時(shí)，到數(shù)千個(gè)單體核苷酸單位的范圍。除非另外指明，當(dāng)表示多核苷酸序列時(shí)，應(yīng)該理解，所述核苷酸是在從左到右的5'到3'順序，并且"A"表示脫氧腺苷，"C"表示脫氧胞嘧啶,"G"表示脫氧鳥(niǎo)苷，"T"表示胸苷，并且"ir表示脫氧尿苷，除非另外指明。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"猝滅劑"是指吸收至少一些熒光發(fā)射的強(qiáng)度的部分。猝滅劑可以分類(lèi)成熒光猝滅劑和黑暗猝滅劑(darkquenchers)(有時(shí)還叫作非熒光猝滅劑)。熒光猝滅劑是一種部分，典型地是熒光團(tuán)，其可以吸收從在第一波長(zhǎng)的熒光源，例如，但不限于，與核酸的雙鏈片段締合的核酸染料，發(fā)射的熒光信號(hào)，并且在吸收足夠的熒光能量后，所述熒光猝滅劑可以發(fā)射在第二波長(zhǎng)的熒光，其是所述猝滅劑特有的，一種叫作"熒光共振能量轉(zhuǎn)移"或FRET的方法。例如但不作為限制，與TAMRA熒光猝滅劑締合的FAM熒光團(tuán)可以在492nm，F(xiàn)AM的激發(fā)峰，發(fā)光，并且在580nm，TAMRA的發(fā)射峰，發(fā)射熒光。適當(dāng)?shù)嘏c熒光源配對(duì)的黑暗猝滅劑吸收來(lái)自所述光源的熒光能量，但是本身不發(fā)熒光。相反，黑暗猝滅劑消耗所吸收的能量，典型地作為熱量。在某些實(shí)施方案中，黑暗猝滅劑包括發(fā)光團(tuán)，其作用為從熒光源如與本發(fā)明的酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料的能量轉(zhuǎn)移受體，但是其本身不發(fā)射可檢測(cè)的熒光信號(hào)。黑暗或非熒光猝滅劑的非限制性實(shí)例包括DABCYL(4-(4'-二甲基氨基苯基偶氮)磺酸);黑洞猝滅劑系列猝滅劑，例如但不限于，BHQ-l,BHQ-2,禾口BHQ-3;IowaBlack;QSY系列猝滅齊iJ,例如但不限于，QSY-7;完全猝滅劑；遮蔽非熒光猝滅劑；納米晶體，例如但不限于，量子點(diǎn)；金屬如金納米顆粒；等等。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"反應(yīng)容器"通常是指任何容器、室、裝置或組件，按照本發(fā)明在其中可以發(fā)生反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)容器可以是微管，例如但不限于，0.2mL或0.5mL的反應(yīng)管，如MicroAmp⑧光學(xué)管(應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems))或微離心管，或其它在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用的此類(lèi)容器。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)容器包括多孔平板的孔，載玻片上的點(diǎn)，或微觀流體裝置的通道或室，包括但不限于應(yīng)用生物系統(tǒng)TaqMan低密度陣列(AppliedBiosystemsTaqManLowDensityArray)。例如但不作為限制，多個(gè)反應(yīng)容器可以置于同一支持物上。在一些實(shí)施方案中，在芯片上的實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a-chip)樣的裝置，例如可從Caliper和Fluidgm獲得，可以在公開(kāi)的方法中作為反應(yīng)容器。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，許多反應(yīng)容器是可以商購(gòu)的，或者可以設(shè)計(jì)用于本發(fā)明的情形中。術(shù)語(yǔ)"報(bào)道基團(tuán)"在本文以廣義應(yīng)用，并且是指任何可鑒定標(biāo)記、標(biāo)志或部分。術(shù)語(yǔ)"小RNA分子"在本文以廣義應(yīng)用，并且是指任何核酸序列，其包含不編碼的核糖核苷酸，并且典型地具有下列長(zhǎng)度150個(gè)核苷酸或更少，IOO個(gè)核苷酸或更少，75個(gè)核苷酸或更少，30個(gè)核苷酸或更少，在19和27個(gè)核苷酸之間，并且在21和23個(gè)核苷酸之間。小RNA分子可以是單鏈的，雙鏈的，或者可以包括至少一個(gè)單鏈區(qū)域和至少一個(gè)雙鏈區(qū)域，雙鏈區(qū)域包括但不限于莖-環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。小RNA分子的非限制性實(shí)例包括不翻譯的功能RNA,非編碼的RNA(ncRNA)，小的非信使RNA(snmRNA)，小干擾RNA(siRNA)，tRNA，小的非編碼RNA(tncRNA)，小的調(diào)節(jié)RNA(smRNA)，snoRNA，stRNA，snRNA，微小RNA(miRNA)，其包括但不限于miRNA前體如初始miRNA(pri-miRNA)和前體miRNA(pre-miRNA)，以及小干擾RNA(siRNA)(參見(jiàn)，例如，Eddy,NatureReviewsGenetics(自然遺傳學(xué)綜述)2:919-29(2001);Storz,Science(科學(xué))296:1260-63(2002);Buckingham,HorizonSymposia:UnderstandingtheRNAissance:l-3(2003))。在某些實(shí)施方案中，靶核酸包括小RNA分子。當(dāng)用于本說(shuō)明書(shū)時(shí)，包括核糖核苷酸和/或核糖核苷酸類(lèi)似物的本發(fā)明的這些酶抑制劑清楚地從術(shù)語(yǔ)小RNA分子的目的范圍排除。術(shù)語(yǔ)"熱穩(wěn)定"，當(dāng)參考酶應(yīng)用時(shí)，表示在升高的溫度，例如但不限于，在約55。C或更高，所述酶是功能性的或有活性的(即，可以進(jìn)行催化作用)。可以適用于本發(fā)明的熱穩(wěn)定的酶可從許多供應(yīng)商處商購(gòu)，其包括但不限于，應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)(FosterCity,CA),普洛麥格(Promega)(Madison,WI),Stratagene(LaJolla,CA)，和紐英倫生物實(shí)驗(yàn)室(NewEnglandBioLabs)(Beverly,MA)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，熱穩(wěn)定的酶可以從各種嗜熱性/或超嗜熱性生物體分離，所述嗜熱性和/或超嗜熱性生物體例如但不限于，某些真細(xì)菌和古細(xì)菌物種，其包括但不限于，感染這樣的生物體的某些病毒，并且這樣的熱穩(wěn)定酶可以適用于本發(fā)明公開(kāi)的復(fù)合物、方法和試劑盒。術(shù)語(yǔ)"通用堿基"或"通用核苷酸"通常在本文可互換使用，并且是指可以取代多核苷酸中的多于一種的天然存在的核苷酸的核苷酸類(lèi)似物，其包括但不限于，酶抑制劑。通用堿基典型地包含可以包含或可以不包含氮原子的芳香環(huán)部分，并且通常應(yīng)用芳香環(huán)堆積來(lái)穩(wěn)定雙鏈體。在某些實(shí)施方案中，通用堿基可以共價(jià)附著到戊糖糖的C-1'碳上，以形成通用核苷酸。在某些實(shí)施方案中，通用堿基沒(méi)有特異性與另一種核苷酸堿基氫鍵鍵合。在某些實(shí)施方案中，核苷酸堿基可以通過(guò)疏水堆積而與同一核酸鏈上的鄰近核苷酸堿基相互作用。通用核苷酸和通用堿基的非限制性實(shí)例包括脫氧-7-氮雜剛哚三磷酸酯(d7AITP),脫氧異喹諾酮三磷酸酯(dICSTP)，脫氧丙炔基異喹諾酮三磷酸酯(dPICSTP)，脫氧甲基-7-氮雜吲哚三磷酸酯(dM7AITP),脫氧ImPy三磷酸酯(dlmPyTP),脫氧PP三磷酸酯(dPPTP)，脫氧丙炔基-7-氮雜吲哚三磷酸酯(dP7AITP),3-甲基異喹諾酮(MICS),5-甲基異二價(jià)碳基(5MICS)，咪唑-4-羧酰胺(carboxamide)，3-硝基吡咯，5-硝基吲哚，次黃嘌呤，肌苷，脫氧肌苷，5-氟脫氧尿苷，4-硝基苯并咪唑，以及某些PNA-堿基，其包括但不限于某些假互補(bǔ)的PNA(pcPNA)堿基。除了其它地方之外，通用堿基的描述可以在Loakes,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)29:2437-47(2001);Berger等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)28:2911-14(2000);Loakes等，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)270:426-35(1997);Verma和Eckstein,Ann.Rev.Biochem.(生物化學(xué)綜述年刊)67:99-134(1998);公布的PCT申請(qǐng)?zhí)朥S02/33619,以及Patron和Pervin,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,433,134中找到。當(dāng)兩個(gè)不同的寡核苷酸與同一線(xiàn)性互補(bǔ)核酸的不同區(qū)域退火，并且一個(gè)寡核苷酸的3，-端朝向或者相對(duì)另一個(gè)寡核苷酸的5，-端時(shí)，前者可以叫作"上游"寡核苷酸，并且后者叫作"下游"寡核苷酸。某些示例性成分術(shù)語(yǔ)"裂解酶"是指這樣的任何多肽，即，當(dāng)與核酸裂解結(jié)構(gòu)(有時(shí)叫作重疊突出(flap)結(jié)構(gòu)或侵入性裂解反應(yīng)底物)組合并且在適當(dāng)?shù)臈l件下時(shí)，其可以將下游裂解探針的非退火突出部分裂解，以產(chǎn)生包含可連接的缺口的結(jié)構(gòu)。裂解酶的非限制性實(shí)例包括結(jié)構(gòu)-特異的核酸酶，例如但不限于，來(lái)自細(xì)菌和噬菌體的某些DNA聚合酶，包括其分離的5，核酸外切酶結(jié)構(gòu)域；Cleavase⑧酶(ThirdWaveTechnologies,Inc.(第三波技術(shù)公司)，Madison，WI);真核突出核酸內(nèi)切酶；和古細(xì)菌突出核酸內(nèi)切酶(參見(jiàn)，例如，Lyamichev等，Science(科學(xué))260:778-83(1993);L傳,J.Biol.Chem.(生物的化學(xué)雜志)270:22109-12(1995);Wu等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)24:2036-43(1996);Hosfidd等,J.Biol,Chem.(生物的化學(xué)雜志)273:27154-61(1998);Kaiser等,J.Biol.Chem.(生物的化學(xué)雜志)274:21387-94(1999);Allawi等，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)328:537-54(2003);以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，614,402和6,706，471)。核酸裂解結(jié)構(gòu)典型地包括與裂解探針對(duì)雜交的模板鏈(通常是靶核酸，單鏈擴(kuò)增子，或雙鏈擴(kuò)增子的分開(kāi)的鏈)，所述裂解探針對(duì)包括兩個(gè)重疊的探針，其與所述模板鏈雜交形成"突出"。第一或上游裂解探針包括與所述模板鏈的第一部分互補(bǔ)的序列，并且與第二或下游裂解探針的模板-互補(bǔ)序列的5'-端重疊，所述第二或下游裂解探針包括(1)與鄰近所述模板鏈的第一部分的模板鏈的第二部分互補(bǔ)的序列，和(2)含有至少一個(gè)可以或可以不與所述模板鏈互補(bǔ)的核苷酸的5'-區(qū)域，但是當(dāng)與所述模板鏈雜交時(shí)，所述區(qū)域被上游裂解探針的3'-端置換(參見(jiàn)，例如，Lyamichev等,Nat.Biotechnol.(自然生物技術(shù))17:292-96(1999),特別是圖l;Neville等，BioTechniques(生物技術(shù))32:S34-43(2002),特別是圖2A;Allawi等，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)328:537-54(2003),特別是圖2;以及Brow等,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，706，471，例如在圖32和65)。將本發(fā)明的某些裂解酶抑制劑設(shè)計(jì)成在第一溫度采取類(lèi)似于或模擬核酸裂解結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。某些公開(kāi)的裂解酶抑制劑可以在第一溫度形成核酸裂解結(jié)構(gòu)，但是至少一種寡核苷酸包括至少一種核苷酸類(lèi)似物和/或至少一種不能被所述裂解酶裂解或被所述裂解酶緩慢裂解的核苷酸間連接("不可裂解的核苷酸間連接")。不可裂解的核苷酸間連接的非限制性實(shí)例包括硫代磷酸酯，其包括但不限于二硫代磷酸酯；甲基磷酸酯；氨基磷酸酯；和硼代磷酸酯(boranophosphates)。"連接酶"是一種這樣的多肽，即，在適當(dāng)條件下，其催化在相鄰雜交的探針的3'-OH和5'-磷酸之間形成磷酸二酯鍵，所述雜交的探針包括但不限于，連接探針組的第一和第二連接探針，或者第一可裂解探針和已經(jīng)被裂解酶裂解的第二裂解探針的雜交的片段。溫度敏感性連接酶，包括但不限于，噬菌體T4連接酶和大腸桿菌連接酶。熱穩(wěn)定性連接酶的非限制性實(shí)例包括4A連接酶，7^連接酶，W連接酶，M/Z2連接酶，7狄連接酶，rAHB8連接酶，7^連接酶，棲熱菌屬(772mww)物種AK16D連接酶，^e連接酶，Z/g7x連接酶，Aae連接酶，7w連接酶，和戶(hù)/w連接酶(參見(jiàn)，例如，Housby等.，Nuc.AcidsRes.(核酸研究)28:el0，2000;Tong等，Nud.AcidsRes.(核酸研究)28:1447-54,2000;Nakatani等，Eur.J.Biochem.(歐洲生物化學(xué)雜志)269:650-56,2002;禾口Sriskanda等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)11:2221-28，2000)。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以從嗜溫性、嗜熱性或超嗜熱性生物體獲得許多嗜溫的、熱穩(wěn)定的和/或超嗜熱的連接酶，包括DNA連接酶和RNA連接酶，所述嗜溫的、嗜熱的或超嗜熱的生物體例如，某些真細(xì)菌和古細(xì)菌物種，并且包括感染這樣的嗜溫性、嗜熱性或超嗜熱性生物體的某些病毒；并且這樣的連接酶可以適用于本發(fā)明公開(kāi)的復(fù)合物、方法和試劑盒。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"核酸染料"是指這樣的熒光分子，即，其對(duì)雙鏈多核苷酸特異，并且當(dāng)與雙鏈多核苷酸締合時(shí)，其至少表現(xiàn)出比與單鏈多核苷酸締合基本上更高的熒光增強(qiáng)。典型的核酸染料分子通過(guò)嵌入到雙鏈片段的堿基對(duì)之間，通過(guò)與雙鏈片段的大溝或小溝結(jié)合，或者二者，而與多核苷酸的雙鏈片段締合。核酸染料的非限制性實(shí)例包括溴化乙錠，DAPI，Hoechst衍生物，其包括但不限于Hoechst33258和Hoechst33342，嵌入劑，其包括鑭系元素螯合物(例如但不限于，攜帶兩個(gè)熒光四配位基的P-二酮-Eu3+螯合物(NDI(BHHCT-Eu3+)2)，參見(jiàn)，例如，Nojima等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)增刊No.1,105-06(2001))，溴化乙錠，和某些不對(duì)稱(chēng)的花青染料，如SYBRGreen,PicoGreen,禾口BOXTO。某些公開(kāi)的酶抑制劑的核酸序列包括適體。適體以高特異性、構(gòu)象-依賴(lài)性方式，典型地以非常高的親和力，而結(jié)合靶分子，盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，如果需要，可以選擇具有更低結(jié)合親和力的適體。已經(jīng)表明適體基于非常小的結(jié)構(gòu)差別如存在或不存在甲基或羥基基團(tuán)而區(qū)分靶，并且某些適體可以區(qū)分D-和L-對(duì)映體。已經(jīng)獲得結(jié)合小分子耙的適體，所述小分子靶包括藥物、金屬離子、和有機(jī)染料、肽、生物素和蛋白質(zhì)，所述適體包括但不限于鏈霉抗生物素蛋白，VEGF，病毒蛋白和各種酶類(lèi)，其包括但不限于DNA-依賴(lài)性DNA聚合酶，RNA-依賴(lài)性DNA聚合酶.RNA-依賴(lài)性RNA聚合酶、解旋酶和蛋白酶(參見(jiàn)，例如，Lin和Jayasena，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)271:100-11(1997);Thomas等，J,Biol.Chem.(生物的化學(xué)雜志)272:27980-86(1997);Kulbachinskiy等，Eur.J.Biochem.(歐洲生物化學(xué)雜志)271:4921-31(2004);Hannoush等，Chembiochem.(化學(xué)生物化學(xué))5:527-33(2004);Bellecave等，Oligonucleotides(寡核苷酸)13:455-63(2003);和Nishikawa等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)31:1935-43(2003))。已經(jīng)表明在生物素?；?、熒光素標(biāo)記后，并且當(dāng)附著到玻璃表面和微球體上時(shí)，適體保留功能活性。適體，包括speigelmers，通過(guò)體外選擇方法鑒定，例如但不限于已知為通過(guò)指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)的方法進(jìn)行鑒定。在所述SELEX方法中，非常大的組合寡核苷酸文庫(kù)，例如1014到1015個(gè)個(gè)體序列，通常如60-100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度那樣大，常規(guī)通過(guò)體外選擇和擴(kuò)增的重復(fù)方法而進(jìn)行篩選。大部分靶在8-15個(gè)循環(huán)內(nèi)親和富集，并且所述方法已經(jīng)自動(dòng)化允許更快的適體分離。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解，適體可以按照常規(guī)方法獲得，并且無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。除了其它地方之外，適體以及它們的選擇的描述可以在L.Gold,J,Biol.Chem.(生物的化學(xué)雜志),270(23):13581-84(1995);L.Gold等，Ann.Rev.Biochem.(生物化學(xué)綜述年刊)64:763-97(1995);Wilson和Szostak,Ann.Rev.Biochem.(生物化學(xué)綜述年刊)68:611-47(1999);Cox等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)30:el08(2002);Hermann和Patel,Science(科學(xué))287:820-25(2000);Vuyisich和Beal，Chem.&Biol.(化學(xué)和生物)9:907-13(2002);S.Jayasena,Clin.Chem.(臨床化學(xué))，45:1628-50(1999);Cox和Ellington，Bioorg,Med.Chem.(生物有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué))9:2525-31(2001);Eulberg等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)33:e5(2005);以及Jayasena和Gold,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，183,967中找到。術(shù)語(yǔ)"DNA聚合酶"在本文中以廣義應(yīng)用，并且是指可以以模板-依賴(lài)性方式通過(guò)加入脫氧核糖核苷酸和/或某些核苷酸類(lèi)似物而催化雜交的引物的5'-3'延伸的任何多肽。例如但不限于，在引物延伸反應(yīng)過(guò)程中，向與核酸模板退火的引物的3'-端順序添加脫氧核糖核苷酸。DNA聚合酶的非限制性實(shí)例包括RNA-依賴(lài)性DNA聚合酶，其包括但不限于反轉(zhuǎn)錄酶，以及DNA-依賴(lài)性DNA聚合酶。應(yīng)該理解，某些DNA聚合酶(例如但不限于某些A型真細(xì)菌DNA聚合酶和r^DNA聚合酶)還可以包括結(jié)構(gòu)-特異性核酸酶活性，并且當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)包括侵入性裂解反應(yīng)，例如但不限于，F(xiàn)EN-LCR或PCR-FEN(參見(jiàn)，例如，Bi等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,511,810;和Neville等，BioTechniques(生物技術(shù))32:S34-43(2002))時(shí)，其中所述裂解酶包括DNA聚合酶，在侵入性裂解的情形中，這樣的聚合酶在本文中叫作裂解酶，并且對(duì)應(yīng)的酶活性包括結(jié)構(gòu)-特異性的寡核苷酸裂解。在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶提供多聚化活性和結(jié)構(gòu)-特異性裂解活性。術(shù)語(yǔ)"RNA聚合酶"是指DNA-依賴(lài)性RNA聚合酶或RNA-依賴(lài)性聚合酶(有時(shí)叫作RNA復(fù)制酶)，并且包括可以以模板-依賴(lài)性方式催化核糖核苷酸的5'-3'添加的任何多肽。在某些實(shí)施方案中，RNA聚合酶與啟動(dòng)子序列結(jié)合，并且催化轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶的非限制性實(shí)例包括來(lái)自噬菌體T3，T7，SP6,f2,MS2,和Qp的RNA聚合酶。術(shù)語(yǔ)"引物"是指多核苷酸，通常是包含典型地約12到約35個(gè)核苷酸長(zhǎng)的"靶"結(jié)合部分的寡核苷酸，其被設(shè)計(jì)成在適當(dāng)?shù)膰?yán)格條件下，選擇性地雜交靶核酸旁側(cè)序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)應(yīng)的引物-結(jié)合位點(diǎn)；并且作為從模板的3，-端合成與相對(duì)應(yīng)的多核苷酸模板互補(bǔ)的核苷酸序列的起始點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)"正向"和"反向"，當(dāng)參考引物對(duì)的引物應(yīng)用時(shí)，指示所述引物在多核苷酸序列上的相對(duì)方向。出于舉例說(shuō)明的目的，而不是作為限制，考慮水平從左到右方向繪制的單鏈多核苷酸，其5，-端在左側(cè)。所述"反向"引物設(shè)計(jì)成與位于或接近這一以5'到3'方向的示例性多核苷酸的"3'-端"的下游引物-結(jié)合位點(diǎn)退火，從右到左。相對(duì)應(yīng)的"正向"引物設(shè)計(jì)成與位于或接近以5'到3，"正向"方向的多核苷酸的"5，-端"的上游引物-結(jié)合位點(diǎn)的補(bǔ)體退火，從左到右。因此，所述反向引物包括與多核苷酸的反向或下游引物-結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，并且所述正向引物包括與正向或上游引物-結(jié)合位點(diǎn)相同或基本上相同的序列。應(yīng)該理解，在本段中所用的術(shù)語(yǔ)"3，-端"和"5'-端"只是舉例說(shuō)明性的，并不必按字面意思是指多核苷酸的每一端。相反，唯一的限制是這一示例性引物對(duì)的反向引物與位于正向引物-結(jié)合位點(diǎn)的下游的反向引物-結(jié)合位點(diǎn)退火，其包括與相對(duì)應(yīng)的正向引物的"靶"結(jié)合部分相同的序列或基本上相同的序列。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，這些術(shù)語(yǔ)并不意欲是限制，而是在給出的實(shí)施方案中提供舉例說(shuō)明的方向。本發(fā)明的"引物對(duì)"包括正向引物和相對(duì)應(yīng)的反向引物。所述正向引物包括第一靶-特異性部分，其包括與第一或上游靶旁側(cè)序列的核苷酸序列相同或基本上相同的序列，并且其被設(shè)計(jì)成與特別存在于反向擴(kuò)增產(chǎn)物中的上游耙旁側(cè)序列的補(bǔ)體選擇性地雜交。引物對(duì)的反向引物包括第二靶-特異性部分，其包括與特別存在于正向擴(kuò)增產(chǎn)物中的第二或下游靶區(qū)域旁側(cè)序列互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的序列，并且所述序列設(shè)計(jì)成與特別存在于正向擴(kuò)增產(chǎn)物中的第二或下游靶區(qū)域旁側(cè)序列選擇性地雜交。在某些實(shí)施方案中，正向引物、反向引物、或引物對(duì)的正向引物和反向引物還包括報(bào)道探針結(jié)合位點(diǎn)，通用引物-結(jié)合位點(diǎn)，和/或報(bào)道基團(tuán)，例如但不限于熒光報(bào)道基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，測(cè)序引物包括熒光報(bào)道基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，引物對(duì)的正向引物和相對(duì)應(yīng)的反向引物具有不同的解鏈溫度，以允許進(jìn)行基于溫度的不對(duì)稱(chēng)PCR。按照本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以使用通用引物或引物組。在某些實(shí)施方案中，通用引物或通用引物組雜交并且可以用來(lái)擴(kuò)增兩種或多種不同的靶核酸種類(lèi)和/或兩種或多種不同種類(lèi)的需要的擴(kuò)增子。術(shù)語(yǔ)"探針"是指這樣的多核苷酸，即，其包括設(shè)計(jì)成以序列-特異性方式與在特定的核酸序列上，例如但不限于靶核酸或擴(kuò)增產(chǎn)物的互補(bǔ)探針-結(jié)合位點(diǎn)雜交的部分。在某些實(shí)施方案中，將連接探針組的相應(yīng)的探針連接在一起形成連接的探針。在一些實(shí)施方案中，裂解探針組中的相應(yīng)的探針與模板鏈退火，形成核酸裂解結(jié)構(gòu)，其在適當(dāng)?shù)臈l件下可以被適當(dāng)?shù)牧呀饷噶呀?，以形成包括模板鏈、上游裂解探針和第二裂解探針的雜交的片段的雜交結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，所退火的上游裂解探針和下游裂解探針的雜交的片段連接在一起，形成連接的探針。在某些實(shí)施方案中，探針包括報(bào)道基團(tuán)，例如但不限于，報(bào)道探針。在一些實(shí)施方案中，探針包括引物-結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的探針和引物的序列4寺異性部分長(zhǎng)度足夠長(zhǎng)，以允許與靶核酸和需要的擴(kuò)增子中的互補(bǔ)序列特異性退火。除了其它地方之外，引物和探針設(shè)計(jì)的詳細(xì)描述可以在Dieffenbach和Dveksler，PCRPrimer,ALaboratoryManual(PCR弓I物，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，ColdSpringHarborPress(冷泉港出版社)(1995;以下為"PCRPrimer(PCR引物)");R.Rapley,TheNucleicAcidProtocolsHandbook(核酸方法手冊(cè))(2000),Humana出版社，Totowa,NewJersey(以下為"Rapley");Schena;和Kwok等，Nucl.AcidRes.(核酸研究)18:999-1005(19卯)中找到。引物和探針設(shè)計(jì)軟件程序也是可以商購(gòu)獲得的，包括但不限于，PrimerExpress,AppliedBiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng))，F(xiàn)osterCity,CA;PrimerPremierandBeacon設(shè)計(jì)軟件，PREMIERBiosoftInternational(國(guó)際PREMIER生物軟件)，PaloAlto,CA;PrimerDesigner4,Sci-Ed軟件，Durham,NC;PrimerDetective(引物檢測(cè))，ClonTech,PaloAlto，CA;Lasergene，DNASTAR,公司，Madison，WI;Oligo軟件，NationalBiosciences,Inc.(國(guó)家生物科學(xué)公司)，Plymouth,MN;iOligo,Caesar軟件,Portsmouth,NH;禾Q在萬(wàn)維網(wǎng)reattimeprimerdatabase.ht,st或在medgen31.urgent.be/primerdatabase/index(還參見(jiàn)，Pattyn等，Nucl.AcidRes.(核酸研究)31:122-23(2003))的RTPrimerDB。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解，所公開(kāi)的探針和引物的補(bǔ)體、靶核酸、需要的擴(kuò)增子或它們的組合，可以用于本發(fā)明的某些實(shí)施方案中。例如，但不限于，基因組DNA樣品可以包括靶核酸序列及其補(bǔ)體。因此，在某些實(shí)施方案中，當(dāng)將基因組樣品變性時(shí)，所述靶核酸及其補(bǔ)體都以單鏈序列存在于樣品中。在某些實(shí)施方案中，引物、連接探針對(duì)、裂解探針對(duì)或它們的組合可以設(shè)計(jì)成選擇性地雜交適當(dāng)?shù)男蛄校鲞m當(dāng)?shù)男蛄邪ǖ幌抻?，靶核酸、所述靶核酸的補(bǔ)體、擴(kuò)增子和/或擴(kuò)增子的補(bǔ)體。術(shù)語(yǔ)"報(bào)道探針"是指這樣的核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物的序列，艮卩，其與靶核酸和/或擴(kuò)增子退火，并且當(dāng)檢測(cè)，包括但不限于強(qiáng)度或發(fā)射的波長(zhǎng)的變化時(shí)，其在終點(diǎn)或?qū)崟r(shí)檢測(cè)技術(shù)例如但不限于Q-PCR技術(shù)中用于鑒定和/或定量相對(duì)應(yīng)的耙核酸。大部分報(bào)道探針可以基于它們作用模式分類(lèi)，例如但不限于核酸酶探針，其包括但不限于TaqMan⑧探針(參見(jiàn)，例如，Livak,GeneticAnalysis:BiomolecularEngineering(遺傳分析生物分子加工)14:143-149(1999);Yeung等，BioTechniques(生物技術(shù))36:266-75(2004》;延伸探針，如蝎子引物，LuxTm引物，Amplifl畫(huà)，等等；雜交探針，如分子beacons，Edipse探針，照亮(lightup)探針，單一標(biāo)記的報(bào)道探針對(duì)，雜交探針對(duì)，等；或它們的組合。在某些實(shí)施方案中，報(bào)道探針包括PNA,LNA,通用堿基或它們的組合，并且可以包括莖-環(huán)和無(wú)莖的報(bào)道探針構(gòu)型。某些報(bào)道探針是單一標(biāo)記的，而另一些報(bào)道探針是雙標(biāo)記的。在鄰近雜交的探針之間包括FRET的雙探針系統(tǒng)在術(shù)語(yǔ)報(bào)道探針的目的范圍內(nèi)(參見(jiàn)，例如，Zhang等,H印atology(肝臟病學(xué))36:723-28(2003))。"不對(duì)稱(chēng)的花青染料(unsymmetricalcyaninedye)"，在本領(lǐng)域中有時(shí)描述為不對(duì)稱(chēng)的花青染料(asymmetriccyaninedye)或不對(duì)稱(chēng)花青染料(asymmetricalcyaninedye)，是指具有通式R2N[CH-CH]nCH-NR2的染料分子，其中n是小的數(shù)字，并且R基團(tuán)典型地包括至少一個(gè)吲哚基團(tuán)和至少一個(gè)喹啉基團(tuán)或至少一個(gè)吡啶基團(tuán)。不對(duì)稱(chēng)花青染料的非限制性實(shí)例包括[2-[AK3-二甲基氨基丙基)-iV-丙基氨基]-4-[2,3-二氫-3-甲基-(苯并-l,3-噻唑-2-基)-亞甲基]-1-苯基-喹啉鑰](SYBRGreen),[2-[7V-雙-(3-二甲基氨基丙基)-氨基)-氨基]-4-[2,3-二氫-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亞甲基]-1-苯基-喹啉鎗](PicoGreen),4-[(3-甲基-6-(苯并噻唑-2-基)-2,3-二氫-(苯并-l,3-噻唑)-2-亞甲基)]-l-甲基吡啶鑰碘化物(BEBO)，BOXTO,禾卩BETO。除了其它地方之外，不對(duì)稱(chēng)花青染料的描述可以在Karlsson等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)31:6227-34(2003);Zipper等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)32:el03(2004);Bengtsson等,Nud.AcidsRes.(核酸研究)31:e45(2003);和Goransson等，Asymettriccyaninedyes(不對(duì)稱(chēng)的花青染料)，DNATechnology(DNA技術(shù))2005,Chalmers技術(shù)大學(xué)(2005;可獲自萬(wàn)維網(wǎng):molbiotech.Chalmers.se/research/mk/Asymmetric%cyanine%<iyes.doc)+找到。術(shù)語(yǔ)"靶核酸"或"靶"是指使用本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒特異性擴(kuò)增和/或檢測(cè)的核酸序列(用于次級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物相反，其是假的副反應(yīng)的結(jié)果，典型地由于錯(cuò)誤引發(fā)導(dǎo)致)。在某些實(shí)施方案中，耙核酸作為引物延伸反應(yīng)中的模板。在一些實(shí)施方案中，靶核酸作為連接模板。在一些實(shí)施方案中，靶核酸作為核酸裂解結(jié)構(gòu)中的模板鏈。在某些實(shí)施方案中，所述靶核酸包括DNA，并且存在于基因組DNA(gDNA)或線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)中。在某些實(shí)施方案中，所述靶核酸包括RNA，例如但不限于，核糖體RNA(rRNA),信使RNA(mRNA)，轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)，或RNA分子如miRNA前體，其包括但不限于，primiRNA,pre-miRNA，或pri-miRNA和pre-miRNA。在一些實(shí)施方案中，所述靶核酸包括小RNA分子，其包括但不限于，miRNA,siRNA,stRNA,snoRNA,或其它ncRNA。所述靶核酸不必構(gòu)成完整的核酸分子。例如但不作為限制，大的核酸，例如gDNA片段，可以包括多樣的或不同的靶核酸。典型地，靶核酸具有至少一個(gè)確定的末端。在許多核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，所述靶具有兩個(gè)確定的末端。在某些實(shí)施方案中，靶核酸位于兩個(gè)旁側(cè)的序列，第一靶旁側(cè)序列和第二靶旁側(cè)序列之間，所述旁側(cè)的序列位于所述靶核酸的任一端，但不必緊鄰所述靶核酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸如gDNA片段包括多個(gè)或不同的靶核酸。在一些實(shí)施方案中，靶核酸緊接或鄰近一個(gè)或多個(gè)不同的耙核酸。在一些實(shí)施方案中，給定的靶核酸可以在其5'-端與一個(gè)靶核酸重疊，在其3，-端與另一個(gè)靶核酸重疊，或者兩者。在其它實(shí)施方案中，例如但不限于當(dāng)所述靶包括小的RNA分子時(shí)，所述靶可以不包括旁側(cè)區(qū)域，并且引物設(shè)計(jì)成與所述小RNA靶的一部分，典型地是所述靶核酸的一個(gè)末端退火(參見(jiàn)，例如，Chen等，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)10/947，460)。某些示例性組成技術(shù)按照本發(fā)明，靶核酸可以從任何活的或曾經(jīng)存活的生物體獲得，所述生物體包括原核生物、古細(xì)菌或真核生物，例如但不限于昆蟲(chóng)，其包括但不限于果蠅(Z>o^/7a);蟲(chóng)，其包括但不限于秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)(C.e/egmw);植物，其包括但不限于擬南芥"raZ)Wo戸&);以及動(dòng)物，其包括但不限于人、小鼠、家畜或非人靈長(zhǎng)類(lèi)；并且包括原核細(xì)胞以及從真核生物獲得的細(xì)胞、組織和器官，其例如但不限于臨床活組織切片材料、口腔拭子、培養(yǎng)的細(xì)胞和血細(xì)胞。病毒核酸也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所述靶核酸可以以雙鏈或單鏈形式存在。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解，gDNA不但包括全長(zhǎng)物質(zhì)，而且包括通過(guò)許多方法例如但不限于酶消化、超聲、剪切力等而產(chǎn)生的片段，并且所有這樣的物質(zhì)，不管是全長(zhǎng)的還是片段的，都代表可以作為本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)的模板的gDNA的形式。靶核酸可以是合成的或天然存在的。在適當(dāng)?shù)那樾沃校詡?cè)序列的特定的靶核酸可以使用本領(lǐng)域公知的寡核苷酸合成方法而合成。除了其它地方之外，這樣的技術(shù)的詳細(xì)描述可以在Beaucage;和Blackburn與Gait中找到。用于合成靶核酸以及其它寡核苷酸，包括但不限于某些酶抑制劑、探針和引物的自動(dòng)化DNA合成儀可以從許多來(lái)源商購(gòu)獲得，例如，包括應(yīng)用生物系統(tǒng)DNA合成儀381A，391,392和394型(AppliedBiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng))，F(xiàn)osterCity，CA)。靶核酸，在適當(dāng)?shù)那樾沃?，其包括旁?cè)區(qū)域，以及其它寡核苷酸還可以使用本領(lǐng)域公知的體內(nèi)方法和/或體外方法而生物合成產(chǎn)生。除了其它地方以外，這樣的技術(shù)的描述可以在Sambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，冷泉港出版社(1989)(以下為"Sambrook等，，)；和Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)方法)，JohnWiley和Sons，公司，包括2005年9月26日的補(bǔ)充(以下為"Ausubd等")中找到。用于本發(fā)明的方法中的靶核酸，包括但不限于，gDNA可以使用本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)臉悠分苽浼夹g(shù)而從生物材料獲得。商購(gòu)的核酸提取儀器和系統(tǒng)特別包括ABIPRISM6100核酸PrepStation和ABIPRISM6700核酸自動(dòng)工作站(ABIPRISM6700NucleicAddAutomatedWorkStation)。核酸樣品制備試劑和試劑盒也可以商購(gòu)，包括但不限于，NucPrep化學(xué)，BloodPrep化學(xué)，ABIPRISMTransPrep系統(tǒng)，和PrepManTM超樣品制備試齊lJ(全部來(lái)自應(yīng)用AppliedBiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng)))和miRvanaRNA分離試劑盒(Ambion,Austin,TX)。純化的或部分純化的核酸，包括但不限于，gDNA和總RNA以及組織-特異性核酸制備物，可從許多商業(yè)來(lái)源商購(gòu)獲得，包括但不限于，Coriell細(xì)胞儲(chǔ)藏處，Coridl醫(yī)學(xué)研究院(CoriellInstituteforMedicalResearch)，Camden,NJ;血清學(xué)公司(SerologicalsCorp.),Norcross,GA;Stratagene，LaJollaCA;Ambion,Austin,TX;以及美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(AmericanTypeCultureCollection(ATCC))，Manassas,VA。術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增(amplifying)"和"擴(kuò)增(amplification)"以廣義應(yīng)用，并且是指本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，在所述技術(shù)中再生產(chǎn)或復(fù)制靶核酸、擴(kuò)增子、至少靶核酸的部分、或至少擴(kuò)增子的部分(包括互補(bǔ)鏈的合成或連接探針的形成)，典型地以模板-依賴(lài)性方式進(jìn)行，包括廣泛范圍的線(xiàn)性地或指數(shù)性地?cái)U(kuò)增核酸序列的技術(shù)。一些擴(kuò)增技術(shù)等溫地進(jìn)行；一些擴(kuò)增技術(shù)使用溫度循環(huán)進(jìn)行；一些擴(kuò)增技術(shù)包括至少一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增步驟和至少一個(gè)包括熱循環(huán)的擴(kuò)增步驟。擴(kuò)增技術(shù)的一些非限制性實(shí)例包括引物延伸，其包括但不限于PCR,RT-PCR，異步PCR(asynchronousPCR(A-PCR))，不對(duì)稱(chēng)PCR，定量或Q-PCR;連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR),連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR)，其包括但不限于每一種的缺口填補(bǔ)和缺口寡核苷酸形式(參見(jiàn)，例如，Cao,DNAAmplification(DNA擴(kuò)增)中第1.3章CurrentTechniquesandApplications(現(xiàn)代技術(shù)和應(yīng)用)，Demidov和Broude，編，Horizon生物科學(xué)(2004;以下為"Demidov和Broude");Abravaya等，Nud.AcidsRes.(核酸研究)23:675-82(1995);Lizardi等,Nat.Genetics(自然遺傳學(xué))19:225-32(1998);和Segev,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,004,826);旋轉(zhuǎn)循環(huán)擴(kuò)增(RCA)，有時(shí)叫作滾環(huán)復(fù)制(RCR);鏈置換擴(kuò)增(SDA)和多置換擴(kuò)增(MDA);基于核酸鏈的擴(kuò)增(NASBA)，有時(shí)叫作轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)或自我-維持的復(fù)制(3SR);SPIAT，BRiboSPIAT，;^(參見(jiàn)，例如，Kurn,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,251,639和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)US2003/0017591Al);以及解旋酶-依賴(lài)性擴(kuò)增(HDA;參見(jiàn)，例如，Vincent等，EMBO報(bào)告5:795-800(2004))，并且包括但不限于多鏈體形式和/或它們的組合，例如但不限于，OLA/PCR,PCR/LDR,PCR/LCR，這還叫作組合的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(CCR)某些擴(kuò)增技術(shù)的描述可以特別在下列各項(xiàng)中找到MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Sambrook和Russell,編，ColdSpringHarborPress,第3版.(2001;以下為"Sambrook和Russell，，)；Sambrook等；Ausubel等；PCRPrimer(PCR引物);McPh固n;Rapley;Lizardi等，NatGenetics(自然遺傳學(xué))19:225-32(1998);Wiedmann等，S51-64,在PCRMethodsandApplications(PCR方法和應(yīng)用)中，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1994);Cao,TrendsinBiotechnol(生物技術(shù)的趨勢(shì))22:38-44(2004);以及Wenz和Schroth,美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)US2003/0190646A1。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增技術(shù)包括至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，例如但不限于，下列步驟將雙鏈核酸變性，以分離組成鏈；將引物雜交到耙旁側(cè)序列或擴(kuò)增子的引物-結(jié)合位點(diǎn)上(或其補(bǔ)體，適當(dāng)?shù)?；并且使用DNA聚合酶以模板-依賴(lài)性方式合成核苷酸鏈。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增循環(huán)包括下列步驟將雙鏈核酸變性，以分離組成鏈；將第一連接探針和相對(duì)應(yīng)的第二連接探針雜交到(l)靶核酸或所述靶核酸的補(bǔ)體上，或(2)擴(kuò)增子上；并且將鄰近雜交的探針用連接酶連接，以形成連接的探針(代表性的擴(kuò)增子)。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增循環(huán)包括下列步驟將雙鏈核酸變性，以分離組成鏈；將上游裂解探針和相對(duì)應(yīng)的下游裂解探針雜交到(l)靶核酸或所述耙核酸的補(bǔ)體上，或(2)擴(kuò)增子上，以形成核酸裂解結(jié)構(gòu)；將所述裂解結(jié)構(gòu)裂解，以釋放突出，并且形成包括鄰近下游裂解探針的雜交片段而退火的上游裂解探針的雜交結(jié)構(gòu)；并且任選地將鄰近雜交的探針用連接酶連接，以形成連接的探針。所述循環(huán)可以重復(fù)或可以不重復(fù)。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增循環(huán)包括多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，例如但不限于20個(gè)循環(huán)，25個(gè)循環(huán),30個(gè)循環(huán),35個(gè)循環(huán),40個(gè)循環(huán),45個(gè)循環(huán)或多于45個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增包括使用儀器的熱循環(huán)，所述儀器例如但不限于，GeneAmpPCR系統(tǒng)9700,9600,2700,或2400熱循環(huán)儀(全部來(lái)自應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems))。在某些實(shí)施方案中，在擴(kuò)增反應(yīng)，例如但不限于不對(duì)稱(chēng)PCR或A-PCR中，產(chǎn)生單鏈擴(kuò)增子。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了這樣的裝置，其可以使用含有核酸染料的反應(yīng)組合物進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)和檢測(cè)，發(fā)射特定波長(zhǎng)的光束，讀取從與雙鏈核酸締合的核酸染料分子發(fā)射的熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并且在每個(gè)循環(huán)后顯示熒光的強(qiáng)度。包括熱循環(huán)儀、光束發(fā)射器和熒光信號(hào)檢測(cè)器的裝置，例如，已經(jīng)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，928,907;6,015,674;和6,174,670中描述，并且包括但不限于，ABIPrism7700序列檢測(cè)系統(tǒng)((AppliedBiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng)),Foster市，加利福尼亞)和ABIGeneAmp5700序列檢測(cè)系統(tǒng)((AppliedBiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng))，F(xiàn)oster市，加利福尼亞)。在某些實(shí)施方案中，這些功能可以通過(guò)分開(kāi)的裝置進(jìn)行。例如但不限于，如果應(yīng)用Q-P復(fù)制酶反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，所述反應(yīng)可以不在熱循環(huán)儀中發(fā)生，而是在這樣的儀器的反應(yīng)容器中發(fā)生，所述儀器可以包括在特定波長(zhǎng)發(fā)射的光束，熒光信號(hào)的檢測(cè)，以及在監(jiān)測(cè)儀或其它讀取裝置上計(jì)算并且顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量。在某些實(shí)施方案中，組合的熱循環(huán)和熒光檢測(cè)裝置可以用于精確定量樣品中的靶核酸序列。在某些實(shí)施方案中，熒光信號(hào)可以在一個(gè)或多個(gè)熱循環(huán)過(guò)程中和/或一個(gè)或多個(gè)熱循環(huán)后檢測(cè)并且顯示，因此允許當(dāng)反應(yīng)"實(shí)時(shí)"發(fā)生時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，人們可以使用擴(kuò)增產(chǎn)物的量和擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目來(lái)計(jì)算擴(kuò)增前在樣品中有多少靶核酸序列。在一些實(shí)施方案中，提供一種連接探針組用于靶核酸，并且所述靶進(jìn)行線(xiàn)性擴(kuò)增，例如但不限于LDR。在某些實(shí)施方案中，提供兩個(gè)連接探針組用于靶核酸，并且對(duì)所述靶進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，例如但不限于LCR。在一些實(shí)施方案中，第一裂解探針和相對(duì)應(yīng)的第二裂解探針與靶核酸退火，形成核酸裂解結(jié)構(gòu)，所述核酸裂解結(jié)構(gòu)包括形成裂解酶的適當(dāng)?shù)牡孜锏闹丿B或突出序列(flapsequence)。在某些實(shí)施方案中，在裂解后，所述第一裂解探針和第二裂解探針的雜交的片段可以連接以形成連接的探針。在一些實(shí)施方案中，連接的探針包括引物-結(jié)合位點(diǎn)，并且可以作為引物延伸反應(yīng)，例如但不限于PCR的模板。按照本發(fā)明的引物延伸是一種擴(kuò)增方法，其包括使用DNA聚合酶以5'到3，方向?qū)⑴c模板退火的引物延伸。按照某些實(shí)施方案，使用適當(dāng)?shù)木彌_劑、鹽、pH、溫度和適當(dāng)?shù)腘TPs(其可以，但不必包括核苷酸類(lèi)似物)，DNA聚合酶結(jié)合與從退火的引物的3，-端起始的模板鏈互補(bǔ)的核苷酸，以生成互補(bǔ)鏈。在某些實(shí)施方案中，用于引物延伸的DNA聚合酶缺少或基本上缺少5，-核酸外切酶活性，3，-核酸外切酶活性或二者。在一些實(shí)施方案中，引物延伸包括反轉(zhuǎn)錄，并且DNA聚合酶包括反轉(zhuǎn)錄酶或在特定條件下包括反轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA-依賴(lài)性DNA聚合酶，例如但不限于，嗜熱棲熱菌(T7zwmitfAwmcip/z//^1(Tif/7」DNA聚合酶，重組37/zDNA聚合酶pol)，GeneAmpAccuRTRNAPCR酶，或棲熱菌屬物種Z05(TZ05)DNA聚合酶(參見(jiàn)，例如，Smith等，在PCRPrimer(PCR引物)中，第211畫(huà)219頁(yè))。在某些實(shí)施方案中，引物延伸包括反轉(zhuǎn)錄酶和DNA-依賴(lài)性DNA聚合酶。在某些這樣的實(shí)施方案中，反應(yīng)組合物可以包括一種DNA聚合酶抑制劑或至少兩種不同的DNA聚合酶抑制劑，例如但不限于，可以與反轉(zhuǎn)錄酶形成復(fù)合物的第一DNA聚合酶和可以與DNA-依賴(lài)性DNA聚合酶形成復(fù)合物的第二DNA聚合酶抑制劑。特定的引物延伸反應(yīng)的描述可以特別在Sambrook等，Sambrook和Russell,Ausubel等，和Chen等，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)10/947,460中找到。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增包括兩步反應(yīng)，其包括但不限于，預(yù)擴(kuò)增步驟，其中發(fā)生有限數(shù)目的擴(kuò)增循環(huán)(例如，但不限于，2,3,4,或5個(gè)擴(kuò)增循環(huán))，然后通常將得到的擴(kuò)增子稀釋?zhuān)⑶覍⒉糠值南♂尩臄U(kuò)增子在后續(xù)擴(kuò)增步驟中進(jìn)行其它的擴(kuò)增循環(huán)(參見(jiàn)，例如，Marmaro和Gordes,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,605,451;以及Andersen和Ruff,美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)US2004/0175733)。在一些實(shí)施方案中，預(yù)擴(kuò)增步驟，后續(xù)擴(kuò)增步驟，或者兩者，包括DNA聚合酶抑制劑。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)包括多重?cái)U(kuò)增，其中使用多種不同的引物組、多種不同的連接探針組、多種不同的裂解探針組或它們的組合，同時(shí)擴(kuò)增多種不同的靶核酸和/或多種不同的擴(kuò)增產(chǎn)物種類(lèi)(參見(jiàn)，例如，Henegariu等，BioTechniques(生物技術(shù))23:504-11,1997;Belgrader等，DevelopmentofaMultiplexLigationDetectionReactionDNATypingAssay(多鏈體連接檢測(cè)反應(yīng)DNA分型測(cè)定的開(kāi)發(fā))，SixthInternationalSymposiumonHumanIdentification(第六次人類(lèi)鑒定國(guó)際研討會(huì))(1995);和Rapley，特別在第79章)。所公開(kāi)的方法的某些實(shí)施方案包括多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)和單重(single-plex)擴(kuò)增反應(yīng)，包括平行進(jìn)行的多個(gè)單重或更低重(lower-plexy)反應(yīng)(例如但不限于，雙重(two-plex)、三重(three-plex)、四重(four畫(huà)plex)、五重(five-plex)或六重(six-plex)反應(yīng))。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)包括不對(duì)稱(chēng)PCR。按照某些實(shí)施方案，不對(duì)稱(chēng)PCR包括這樣的反應(yīng)組合物，其包括(i)至少一種引物對(duì)，其中相對(duì)于所述引物對(duì)的相對(duì)應(yīng)的引物，存在過(guò)量的一種引物，例如但不限于，5倍、10倍或20倍過(guò)量；(ii)只包含正向引物或只包含反向引物的至少一種引物對(duì)；(iii)至少一種引物對(duì)，在給定的擴(kuò)增條件下，其包括導(dǎo)致一條鏈擴(kuò)增的引物和失去能力的相對(duì)應(yīng)的引物；或(iv)滿(mǎn)足上述(i)和(iii)的描述的至少一種引物對(duì)。因此，當(dāng)擴(kuò)增耙核酸和/或擴(kuò)增子時(shí)，生成隨后的擴(kuò)增產(chǎn)物的過(guò)量的一條鏈(相對(duì)于其補(bǔ)體)。不對(duì)稱(chēng)的PCR的描述可以特別在McPherson,特別是第5章；和Rapley,特別是第64章中找到。在某些實(shí)施方案中，人們可以使用至少一種引物對(duì)，其中所述引物中的一種的Tm高于另一種引物的Tm，有時(shí)叫作A-PCR(參見(jiàn)，例如，Chen等，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)US2003/0207266A1)。在某些實(shí)施方案中，正向引物的Tm與相對(duì)應(yīng)的反向引物的Tm有至少4-15。C的差別。在某些實(shí)施方案中，正向引物的Tm與相對(duì)應(yīng)的反向引物的Tm有至少8-15t:的差別。在某些實(shí)施方案中，正向引物的Tm與相對(duì)應(yīng)的反向引物的Tm有至少10-15"C的差別。在某些實(shí)施方案中，正向引物的Tm與相對(duì)應(yīng)的反向引物的Tm有至少10-12'C的差別。在某些實(shí)施方案中，在至少一種引物對(duì)中，正向引物的Tm與相對(duì)應(yīng)的反向引物的Tm的差別在于至少約4'C，至少約8'C，至少約10。C，或至少約12。C。在A-PCR的某些實(shí)施方案中，除了引物對(duì)中的引物的Tm的差異之外，相對(duì)于引物對(duì)中的另一種引物，還存在過(guò)量的一種引物。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于引物對(duì)中的另一種引物，存在5倍到20倍過(guò)量的一種引物。在某些A-PCR的實(shí)施方案中，引物的濃度為至少50nM。按照某些A-PCR實(shí)施方案，人們可以在第一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中使用常規(guī)的PCR，以致兩個(gè)引物退火，并且雙鏈擴(kuò)增子或靶核酸的兩條鏈都得到擴(kuò)增。然而，在同一擴(kuò)增反應(yīng)的后續(xù)循環(huán)中通過(guò)升高溫度，可以使得具有更低Tm的引物失去能力，以致只有一條鏈得到擴(kuò)增。因此，其中具有更低Tm的引物失去能力的后續(xù)的A-PCR循環(huán)導(dǎo)致不對(duì)稱(chēng)的擴(kuò)增。所以，當(dāng)擴(kuò)增靶核酸或擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，生成后續(xù)擴(kuò)增產(chǎn)物的過(guò)量的一條鏈(相對(duì)于其補(bǔ)體)。按照某些A-PCR實(shí)施方案，可以通過(guò)改變第一階段的常規(guī)PCR循環(huán)過(guò)程中的循環(huán)數(shù)而控制擴(kuò)增的水平。在這樣的實(shí)施方案中，通過(guò)改變初始的常規(guī)循環(huán)的數(shù)目，人們可以改變?cè)诰哂懈蚑m的引物失去能力的更高的溫度進(jìn)行后續(xù)PCR循環(huán)的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的量。最優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)的特定的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。例如，已知PCR可以通過(guò)改變用于退火、聚合和變性的時(shí)間和溫度，以及改變反應(yīng)組合物中的緩沖劑、鹽、和其它試劑而最優(yōu)化。最優(yōu)化還可以受所用的探針和/或引物的設(shè)計(jì)的影響。例如，探針和/或引物的長(zhǎng)度，以及G-C:A-T比例可以改變退火的效率，因此改變擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增最優(yōu)化的描述可以特別在下列各項(xiàng)中找到JamesC.Wetmur,"NucleicAcidHybrids,FormationandStructure(核酸雜化體，形成和結(jié)構(gòu))，"在MolecularBiologyandBiotechnology(分子生物學(xué)和生物技術(shù))中，第605-8頁(yè)，(RobertA.Meyers編，1995);McPherson,特別是第4章；Rapley;以及Protocols&ApplicationsGuide(方法和應(yīng)用指南),rev.9/04,普洛麥格(Promega)。某些反應(yīng)組合物還包含dUTP和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG;例如，AmpErase,應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems))或尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG;紐英倫生物實(shí)驗(yàn)室(NewEnglandBioLabs),Beverly,MA)。例如，在擴(kuò)增反應(yīng)中應(yīng)用dUTP和UNG的討論可以在Kwok等，Nature(自然)，339:237-238，1989;McPherson;Longo等，Gene(基因)，93:125-128,1990;和Gelfand等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，418，149中找到。在某些方法實(shí)施方案中，擴(kuò)增包括解旋酶，其包括但不限于，大腸桿菌UvrD解旋酶，DnaB解旋酶，或噬菌體T7基因4蛋白；DNA聚合酶，其包括但不限于DNA聚合酶III或DNA聚合酶I的克列諾片段；解旋酶輔助蛋白,其包括但不限于，MutL蛋白；單鏈結(jié)合蛋白(SSB)，其包括但不限于，大腸桿菌SSB,T7基因2.5SSB，T4基因32蛋白，和/或RB49基因32蛋白；或它們的組合。在某些實(shí)施方案中，包含核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑設(shè)計(jì)成當(dāng)所述酶抑制劑和解旋酶在第一溫度彼此締合形成復(fù)合物時(shí)，抑制解旋酶的酶活性，但是在第二溫度不抑制，在第二溫度，所述酶抑制劑和解旋酶解聚。在某些實(shí)施方案中，解旋酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。在一些實(shí)施方案中，解旋酶抑制劑的核苷酸序列可以在第一溫度形成雙鏈片段，但是典型地不在第二溫度形成。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增包括連接酶-介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)，例如但不限于，LDR,LCR,FEN-LCR,連接介導(dǎo)的擴(kuò)增方法的缺口寡核苷酸和缺口-填補(bǔ)形式，連接酶-介導(dǎo)的擴(kuò)增的扣鎖形式，和與PCR和/或其它擴(kuò)增方法偶聯(lián)的連接方法，并且包括它們的多重形式(參見(jiàn)，例如，Demidov和Broude,特別是第1.3章；Lizardi等,Nat.Genetics(自然遺傳學(xué))19:225-32(1998);Bi等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,511，810;以及Wenz和Schroth,美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)US2003/10190646A1)。按照某些包括連接酶-介導(dǎo)的擴(kuò)增的方法，連接酶和包含核苷酸序列和猝滅劑的連接酶抑制劑在第一溫度締合，以形成連接酶-連接酶抑制劑復(fù)合物。當(dāng)與所述連接酶抑制劑締合時(shí)，連接酶的酶促活性被抑制，其減少在不存在連接酶抑制劑時(shí)可能發(fā)生的至少一些錯(cuò)誤連接，因此減少某些次級(jí)擴(kuò)增子，并且減少背景熒光。當(dāng)將包括連接酶-連接酶抑制劑復(fù)合物的反應(yīng)組合物加熱到第二溫度時(shí)，所述連接酶抑制劑與所述連接酶解聚，并且鄰近雜交的探針可以有效地連接。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)它們雜交到靶核酸或其補(bǔ)體上時(shí)，5，-端下游連接探針和相對(duì)應(yīng)的上游連接探針的3，-端不是緊密鄰近的，并且應(yīng)用缺口-填補(bǔ)步驟，以將上游探針的3'-端延長(zhǎng)到與下游探針的5'-端毗鄰。在其它實(shí)施方案中，在下游探針的5'-端和上游探針的3，-端之間存在缺口，以致"缺口寡核苷酸"可以在所述連接探針相對(duì)的末端之間的缺口中雜交。在某些這樣的實(shí)施方案中，5，-端下游探針可以與缺口寡核苷酸的3，-端連接，并且上游探針的3'-端可以與缺口寡核苷酸的5'-端連接。在某些實(shí)施方案中，連接酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。在一些實(shí)施方案中，連接酶抑制劑的核苷酸序列可以在第一溫度形成雙鏈片段，但是典型地不在第二溫度形成。按照某些缺口-填補(bǔ)LCR或缺口-填補(bǔ)LDR擴(kuò)增技術(shù)，可以在第一溫度形成包括DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑的復(fù)合物，抑制所述DNA聚合酶的活性。在某些實(shí)施方案中，連接酶和連接酶抑制劑在第一溫度形成復(fù)合物，以抑制錯(cuò)誤退火的連接探針的連接，所述的錯(cuò)誤退火有時(shí)叫作錯(cuò)誤連接。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，所公開(kāi)的酶抑制劑、復(fù)合物、方法和試劑盒可以用于各種不同的情形中，在所述情形中，進(jìn)行可以進(jìn)行引物和/或探針的錯(cuò)誤退火并且隨后形成不需要的次級(jí)擴(kuò)增子的酶-介導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng)?？梢允芤嬗谑褂冒鐒┑拿敢种苿┮灾辽贉p少背景熒光的任何酶-介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)在本發(fā)明的目的范圍內(nèi)。擴(kuò)增的或測(cè)序的靶核酸可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)檢測(cè)，其包括測(cè)量、定量和/或直接或間接地觀察可猝滅的發(fā)射，其包括但不限于，熒光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光等，例如但不限于，激光誘導(dǎo)的熒光和電化學(xué)發(fā)光。按照所公開(kāi)的方法的一些實(shí)施方案，檢測(cè)可以包括任何適當(dāng)?shù)膶?shí)時(shí)或終點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)。適當(dāng)?shù)臋z測(cè)技術(shù)的一些非限制性的實(shí)例包括解鏈曲線(xiàn)分析、Q-PCR或其它包括核酸染料，并且在一些實(shí)施方案中，包括至少一種報(bào)道探針的實(shí)時(shí)技術(shù)；以及電泳技術(shù)，其包括但不限于凝膠電泳。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，各種猝滅劑部分是可用的，其籠統(tǒng)地涵蓋寬范圍的可檢測(cè)的發(fā)射，并且通過(guò)將具有適當(dāng)?shù)奈兆V的猝滅劑與發(fā)射源配對(duì)，其可以減少來(lái)自所述源的發(fā)射中的至少一些。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括Q-PCR。術(shù)語(yǔ)"定量PCR"或"Q-PCR"，還叫作實(shí)時(shí)PCR，是指用于特異性地、非特異性地或二者定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的各種方法(參見(jiàn)，例如，Raeymakers,Mol.Biotechnol.(分子生物技術(shù))15:115-22(2000);Joyce,定量RT-PCR,在MethodsinMolBiol.(分子生物學(xué)方法)中，巻193,O，Connell,編，Humana出版社;Pierson等,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)31(14):e73(2003))。這樣的方法典型地分類(lèi)為基于動(dòng)力學(xué)的系統(tǒng)，其通常確定或比較擴(kuò)增因素，諸如確定閾值循環(huán)(Q)，或分類(lèi)為共擴(kuò)增方法，其通常比較從靶和標(biāo)準(zhǔn)模板同時(shí)擴(kuò)增而產(chǎn)生的產(chǎn)物的量。Q-PCR技術(shù)典型地包括報(bào)道探針，核酸染料，或二者。例如但不限于TaqMan⑧探針(應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)),i-探針，分子be羅s,Edipse探針,蝎子引物，Lux頂引物，F(xiàn)RET引物,溴化乙錠，以及不對(duì)稱(chēng)的花青染料，例如但不限于，SYBRGreenI(分子探針(MolecularProbes))，YO-PRO-1,Hoechst33258,BOXTO(TATAA生物中心(Biocenter)，Goteborg，瑞典)和PicoGreen⑧(分子探針)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在測(cè)序反應(yīng)之前或與之聯(lián)合進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)"測(cè)序"以廣義用于此，并且是指本領(lǐng)域已知的允許鑒定在至少部分多核苷酸，例如但不限于靶核酸或擴(kuò)增子中的至少一些連續(xù)的核苷酸的次序的任何技術(shù)。測(cè)序技術(shù)的一些非限制性的實(shí)例包括桑格雙脫氧終止子方法和Maxam和Gilbert的化學(xué)裂解方法，包括這些方法的變化；通過(guò)雜交測(cè)序；通過(guò)合成測(cè)序；以及限制性作圖。一些測(cè)序方法包括電泳，其包括毛細(xì)電泳和凝膠電泳；通過(guò)雜交測(cè)序包括微陣列雜交；質(zhì)譜；和單分子檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，測(cè)序包括直接測(cè)序，雙鏈體測(cè)序，循環(huán)測(cè)序，單堿基延伸測(cè)序(SBE)，固相測(cè)序，或它們的組合。在一些實(shí)施方案中，測(cè)序包括使用儀器檢測(cè)測(cè)序的產(chǎn)物，所述儀器例如，但不限于，ABIPRISM377DNA測(cè)序儀，ABIPRISM310,3100，3100-Avant,3730，或3730xl基因分析儀，ABIPRISM3700DNA分析儀(全部來(lái)自應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)),或質(zhì)譜儀。在一些實(shí)施方案中，測(cè)序包括在擴(kuò)增產(chǎn)物中結(jié)合dNTP，其包括dATP,dCTP，dGTP,dTTP,dUTP,dITP或它們的組合，并且包括dNTPs的雙脫氧核糖核苷酸類(lèi)似物。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員應(yīng)該理解，所用的測(cè)序方法典型地不是本發(fā)明方法的限制。相反，提供至少部分相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增子或靶核酸的至少一些連續(xù)的核苷酸的次序的任何測(cè)序技術(shù)可以典型地與本方法一起應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，在測(cè)序步驟之前，通過(guò)酶降解，其包括但不限于核酸外切酶I和蝦堿性磷酸酶消化，例如但不限于ExoSAP-IT⑧試劑(USB公司，Cleveland,OH)，而去除未結(jié)合的引物和/或dNTPs。在一些實(shí)施方案中，未結(jié)合的引物，dNTPs,和/或ddNTPs通過(guò)凝膠或柱純化、沉淀、過(guò)濾、珠子、磁力分離或基于雜交的選出而適當(dāng)?shù)厝コ?參見(jiàn)，例如，ABIPRISMDuplex384WellF/R序列捕獲試劑盒，應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)P/N4308082)。在某些實(shí)施方案中，將包含擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)組合物，或至少部分這樣的反應(yīng)組合物，未進(jìn)行之間的純化步驟而進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)(參見(jiàn)，例如，Baskin等，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)US2002/0137047Al)。測(cè)序技術(shù)的描述可以特別在下列各項(xiàng)中找到McPherson，特別是第5章;Sambrook禾口Russell;Ausubel等；Siuzdak,TheExpandingRoleofMassSpectrometryinBiotechnology(質(zhì)譜在生物技術(shù)中的擴(kuò)大作用)，MCC出版社,2003，特別是第7章；以及Rapley,特別是第VI章。在一些實(shí)施方案中，所公開(kāi)的方法和試劑盒包括微觀流體裝置，"在芯片上的實(shí)驗(yàn)室"，或micrototal分析系統(tǒng)(W「AS)。在一些實(shí)施方案中，使用微觀流體裝置進(jìn)行樣品制備。在一些實(shí)施方案中，使用微觀流體裝置進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，使用微觀流體裝置進(jìn)行測(cè)序或?qū)崟r(shí)PCR反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，使用微觀流體裝置獲得至少部分?jǐn)U增產(chǎn)物的核苷酸序列。示例性微觀流體裝置的描述可以特別在下列各項(xiàng)中找到公布的PCT申請(qǐng)?zhí)朩O/0185341和WO04/011666;Kartalov和Quake,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)32:2873-79，2004;以及Fiorini和Chiu,BioTechniques(生物技術(shù))38:429-46,2005。某些示例性實(shí)施方案本發(fā)明提供用于擴(kuò)增靶核酸并且用于減少背景熒光的組合物、方法和試劑盒，典型地在包含至少一種酶和至少一種酶抑制劑的反應(yīng)組合物中，所述酶抑制劑包括至少一種核苷酸序列和至少一種猝滅劑。所述酶抑制劑包含核苷酸序列和猝滅劑。設(shè)計(jì)這樣的酶抑制劑的核苷酸序列，以通過(guò)在第一溫度抑制酶的活性而減少不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物的形成，特別是由于在非靶序列的錯(cuò)誤引發(fā)事件，連接和/或裂解探針的錯(cuò)誤退火，以及引物二聚體的形成而導(dǎo)致的不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物的形成，而在第二溫度不抑制酶的活性。減少的次級(jí)擴(kuò)增子形成的水平減少反應(yīng)組合物中的非特異性熒光的至少一種成分。所公開(kāi)的酶抑制劑還設(shè)計(jì)成在適當(dāng)條件下自我猝滅。所公開(kāi)的抑制劑的猝滅劑部分設(shè)計(jì)成吸收在第一溫度范圍內(nèi)通過(guò)核酸染料分子與所述酶抑制劑的雙鏈片段的締合而產(chǎn)生的熒光信號(hào)中的至少一些，而不管所述酶抑制劑是在溶液中游離的還是與酶復(fù)合的。因此，所述酶抑制劑的猝滅劑減少這種背景熒光的次級(jí)來(lái)源中的至少一些，進(jìn)一步減少反應(yīng)組合物中的非特異性熒光。某些示例性酶抑制劑按照本發(fā)明，包含核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑設(shè)計(jì)成在所述酶抑制劑與所述酶在酶抑制劑-酶復(fù)合物中締合時(shí)，而抑制酶的至少一種酶活性。設(shè)計(jì)所述酶抑制劑的核苷酸序列，以致它們可以形成包括至少一個(gè)雙鏈片段的結(jié)構(gòu)，并且選擇所述猝滅劑以能夠吸收在與所述酶抑制劑的雙鏈片段締合時(shí)從核酸染料發(fā)射的熒光中的至少一些。在第一溫度，例如，但不限于，室溫(典型地約22°C-28°C)以及低于、處于或略高于需要的模板延伸溫度的溫度，可以形成所述酶-酶抑制劑復(fù)合物和/或保持締合。當(dāng)將包含酶-酶抑制劑復(fù)合物的反應(yīng)組合物加熱到第二溫度時(shí)，所述酶隨著所述復(fù)合物解聚而釋放。所公開(kāi)的RNA聚合酶抑制劑設(shè)計(jì)成在所述抑制劑和RNA聚合酶在復(fù)合物中締合時(shí)而抑制RNA聚合酶的聚合活性。所公開(kāi)的連接酶抑制劑設(shè)計(jì)成在所述連接酶抑制劑和所述連接酶在復(fù)合物中締合時(shí)，這包括錯(cuò)誤退火的連接探針的連接，而抑制在模板上兩個(gè)相鄰雜交的核苷酸鏈之間的磷酸二酯的形成。所公開(kāi)的解旋酶抑制劑設(shè)計(jì)成在所述解旋酶抑制劑和所述解旋酶在復(fù)合物中締合時(shí)，抑制所述解旋酶催化雙鏈核酸的解旋的能力。某些公開(kāi)的裂解酶抑制劑設(shè)計(jì)成在所述裂解酶抑制劑和所述裂解酶在復(fù)合物中締合時(shí)，而抑制所述裂解酶的5'-核酸酶活性。在某些實(shí)施方案中，連接酶抑制劑、RNA聚合酶抑制劑、解旋酶抑制劑、和/或裂解酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。本發(fā)明的酶抑制劑的抑制能力典型地不顯著依賴(lài)于所述抑制劑的精確序列。相反，所述酶抑制劑的整體結(jié)構(gòu)及其解鏈溫度是酶抑制劑是否將抑制相對(duì)應(yīng)的酶的目的酶活性的主要決定因素。在某些實(shí)施方案中，將酶抑制劑設(shè)計(jì)成在第一溫度采用模擬相對(duì)應(yīng)的酶的底物的構(gòu)象，允許所述酶與所述抑制劑締合形成復(fù)合物，在所述復(fù)合物中抑制所述酶的酶活性。在第二溫度，所述酶抑制劑的構(gòu)象可以改變，以致它不再模擬底物，并且將所述酶從所述復(fù)合物中釋放出來(lái)。因此，當(dāng)它們基本上是單鏈的和/或不與所述酶在復(fù)合物中時(shí)，所公開(kāi)的抑制劑典型地表現(xiàn)出顯著更少的抑制作用，如果有抑制作用的話(huà)。在一些實(shí)施方案中，酶抑制劑的核苷酸序列包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核苷酸類(lèi)似物、非核苷酸接頭或它們的組合。所公開(kāi)的連接酶抑制劑顯著地不干擾連接探針或裂解探針與靶核酸或需要的擴(kuò)增子，例如但不限于，連接的探針上的相對(duì)應(yīng)的序列的退火。所公開(kāi)的解旋酶抑制劑顯著地不干擾引物與相對(duì)應(yīng)的靶旁側(cè)序列或擴(kuò)增子的雜交。所公開(kāi)的裂解酶抑制劑顯著地不干擾裂解探針或連接探針與靶核酸或需要的擴(kuò)增子上的相對(duì)應(yīng)的序列的退火，或者引物與相對(duì)應(yīng)的靶旁側(cè)序列和/或擴(kuò)增子的雜交。將所公開(kāi)的DNA聚合酶抑制劑設(shè)計(jì)成在所述抑制劑與所述DNA聚合酶，并且任選地NTP和/或核苷酸類(lèi)似物，在第一溫度在DNA聚合酶抑制劑-DNA聚合酶復(fù)合物中締合時(shí)，而抑制DNA聚合酶的聚合活性，所述第一溫度例如但不限于，近似等于或低于引物的Tm的溫度。本發(fā)明的DNA聚合酶抑制劑的抑制能力通常不顯著地依賴(lài)所述抑制劑的精確的序列。相反，DNA聚合酶抑制劑的整體結(jié)構(gòu)及其解鏈溫度是DNA聚合酶抑制劑是否將抑制所述DNA聚合酶的酶活性即，聚合的主要決定因素。典型地，所公開(kāi)的DNA聚合酶抑制劑在它們包括雙鏈片段并且與所述DNA聚合酶，任選地NTP和/或核苷酸類(lèi)似物，在復(fù)合物中締合時(shí)，將干擾所述DNA聚合酶的聚合活性。然而，當(dāng)它們是單鏈的，并且與所述DNA聚合酶不在復(fù)合物中時(shí)，所公開(kāi)的DNA聚合酶抑制劑表現(xiàn)出顯著更少的抑制作用，如果有一些抑制作用的話(huà)。在某些實(shí)施方案中，選擇DNA聚合酶抑制劑的Tm近似等于或低于在所選的聚合或引物延伸反應(yīng)中所用的退火引物的引物延伸所用的溫度，但巧是總是這樣。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶抑制劑的解鏈溫度稍微高于引物延伸溫度，例如但不限于其中所述DNA聚合酶抑制劑以低濃度使用的反應(yīng)組合物。典型地，本發(fā)明的DNA聚合酶抑制劑在處于或低于第一溫度時(shí)包括至少一個(gè)雙鏈片段，但是在處于或高于第二溫度時(shí)，是單鏈的或基本上單鏈的。因此在第一溫度，在復(fù)合物中的DNA聚合酶的酶活性被抑制，而在第二溫度，所述DNA聚合酶是活性的，并且可以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。示例性的第一溫度包括22°C,23°C,24°C，25°C,26°C，27°C,28°C,29°C,30°C，約22。C到約40°C，約25。C到約35°C，以及約22。C到約28°C，并且清楚地包括在指定的第一溫度范圍內(nèi)的所有居間溫度。示例性的第二溫度包括42°C，43°C,44。C,45。C，46°C，47°C，48。C,49°C,50°C,51°C，52°C,53°C,54°C,55°C,56°C,57°C,58°C,59°C,60°C,61。C,62°C,63°C,64°C,65°C，66°C,67°C,68°C,69°C,70°C，7rC，72°C,73°C，約48。C到約73。C，約53。C到約67。C,約63。C到約67。C,以及約64。C到約66°C，并且清楚地包括在指定的第二溫度范圍內(nèi)的居間溫度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，對(duì)于給定的擴(kuò)增反應(yīng)的適當(dāng)?shù)牡谝缓偷诙囟葘⒅辽俨糠秩Q于所述酶、所述酶抑制劑的Tm、和/或所述引物禾卩/或探針的Tm，但是，使用本領(lǐng)域己知的和本發(fā)明告知的方法，可以常規(guī)確定適當(dāng)?shù)臏囟?，無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括單一寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，這樣的DNA聚合酶抑制劑包括第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域，并且任選地，第四區(qū)域；并且所述第一區(qū)域與所述第三區(qū)域互補(bǔ)。在適當(dāng)?shù)臈l件下，包括在第一溫度下，這樣的DNA聚合酶抑制劑的第一區(qū)域和第三區(qū)域可以退火，并且形成至少一個(gè)雙鏈片段，以致所述DNA聚合酶抑制劑采取莖-環(huán)或發(fā)夾構(gòu)象。在某些實(shí)施方案中，只有在第一區(qū)域中的部分子集核苷酸與在第三區(qū)域中的相對(duì)應(yīng)的部分子集核苷酸互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，所公開(kāi)的DNA聚合酶抑制劑包括可以影響或可以不影響所述DNA聚合酶抑制劑的Tm的核苷酸類(lèi)似物。一些包含一種寡核苷酸的示例性的DNA聚合酶抑制劑在圖1中示例性地描述。在圖1A中所示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括在整個(gè)圖1中用黑色條帶顯示的第一區(qū)域(l)，在整個(gè)圖1中用波浪線(xiàn)顯示的第二區(qū)域(2)，第三區(qū)域(3)，和任選地第四區(qū)域([4]，以中括號(hào)顯示，以表明在本實(shí)施方案中它是任選地)，其在整個(gè)圖1中以黑色陰影顯示。由于末端核苷酸包括雙脫氧胞嘧啶(以ddC顯示)，所以這種示例性抑制劑的3'-端是不可延伸的。所述第一區(qū)域(1)還包括猝滅劑(5)。所述示例性的抑制劑顯示第一區(qū)域(1)與第三區(qū)域(3)退火形成雙鏈片段，以致所述抑制劑是以莖-環(huán)構(gòu)象存在，其中第二區(qū)域(2)形成所述環(huán)，并且第四區(qū)域(4)作為5'單鏈突出端。在某些實(shí)施方案中，這樣的DNA聚合酶抑制劑的第四區(qū)域的單鏈突出端包括至少一些核糖核苷酸，特別是當(dāng)將所述抑制劑設(shè)計(jì)成與特定的反轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合時(shí)。在圖1B中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括第一區(qū)域(l)、第二區(qū)域(2)、和第三區(qū)域(3)，但是沒(méi)有第四區(qū)域。顯示所述第一區(qū)域(1)和第三區(qū)域(3)退火形成莖，并且第二區(qū)域(2)形成環(huán)結(jié)構(gòu)，并且還包括猝滅劑(5)。在圖1C中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括第一區(qū)域(l)，其包括第一猝滅劑(6)，顯示為Qh第二區(qū)域(2)，其包括第二猝滅劑(7)，顯示為Q2;和第三區(qū)域(3);以及任選地第四區(qū)域([4])。在圖1D中顯示的示例性的DNA聚合酶抑制劑包括第一區(qū)域(l)，第二區(qū)域(2)，第三區(qū)域(3)，以及任選地第四區(qū)域([4])，所述第四區(qū)域在5'-端包括猝滅劑(5)，顯示為Q。在特定的DNA聚合酶抑制劑實(shí)施方案中，所述核苷酸序列包括第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域、第四區(qū)域、第五區(qū)域和第六區(qū)域；其中所述第一區(qū)域與第三區(qū)域互補(bǔ)，并且所述第一區(qū)域和第三區(qū)域可以在第一溫度形成至少一個(gè)雙鏈片段；其中所述第四區(qū)域與第六區(qū)域互補(bǔ)，并且所述第四區(qū)域和第六區(qū)域可以在第一溫度形成至少一個(gè)雙鏈片段；其中在第六區(qū)域的3'-端和第一區(qū)域的5'-端之間存在至少一個(gè)單鏈區(qū)域；并且其中第六區(qū)域的3'-端包括不可延伸的核苷酸。在其它DNA聚合酶抑制劑實(shí)施方案中，所述核苷酸序列包括至少兩種不同的寡核苷酸，例如但不限于，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括兩種寡核苷酸，第一寡核苷酸包括第一區(qū)域，并且第二寡核苷酸包括第三區(qū)域，并且任選地，包括第四區(qū)域，并且第一寡核苷酸的第一區(qū)域與第二寡核苷酸的第三區(qū)域互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，第一區(qū)域中只有子集的核苷酸與第三區(qū)域相對(duì)應(yīng)的片段互補(bǔ)。在適當(dāng)條件下，包括在第一溫度下，第一寡核苷酸的第一區(qū)域和第二寡核苷酸的第三區(qū)域可以退火，形成包括至少一個(gè)雙鏈片段的雙鏈體。當(dāng)將本發(fā)明的DNA聚合酶抑制劑加熱到第二溫度時(shí)，例如但不限于在第二溫度范圍內(nèi)，它們采取單鏈的或基本上單鏈的構(gòu)象，不是莖-環(huán)或雙鏈體構(gòu)象。一些包括兩種或多種寡核苷酸的示例性酶抑制劑示例性顯示在圖2中。在圖2A中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括與第二寡核苷酸退火的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括在整個(gè)圖2中以黑色條帶顯示的第一區(qū)域(l)，所述第二寡核苷酸包括第三區(qū)域(3)和在整個(gè)圖2中以黑色陰影顯示的第四區(qū)域(4)。這種示例性DNA聚合酶抑制劑的第一寡核苷酸還包括猝滅劑，表示為Q。在圖2B中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括與第二寡核苷酸退火的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域(l)，所述第二寡核苷酸包括第三區(qū)域(3)和第四區(qū)域(4)。在這種示例性的DNA聚合酶抑制劑中，顯示猝滅劑(Q)附著在第四區(qū)域(4)上。在圖2C中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括含有第一猝滅劑(表示為Ql)的第一區(qū)域(l)，所述第二寡核苷酸包括第三區(qū)域(3)以及包含第二猝滅劑(表示為Q2)的第四區(qū)域(4)。在圖2D中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括與第二寡核苷酸退火的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域(l)，所述第二寡核苷酸包括第三區(qū)域(3)，其中所述第二寡核苷酸包括猝滅劑(表示為Q)。在圖2E中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括第一寡核苷酸，其包括第一區(qū)域(1)并且與包含第三區(qū)域(3)的第二寡核苷酸退火，其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸都包括猝滅劑(表示為Ql和Q2)。在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括與之結(jié)合的適體，并且當(dāng)被適體結(jié)合時(shí)抑制所述DNA聚合酶的酶活性。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶抑制劑包括包含至少一個(gè)雙鏈片段的適體。當(dāng)所述適體在溶液中游離，或者在復(fù)合物中與所述DNA聚合酶結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑吸收由與所述適體締合的核酸染料分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)中的至少一匙。所公開(kāi)的DNA聚合酶抑制劑不顯著地干擾引物與相對(duì)應(yīng)的靶旁側(cè)序列和/或擴(kuò)增子加雜交。除了減少與DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料分子的熒光強(qiáng)度并且減少次級(jí)擴(kuò)增子的形成之外，相對(duì)于不包含所述DNA聚合酶抑制劑的平行擴(kuò)增反應(yīng)，本發(fā)明的一些DNA聚合酶抑制劑提高需要的擴(kuò)增子的產(chǎn)量。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列的3'-端不能通過(guò)DNA聚合酶延伸，典型地是由于存在不可延伸性核苷酸，其包括但不限于含有封閉基團(tuán)的末端核苷酸。封閉基團(tuán)是可以添加到核苷酸或核酸上以防止或使通過(guò)DNA聚合酶的核苷酸添加最少化的化學(xué)部分。通過(guò)將封閉基團(tuán)添加到末端3'-OH上，所述核苷酸不再能夠參與由DNA聚合酶催化的磷酸二酯鍵形成。封閉基團(tuán)的一些非限制性實(shí)例包括烷基基團(tuán)、非核苷酸接頭、硫代磷酸酯、鏈垸二醇?xì)埢?、PNA、LNA、包含替代3'-羥基基團(tuán)的3'氨基基團(tuán)的核苷酸類(lèi)似物、包含替代5'磷酸基團(tuán)的5'羥基基團(tuán)的核苷酸類(lèi)似物、以及缺少3'OH基團(tuán)的核苷酸衍生物。烷基封閉基團(tuán)是飽和烴，其可以是直鏈的、支鏈的、環(huán)形的或它們的組合。不可延伸的核苷酸的一些非限制性的實(shí)例包括具有已經(jīng)被修飾，如通過(guò)用氫或氟取代或通過(guò)形成酯、酰胺、硫酸酯或糖苷而修飾的3'-羥基基團(tuán)的核苷酸。這些核苷酸通常是不可鏈延伸的?？梢允褂玫牟豢裳由斓暮塑账岬钠渌鼘?shí)例包括具有修飾的核糖部分的核苷酸。在某些實(shí)施方案中，核糖核苷酸可以作為不可延伸的核苷酸，原因在于在核糖核苷酸中終止的寡核苷酸不能通過(guò)特定的DNA聚合酶延伸?？梢孕揎椝龊颂牵园?'-脫氧衍生物，其包括其中3'-羥基被除氫以外的官能團(tuán)如疊氮基團(tuán)取代的那些。在某些實(shí)施方案中，不可延伸的核苷酸包括雙脫氧核苷酸(ddN)，例如但不限于，雙脫氧腺苷(ddA)、雙脫氧胞嘧啶(ddC)、雙脫氧鳥(niǎo)苷(ddG)、雙脫氧胸苷(ddT)或雙脫氧尿苷(ddU)。在一些實(shí)施方案中，酶抑制劑包含兩種猝滅劑、三種猝滅劑或多于三種猝滅劑。在某些抑制劑實(shí)施方案中，第一區(qū)域包含猝滅劑和/或第三區(qū)域包含第三猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，第二區(qū)域包含猝滅劑。在一些實(shí)施方案中，第四區(qū)域包含猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，第五區(qū)域包含猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，第六區(qū)域包含猝滅劑。在一些實(shí)施方案中，酶抑制劑在核苷酸序列的3'-端、核苷酸序列的5'-端和/或內(nèi)部包含猝滅劑。在一些實(shí)施方案中，酶抑制劑包含第二區(qū)域，并且在一些實(shí)施方案中，包含形成莖-環(huán)構(gòu)象的環(huán)的第五區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，環(huán)包含猝滅劑。所公開(kāi)的連接酶抑制劑沒(méi)有顯著地干擾連接探針與相對(duì)應(yīng)的耙核酸和/或擴(kuò)增子的退火，并且在某些實(shí)施方案中，沒(méi)有顯著地干擾裂解探針與相對(duì)應(yīng)的靶核酸和/或擴(kuò)增子的退火，和/或引物與相對(duì)應(yīng)的耙核酸和/或擴(kuò)增子的退火。所公開(kāi)的裂解酶抑制劑沒(méi)有顯著地干擾裂解探針與相對(duì)應(yīng)的靶核酸或擴(kuò)增子的退火，并且在某些實(shí)施方案中，沒(méi)有顯著地干擾連接探針與相對(duì)應(yīng)的靶核酸或擴(kuò)增子的退火，和/或引物與相對(duì)應(yīng)的靶核酸或擴(kuò)增子的退火。所公開(kāi)的解旋酶抑制劑沒(méi)有顯著地干擾引物與相對(duì)應(yīng)的靶核酸和/或擴(kuò)增子的退火，并且在某些實(shí)施方案中，沒(méi)有顯著地干擾裂解探針和/或連接探針與相對(duì)應(yīng)的靶核酸和/或擴(kuò)增子的退火。除了減少與酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料分子的熒光強(qiáng)度并且減少次級(jí)擴(kuò)增子的形成之外，相對(duì)于不包含所述酶抑制劑的平行擴(kuò)增反應(yīng)，本發(fā)明的一些酶抑制劑可以增加需要的擴(kuò)增子的產(chǎn)量。在某些實(shí)施方案中，酶抑制劑的雙鏈片段包含內(nèi)部堿基對(duì)錯(cuò)配。在某些實(shí)施方案中，酶抑制劑包含環(huán)結(jié)構(gòu)，典型地是包含雙鏈片段和單鏈環(huán)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，酶抑制劑包含兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，在第一溫度，當(dāng)抑制劑的互補(bǔ)序列彼此退火時(shí)，酶抑制劑的第二區(qū)域和/或第五區(qū)域可以形成環(huán)結(jié)構(gòu)，例如但不限于，第一區(qū)域與第三區(qū)域退火；和/或第四區(qū)域與第六區(qū)域退火。在某些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列的第二區(qū)域、第五區(qū)域或第二區(qū)域和第五區(qū)域包括2-12個(gè)核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物，并且在一些實(shí)施方案中，包括2-6個(gè)核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物。在一些實(shí)施方案中，所述第二和/或第五區(qū)域包括非核苷酸接頭。在某些實(shí)施方案中，酶抑制劑的第二區(qū)域、第五區(qū)域、或第二和第五區(qū)域由序列(T)n組成，基本上由序列(T)n組成，或者包括序列(T)n，其中n是在1和8之間的任何數(shù)目的T核苷酸，例如但不限于，TT,TTT，TTTT,或TTTTT。在其它實(shí)施方案中，所述第二區(qū)域和/或第五區(qū)域由核苷酸A，C,和/或G組成，基本上由核苷酸A,C,和/或G組成，或者包括核苷酸A，C，和/或G，包括但不限于任意這些核苷酸的核苷酸類(lèi)似物。在一些實(shí)施方案中，所述第二區(qū)域和/或第五區(qū)域包括(l)至少一個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如但不限于PNA禾Q/或LNA，和/或(2)非核苷酸接頭，例如但不限于包含烴基團(tuán)(-CH2-)的非核苷酸，包括但不限于，包括烷、烯或炔部分，以及乙二醇的接頭，其包括但不限于聚乙二醇(PEG)。典型地所述接頭基團(tuán)不是疏水性的。在某些實(shí)施方案中，接頭是親水性的，或者接頭的至少部分具有親水特性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在所公開(kāi)的酶抑制劑中的接頭的組成通常沒(méi)有限制，條件是所述接頭不干擾酶-酶抑制劑的相互作用，并且所述接頭足夠靈活，足以允許所述酶抑制劑在第一溫度自我退火。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶抑制劑包含在所述核苷酸序列的3，-端、5'-端或3'-端和5'-端兩端上的小溝結(jié)合物。在一些實(shí)施方案中，所述小溝結(jié)合物位于內(nèi)部。在某些實(shí)施方案中，所述小溝結(jié)合物還包含猝滅劑，例如但不限于，MGB-NFQ(應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems))。小溝結(jié)合物的非限制性實(shí)例包括，抗生素如紡錘菌素，偏端霉素，重氮氨苯脒乙酰甘氨酸鹽，噴他脒及其它芳香二脒，Hoechst33258，SN6999，金霉(aureolic)抗腫瘤藥如色霉素和光神霉素，CC-1065,二氫環(huán)吡咯并吲哚三肽(DPl3)，1，2-二氫-(3H)-吡咯并[3,2-e]吲哚-7-羧酸酯(CDPl3),以及相關(guān)的化合物和類(lèi)似物。小溝結(jié)合物的描述可以特別在下列各項(xiàng)中找到NucleicAcidsinChemistryandBiology(化學(xué)和生物學(xué)中的核酸)，第2版，Blackburn和Gait,特別在第8.3部分中；Kumar等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)26:831-38:1998;Kutyavin等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)28:655-61，2000;Turner和Denny,Curr.DrugTargets(現(xiàn)代藥物耙)1:1-14,2000;Kutyavin等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)25:3718-25,1997;Lukhtanov等，Bioconjug.Chem,(生物綴合物化學(xué))7:564-7，1996;Lukhtanov等，Bioconjug.Chem.(生物綴合物化學(xué))6:418-26,1995;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,426,408;和PCT公布申請(qǐng)?zhí)朩O03/078450。本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白小溝結(jié)合物典型地提高它們所附著的寡核苷酸的Tm，允許這樣的寡核苷酸有效地在更高的溫度雜交。小溝結(jié)合物可以特別從應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)(FosterCity,CA)和Epoch生物科學(xué)(EpochBiosciences)(Bothell,WA)商購(gòu)。在一些實(shí)施方案中，酶抑制劑的核苷酸序列包含通用堿基。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶抑制劑包括第四區(qū)域或包含通用堿基的第六區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，緊鄰DNA聚合酶抑制劑的第三區(qū)域的第四區(qū)域的核苷酸包含通用堿基。在某些實(shí)施方案中，緊鄰在DNA聚合酶抑制劑的第六區(qū)域和第一區(qū)域之間的單鏈區(qū)域的第六區(qū)域的核苷酸包含通用堿基。在一些實(shí)施方案中，所述通用堿基與NTP在DNA聚合酶抑制劑-DNA聚合酶復(fù)合物中相互作用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，使用公知的方法和通過(guò)本發(fā)明的指導(dǎo)，并且無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)，可以經(jīng)驗(yàn)性地確定酶抑制劑的Tm;或者Tm可以應(yīng)用運(yùn)算法則估計(jì)。用于計(jì)算估計(jì)的Tm，包括含有常用核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物的嵌合的寡聚體的Tm的一些公式和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則是本領(lǐng)域公知的。按照一個(gè)用于寡核苷酸的這樣的預(yù)測(cè)公式，1^1=(4乂0+<:的數(shù)目)+(2XA+T的數(shù)目)。特定的寡核苷酸如酶抑制劑、探針或引物的Tm，還可以使用已知的方法無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)而常規(guī)確定。Tm/解鏈溫度以及它們的計(jì)算的描述可以特別在Rapley;Nielsen,ExiqonTechnicalNoteLNA02/07.2002,ExiqonA/S;McPherson;Finn等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)17:3357-63,1996中找到。本發(fā)明的酶抑制劑的解鏈溫度可以以各種方法計(jì)算。例如，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員明白第一和第三區(qū)域，并且在某些實(shí)施方案中，第四和第六區(qū)域的互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度和/或組成，可以不同，以增加或減少酶抑制劑的解鏈溫度；在某些抑制劑實(shí)施方案中，第四和第六區(qū)域的互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度和/或組成可以不同，以增加或減少所述酶抑制劑的Tm。因此，一般地，與具有更少數(shù)目的雜交堿基對(duì)的雙鏈片段相比，具有更多數(shù)目的雜交堿基對(duì)的雙鏈片段通常在更高的溫度解鏈。然而，如果需要長(zhǎng)的雙鏈片段，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以引入堿基對(duì)錯(cuò)配，例如但不限于，G:T堿基對(duì)，以調(diào)節(jié)解鏈溫度。在某些實(shí)施方案中，酶抑制劑的雙鏈片段含有一個(gè)錯(cuò)配的堿基對(duì)，兩個(gè)錯(cuò)配的堿基對(duì)，三個(gè)錯(cuò)配的堿基對(duì)，四個(gè)錯(cuò)配的堿基對(duì)，或多于四個(gè)錯(cuò)配的堿基對(duì)，其中兩個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配的堿基對(duì)可以，但是不必要，是相鄰的。因此，所公開(kāi)的酶抑制劑的雙鏈片段不必是100%互補(bǔ)的。相反，雙鏈片段可以具有許多或特定百分比的錯(cuò)配或擺動(dòng)堿基對(duì)。例如，所述雙鏈片段可以具有約2%，約3%,約4%，約5%,約6%,約7%,約8%，約9%,約10%,約11%,約12%，約13%,約14%,約15%,約16%,約17%，約18%,約19%,或約20%的堿基對(duì)錯(cuò)配。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)設(shè)計(jì)包含無(wú)堿基的核苷酸類(lèi)似物的雙鏈片段，而調(diào)節(jié)酶抑制劑的解鏈溫度，所述無(wú)堿基的核苷酸類(lèi)似物例如但不限于，包含糖或糖類(lèi)似物和磷酸酯或磷酸酯類(lèi)似物而不是核苷酸堿基或核苷酸堿基類(lèi)似物的類(lèi)似物，其特別消除雙鏈區(qū)域內(nèi)的堿基對(duì)。包含第二區(qū)域和/或第五區(qū)域的酶抑制劑的解鏈溫度還可以通過(guò)增加或減少在環(huán)中的核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物的數(shù)目而調(diào)節(jié)。包含單一寡核苷酸的酶抑制劑的解鏈溫度還可以通過(guò)在可以在第一溫度包含至少一個(gè)雙鏈片段的區(qū)域與在第一溫度不包含雙鏈片段的區(qū)域之間的結(jié)合處存在或不存在一個(gè)或多個(gè)"GC夾"而進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如但不限于環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基，其包括但不限于，在某些實(shí)施方案中，鄰近第二區(qū)域并且與鄰近第二區(qū)域的第三區(qū)域的核苷酸退火的第一區(qū)域的核苷酸(參見(jiàn)，例如，圖IA)，和/或在一些實(shí)施方案中，鄰近第五區(qū)域并且與鄰近第五區(qū)域的第六區(qū)域的核苷酸退火的第四區(qū)域的核苷酸(參見(jiàn)，例如，圖1E)。類(lèi)似地，包含兩種或多種寡核苷酸的酶抑制劑的Tm可以通過(guò)存在或不存在GC夾而調(diào)節(jié)，特別是在它們位于所述酶抑制劑的第一和第三區(qū)域的互補(bǔ)片段的一端或兩端時(shí)，其包括但不限于，環(huán)的堿基，如果適當(dāng)?shù)脑?huà)；并且在某些實(shí)施方案中，位于所述酶抑制劑的第四和第六區(qū)域的互補(bǔ)片段的兩端中的一端。酶抑制劑的解鏈溫度還可以通過(guò)在所述核苷酸序列的第一和/或第三區(qū)域中的核苷酸類(lèi)似物進(jìn)行調(diào)節(jié)，并且在某些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列的第四和/或第六區(qū)域，例如但不限于脫氮-dA。提高Tm的核苷酸類(lèi)似物的一些非限制性實(shí)例包括取代dC的C-5丙炔基-dC或5-甲基-2，-脫氧胞苷；取代dA的2,6-二氨基嘌呤2'-脫氧核苷(2-氨基-dA);以及取代dT的C-5丙炔基-dU;其中每種取代分別提高相對(duì)解鏈溫度約2.8。C，1.3°C,3.0°C,和1.7°C。當(dāng)考慮雙鏈片段的長(zhǎng)度時(shí)，應(yīng)該考慮所述酶抑制劑的解鏈溫度。例如但不限于，如果DNA聚合酶抑制劑的Tm太高，那么它可以在高于在引物延伸擴(kuò)增中所用的溫度的溫度變性，由此引起需要的聚合反應(yīng)的抑制和減少的需要的擴(kuò)增子的產(chǎn)量。如果所述Tm太低，那么所述DNA聚合酶抑制劑可以在允許引物與非靶核酸雜交并且延伸的溫度解鏈，并且失活。當(dāng)所述DNA聚合酶能夠擴(kuò)增這樣的非靶核酸時(shí)，那么將在終擴(kuò)增產(chǎn)物混合物中存在許多不需要的產(chǎn)物，包括引物-二聚體。在某些實(shí)施方案中，酶抑制劑具有適當(dāng)?shù)亟咏?，但不是顯著高于擴(kuò)增反應(yīng)的所選的延伸、連接和/或裂解反應(yīng)溫度的解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，特別是當(dāng)所述酶抑制劑以低濃度應(yīng)用時(shí)，可以使用具有適當(dāng)?shù)馗哂谝镅由鞙囟?、連接溫度、或裂解反應(yīng)溫度的解鏈溫度的酶抑制劑。典型地，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定酶抑制劑在將要使用其的條件下，例如，在核酸聚合條件下的解鏈溫度。一種示例性的DNA聚合酶抑制劑包括下述，由下述組成或基本上由下述組成5，-「TCTGGlGATA(脫氮dA)TT〖脫氮dA)TGGTA(脫氮dA)ATATGT(DABCYL-T)TTC7r7Y應(yīng)飾々淡賓詢(xún)r(jià)arC(MGB-NFQ)-3，(SEQIDNO:)，其中第四區(qū)域以中括號(hào)表示，第三區(qū)域以下劃線(xiàn)表示，第二區(qū)域以黑體表示，并且第一區(qū)域以斜體表示，并且其中所述第二區(qū)域包括第一猝滅劑(在本實(shí)施例中表示為DABCYL)，并且所述第一區(qū)域包括包含第二猝滅劑(在本實(shí)施例中表示為MGB-NFQ)的小溝結(jié)合物。由于在這兩個(gè)區(qū)域之間的兩個(gè)內(nèi)部G:T堿基對(duì)錯(cuò)配，所以第一區(qū)域基本上與第三區(qū)域互補(bǔ)，但是所述DNA聚合酶抑制劑仍然在第一溫度自我退火。在這種示例性DNA聚合酶抑制劑的一些實(shí)施方案中，在所述DNA聚合酶抑制劑的3，-端上的末端C核苷酸包括核苷酸類(lèi)似物雙脫氧胞嘧啶(ddC)。在一些實(shí)施方案中，第二區(qū)域包括TT,TTT,或TTTTT，由TT，TTT，或TTTTT組成或基本上由TT，TTT，或TTTTT組成。在其它實(shí)施方案中，第二區(qū)域包含非核苷酸接頭。在一些實(shí)施方案中，第二區(qū)域不包含猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，所述DNA聚合酶抑制劑的5'-端還包含猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，所述DNA聚合酶抑制劑的至少一個(gè)G核苷酸包含核苷酸類(lèi)似物脫氮-dG。在一些實(shí)施方案中，替代或除了DABCYL部分之外，所述第一猝滅劑包括TAMRATM(羧基四甲基羅丹明)；黑洞猝滅劑(blackholequencher)染料，例如但不限于BHQ-1,BHQ-2,或BHQ-3(生物搜索技術(shù)公司(BiosearchTechnologies,Inc.));OREGONGREEN⑧染料(分子探針)；ROXTM(羧基-X-羅丹明)；DABSYL(4-二甲基氨基偶氮苯_4，-磺酰氯)；或TET(四氯熒光素)。在一些實(shí)施方案中，替代或除了MGB-NFQ之外，所述第二猝滅劑包括DABSYL，DABCYL,TAMRA，黑洞猝滅劑，ROX,OREGONGREEN，或TET。猝滅劑的選擇典型地不限于本發(fā)明，條件是所選擇的猝滅劑可以吸收在所述核酸染料特有的波長(zhǎng)的熒光，并且所述猝滅劑和/或所述猝滅劑在抑制劑中的位置基本上不減少所述抑制劑自我退火和/或與酶復(fù)合的能力。另一種示例性DNA聚合酶抑制劑包括下述，由下述組成或基本上由下述組成^4rL47^/C-3，(SEQIDNO.)，其中所述第四區(qū)域以中括號(hào)表示，第三區(qū)域用下劃線(xiàn)表示，第二區(qū)域以黑體表示，并且第一區(qū)域以斜體表示，并且其中第四區(qū)域包含猝滅劑(在本實(shí)施例中表示為T(mén)ET)。第一區(qū)域與第三區(qū)域互補(bǔ)。在所述DNA聚合酶抑制劑的第一區(qū)域的3，-端的末端C核苷酸包括核苷酸類(lèi)似物雙脫氧胞嘧啶(ddC)，使得這一示例性的DNA聚合酶抑制劑不可延伸。在一些實(shí)施方案中，第二區(qū)域包括TT，TTTT,或TTTTT，由TT,TTTT,或TTTTT組成或基本上由TT,TTTT,或TTTTT組成。在一些實(shí)施方案中，第二區(qū)域包括非核苷酸接頭。在某些實(shí)施方案中，第二區(qū)域不包含猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，所述DNA聚合酶抑制劑的5'-端還包含猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)G核苷酸包括核苷酸類(lèi)似物脫氮-dG，至少一個(gè)A核苷酸包括核苷酸類(lèi)似物脫氮-dA，或者至少一個(gè)G核苷酸包括脫氮-dG和至少一個(gè)A核苷酸包括脫氮-dA。在一些實(shí)施方案中，替代或除了TET部分之外，所述猝滅劑包括TAMRA,黑洞猝滅劑染料，ROX，OREGONGREEN,DABCYL,或DABSYL。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，典型地，所公開(kāi)的酶抑制劑的長(zhǎng)度與核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物的組成可以變化，以便當(dāng)在復(fù)合物中締合時(shí)，最優(yōu)化所述抑制劑，特別是雙鏈片段的穩(wěn)定性，并且提高其抑制相對(duì)應(yīng)的酶的酶活的能力。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)該理解，當(dāng)所述酶-酶抑制劑復(fù)合物在第一溫度的解離速率，有時(shí)叫作"脫離-速率(off-rate)"是低的時(shí)，所公開(kāi)的酶抑制劑典型地更有效地抑制次級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。然而，在某些應(yīng)用中，人們可以能夠通過(guò)使用更高濃度的酶抑制劑而補(bǔ)償"更快"的脫離速率。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明白，用于特定應(yīng)用的適當(dāng)?shù)拿敢种苿舛瓤梢詰{經(jīng)驗(yàn)確定。當(dāng)檢測(cè)包括解鏈曲線(xiàn)分析，有時(shí)叫作解離曲線(xiàn)分析時(shí)，本發(fā)明的酶抑制劑是特別有用的。為了產(chǎn)生解鏈或解離曲線(xiàn)，將反應(yīng)組合物加熱，典型地以逐步或遞增方式加熱，并且在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔檢測(cè)反應(yīng)混合物的熒光。首先，在最初加熱過(guò)程中，由于所述酶抑制劑的猝滅劑部分，其在第一溫度范圍內(nèi)，減少?gòu)呐c所述酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料分子發(fā)射的熒光，所以反應(yīng)組合物中的非特異性熒光減少。隨著溫度升高到第二溫度，所述酶抑制劑的雙鏈片段開(kāi)始解鏈，將已經(jīng)與所述酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料分子釋放。由于所述酶抑制劑解離，其將使得一種或多種擴(kuò)增子的評(píng)估變得復(fù)雜，所以預(yù)計(jì)將在解離曲線(xiàn)(以熒光的一階導(dǎo)數(shù)相對(duì)溫度作圖)中出現(xiàn)峰值。由于在所述酶抑制劑中存在猝滅劑，與所述抑制劑解鏈相關(guān)的解離峰減小或不被檢測(cè)到，原因在于所述猝滅劑吸收從締合的染料分子發(fā)射的熒光中的至少一些，這至少減小了所述酶抑制劑的解離峰(參見(jiàn)，例如，圖3-6)。通常，本發(fā)明的DNA聚合酶抑制劑可以用于其中使用DNA聚合酶的任何擴(kuò)增方法中。例如，所公開(kāi)的DNA聚合酶抑制劑可以用于一種或多種下述方法中DNA測(cè)序，DNA擴(kuò)增，RNA擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄,DNA合成和/或引物延伸。所公幵的DNA聚合酶抑制劑可以用于反應(yīng)組合物中以用來(lái)通過(guò)引物延伸而擴(kuò)增靶核酸，所述引物延伸例如但不限于，PCR和/或反轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的DNA聚合酶抑制劑還可以用于某些測(cè)序技術(shù)中。所公開(kāi)的DNA聚合酶抑制劑可以用于使用終止子核苷酸通過(guò)單一核苷酸引物延伸的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測(cè)中。任何這樣的方法，包括其變體，例如但不限于，多核苷酸或引物標(biāo)記，微型測(cè)序等，考慮與本文公開(kāi)的DNA聚合酶抑制劑一起應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，連接酶抑制劑包括可以在第一溫度作為連接底物模擬物的寡核苷酸，其是一種包含不能通過(guò)連接酶連接的切口的底物。在一些實(shí)施方案中，連接酶抑制劑包括兩個(gè)鄰近雜交的核酸末端，但是至少一個(gè)末端的至少一個(gè)末端核苷酸不與所述抑制劑的"模板"鏈雜交，并且所述兩端不能連接在一起。在某些實(shí)施方案中，連接酶抑制劑包括兩個(gè)鄰近雜交的核酸末端，但是至少一個(gè)末端包括不被連接酶連接的末端核苷酸。例如，3'末端核苷酸不包含3'-羥基基團(tuán)，5'末端核苷酸不包含5'-磷酸基團(tuán)，或者二者。圖1E中顯示了一個(gè)包含不能通過(guò)連接酶閉合的切口的示例性的連接酶抑制劑實(shí)施方案。這種示例性的連接酶抑制劑包括第一區(qū)域(1)，第二區(qū)域(2),第三區(qū)域(3),第四區(qū)域(4),第五區(qū)域(8)，和第六區(qū)域(9)。所述第二區(qū)域(2)，以環(huán)結(jié)構(gòu)表示，還包含第一猝滅劑(6);和第五區(qū)域(8)，也以環(huán)結(jié)構(gòu)表示，還包括第二猝滅劑(7)。顯示第一區(qū)域(l)與第三區(qū)域(3)退火形成第一雙鏈片段；并且顯示第四區(qū)域(4)與第六區(qū)域(9)退火形成第二雙鏈片段，例如，其可以在第一溫度發(fā)生。第六區(qū)域(9)的3'-端包含不可連接的末端(IO)，例如但不限于，缺少3'-OH基團(tuán)的末端核苷酸(表示為X)。在某些實(shí)施方案中，這樣的示例性連接酶抑制劑的第六區(qū)域的3，-端和域第一區(qū)域的5，-端不與"模板鏈"(在這一舉例說(shuō)明中，分別為第四區(qū)域(4)和/或第三區(qū)域(3))退火。在某些實(shí)施方案中，連接酶抑制劑的上游末端(在圖1E中所示的所述示例性連接酶抑制劑中表示為9)包括8個(gè)核苷酸，9個(gè)核苷酸，IO個(gè)核苷酸，ll個(gè)核苷酸，12個(gè)核苷酸，13個(gè)核苷酸，14個(gè)核苷酸，15個(gè)核苷酸，16個(gè)核苷酸，17個(gè)核苷酸，18個(gè)核苷酸，19個(gè)核苷酸,20個(gè)核苷酸，或多于20個(gè)核苷酸。應(yīng)該理解，連接酶抑制劑的"上游鏈"的長(zhǎng)度應(yīng)該典型地設(shè)計(jì)成至少與所需要的連接酶的足跡一樣長(zhǎng)，并且可以更長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，連接酶抑制劑包括可以與模板鏈鄰近雜交的2個(gè)寡核苷酸，但是切口的相對(duì)末端不適合連接在一起，例如，但不限于，上游鏈的3'-端不包含3'-OH基團(tuán)，下游鏈的5'-端不包含5，-磷酸基團(tuán)，或者二者。一些連接酶抑制劑實(shí)施方案包括至少三個(gè)寡核苷酸第一寡核苷酸，第二寡核苷酸和第三寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域，所述第二寡核苷酸包括第三區(qū)域和第四區(qū)域，并且所述第三寡核苷酸包括第六區(qū)域，其中所述第一區(qū)域與第三區(qū)域互補(bǔ)，并且第四區(qū)域與第六區(qū)域互某些連接酶抑制劑包括兩個(gè)寡核苷酸，包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域，第二區(qū)域，第三區(qū)域和第四區(qū)域，并且所述第二寡核苷酸包括第六區(qū)域，并且其中所述第一區(qū)域與第三區(qū)域互補(bǔ)，并且第四區(qū)域與第六區(qū)域互補(bǔ)。在適當(dāng)?shù)臈l件下，包括在第一溫度下，所述第一區(qū)域和第三區(qū)域可以退火，并且形成至少一個(gè)雙鏈片段，并且第四區(qū)域和第六區(qū)域可以退火，形成至少一個(gè)雙鏈片段。其它連接酶抑制劑實(shí)施方案包括多于兩個(gè)寡核苷酸，在適當(dāng)?shù)臈l件下，包括在第一溫度下，其可以退火，形成在兩個(gè)鄰近雜交的寡核苷酸末端之間包含不能通過(guò)連接酶閉合的切口或缺口的雜交結(jié)構(gòu)。在某些連接酶抑制劑實(shí)施方案中，位于或者接近上游寡核苷酸的3-端、下游寡核苷酸的5，-端、或者上述兩端的至少一個(gè)核苷酸，不與第三寡核苷酸的相對(duì)應(yīng)的核苷酸互補(bǔ)，其中所述第一和第二寡核苷酸與所述第三寡核苷酸鄰近退火。因此，至少一個(gè)相對(duì)末端不能與模板有效退火并且連接酶不能將它們連接在一起。在某些實(shí)施方案中，裂解酶抑制劑包括突出序列，其包括至少一個(gè)不可被所述裂解酶裂解或被之緩慢裂解的核苷酸間連接。這樣的抑制劑的一個(gè)示例性實(shí)施方案在圖1F中示例性顯示。所述示例性抑制劑包括第一區(qū)域(1),第二區(qū)域(2),包含第一猝滅劑(6)的第三區(qū)域(3),第四區(qū)域(4),第五區(qū)域(8),和第六區(qū)域(9)，在本示例性抑制劑中所述第六區(qū)域(9)包含第二猝滅劑(7)。顯示所述第一區(qū)域(1)和第三區(qū)域(3)退火，形成第一雙鏈片段，第四區(qū)域(4)和第六區(qū)域(9)退火，形成第二雙鏈片段，并且第二區(qū)域(2)和第五區(qū)域(8)分別表示為環(huán)結(jié)構(gòu)。在第一區(qū)域(l)的上游是突出序列(ll)，在本示例性實(shí)施方案中，其包括不能被裂解酶裂解的多種核苷酸間連接(12)。在這種構(gòu)象中，所述示例性酶抑制劑形成裂解結(jié)構(gòu)模擬物，其為類(lèi)似于核酸裂解結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但是其作為所述裂解酶的無(wú)效底物。在某些實(shí)施方案中，例如但不限于，當(dāng)所述裂解酶包括具有聚合活性的DNA聚合酶時(shí)，和/或當(dāng)反應(yīng)組合物包括裂解酶和DNA聚合酶時(shí)，所述裂解酶抑制劑的3'-端包括不可延伸的核苷酸，其包括但不限于ddN。在某些實(shí)施方案中，酶抑制劑的核苷酸序列包括適體，其包括至少一個(gè)雙鏈片段，并且其與酶結(jié)合，并且當(dāng)所述酶結(jié)合適體時(shí)，其抑制酶的酶促活性。當(dāng)所述適體在低于第二溫度下在溶液中游離時(shí)，或者在復(fù)合物中與酶結(jié)合時(shí)，所述猝滅劑吸收由與所述適體締合的核酸染料分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)中的至少一些。某些示例性復(fù)合物按照本發(fā)明的復(fù)合物包括與酶締合的酶抑制劑，以致所述酶的至少一種酶促活性被抑制。在某些實(shí)施方案中，復(fù)合物包括與擴(kuò)增酶如包含在擴(kuò)增反應(yīng)中的任何酶締合的酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合物包括與RNA聚合酶抑制劑締合的RNA聚合酶。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合物包括與連接酶締合的連接酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合物包括與解旋酶締合的解旋酶抑制劑。在某些實(shí)施方案中，復(fù)合物包括與裂解酶抑制劑締合的裂解酶。一些復(fù)合物還包括其它的成分，例如但不限于，脫氧核糖核苷酸(dNTP)，核糖核苷酸(rNTP)，核苷酸類(lèi)似物，解旋酶輔助蛋白，SSB，或酶輔因子，其包括但不限于ATP和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，并且包括其可以參與某些酶-酶抑制劑復(fù)合物的形成和/或穩(wěn)定的不可裂解的類(lèi)似物，或它們的組合。在某些實(shí)施方案中，酶-酶抑制劑復(fù)合物包括與DNA聚合酶抑制劑締合的DNA聚合酶。在某些實(shí)施方案中，包括DNA聚合酶抑制劑和DNA聚合酶的復(fù)合物還包括NTP和/或核苷酸類(lèi)似物，其可以參與所述DNA聚合酶抑制劑-DNA聚合酶復(fù)合物。按照本發(fā)明，當(dāng)DNA聚合酶與DNA聚合酶抑制劑以及任選地NTP和/或核苷酸類(lèi)似物復(fù)合(即，在復(fù)合物中締合)時(shí)，所述DNA聚合酶關(guān)于其催化向引物或新生多核苷酸鏈的3'-端添加核苷酸的酶促活性被抑制。典型地，設(shè)計(jì)所公開(kāi)的DNA聚合酶抑制劑，以在第一溫度形成至少一個(gè)雙鏈片段并且與DNA聚合酶復(fù)合。當(dāng)將所述復(fù)合物加熱到第二溫度時(shí)，所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段變性并且復(fù)合物解離。當(dāng)從所述復(fù)合物釋放時(shí)，所述DNA聚合酶的合成活性恢復(fù)，并且，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以擴(kuò)增特定的核酸序列。按照某些實(shí)施方案，復(fù)合物包括與DNA聚合酶締合的DNA聚合酶抑制劑，以致所述DNA聚合酶的酶促活性被抑制。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合物包括與DNA聚合酶締合的以單或雙莖-環(huán)構(gòu)象的DNA聚合酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合物包括與DNA聚合酶抑制劑締合的DNA聚合酶，所述DNA聚合酶抑制劑包括退火形成至少一個(gè)雙鏈片段的至少兩個(gè)寡核苷酸。典型地，DNA聚合酶抑制劑的第一和第三區(qū)域在第一溫度退火形成雙鏈片段，并且所述DNA聚合酶抑制劑適當(dāng)?shù)夭扇∏o-環(huán)構(gòu)象或雙鏈體構(gòu)象。在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶抑制劑的第四和第六區(qū)域在第一溫度退火形成雙鏈片段，并且所述DNA聚合酶抑制劑適當(dāng)?shù)夭扇∏o-環(huán)構(gòu)象、雙莖-環(huán)構(gòu)象或雙鏈體構(gòu)象。當(dāng)以莖-環(huán)或雙鏈體構(gòu)象的DNA聚合酶抑制劑與DNA聚合酶結(jié)合時(shí)，所述DNA聚合酶抑制劑和所述DNA聚合酶可以締合形成復(fù)合物，其中所述DNA聚合酶的活性被抑制。隨著反應(yīng)溫度升高，在或者接近第二溫度時(shí)，所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段變性，使得所述復(fù)合物解離，并且免除對(duì)所述DNA聚合酶的抑制。本發(fā)明的DNA聚合酶典型地包括，但不限于，DNA-依賴(lài)型DNA聚合酶和RNA-依賴(lài)型DNA聚合酶，包括反轉(zhuǎn)錄酶。某些反轉(zhuǎn)錄酶在特定的反應(yīng)條件下?lián)碛蠨NA-依賴(lài)型DNA聚合酶活性，這包括AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶。這樣的具有DNA-依賴(lài)型DNA聚合酶活性的反轉(zhuǎn)錄酶可以適用于所公開(kāi)的方法，并且清楚地在本發(fā)明的考慮中。DNA聚合酶的描述可以特別在下列各項(xiàng)中找到LehningerPrinciplesofBiochemistry(生物化學(xué)原理)，第3版,Nelson和Cox,Worth出版社，紐約，NY，2000，特別是第26禾口29章；Twyman，AdvancedMolecularBiology:AConciseReference(高級(jí)分子生物學(xué)簡(jiǎn)明參考)，生物科學(xué)出版社(BiosScientificPublishers),紐約，NY,1999;Ausubel等；Lin禾Waysena,J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)271:100-11,1997;Pavlov等，TrendsinBiotechnol.(生物技術(shù)趨勢(shì))22:253-60:2004;禾卩EnzymaticResourceGuide:DNApolymerases(酶資、源指南DNA聚合酶)，1998,普洛麥格(Promega),Madison,WI。DNA聚合酶活性的抑制可以關(guān)于通過(guò)所述DNA聚合酶的次級(jí)擴(kuò)增子的合成或更一般地，關(guān)于全部核酸的合成而觀察到。通常，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇最優(yōu)化需要的擴(kuò)增子的合成，同時(shí)最小化假的副產(chǎn)物的合成。因此，在產(chǎn)生需要的擴(kuò)增子時(shí)，當(dāng)與不存在所選擇的DNA聚合酶抑制劑時(shí)合成的次級(jí)擴(kuò)增子的量相比時(shí)，所公開(kāi)的DNA聚合酶抑制劑可以抑制次級(jí)擴(kuò)增子的合成約5°/。，約10%,約15%，約20%,約25%，約30%,約35°/0，約40%,約45%，約50%,約55%，約60°/。，約65%,約70%，約75°/。，約85%,約90%，約95%，約96%，約97%,約98%，約99%,或大于約99%。連接酶活性的抑制可以關(guān)于通過(guò)在反應(yīng)組合物中，例如但不限于，其中發(fā)生LCR,LDR，LDR-PCR，PCR-LDR,或FEN-LCR的反應(yīng)組合物中，不需要的副產(chǎn)物，包括但不限于，錯(cuò)誤連接產(chǎn)物的合成或更一般地，關(guān)于全部核酸的擴(kuò)增而觀察到。通常，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇最優(yōu)化需要的擴(kuò)增子的合成，同時(shí)最小化假的副產(chǎn)物的合成。因此，在產(chǎn)生需要的擴(kuò)增子時(shí)，當(dāng)與不存在所選擇的連接酶抑制劑時(shí)產(chǎn)生的次級(jí)擴(kuò)增子的量相比時(shí)，所公開(kāi)的連接酶抑制劑可以抑制不需要的副產(chǎn)物的合成約5%,約10%，約15%，約20%，約25%，約30%,約35%，約40%，約45%,約50%,約55%，約60%，約65%,約70%,約75%，約85%,約90%,約95%，約96%,約97%,約98%，約99%,或大于約99%。裂解酶活性的抑制可以關(guān)于在反應(yīng)組合物中，例如但不限于，其中發(fā)生FEN-LCR的反應(yīng)組合物中，不需要的副產(chǎn)物的合成或更一般地，關(guān)于全部核酸的擴(kuò)增而觀察到。通常，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇最優(yōu)化需要的擴(kuò)增子的合成，同時(shí)最小化假的副產(chǎn)物的合成。因此，在產(chǎn)生需要的擴(kuò)增子時(shí)，當(dāng)與不存在所選擇的裂解酶抑制劑時(shí)合成的次級(jí)擴(kuò)增子的量相比時(shí)，所公開(kāi)的裂解酶抑制劑可以抑制不需要的副產(chǎn)物的合成約5%,約10%，約15%，約20%，約25%,約30%，約35%，約40%,約45%,約50%，約55%，約60%,約65%，約70%,約75%，約85%,約90%,約95%,約96%,約97%，約98%,約99%,或大于約99%。解旋酶活性的抑制可以關(guān)于在反應(yīng)組合物中，例如但不限于，其中發(fā)生HDA的反應(yīng)組合物中，次級(jí)擴(kuò)增子的合成或更一般地，關(guān)于全部核酸的合成而觀察到。通常，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇最優(yōu)化需要的靶核酸的合成，同時(shí)最小化假的副產(chǎn)物的合成。因此，在產(chǎn)生需要的擴(kuò)增子時(shí)，當(dāng)與不存在所選擇的解旋酶抑制劑時(shí)產(chǎn)生的次級(jí)擴(kuò)增子的量相比時(shí)，所公開(kāi)的解旋酶抑制劑可以抑制次級(jí)擴(kuò)增子的合成約5%,約10%，約15%，約20%，約25%，約30%，約35%，約40%，約45°/。，約50%，約55%，約60%,約65%,約70%，約75%,約85%,約90%,約95%,約96%,約97%,約98%,約99%,或大于約99%。所公開(kāi)的酶抑制劑可以與所述酶以各種比例或濃度結(jié)合，以形成復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，所述酶抑制劑以比所述酶更高的摩爾濃度存在。在其它實(shí)施方案中，所述酶抑制劑以與所述酶大約相同或更低的摩爾濃度存在。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇使用大于l:1(抑制劑酶)的酶抑制劑與酶的摩爾比例，以確保存在足夠的酶抑制劑，以致每個(gè)酶分子可以與酶抑制劑締合形成復(fù)合物。通常，高度有效的酶抑制劑可以以比較不有效的酶抑制劑更低的濃度應(yīng)用。因此，酶抑制劑可以以各種濃度提供在反應(yīng)組合物中。例如，這樣的濃度可以從約lnM到約10mM，或從約5nM到約lmM,或從約10nM到約100pM，或者由本領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇的其它便利的濃度而不同。本文公開(kāi)的酶抑制劑可以在擴(kuò)增反應(yīng)之前或過(guò)程中與酶結(jié)合以形成復(fù)合物，條件是所述擴(kuò)增反應(yīng)條件包括在第一溫度的至少一個(gè)步驟。在某些實(shí)施方案中，在形成反應(yīng)組合物之前，酶和酶抑制劑在第一溫度結(jié)合。這樣的預(yù)溫育步驟可以促進(jìn)酶抑制劑-酶復(fù)合物的形成，并且?guī)椭鷾p少或消除不需要的副產(chǎn)物如錯(cuò)誤引發(fā)的擴(kuò)增子、錯(cuò)誤連接的探針和寡聚體化的引物的合成。某些示例性方法所公開(kāi)的酶抑制劑在本發(fā)明的方法中起至少兩種作用。第一，在第一溫度，所公開(kāi)的酶抑制劑作用抑制相對(duì)應(yīng)的酶的酶促活性，減少次級(jí)擴(kuò)增子形成，所述次級(jí)擴(kuò)增子特別由于引物和/或探針與除靶核酸以外的序列的錯(cuò)誤退火以及引物二聚體形成而引起。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員應(yīng)該理解，通過(guò)減少次級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物的形成，本發(fā)明的酶抑制劑可以減少反應(yīng)組合物的非特異性熒光。第二，由于所述至少一種猝滅劑部分可以吸收由與所述酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料分子發(fā)射的熒光中的至少一些，所以，所公開(kāi)的酶抑制劑還可以減少在反應(yīng)組合物中由于所述酶抑制劑的自我-猝滅能力引起的非特異性熒光。在某些實(shí)施方案中，酶抑制劑還在所公開(kāi)的方法中增加擴(kuò)增子的產(chǎn)量。本發(fā)明提供擴(kuò)增靶核酸的方法。按照某些方法實(shí)施方案，反應(yīng)組合物在第一溫度形成，其中所述反應(yīng)組合物包括DNA聚合酶；DNA聚合酶抑制劑，其包含核苷酸序列和猝滅劑；核苷三磷酸酯(NTP)，典型地是脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)的混合物；靶核酸；引物；以及核酸染料。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)組合物還包括核苷酸類(lèi)似物。在一些實(shí)施方案中，所述DNA聚合酶、DNA聚合酶抑制劑、以及任選地NTP和/或核苷酸類(lèi)似物，在形成所述反應(yīng)組合物之前結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，在形成反應(yīng)組合物之前，將所述DNA聚合酶和所述DNA聚合酶抑制劑在第一溫度預(yù)溫育。在第一溫度下，所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括至少一個(gè)雙鏈片段，并且所述DNA聚合酶與所述DNA聚合酶抑制劑可以締合形成復(fù)合物。相對(duì)于在包括相同的DNA聚合酶抑制劑核苷酸序列但是缺少猝滅劑的平行反應(yīng)組合物中檢測(cè)到信號(hào)，所述猝滅劑吸收由與所述核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料分子發(fā)射的熒光信號(hào)中的至少一些。然后，將所述反應(yīng)組合物加熱到接近、處于或高于所述DNA聚合酶抑制劑的解鏈溫度的第二溫度，使得雙鏈片段變性，并且使所述復(fù)合物解離。隨著所述DNA聚合酶抑制劑從所述復(fù)合物釋放，所述DNA聚合酶的酶促活性不再被抑制。將所述反應(yīng)組合物進(jìn)行至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，以產(chǎn)生多個(gè)擴(kuò)增子。本發(fā)明提供減少在反應(yīng)組合物中的非特異性熒光的方法。按照某些這樣的方法，反應(yīng)組合物在第一溫度形成，其中所述反應(yīng)組合物包括DNA聚合酶；DNA聚合酶抑制劑，其包含核苷酸序列和猝滅劑；NTP，典型地是dNTPs的混合物；耙核酸；引物；以及核酸染料。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)組合物還包括核苷酸類(lèi)似物。在一些實(shí)施方案中，所述DNA聚合酶、DNA聚合酶抑制劑、以及任選地NTP和/或核苷酸類(lèi)似物，在形成所述反應(yīng)組合物之前結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，在形成反應(yīng)組合物之前，將所述DNA聚合酶和所述DNA聚合酶抑制劑在第一溫度預(yù)溫育以形成復(fù)合物。相對(duì)于在包括相同的DNA聚合酶抑制劑核苷酸序列但是缺少猝滅劑的平行反應(yīng)組合物中檢測(cè)到的信號(hào)，所述猝滅劑吸收由與所述核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料分子發(fā)射的熒光信號(hào)中的至少一些。然后，將所述反應(yīng)組合物加熱到接近、處于或高于所述DNA聚合酶抑制劑的解鏈溫度的第二溫度，使得雙鏈片段變性，并且使所述復(fù)合物解離。隨著所述DNA聚合酶從所述復(fù)合物釋放，所述DNA聚合酶的聚合活性不再被抑制。將所述反應(yīng)組合物進(jìn)行至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，以產(chǎn)生多個(gè)擴(kuò)增子。在適當(dāng)?shù)臋z測(cè)條件下，可以檢測(cè)在所述反應(yīng)組合物中與多種擴(kuò)增子締合的核酸染料的熒光，然而，與所述DNA聚合酶^]制劑的核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料的熒光至少被所述猝滅劑減少。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)包括多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，例如但不限于，至少10個(gè)循環(huán)，至少15個(gè)循環(huán)，至少20個(gè)循環(huán)，至少25個(gè)循環(huán),至少30個(gè)循環(huán)，至少35個(gè)循環(huán)，至少40個(gè)循環(huán)，或者多于40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，將所述反應(yīng)組合物進(jìn)行至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)包括PCR，其包括PCR的變體，例如但不限于，RT-PCR，不對(duì)稱(chēng)PCR，或定量或?qū)崟r(shí)PCR(參見(jiàn)，例如，Rapley,特別是第VII部分；Protocols&ApplicationsGuide(方法和應(yīng)用指南),rev.9/04,普洛麥格(Promega);McPh固n)。所公開(kāi)的方法的某些實(shí)施方案包括多重?cái)U(kuò)增步驟，其包括但不限于，多個(gè)平行單重或更低重的擴(kuò)增反應(yīng)(例如，2-重、3-重，4-重，5-重，或6-重?cái)U(kuò)增反應(yīng))；多重檢測(cè)步驟，其包括但不限于，多個(gè)平行的單重或更低重的檢測(cè)步驟(例如，其中在同一反應(yīng)組合物中檢測(cè)二、三、四、五或六種不同的擴(kuò)增子)；或者多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)和多重檢測(cè)方法二者。在一些實(shí)施方案中，所述靶核酸包括多種不同的靶核酸，所述引物包括多種不同的引物或多種不同的引物對(duì)，多種擴(kuò)增子包括多種不同的擴(kuò)增子，并且所述檢測(cè)包括檢測(cè)與所述多種不同的擴(kuò)增子締合的核酸染料的熒光。使用所公開(kāi)的DNA聚合酶抑制劑獲得的酶促抑制的程度可以不同，并且可以依賴(lài)于所用的方法，DNA聚合酶，所選的DNA聚合酶抑制劑的結(jié)構(gòu)和解鏈溫度，以及其它因素，如引物延伸溫度。這些變量中的每一個(gè)可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用本發(fā)明和/或可用的方法進(jìn)行最優(yōu)化，以獲得具有最少的非靶核酸產(chǎn)量的需要的產(chǎn)物的優(yōu)化產(chǎn)量。類(lèi)似地，非特異性熒光減少的程度可以不同，除了其它因素，這特別取決于在所述核苷酸序列中的特別的猝滅劑，每種DNA聚合酶抑制劑所用的猝滅劑的數(shù)目，所用的核酸染料，反應(yīng)條件，以及所述DNA聚合酶抑制劑減少次級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量的效力。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員應(yīng)該理解，在特定的DNA聚合酶抑制劑中的特定的一種猝滅劑或多種猝滅劑的數(shù)目和放置，特定的DNA聚合酶與特定的DNA聚合酶抑制劑的配對(duì)，以及特定的猝滅劑與特定的核酸染料的配對(duì)，可以使用本領(lǐng)域己知的常規(guī)方法無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)而憑經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，以最優(yōu)化在特定的反應(yīng)組合物和擴(kuò)增技術(shù)中的非特異性熒光的減少。按照某些方法實(shí)施方案，在包括靶核酸和連接探針對(duì)的反應(yīng)組合物中，連接酶與連接酶抑制劑在第一溫度形成復(fù)合物。在某些實(shí)施方案中，在形成反應(yīng)組合物之前，將所述連接酶與所述連接酶抑制劑結(jié)合，并且進(jìn)行預(yù)溫育。在第一個(gè)第二溫度，所述連接酶-連接酶抑制劑復(fù)合物解離，釋放連接酶。所述連接探針對(duì)的上游和下游連接探針選擇性地與靶核酸雜交，并且所述連接酶催化形成連接的探針。一些這樣的實(shí)施方案包括多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，其包括下列步驟變性，將上游和下游連接探針退火，并且連接所述探針，以產(chǎn)生連接的探針。在某些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)組合物包括設(shè)計(jì)成與所連接的探針的補(bǔ)體的至少一部分特異性雜交的連接探針對(duì)。在一些實(shí)施方案中，連接的探針包括引物-結(jié)合位點(diǎn)，并且所述反應(yīng)組合物包括引物以及DNA聚合酶-DNA聚合酶復(fù)合物。按照某些公開(kāi)的方法，在第一溫度，裂解酶與裂解酶抑制劑形成復(fù)合物，并且連接酶與連接酶抑制劑形成復(fù)合物。在某些實(shí)施方案中，在第一個(gè)第二溫度，所述裂解酶-裂解酶抑制劑復(fù)合物解離。然后，釋放的裂解酶可以從某些重疊的突出結(jié)構(gòu)裂解突出部分，所述重疊的突出結(jié)構(gòu)包括(1)靶核酸或單鏈擴(kuò)增子，(2)上游裂解探針，和(3)對(duì)應(yīng)的下游裂解探針，其包括與上游裂解探針的3，-端至少重疊一個(gè)核苷酸的5'-突出端或突出序列。當(dāng)所述突出被裂解酶裂解時(shí)，形成包括模板鏈、上游裂解探針和下游裂解探針的雜交的片段的雜交結(jié)構(gòu)，在上游裂解探針的3'-端和下游裂解探針的雜交的片段的5，-端之間具有可連接的切口。在一些實(shí)施方案中，在第二個(gè)第二溫度，所述連接酶-連接酶抑制劑復(fù)合物解離，并且釋放的連接酶可以連接在雜交結(jié)構(gòu)中的切口，以產(chǎn)生包括連接的探針和模板鏈的雙鏈體。在某些實(shí)施方案中，連接的探針包括至少一個(gè)引物-結(jié)合位點(diǎn)。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員應(yīng)該理解，所述第一個(gè)第二溫度和所述第二個(gè)第二溫度可以近似是相同的溫度，或者它們可以是不同的溫度。在第一溫度，一些方法實(shí)施方案還包括DNA聚合酶-DNA聚合酶抑制劑復(fù)合物。在適當(dāng)?shù)牡谌齻€(gè)第二溫度下，所述DNA聚合酶-DNA聚合酶抑制劑復(fù)合物解離。在適當(dāng)?shù)臈l件下，引物與連接的探針的引物-結(jié)合部分特異性地雜交，并且可以發(fā)生引物延伸。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員應(yīng)該理解，當(dāng)在反應(yīng)組合物中使用不同的酶抑制劑時(shí)，下列各項(xiàng)中的至少兩者第一個(gè)第二溫度，第二個(gè)第二溫度，和第三個(gè)第二溫度，可以是近似相同的溫度或者它們可以全部是不同的溫度。在所公開(kāi)的復(fù)合物、方法和試劑盒中所用的示例性的裂解酶包括，但不限于，大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I，水生棲熱菌(77zerm^a《wa"a^)DNA聚合酶I，嗜熱棲熱菌(T72ermw"/zwmo;/n7ws)DNA聚合酶I,哺乳動(dòng)物FEN-l,閃爍古生球菌(^c/weog/o6^/"/g^tf)FEN-l,詹氏甲垸球菌(Me^z朋ococcws_/wmsc/2")FEN-l,激烈熱球菌(jP,ococcws/wn'osws)FEN-1，秉A自養(yǎng)甲烷桿菌(Afe^awoZac/eWwwf/7erwoflwto^o//7/cww)FEN-1，嗜熱棲熱菌(TTzenm^f/zem2op/n7ws)FEN畫(huà)l,Cleavase酶(第三波公司(ThirdWave,Inc.)，Madison,WI)，酉良酒酵母(Sacc/7aram7cescerev&〖ae)RTH1，酉良酒酵母(Sce^v^'ae)RAD27栗酒裂殖酵母(Sc/7iza^cc/7"ro附;^^;70wZ)e)rad2,噬菌體T55，-3，核酸外切酶，極端嗜熱球古菌(/yoccw/zor汰o^//)FEN-1，人核酸外切酶l，牛胸腺5，-3'核酸外切酶，包括其在真細(xì)菌，真核細(xì)胞，和古菌(archaea)中的同系物，諸如結(jié)構(gòu)特異酶的II類(lèi)家族的成員。除了其它地方之外，裂解酶的描述可以特別在下列各項(xiàng)中找到Lyamichev等，Science(科學(xué))260:778-83(1993);Eis等，Nat.Biotechnol.(自然生物技術(shù))19:673-76(2001);Shen等，TrendsinBio.Sci.(生物科學(xué)趨勢(shì))23:171-73(1998);Kaiser等，J.Biol.Chem.(生物的化學(xué)雜志)274:21387-94(1999);Ma等，J.Biol.Chem.(生物的化學(xué)雜志)275:24693-700(2000);Allawi等，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)328:537-54(2003);Sharma等，J.Biol.Chem.(生物的化學(xué)雜志)278:23487-96(2003);以及Feng等,Nat.Struct.Mol.Biol.(自然結(jié)構(gòu)分子生物學(xué))11:450-56(2004)。按照某些公開(kāi)的方法，DNA聚合酶與DNA聚合酶抑制劑，以及任選地NTP和/或核苷酸類(lèi)似物結(jié)合，以形成復(fù)合物。在某些實(shí)施方案中，所述DNA聚合酶包括反轉(zhuǎn)錄酶，DNA-依賴(lài)型DNA聚合酶，其包括但不限于，熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，或反轉(zhuǎn)錄酶和DNA-依賴(lài)型DNA聚合酶。在一些實(shí)施方案中，所述DNA聚合酶抑制劑包括(l)第一DNA聚合酶抑制劑，其在適當(dāng)?shù)牡谝粶囟瓤梢耘c反轉(zhuǎn)錄酶形成復(fù)合物，(2)第二DNA聚合酶抑制劑，其在適當(dāng)?shù)牡谝粶囟瓤梢耘cDNA依賴(lài)型DNA聚合酶形成復(fù)合物，或(3)第一DNA聚合酶抑制劑，其在適當(dāng)?shù)牡谝粶囟瓤梢耘c反轉(zhuǎn)錄酶形成復(fù)合物，和第二DNA聚合酶抑制劑，其在適當(dāng)?shù)牡谝粶囟瓤梢耘cDNA-依賴(lài)型DNA聚合酶形成復(fù)合物，其中所述第一DNA聚合酶抑制劑和所述第二DNA聚合酶抑制劑包括相同的核苷酸序列或不同的核苷酸序列，其中適用于第一DNA聚合酶抑制劑的第一溫度和適用于第二DNA聚合酶抑制劑的第一溫度是相同的溫度或不同的溫度。按照某些公開(kāi)的方法，擴(kuò)增包括兩階段PCR反應(yīng)，其包括兩種不同的反應(yīng)組合物第一反應(yīng)組合物和第二反應(yīng)組合物，每種包括DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑。在某些這樣的實(shí)施方案中，第一反應(yīng)組合物包括第一DNA聚合酶，第一DNA聚合酶抑制劑，NTP，典型地是NTPs的混合物，和引物，典型地是多種不同的引物對(duì)。在某些實(shí)施方案中，將DNA聚合酶，DNA聚合酶抑制劑，和任選地NTP和/或核苷酸類(lèi)似物在形成第一反應(yīng)組合物之前組合。將所述第一反應(yīng)組合物進(jìn)行有限數(shù)目的擴(kuò)增循環(huán)，例如但不限于，2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、ll個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)或15個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。在所述有限的第一階段擴(kuò)增后，將第一反應(yīng)組合物稀釋?zhuān)⑶覍⑺♂尩牡谝环磻?yīng)組合物的部分與第二DNA聚合酶，第二DNA聚合酶抑制劑,NTP,典型地是NTPs的混合物，和引物，典型地是引物對(duì)組合。在某些實(shí)施方案中，將DNA聚合酶，DNA聚合酶抑制劑，和任選地NTP和/或核苷酸類(lèi)似物在形成第二反應(yīng)組合物之前組合。將第二反應(yīng)組合物進(jìn)行多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，例如但不限于，10-45個(gè)擴(kuò)增循環(huán)或20-40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，包括在所列范圍內(nèi)的任何數(shù)目的擴(kuò)增循環(huán)，正如每個(gè)以及每一個(gè)擴(kuò)增數(shù)目是在本文中清楚地?cái)⑹龅?。在一些?shí)施方案中，在稀釋的第一>反應(yīng)組合物中存在足夠的殘留的第一DNA聚合酶，在所述稀釋的第一反應(yīng)組合物中，第二DNA聚合酶不是必需的。在一些實(shí)施方案中，在稀釋的第一反應(yīng)組合物中存在足夠的殘留的第一DNA聚合酶抑制劑，在所述稀釋的第一反應(yīng)組合物中，第二DNA聚合酶抑制劑不是必需的。在某些實(shí)施方案中，所述第一DNA聚合酶和第二DNA聚合酶是相同的聚合酶或不同的聚合酶，其包括但不限于，反轉(zhuǎn)錄酶和DNA-依賴(lài)型DNA聚合酶。在一些實(shí)施方案中，所述第一DNA聚合酶抑制劑和所述第二DNA聚合酶抑制劑是相同的抑制劑或不同的抑制劑。出于舉例說(shuō)明的目的，而不是這樣的實(shí)施方案的限制，考慮一種示例性的RT-PCR反應(yīng)，其包括第一反應(yīng)，所述第一反應(yīng)包括反轉(zhuǎn)錄酶、第一DNA聚合酶抑制劑、以及任選地NTP和/或核苷酸類(lèi)似物；和第二反應(yīng)組合物，所述第二反應(yīng)組合物包括熱穩(wěn)定的DNA-依賴(lài)型DNA聚合酶、第二DNA聚合酶抑制劑、以及任選地NTP和/或核苷酸類(lèi)似物。所述第一DNA聚合酶抑制劑可以設(shè)計(jì)成在低于反轉(zhuǎn)錄的最佳溫度的溫度(即，示例性第一階段第一溫度)下抑制反轉(zhuǎn)錄酶活性，但是處于或高于最佳反轉(zhuǎn)錄溫度(即，示例性第一階段第二溫度)時(shí)不抑制。所述第二DNA聚合酶抑制劑可以設(shè)計(jì)成在低于第二階段第一溫度的溫度下抑制熱穩(wěn)定性DNA聚合酶的酶活性，所述低于第二階段第一溫度的溫度例如但不限于，低于至少一個(gè)PCR引物的Tm(即，示例性第二階段第一溫度)約5。C到約1(TC或者約4。C更低到約6。C的溫度，但是不高于所述PCR引物的Tm(即，示例性第一階段第二溫度)。本發(fā)明的方法可以典型地與任何靶核酸一起應(yīng)用。所公開(kāi)的方法不但用于生產(chǎn)大量的需要的擴(kuò)增子，還用于生產(chǎn)或測(cè)序已知存在但是沒(méi)有完全測(cè)序或純化的核酸。人們只需要充分詳細(xì)地知道在靶的一端或兩端，艮P，靶旁側(cè)序列的充分?jǐn)?shù)目的堿基的相同性，以致可以制備至少一種可以作為測(cè)序引物的引物。在可接受的第二靶旁側(cè)序列的測(cè)序和鑒定后，可以制備第二引物，并且位于旁側(cè)序列之間的靶核酸可以指數(shù)擴(kuò)增，并且在一些實(shí)施方案中，定量。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)已經(jīng)獲得足夠多的序列時(shí)，可以合成適當(dāng)?shù)倪B接探針組和/或適當(dāng)?shù)牧呀馓结樈M。在所公開(kāi)的方法的某些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括評(píng)估內(nèi)標(biāo)或?qū)φ招蛄?，并且可以包括將需要的擴(kuò)增子的量與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或內(nèi)部大小標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照序列、被動(dòng)參照染料或二者包含在反應(yīng)組合物中，以解釋泳道-與-泳道、毛細(xì)管-與-毛細(xì)管和/或測(cè)定-與-測(cè)定的可變性。本方法的某些實(shí)施方案還包括多孔反應(yīng)容器，其包括但不限于，多孔板或多室微觀流體裝置，在其中進(jìn)行多種擴(kuò)增反應(yīng)，并且在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行多種檢測(cè)，典型地平行進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，產(chǎn)生擴(kuò)增子的一種或多種多重反應(yīng)在同一反應(yīng)容器中進(jìn)行，所述反應(yīng)容器包括但不限于，多孔板，如96孔、384孔、1536孔板等；或在微觀流體裝置中進(jìn)行，例如但不限于，TaqMan⑧低密度陣列(應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems))。在一些實(shí)施方案中，大規(guī)模的平行擴(kuò)增步驟包括多孔反應(yīng)容器，包括含有多個(gè)反應(yīng)孔的板，例如但不限于，24孔板、96孔板、384孔板、或1536孔板；或多室微觀流體裝置，例如但不限于，TaqMan低密度陣列，其中每個(gè)室或每個(gè)孔適當(dāng)?shù)匕ㄟm當(dāng)?shù)囊铩⒁锝M、和/或報(bào)道探針。典型地，這樣的擴(kuò)增步驟以一系列平行的單重、兩重、三重、四重、五重或六重反應(yīng)發(fā)生，盡管更高水平的平行多重方法也在本發(fā)明的目的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)組合物還包括被動(dòng)參照染料。所述被動(dòng)參照染料包含在反應(yīng)組合物中作為內(nèi)部對(duì)照，以允許在熒光上對(duì)非PCR相關(guān)的變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，例如但不限于，孔-與-孔、管-與-管、板-與-板、以及測(cè)定_與_測(cè)定變量。被動(dòng)參照提供標(biāo)準(zhǔn)化的基線(xiàn)，原因在于其熒光在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有變化。典型地，所述被動(dòng)參照不干擾擴(kuò)增反應(yīng)。被動(dòng)參照染料以及基于所述被動(dòng)參照的標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算，例如但不限于，Rn和ARn的應(yīng)用，是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)，例如，Killigore等，J.Clin.Micro.(臨床微生物學(xué)雜志)，38:2516-19,2000;使用AmpliTaqGoldDNA聚合酶方法的TaqMan⑧PCR試劑試劑盒，應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)P/N402823Rev.D2003;BrilliantSYBRGreenQRT-PCRMaster混合試劑盒,l-步使用手冊(cè)，Rev,#75003a,Stratagene,2005;和實(shí)時(shí)PCR的綱要(EssentialofRealTimePCR),應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems))。在一些實(shí)施方案中，所述被動(dòng)參照染料包括ROXTM或TAMRATM。某些示例性試劑盒本發(fā)明還提供設(shè)計(jì)成迅速進(jìn)行某些公開(kāi)的方法的試劑盒。試劑盒可以通過(guò)組裝實(shí)施所述方法必需的兩個(gè)或多個(gè)成分而迅速進(jìn)行某些公開(kāi)的方法。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含預(yù)先測(cè)量的單位量的成分，以將終端使用者測(cè)量的需要最小化。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括進(jìn)行一種或多種所公開(kāi)的方法的用法說(shuō)明。優(yōu)選地，將所述試劑盒成分最優(yōu)化，以與另一種聯(lián)合實(shí)施。某些公開(kāi)的試劑盒包括含有核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括下列各項(xiàng)中的至少一種連接酶抑制劑，解旋酶抑制劑，RNA聚合酶抑制劑，裂解酶抑制劑，和/或DNA聚合酶抑制劑。本發(fā)明的某些試劑盒還包括下列各項(xiàng)中的至少一種連接酶，解旋酶，RNA聚合酶，和裂解酶。某些試劑盒包括酶抑制劑，并且還包括下列各項(xiàng)中的至少一種引物，其包括但不限于隨機(jī)引物或包含寡dT的引物，或引物對(duì)；連接探針對(duì)；裂解探針組；連接酶輔因子，其包括但不限于ATP或NAD;SSB;和/或解旋酶輔助蛋白。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括引物，DNA聚合酶，連接酶，或它們的組合。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括NTP，核苷酸類(lèi)似物或二者。某些試劑盒實(shí)施方案包括含有核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括DNA聚合酶；對(duì)照序列，例如但不限于，內(nèi)標(biāo)序列如持家基因和/或共擴(kuò)增序列(參見(jiàn)，例如，Siebert和Larrick，BioTechniques(生物技術(shù))14:244-49(1993);Joyce,QuantitativeRT-PCR(定量RT-PCR),83-92,在MethodsinMolBiol.(分子生物學(xué)方法)中，巻193,O，Connell,編，Humana出版社；Raeymaekers,Mol.Biotechnol.(分子生物技術(shù))115-22(2000))或包含分子大小或重量標(biāo)準(zhǔn)的多核苷酸梯度；引物和/或引物對(duì)；報(bào)道探針；核酸染料；被動(dòng)參照染料；或它們的組合。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括多種不同的引物對(duì)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括正向引物、反向引物、或正向引物和反向引物，其還包括報(bào)道基團(tuán)。在一些這樣的實(shí)施方案中，引物對(duì)的正向引物的報(bào)道基團(tuán)與所述引物對(duì)的反向引物的報(bào)道基團(tuán)不同。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解，許多不同種類(lèi)的報(bào)道基團(tuán)可以用于本發(fā)明，不管是單個(gè)的或與一種或多種不同的報(bào)道基團(tuán)組合。在某些實(shí)施方案中，報(bào)道基團(tuán)發(fā)射熒光，化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光，磷光或電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。報(bào)道基團(tuán)的一些非限制性的實(shí)例包括熒光團(tuán)，放射性同位素，色原，酶，抗原，其包括但不限于表位標(biāo)記，半導(dǎo)體納米晶體，如量子點(diǎn)，重金屬，染料，磷光基團(tuán)，化學(xué)發(fā)光基團(tuán)，電化學(xué)檢測(cè)部分，結(jié)合蛋白，磷(phosphors)，稀土螯合劑，過(guò)渡金屬螯合劑，近紅外染料，電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，和質(zhì)譜-相容的報(bào)道基團(tuán)，如質(zhì)量標(biāo)記、電荷標(biāo)記和同位素(參見(jiàn)，例如，Hafff卩Smirnov,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)25:3749-50,1997;Xu等，Anal.Chem.(化學(xué)年刊)69:3595-3602,1997;Sauer等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)31:e63,2003)。除了其它地方，將報(bào)道基團(tuán)附著到核酸上的詳細(xì)方法可以特別在下列各項(xiàng)中找到Hermanson,BioconjugateTechniques(生物綴合物技術(shù)),學(xué)院出版社(AcademicPress),SanDiego,1996;CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry(現(xiàn)代核酸化學(xué)方法)，Bea固ge等，編，JohnWiley和Sons，紐約，紐約(2000),包括從2005年8月起的增刊;以及Haugland，HandbookofFluorescentProbesandResearchProducts(熒光探針和研究產(chǎn)物手冊(cè))，第10版，MolecularProbes(分子探針)-Invitrogen，2005。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括兩種或多種不同的酶抑制劑，例如但不限于，連接酶抑制劑和裂解酶抑制劑；裂解酶抑制劑，連接酶抑制劑，和DNA聚合酶抑制劑；或解旋酶抑制劑和DNA聚合酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括兩種或多種不同的DNA聚合酶抑制劑。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括兩種不同的酶，其包括但不限于，DNA-依賴(lài)型DNA聚合酶和RNA-依賴(lài)型DNA聚合酶，如反轉(zhuǎn)錄酶；連接酶和裂解酶；RNA聚合酶和DNA聚合酶，例如但不限于，反轉(zhuǎn)錄酶；以及解旋酶和DNA聚合酶。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。本發(fā)明，己經(jīng)如上文所述，可以通過(guò)參考實(shí)施例更好地理解。下述實(shí)施例只是意欲舉例說(shuō)明的目的，并不應(yīng)該以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l:為了評(píng)估某些示例性酶抑制劑的猝滅劑部分吸收從與所述示例性酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料分子發(fā)射的熒光中的至少一些的作用，合成了五種示例性DNA聚合酶抑制劑，如在表l(如下)中所示。特性、位置以及猝滅劑部分的數(shù)目是不同的。表l.<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>在室溫下形成一系列平行組合物，每種包括在lX反應(yīng)緩沖液(50mMTris緩沖液，pH9，5mMMgCl"250dATP，dCTP和dGTP,500dUTP,60nMROX被動(dòng)參照染料)中的1XSYBRGreenI核酸染料(分子探針)，以及在表1中所示的一種示例性DNA聚合酶抑制劑，其適當(dāng)?shù)匾?nM,10nM,25nM，50nM,75nM，或100nM的濃度存在。如在表l中看出，除了在DNA聚合酶抑制劑D的3'-端的核苷酸是C，而"DNA聚合酶抑制劑"A、DNA聚合酶抑制劑B和DNA聚合酶抑制劑C的3'-端的核苷酸都包括核苷酸類(lèi)似物雙脫氧胞嘧啶(ddC)以外，"DNA聚合酶抑制劑"A、DNA聚合酶抑制劑B、DNA聚合酶抑制劑C、以及DNA聚合酶抑制劑D享有相同的核苷酸序列。"DNA聚合酶抑制劑"A缺少猝滅劑部分(因此，A不是本發(fā)明的真正的DNA聚合酶抑制劑，其用引號(hào)標(biāo)記"DNA聚合酶抑制劑"指示)；DNA聚合酶抑制劑B在其5'-端包含DABCYL猝滅劑部分；DNA聚合酶抑制劑C在其5'-端包含ROX猝滅劑部分；并且DNA聚合酶抑制劑D在其3，-端包含含有非熒光猝滅劑(MGB-NFQ)的小溝結(jié)合物。DNA聚合酶抑制劑E包括這樣的核苷酸序列，g卩，其在其第一和第三區(qū)域包含4個(gè)脫氮-dA核苷酸類(lèi)似物(表示為脫氮A)和兩個(gè)G:T堿基對(duì)錯(cuò)配。DNA聚合酶抑制劑E還包含兩個(gè)猝滅劑部分，在第二區(qū)域環(huán)中的DABCYL部分和在其3，-端的MGB-NFQ。使用ABIPRISM7900HT實(shí)時(shí)序列檢測(cè)系統(tǒng)儀器(應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems))在3(TC到95。C的溫度范圍，對(duì)于每一種組合物生成解離曲線(xiàn)。使用相關(guān)的解離曲線(xiàn)軟件計(jì)算熒光相對(duì)于溫度的導(dǎo)數(shù)。如在圖3中所示，在這一核苷酸序列的Tm(約56。C)從包含IOOnM"DNA聚合酶抑制劑"A(表示為100nMA)的組合物獲得的解離峰比從包含100nM,75nM，或50nMDNA聚合酶抑制劑B(分別表示為100nMB，75nMB,和50nMB)的組合物獲得的解離峰高得多。如在圖3中所示，相對(duì)于"DNA聚合酶抑制劑"A，可能歸因于從與DNA聚合酶抑制劑B的雙鏈片段締合的核酸染料分子發(fā)射的熒光信號(hào)的背景熒光減小。從包含IOOnM"DNA聚合酶抑制劑"A，100nMDNA聚合酶抑制劑C,75nMDNA聚合酶抑制劑C,和50nMDNA聚合酶抑制劑C的組合物中獲得的解離曲線(xiàn)顯示在圖4中。如在圖4中所示，用100nM"DNA聚合酶抑制齊IJ"A獲得的解離峰基本上高于與IOOnM,75nM，或50nM的DNA聚合酶抑制劑C相關(guān)的解離峰。從包含50nM"DNA聚合酶抑制劑"A的組合物和包含50nMDNA聚合酶抑制劑D的組合物獲得的解離曲線(xiàn)顯示在圖5中。從包含50nM"DNA聚合酶抑制劑，，A的組合物獲得解離峰(在圖5中顯示為A)基本上高于從包含50nMDNA聚合酶抑制劑D的組合物獲得的解離峰(顯示為D)。圖6顯示從包含100nM,75nM，50nM,25nM，10nM或5nM"DNA聚合酶抑制劑"A(分別顯示為IOOnM/Std,75nM/Std,50nM/Std,25nM/Std,10nM/Std，和5nM/Std)和100nM,75nM,50nM,25nM,10nM或5nMDNA聚合酶抑制劑E的組合物獲得的解離曲線(xiàn)。如在圖6中所示，從包含"DNA聚合酶抑制劑"A的每種組合物獲得的解離峰是可檢測(cè)地更高的，并且一般基本上高于從包含DNA聚合酶抑制劑E的組合物獲得的解離峰，后者基本上在"基線(xiàn)"處消失，并且不容易區(qū)分。應(yīng)該理解，這些示例性的DNA聚合酶抑制劑目的是作為各種DNA聚合酶抑制劑設(shè)計(jì)的非限制性實(shí)例，例如但不限于，核苷酸序列變化，有和無(wú)小溝結(jié)合物，以及不同的猝滅劑部分，其包括但不限于每個(gè)抑制劑不同數(shù)目的猝滅劑，在所述抑制劑中不同的猝滅劑位置(例如，3'-端、5'-端和內(nèi)部)，以及不同的特異性猝滅劑(例如，DABCYL,ROX,和NFQ)。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員應(yīng)該理解，各種DNA聚合酶抑制劑設(shè)計(jì)是可能的，并且適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶抑制劑可以通過(guò)由本發(fā)明告知的各種設(shè)計(jì)的常規(guī)評(píng)估而獲得，用于與特別的DNA聚合酶和給定的反應(yīng)條件組一起應(yīng)用。^MMl^在gDNA的纖溶酶原激活物尿激酶(PAU)基因中的示例性靶核酸的PCR擴(kuò)增過(guò)程中，抑制次級(jí)擴(kuò)增子為了評(píng)估DNA聚合酶抑制劑E在擴(kuò)增gDNA中的靶核酸中的抑制能力，進(jìn)行PCR反應(yīng)。在室溫下形成6種平行的20]LiL反應(yīng)組合物，每種反應(yīng)組合物包括40ng人gDNA(Coridl);PAU靶核酸-特異的引物對(duì)，其包括2.25正向引物5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCATATTCTCTCATCCTCCTGTCCC-3，(SEQIDNO:)和2.25^M反向引物5，-CAGGAAACAGCTATGACCAAGCGGCTTTAGGCCCACCT腸3，(SEQIDNO:);和終濃度分別為5，10,25,50,75或100nMDNA聚合酶抑制劑E;在lXPCR緩沖液(50mMTris-HCl,pH9，250jiMdATP,dCTP和dGTP,500dUTP,5mMMgCl2,0.6UAmpliTaqDNA聚合酶(應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)),60nMROX被動(dòng)參照染料，8%甘油，0.01%吐溫-20,0.01%NaN3，IXSYBRGreenI核酸染料)中。除了沒(méi)有g(shù)DNA，并且DNA聚合酶抑制劑E的終濃度是50nM之外，在包含與另外六種相同的制劑的第七平行反應(yīng)組合物中包括無(wú)模板對(duì)照。將所述反應(yīng)組合物在室溫下溫育大約15分鐘，然后在ABIPRISM900HT實(shí)時(shí)序列檢測(cè)系統(tǒng)儀器(應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems))中進(jìn)行熱循環(huán)。應(yīng)用下述循環(huán)95°C2分鐘，40個(gè)循環(huán)96°C5秒和60。C2分鐘。為了評(píng)估在每種熱循環(huán)的反應(yīng)組合物中產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物，將15每種反應(yīng)組合物加載到非變性4。/。瓊脂糖E-凝膠(InVitrogen，Carlsbad,CA)的分開(kāi)的泳道中，與加載包括500堿基對(duì)、400堿基對(duì)、300堿基對(duì)、200堿基對(duì)和100堿基對(duì)的標(biāo)記的分子大小梯度(低范圍DNA標(biāo)記，InVitrogen)的兩個(gè)泳道一起。反應(yīng)組合物加載在凝膠的泳道中，如下泳道B,5nM抑制劑E;泳道C,10nM抑制劑E;泳道D，25nM抑制劑E;泳道E,50nM抑制劑E;泳道F，75nM抑制劑E;泳道G，100nM抑制劑E;泳道H，50nM抑制劑E,無(wú)模板對(duì)照。將樣品電泳15分鐘，并且通過(guò)溴化乙錠顯示。如在圖7中所示，需要的擴(kuò)增子(11)的量隨著DNA聚合酶抑制劑濃度增加而增加，直到抑制劑的濃度約為75nM(泳道F)。相反，次級(jí)擴(kuò)增子條帶的密度隨著DNA聚合酶抑制劑濃度增加而減少。^MM^在PCR擴(kuò)增cDNA中的人細(xì)胞色素P450的示例性靶核酸過(guò)程中，抑制次級(jí)擴(kuò)增子在室溫下形成7種平行的20ML反應(yīng)組合物，每種反應(yīng)組合物包括10ng通用參照人cDNA(Stratagene);P"0靶核酸-特異的引物對(duì)，其包括200nM正向引物5'陽(yáng)TGGGAGTCCTGGAAGCAGC-3，(SEQIDNO:)和200nM反向引物5，-TGGCTTCTGGTCAACAAGTGC-3，(SEQIDNO:);和終濃度分別為O，5,10，25，50,75或100nMDNA聚合酶抑制劑E;在1XPCR緩沖液(50mMTris-HCl,pH9，250(^MdATP，dCTP和dGTP，500dUTP,5mMMgCl2,1,5UAmpliTaqDNA聚合酶，60nMROX被動(dòng)參照染料，8%甘油，0.01%吐溫-20，0.01%NaN3,1XSYBRGreenI核酸染料)中。除了沒(méi)有cDNA，并且DNA聚合酶抑制劑E的終濃度是50nM之外，在包含與另外七種相同的制劑的第八平行反應(yīng)組合物中包括無(wú)模板對(duì)照。將所述反應(yīng)組合物在室溫下溫育15分鐘，然后在ABIPRISM7900HT實(shí)時(shí)序列檢測(cè)系統(tǒng)儀器中進(jìn)行熱循環(huán)，并且在非變性瓊脂糖凝膠上分析擴(kuò)增產(chǎn)物，如在實(shí)施例2中所述。反應(yīng)組合物加載在凝膠的泳道中，如下泳道B,0nM抑制劑E;泳道C,5nM抑制劑E;泳道D,10nM抑制劑E;泳道E，25nM抑制劑E;泳道F,50nM抑制劑E;泳道G，75nM抑制劑E;泳道H，100nM抑制劑E;和泳道I，50nM抑制劑E，無(wú)模板對(duì)照。如從在圖8所示的凝膠所看出的，需要的擴(kuò)增子(21)的量隨著DNA聚合酶抑制劑濃度增加而增加，直到抑制劑的濃度約為75nM。在不包含DNA聚合酶抑制劑E的反應(yīng)組合物中(泳道A)，觀察到幾乎很少到?jīng)]有的需要的擴(kuò)增子。次級(jí)擴(kuò)增子條帶的密度隨著DNA聚合酶抑制劑濃度增加而減少。SMM^抑制包括引物二聚體的次級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物獲得5種商購(gòu)引物對(duì)和相應(yīng)的TaqMan報(bào)道探針(應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems))，用于驗(yàn)證基因表達(dá)測(cè)定，其包括用于下列各項(xiàng)的測(cè)定白介素l，P(IU(3;測(cè)定IDHs00174097一ml),TRAF家族成員-相關(guān)的NFKB激活物(TANK;測(cè)定IDHs00370305一ml),脂肪酸合酶(FASN;測(cè)定IDHs00188012—ml),溶質(zhì)載體家族2，成員l(SLC2A1;測(cè)定IDHs00197884一ml),和磷脂酶D1，磷脂酰膽堿-特異的(PLD1;測(cè)定IDHs00160118_ml)。為了評(píng)估示例性酶抑制劑對(duì)引物二聚體擴(kuò)增子形成的作用，平行制備5對(duì)缺少靶核酸的相應(yīng)的反應(yīng)組合物。每種20piL的反應(yīng)組合物對(duì)包括適當(dāng)?shù)囊飳?duì)和相應(yīng)的以lX濃度的TaqMan⑧探針；250dATP,dCTP禾口dGTP;500jxMdUTP;5mMMgCl2;2UAmpliTaqDNA聚合酶；60nMROX被動(dòng)參照；8%甘油；0.01%吐溫-20;0.01%NaN3;在50mMpH9Tris-HCl緩沖液中的1XSYBRGreenI;以及50nM聚合酶抑制劑E或無(wú)抑制劑。將這5組平行的反應(yīng)組合物在室溫下溫育30分鐘，然后轉(zhuǎn)移到ABIPRISM7900HT實(shí)時(shí)序列檢測(cè)系統(tǒng)儀器中。將反應(yīng)組合物加熱到95'C持續(xù)2分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，包括96。C5秒和60'C2分鐘。將15^L熱循環(huán)的反應(yīng)組合物加載至化/。瓊脂糖E凝膠(Iiwitrogen)的單個(gè)泳道上，如下IL1J3測(cè)定，泳道B(無(wú)抑制劑)和C(50nM聚合酶抑制劑E);TANK測(cè)定，泳道D(無(wú)抑制劑)和E(50nM聚合酶抑制劑E);FASN測(cè)定，泳道F(無(wú)抑制劑)和G(50nM聚合酶抑制劑E);SLC2Al觀ij定，泳道H(無(wú)抑制劑)和I(50nM聚合酶抑制劑E);以及PLD1測(cè)定，泳道J(無(wú)抑制劑)和K(50nM聚合酶抑制劑E)。將包括1200,800，400，200,和100堿基對(duì)標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)加載到泳道A和L上。將凝膠電泳15分鐘，并且通過(guò)用核酸染料溴化乙錠染色而顯示(在圖9中所示)。當(dāng)與缺少抑制劑的相應(yīng)的反應(yīng)組合物相比較時(shí)，例如，比較泳道B(IL1(3測(cè)定，無(wú)抑制劑)與C(IL1(3測(cè)定，50nM聚合酶抑制劑E)或者D(TANK測(cè)定，無(wú)抑制齊lj)與E(TANL測(cè)定，50nM聚合酶抑制劑E)，在包含抑制劑的反應(yīng)組合物中，不需要的引物二聚體產(chǎn)物的量至少被減少。SMM^減少與酶抑制劑相關(guān)的非特異性熒光為了使用PCR擴(kuò)增和解鏈曲線(xiàn)分析而評(píng)估示例性聚合酶抑制劑的示例性猝滅劑部分的作用，制備兩種反應(yīng)組合物。每種20^L的反應(yīng)組合物包括來(lái)自TANK測(cè)定(在實(shí)施例4中描述)的以1X濃度的引物和報(bào)道探針；10ng通用參照人cDNA(Stratagene);250dATP，dCTP和dGTP;500pMdUTP;5mMMgCl2;2UAmpliTaqDNA聚合酶，60nMROX被動(dòng)參照，8%甘油，0.01%吐溫-20，0.01%NaN3,在50mMpH9Tris-HCl緩沖液中的lXSYBRGreenI以及50nM"聚合酶抑制劑A"或50nM聚合酶抑制劑E。將反應(yīng)組合物在室溫下溫育15分鐘，然后轉(zhuǎn)移到ABIPRISM7900HT實(shí)時(shí)序列檢測(cè)系統(tǒng)儀器中，并且如在實(shí)施例4中所述進(jìn)行熱循環(huán)。使用所述儀器相關(guān)的軟件，設(shè)定為默認(rèn)條件，產(chǎn)生關(guān)于兩種熱循環(huán)反應(yīng)組合物的解離曲線(xiàn)，顯示在圖10中。當(dāng)所述熱循環(huán)的反應(yīng)組合物包括"聚合酶抑制劑A"時(shí)，觀察到兩個(gè)解離峰，包括峰A("聚合酶抑制劑A")和峰B(TANK擴(kuò)增子)。相反，使用包含聚合酶抑制劑B的熱循環(huán)反應(yīng)組合物獲得的解離曲線(xiàn)包含關(guān)于TANK擴(kuò)增子的峰(在更低組中表示為C)，但是關(guān)于聚合酶抑制劑E沒(méi)有解離峰是容易辨別的。本發(fā)明的酶抑制劑、酶-酶抑制劑復(fù)合物、方法和試劑盒己經(jīng)在本文中進(jìn)行了廣泛而全面地描述。落入總公開(kāi)內(nèi)容中的每種更窄的種類(lèi)和亞類(lèi)分組也形成本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的總描述，限制性條件或負(fù)性限制是從所述種類(lèi)去除任何主題，而不管所去除的物質(zhì)是否在本文中特別引用。前述實(shí)施例是用于舉例說(shuō)明目的，并且不意欲限制本發(fā)明的范圍。盡管已經(jīng)參考各種酶抑制劑、酶-酶抑制劑復(fù)合物、方法以及試劑盒描述了所公開(kāi)的發(fā)明，但是應(yīng)該理解，可以進(jìn)行各種不背離本發(fā)明的變化和修改。提供前述實(shí)施例，以更好地舉例說(shuō)明本發(fā)明，并且不意欲限制本發(fā)明的范圍?？梢砸罁?jù)附上的權(quán)利要求進(jìn)一步理解本發(fā)明的某些方面。權(quán)利要求1.一種包含DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑的復(fù)合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑包含核苷酸序列和猝滅劑。2.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其還包含核苷酸三磷酸(NTP)、核苷酸類(lèi)似物或NTP與核苷酸類(lèi)似物。3.權(quán)利要求l的復(fù)合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域、并且任選地，第四區(qū)域；并且其中所述第一區(qū)域與第三區(qū)域互補(bǔ)。4.權(quán)利要求3的復(fù)合物，其還包含NTP、核苷酸類(lèi)似物、或NTP與核苷酸類(lèi)似物。5.權(quán)利要求3的復(fù)合物，其中所述核苷酸序列不可通過(guò)DNA聚合酶延伸。6.權(quán)利要求3的復(fù)合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結(jié)合物。7.權(quán)利要求l的復(fù)合物，其中所述核苷酸序列包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域，并且所述第二寡核苷酸包括第三區(qū)域，并且任選地，第四區(qū)域，并且其中所述第一寡核苷酸的第一區(qū)域與所述第二寡核苷酸的第三區(qū)域互補(bǔ)。8.權(quán)利要求7的復(fù)合物，其還包含NTP、核苷酸類(lèi)似物、或NTP與核苷酸類(lèi)似物。9.權(quán)利要求7的復(fù)合物，其中所述第一寡核苷酸不能通過(guò)DNA聚合酶延伸，所述第二寡核苷酸不能通過(guò)DNA聚合酶延伸，或者所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸不能通過(guò)DNA聚合酶延伸。10.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。11.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括至少兩種不同的猝滅劑。12.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序13.權(quán)利要求12的復(fù)合物，其中所述核苷酸類(lèi)似物包括7-脫氮-2'-脫氧腺苷(脫氮-dA),7-脫氮_2，-脫氧鳥(niǎo)苷(脫氮-dG),雙脫氧核苷酸(ddN),鎖定核酸(LNA),肽核酸(PNA),或它們的組合。14.一種包含DNA聚合酶，DNA聚合酶抑制劑，和任選地，NTP，核苷酸類(lèi)似物，或NTP與核苷酸類(lèi)似物的復(fù)合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括核苷酸序列和猝滅劑；其中所述核苷酸序列包含第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域，和任選地，第四區(qū)域；其中所述第一區(qū)域與第三區(qū)域互補(bǔ)；其中所述第一區(qū)域、第三區(qū)域或第一區(qū)域和第三區(qū)域包含至少一個(gè)核苷酸類(lèi)似物；并且其中所述第一區(qū)域包含第一猝滅劑，并且所述第二區(qū)域包含第二猝滅劑。15.權(quán)利要求14的復(fù)合物，其中所述第三區(qū)域不能通過(guò)DNA聚合酶延伸，或者所述第四區(qū)域不能通過(guò)DNA聚合酶延伸。16.權(quán)利要求14的復(fù)合物，其中所述核苷酸類(lèi)似物包括脫氮-dA,脫氮-dG，ddN,LNA,PNA，或它們的組合。17.權(quán)利要求14的復(fù)合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結(jié)合物。18.—種DNA聚合酶抑制劑，其包括核苷酸序列和猝滅劑。19.權(quán)利要求18的DNA聚合酶抑制劑，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域，和任選地，第四區(qū)域；并且其中所述第一區(qū)域與第三區(qū)域互補(bǔ)。20.權(quán)利要求19的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸序列不能通過(guò)DNA聚合酶延伸。21.權(quán)利要求19的DNA聚合酶抑制劑，其還包括小溝結(jié)合物。22.權(quán)利要求18的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸序列包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域，并且所述第二寡核苷酸包括第三區(qū)域，和任選地，第四區(qū)域，并且其中所述第一寡核苷酸的第一區(qū)域與所述第二寡核苷酸的第三區(qū)域互補(bǔ)。23.權(quán)利要求22的DNA聚合酶抑制劑，其中所述第一寡核苷酸不能通過(guò)DNA聚合酶延伸，所述第二寡核苷酸不能通過(guò)DNA聚合酶延伸，或者所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸不能通過(guò)DNA聚合酶延伸。24.權(quán)利要求18的DNA聚合酶抑制劑，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。25.權(quán)利要求18的DNA聚合酶抑制劑，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括至少兩種不同的猝滅劑。26.權(quán)利要求18的DNA聚合酶抑制劑，其還包括核苷酸類(lèi)似物。27.權(quán)利要求26的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸類(lèi)似物包括脫氮-dA,脫氮-dG,ddN,LNA,PNA,或它們的組合。28.—種包含核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸序列包括第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域，和任選地，第四區(qū)域；其中所述第一區(qū)域與第三區(qū)域互補(bǔ)；其中所述第一區(qū)域包括核苷酸類(lèi)似物，所述第三區(qū)域包括核苷酸類(lèi)似物，或者所述第一區(qū)域與所述第三區(qū)域包含核苷酸類(lèi)似物；并且其中所述第一區(qū)域包括第一猝滅劑，并且所述第二區(qū)域包括第二猝滅劑。29.權(quán)利要求28的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸序列不能通過(guò)DNA聚合酶延伸。30.權(quán)利要求28的DNA聚合酶抑制劑，其還包括小溝結(jié)合物。31.權(quán)利要求28的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸類(lèi)似物包括脫氮-dA,脫氮-dG,ddN,PNA，LNA，或它們的組合。32.—種包括核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸序列包括5，-TCTGGGATA(脫氮-dA)TT(脫氮-dA)TGGTA(脫氮-dA)ATATG(Tn)C(脫氮-dA)TATTTATT(脫氮-dA)TA(脫氮-dA)TTATC-3',并且其中Tn包括TT，TTT，TTTT,TTTTT,或TTTTTT。33.權(quán)利要求32的DNA聚合酶抑制劑，其中所述猝滅劑包括至少兩種不同的猝滅劑。34.權(quán)利要求32的DNA聚合酶抑制劑，其還包括小溝結(jié)合物。35.權(quán)利要求32的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸序列包括5'-TCTGGGATA(脫氮-dA)TT(脫氮-dA)TGGTA(脫氮-dA)ATATGTTTTC(脫氮-dA)TATTTATT(脫氮-dA)TA(脫氮-dA)TTATC-3，，并且所述猝滅劑包括至少兩種不同的猝滅劑。36.權(quán)利要求35的DNA聚合酶抑制劑，其還包括小溝結(jié)合物。37.權(quán)利要求36的DNA聚合酶抑制劑，其中所述第一猝滅劑包括DABCYL,DABSYL,TAMRA,TET,和ROX中的至少一種；并且所述小溝結(jié)合物還包括第二猝滅劑。38.—種減少非特異性熒光的方法，其包括在第一溫度，形成包括DNA聚合酶，包含核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，核苷酸三磷酸(N丁P),靶核酸，引物，核酸染料，以及任選地核苷酸類(lèi)似物的反應(yīng)組合物，其中所述核苷酸序列包括至少一個(gè)雙鏈片段，其中所述DNA聚合酶和所述DNA聚合酶抑制劑締合形成復(fù)合物，并且其中所述猝滅劑抑制與所述核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料的熒光；將所述反應(yīng)組合物加熱到第二溫度，以使所述復(fù)合物解離；將所述反應(yīng)組合物進(jìn)行至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，以產(chǎn)生多種擴(kuò)增子；和在反應(yīng)組合物中檢測(cè)與多種擴(kuò)增子締合的核酸染料的熒光，其中所述猝滅劑抑制與所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料的熒光。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述檢測(cè)包括實(shí)時(shí)檢測(cè)。40.權(quán)利要求38的方法，其中所述檢測(cè)包括終點(diǎn)檢測(cè)。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述終點(diǎn)檢測(cè)包括解鏈曲線(xiàn)分析。42.權(quán)利要求38的方法，其中在第一溫度形成反應(yīng)組合物之前，將所述DNA聚合酶，DNA聚合酶抑制劑，以及任選地NTP和/或核苷酸類(lèi)似物在一起溫育，以形成復(fù)合物。43.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域，并且任選地，第四區(qū)域；并且其中所述第一區(qū)域與所述第三區(qū)域互補(bǔ)。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述核苷酸序列不能通過(guò)DNA聚合酶延伸。45.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結(jié)合物。46.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域，并且所述第二寡核苷酸包括第三區(qū)域，和任選地，第四區(qū)域，并且其中所述第一寡核苷酸的第一區(qū)域與所述第二寡核苷酸的第三區(qū)域互補(bǔ)。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述第一寡核苷酸不能通過(guò)DNA聚合酶延伸，所述第二寡核苷酸不能通過(guò)DNA聚合酶延伸，或者所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸不能通過(guò)DNA聚合酶延伸。48.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。49.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括至少兩種不同的猝滅劑。50.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括核苷酸類(lèi)似物。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述核苷酸類(lèi)似物包括脫氮-dA,脫氮-dG,ddN,LNA,PNA,或它們的組合。52.權(quán)利要求38的方法，其中所述靶核酸包括多種不同的靶核酸，所述引物包括多種不同的引物，并且所述多種擴(kuò)增子包括多種不同的擴(kuò)增子。53.權(quán)利要求38的方法，其中所述檢測(cè)還包括檢測(cè)探針。54.權(quán)利要求38的方法，其中所述靶核酸包括RNA。55.權(quán)利要求54的方法，其中所述RNA包括信使RNA(mRNA)。56.權(quán)利要求54的方法，其中所述RNA包括小RNA分子。57.權(quán)利要求56的方法，其中所述小RNA分子包括微小RNA(miRNA)。58.權(quán)利要求38的方法，其中所述第一溫度是約22T:到約4(rC。59.權(quán)利要求38的方法，其中所述第二溫度是約48'C到約73'C。60.權(quán)利要求59的方法，其中所述第二溫度是約53X:到約67T:。61.權(quán)利要求60的方法，其中所述第二溫度是64t:到67。C。62.權(quán)利要求38的方法，其中所述靶核酸包括DNA。63.權(quán)利要求38的方法，其中所述引物包括引物對(duì)，并且所述至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)包括DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。64.—種擴(kuò)增靶核酸的方法，其包括在第一溫度，形成包括DNA聚合酶，包含核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，NTP，靶核酸，引物，核酸染料，以及任選地核苷酸類(lèi)似物的反應(yīng)組合物，其中所述核苷酸序列包括至少一個(gè)雙鏈片段，其中所述DNA聚合酶和所述DNA聚合酶抑制劑締合形成復(fù)合物，并且其中所述猝滅劑抑制與所述核苷酸序列的雙鏈片段相締合的熒光；將所述反應(yīng)組合物加熱到第二溫度，以使所述復(fù)合物解離；并且將所述反應(yīng)組合物進(jìn)行至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，以產(chǎn)生多種擴(kuò)增子。65.權(quán)利要求64的方法，其中所述耙核酸包括RNA。66.權(quán)利要求65的方法，其中所述RNA包括mRNA。67.權(quán)利要求65的方法，其中所述RNA包括小RNA分子。68.權(quán)利要求67的方法，其中所述小RNA分子包括miRNA。69.權(quán)利要求64的方法，其中所述靶核酸包括DNA。70.權(quán)利要求64的方法，其中所述引物包括引物對(duì)，并且所述至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)包括PCR。71.權(quán)利要求64的方法，其中在第一溫度形成反應(yīng)組合物之前，將所述DNA聚合酶、DNA聚合酶抑制劑、和任選地，NTP和/或核苷酸類(lèi)似物在一起溫育，以形成復(fù)合物。72.權(quán)利要求64的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域，和任選地，第四區(qū)域；并且其中所述第一區(qū)域與所述第三區(qū)域互補(bǔ)。73.權(quán)利要求72的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列不能通過(guò)DNA聚合酶延伸。74.權(quán)利要求64的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結(jié)合物。75.權(quán)利要求64的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域，并且所述第二寡核苷酸包括第三區(qū)域，和任選地，第四區(qū)域，并且其中所述第一寡核苷酸的第一區(qū)域與所述第二寡核苷酸的第三區(qū)域互補(bǔ)。76.權(quán)利要求75的方法，其中所述第一寡核苷酸不能通過(guò)DNA聚合酶延伸，所述第二寡核苷酸不能通過(guò)DNA聚合酶延伸，或者所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸不能通過(guò)DNA聚合酶延伸。77.權(quán)利要求64的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。78.權(quán)利要求64的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括至少兩種不同的猝滅劑。79.權(quán)利要求64的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括核苷酸類(lèi)似物。80.權(quán)利要求79的方法，其中所述核苷酸類(lèi)似物包括脫氮-dA,脫氮-dG，ddN，LNA，PNA,或它們的組合。81.權(quán)利要求64的方法，其中所述耙核酸包括多種不同的耙核酸；所述引物包括多種不同的引物，多種不同的引物對(duì)，或它們的組合；并且多種擴(kuò)增子包括多種不同的擴(kuò)增子。82.權(quán)利要求64的方法，其中所述第一溫度是約22'C到約4(TC。83.權(quán)利要求64的方法，其中所述第二溫度是約48。C到約73。C。84.權(quán)利要求83的方法，其中所述第二溫度是約53'C到約67'C。85.權(quán)利要求83的方法，其中所述第二溫度是63"C到67'C。86.—種試劑盒，其包括包含核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑。87.權(quán)利要求86的試劑盒，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。88.權(quán)利要求86的試劑盒，其中所述核苷酸序列包括第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域，和任選地，第四區(qū)域；其中所述第一區(qū)域與第三區(qū)域互補(bǔ)。89.權(quán)利要求88的試劑盒，其中所述第一區(qū)域、第三區(qū)域、或第一區(qū)域與第三區(qū)域包括核苷酸類(lèi)似物；并且其中所述第一區(qū)域包括第一猝滅劑，所述第二區(qū)域包括第二猝滅劑，或者所述第一區(qū)域包括第一猝滅劑，以及所述第二區(qū)域包括第二猝滅劑。90.權(quán)利要求86的試劑盒，其中所述核苷酸序列包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區(qū)域，并且所述第二寡核苷酸包括第三區(qū)域，和任選地，第四區(qū)域，并且其中所述第一寡核苷酸的第一區(qū)域與所述第二寡核苷酸的第三區(qū)域互補(bǔ)。91.權(quán)利要求86的試劑盒，其中所述DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結(jié)合物。92.權(quán)利要求86的試劑盒，其還包括核酸染料。93.權(quán)利要求92的試劑盒，其中所述核酸染料包括，溴化乙錠，4，,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),不對(duì)稱(chēng)的花青染料，或它們的組合。94.權(quán)利要求93的試劑盒，其中所述不對(duì)稱(chēng)花青染料包括[2-[AH3-二甲基氨基丙基HV-丙基氨基]-4-[2,3-二氫-3-甲基-(苯并-l，3-噻唑-2-基)-亞甲基]-l-苯基-喹啉鑰](SYBRGreen),[2-[iV-雙-(3-二甲基氨基丙基)-氨基)-氨基]-4-[2,3-二氫-3-甲基-(苯并-l,3-噻唑-2-基)-亞甲基]-l-苯基-喹啉鎗](PicoGreen),4-[(3-甲基-6-(苯并噻唑-2-基)-2，3-二氫-(苯并-l,3-噻唑)-2-亞甲基)]-l-甲基吡啶鐵碘化物(BEBO),BOXTO,BETO，或它們的組合。95.權(quán)利要求86的試劑盒，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。96.權(quán)利要求86的試劑盒，其中所述核苷酸序列包括第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域，和任選地，第四區(qū)域；其中所述第一區(qū)域與第三區(qū)域互補(bǔ)。97.權(quán)利要求86的試劑盒，其還包括報(bào)道探針。98.—種包含酶和酶抑制劑的復(fù)合物，其中所述酶抑制劑包括核苷酸序列和猝滅劑。99.權(quán)利要求98的復(fù)合物，其中所述酶包括RNA聚合酶，連接酶，解旋酶，裂解酶，或它們的組合。100.權(quán)利要求98的復(fù)合物，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。101.權(quán)利要求98的復(fù)合物，其中所述抑制劑的核苷酸序列包括第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域，和任選地，第四區(qū)域；并且其中所述第一區(qū)域與第三區(qū)域互補(bǔ)。102.權(quán)利要求98的復(fù)合物，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括一種寡核苷酸，兩種寡核苷酸，或三種寡核苷酸。103.權(quán)利要求98的復(fù)合物，其中所述酶抑制劑包括至少兩種猝滅劑。104.—種酶抑制劑，其包括核苷酸序列和猝滅劑。105.權(quán)利要求103的酶抑制劑，其中所述核苷酸序列包括適體。106.權(quán)利要求104的酶抑制劑，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括一種寡核苷酸，兩種寡核苷酸，或三種寡核苷酸。107.權(quán)利要求104的酶抑制劑，其中所述核苷酸序列包括第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域、第四區(qū)域、第五區(qū)域和第六區(qū)域；其中所述第一區(qū)域與所述第三區(qū)域互補(bǔ)，并且所述第四區(qū)域與所述第六區(qū)域互補(bǔ)。108.權(quán)利要求107的酶抑制劑，其還包括不可連接的核苷酸。109.權(quán)利要求107的酶抑制劑，其還包括不可裂解的突出序列。110.權(quán)利要求109的酶抑制劑，其中所述不可裂解的突出序列包括不可裂解的核苷酸間連接。111.一種減少非特異性熒光的方法，其包括在第一溫度，形成包括酶，包含核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑，靶核酸，引物和核酸染料的反應(yīng)組合物，其中所述核苷酸序列可以形成至少一個(gè)雙鏈片段，其中所述酶和所述酶抑制劑締合形成復(fù)合物，并且其中所述猝滅劑抑制與所述酶抑制劑的核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料的熒光；將所述反應(yīng)組合物加熱到第二溫度，以使所述復(fù)合物解離；在所述反應(yīng)組合物中擴(kuò)增所述靶核酸，以產(chǎn)生多種擴(kuò)增子；并且在反應(yīng)組合物中檢測(cè)與多種擴(kuò)增子締合的核酸染料的熒光，其中所述猝滅劑抑制與所述酶抑制劑的核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料的熒光。112.權(quán)利要求lll的方法，其中所述酶包括RNA聚合酶，連接酶，解旋酶，裂解酶，或它們的組合。113.權(quán)利要求lll的方法，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。114.權(quán)利要求lll的方法，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括一種寡核苷酸、兩種寡核苷酸或三種寡核苷酸。115.權(quán)利要求lll的方法，其中所述反應(yīng)組合物包括引物、引物對(duì)、連接探針對(duì)、裂解探針對(duì)、或它們的組合。116.—種擴(kuò)增耙核酸的方法，其包括-在第一溫度，形成包括酶，酶抑制劑，耙核酸，和核酸染料的反應(yīng)組合物；其中所述酶抑制劑包括核苷酸序列和至少一種猝滅劑；其中所述核苷酸序列可以形成至少一個(gè)雙鏈片段；其中所述酶和所述酶抑制劑締合形成酶-酶抑制劑復(fù)合物;并且其中所述至少一種猝滅劑抑制與所述核苷酸序列的雙鏈片段相締合的熒光；將所述反應(yīng)組合物加熱到第二溫度，以使所述復(fù)合物解離；并且在所述反應(yīng)組合物中擴(kuò)增所述靶核酸，以產(chǎn)生多種擴(kuò)增子。117.權(quán)利要求116的方法，其中所述酶包括RNA聚合酶，連接酶，解旋酶，裂解酶，或它們的組合。118.權(quán)利要求116的方法，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。119.權(quán)利要求116的方法，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括一種寡核苷酸、兩種寡核苷酸或三種寡核苷酸。120.權(quán)利要求116的方法，其中所述反應(yīng)組合物包括引物、引物對(duì)、連接探針對(duì)、裂解探針對(duì)、或它們的組合。121.—種試劑盒，其包括包含核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑。122.權(quán)利要求121的試劑盒，其中所述酶抑制劑包括RNA聚合酶抑制劑，連接酶抑制劑，解旋酶抑制劑，裂解酶抑制劑，或它們的組合。123.權(quán)利要求122的試劑盒，其還包括引物、DNA聚合酶、連接酶或它們的組合。全文摘要本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增靶核酸同時(shí)減少非特異性熒光和不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物，有時(shí)叫作次級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物或假的副產(chǎn)物，的組合物、方法和試劑盒。本發(fā)明公開(kāi)的酶抑制劑包括核苷酸序列和至少一種猝滅劑。本發(fā)明還提供包括與酶締合的酶抑制劑的復(fù)合物，其中所述酶的至少一種酶促活性被抑制。本發(fā)明公開(kāi)了用于擴(kuò)增靶核酸同時(shí)減少不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，其是減少非特異性熒光的方法。本發(fā)明還提供了迅速進(jìn)行某些公開(kāi)的方法的試劑盒。文檔編號(hào)C12P19/34GK101321877SQ200680043159公開(kāi)日2008年12月10日申請(qǐng)日期2006年9月29日優(yōu)先權(quán)日2005年10月3日發(fā)明者丹尼·H·李,瓊科·史蒂文斯,董守連申請(qǐng)人:阿普里拉股份有限公司