專利名稱：：具有增加的乙酰透明質(zhì)酸Ⅱ產(chǎn)量的植物的制作方法具有增加的乙酰透明質(zhì)酸II產(chǎn)量的植物本發(fā)明涉及合成增加量的乙酰透明質(zhì)酸的植物細(xì)胞和植物，還涉及制備此類植物的方法，還涉及借助這些植物細(xì)胞或植物制備乙酰透明質(zhì)酸的或野生型植物相比具有乙酰透明質(zhì)酸合酶活性和額外增加的UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)活性。本發(fā)明還涉及具有增加的乙酰透明質(zhì)酸合成的植物用于制備乙酰透明質(zhì)酸和含有乙酰透明質(zhì)酸的食品或飼料的用途。乙酰透明質(zhì)酸是天然存在的不分枝的線性粘多糖(葡糖胺葡聚糖)，其由葡糖醛酸和N-乙酰基-葡糖胺的交替分子構(gòu)造。乙酰透明質(zhì)酸的基本構(gòu)件由二糖葡糖醛酸-P-1，3-N-乙酰基葡糖胺組成。在乙酰透明質(zhì)酸中，這些重復(fù)單元通過(guò)P-1,4鍵相互連接。在藥學(xué)中，通常使用術(shù)語(yǔ)透明質(zhì)酸。因?yàn)橐阴Ｍ该髻|(zhì)酸在多數(shù)情況中以聚陰離子存在而不是游離酸存在，所以在下文優(yōu)選使用術(shù)語(yǔ)乙酰透明質(zhì)酸，但是將理解每個(gè)術(shù)語(yǔ)都包括兩種分子形式。乙酰透明質(zhì)酸具有不尋常的物理化學(xué)性質(zhì)，例如聚電解質(zhì)性質(zhì)、粘彈性性質(zhì)、結(jié)合水的高負(fù)載、凝膠形成性質(zhì)，其除了乙酰透明質(zhì)酸的其他性質(zhì)外，描述于Lapcik等人(1998，ChemicalReviews98(8)，2663-2684)的綜述文章中。乙酰透明質(zhì)酸是脊推動(dòng)物的細(xì)胞外結(jié)締組織和體液的組分。在人類中，透明質(zhì)酸通過(guò)所有體細(xì)胞，特別是間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜合成，普遍存在于身體中，在結(jié)締組織、細(xì)胞外基質(zhì)、臍帶、關(guān)節(jié)液、軟骨組織和皮膚和眼睛的玻璃體中濃度尤其高(BernhardGebauer，1998，Inaugural-Dissertation,Virchow-KlinikumMedizinischeFakult這tCharit6derHumboldtUniversitStzuBerlin;Fraser等人，1997，JournalofInternalMedicine242，27-33)。最近，在動(dòng)物非脊推動(dòng)物生物(軟體動(dòng)物)中也發(fā)現(xiàn)了乙酰透明質(zhì)酸(Volpi和Maccari，2003，Biochimie85，619-625)。此夕卜，一些病原性革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(A和C組鏈球菌(^r印too"附))和革蘭氏陰性細(xì)菌(巴斯德菌屬)合成乙酰透明質(zhì)酸作為表多糖，其保護(hù)這些細(xì)菌免受它們的宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，因?yàn)橐阴Ｍ该髻|(zhì)酸是非免疫原性物質(zhì)。感染小球藻屬(C/^"http://)的單細(xì)胞綠藻的病毒的一些在草履蟲屬(」Pffm附ed"附)種中作為內(nèi)共生體存在，病毒感染后賦予單細(xì)胞綠藻合成乙酰透明質(zhì)酸的能力(Graves等人，1999，Virology257，15-23)。然而，合成乙酰透明質(zhì)酸不是表征所述藻類的特征。該藻類合成乙酰透明質(zhì)酸的能力通過(guò)病毒的感染介導(dǎo)，所述病毒的基因組具有編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的序列(DeAngelis，1997，Science278，1800-1803)。此外，所述病毒基因組含有編碼UDP葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)的序列。UDP-Glc-DH催化合成UDP葡糖醛酸，其被乙酰透明質(zhì)酸合酶用作底物(DeAngelis等人，1997，Science278，1800-1803，Graves等人，1999，Virology257，15-23)。UDP-Glc-DH在病毒感染的小球藻屬細(xì)胞中表達(dá)以進(jìn)行乙酰透明質(zhì)酸合成的作用，和它們是否是乙酰透明質(zhì)酸合成所需的不是已知的。天然存在的植物自身在它們的基因組中不具有編碼催化乙酰透明質(zhì)酸合成的蛋白質(zhì)的核酸，盡管已經(jīng)描述和表征了許多植物糖類，迄今還不可(Graves等人，1999,Virology257，15-23)。乙酰透明質(zhì)酸合成的催化通過(guò)單個(gè)膜整合的或膜結(jié)合的酶乙酰透明質(zhì)酸合酶實(shí)現(xiàn)。迄今為止被研究的乙酰透明質(zhì)酸合酶可以分為兩組I類乙酰透明質(zhì)酸合酶和II類乙酰透明質(zhì)酸合酶(DeAngelis，1999，CMLS，CellularandMolecularLifeSciences56，670-682)。脊推動(dòng)物的乙酰透明質(zhì)酸合酶可以通過(guò)所鑒定的同工酶進(jìn)一步區(qū)分。用阿拉伯?dāng)?shù)字以它們的標(biāo)識(shí)順序引用不同的同工酶(例如，hsHASl、hsHAS2、hsHAS3)。迄今還沒(méi)有完全闡明合成的乙酰透明質(zhì)酸分子通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜向細(xì)胞周圍介質(zhì)轉(zhuǎn)移的機(jī)理。以前的假說(shuō)認(rèn)為跨細(xì)胞膜運(yùn)輸通過(guò)乙酰透明質(zhì)酸合酶自身實(shí)現(xiàn)。然而，更近的研究指出乙酰透明質(zhì)酸分子跨細(xì)胞膜運(yùn)輸通過(guò)依賴能量的運(yùn)輸經(jīng)由負(fù)責(zé)該作用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)。從而，通過(guò)突變產(chǎn)生了鏈球菌菌林，其中活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成被抑制。這些菌林比對(duì)應(yīng)的野生型細(xì)菌菌林合成較少的乙酰透明質(zhì)酸(Ouskova等人，2004，Glycobiology14(10)，931-938)。在人成纖維細(xì)胞中，借助特異抑制已知的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可能闡明可以減少所產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量和乙酰透明質(zhì)酸合酶活性(Prehm和Schumacher,2004，BiochemicalPharmacology68，1401-1410)。能夠運(yùn)輸乙酰透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以多少量(如果存在)存在于植物中是未知的。乙酰透明質(zhì)酸的不尋常的性質(zhì)提供了在多種領(lǐng)域中應(yīng)用的可能性，如應(yīng)用于藥學(xué)、化妝品工業(yè)、食品和飼料生產(chǎn)、技術(shù)應(yīng)用(例如，作為潤(rùn)滑劑)等等。乙酰透明質(zhì)酸當(dāng)前的最重要的應(yīng)用是藥物和化妝品領(lǐng)域(見(jiàn)，例如，Lapcik等人，1998，ChemicalReviews98(8)，2663-2684，Goa和Benfield，1994，Drugs47(3)，536-566)。在醫(yī)藥領(lǐng)域，含有乙酰透明質(zhì)酸的產(chǎn)品當(dāng)前被用于關(guān)節(jié)內(nèi)治療關(guān)節(jié)病和在眼科中用于眼外科。乙酰透明質(zhì)酸還被用于治療賽馬中的關(guān)節(jié)病癥。此外，透明質(zhì)酸是一些鼻科藥物中的組分，例如，以眼滴劑和鼻滴劑(nasalia)的形式用于濕潤(rùn)干燥的粘膜。用于注射的含有乙酰透明質(zhì)酸的溶液被用作鎮(zhèn)痛劑和抗風(fēng)濕劑。包含乙酰透明質(zhì)酸或衍生的乙酰透明質(zhì)酸的貼劑用于傷口愈合。作為皮膚用藥，含有乙酰透明質(zhì)酸的凝膠植入物被用于矯正整形外科中的皮膚變形。對(duì)于藥理學(xué)應(yīng)用，優(yōu)選使用具有高分子量的乙酰透明質(zhì)酸。在化妝品藥物中，乙酰透明質(zhì)酸制劑是最合適的皮膚填充材料。通過(guò)注射乙酰透明質(zhì)酸，可能在有限的時(shí)間期限內(nèi)光滑皺紋或者增加嘴唇體積。在化妝品產(chǎn)品中，尤其在皮膚霜?jiǎng)┖拖磩┲?，乙酰透明質(zhì)酸由于它的高水結(jié)合容量而經(jīng)常用作濕潤(rùn)劑。此外，含有乙酰透明質(zhì)酸的制劑以所稱作的營(yíng)養(yǎng)制品(食物補(bǔ)充劑)出售，其也可以用于動(dòng)物(例如，狗、馬)中預(yù)防和減輕關(guān)節(jié)病。用于商業(yè)目的的乙酰透明質(zhì)酸當(dāng)前從動(dòng)物組織(雞冠)分離或者使用細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)酵制備。US4,141,973描述了從雞冠或備選地從臍帶分離乙酰透明質(zhì)酸的方法。除了乙酰透明質(zhì)酸外，動(dòng)物組織(例如，雞冠、臍帶)也含有與乙酰透明質(zhì)酸相關(guān)的其他粘多糖類，如硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、石克酸乙酰肝素和肝素。此外，動(dòng)物有機(jī)體含有蛋白質(zhì)(hyaladherins)，其特異結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸并且是生物中多數(shù)不同功能所需的，如肝臟中乙酰透明質(zhì)酸的降解、乙酰透明質(zhì)酸作為細(xì)胞遷移的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的功能、胞吞作用的調(diào)節(jié)、乙酰透明質(zhì)酸在細(xì)胞表面的錨定或者乙酰透明質(zhì)酸網(wǎng)絡(luò)的形成(Turley，1991，AdvDrugDeliveryRev7,257ff.;Laurent和Fraser，1992，F(xiàn)ASEBJ.6，183ff.;Stamenkovic和Aruffo，1993,MethodsEnzymol.245，195ff;Knudson和Knudson,1993，F(xiàn)ASEB7，1233ff.)。用于乙酰透明質(zhì)酸的細(xì)菌生產(chǎn)的鏈球菌屬菌林唯一地是病原性細(xì)菌。在培養(yǎng)期間，這些細(xì)菌也產(chǎn)生(致熱性)外毒素和溶血素類(鏈球菌溶血素，尤其a和p溶血素)(Kilian，M.:Streptococcus和Enterococcus.在繞Wc"/7kf/cro6/(/ogj;.Greenwood,D.;Slack,RCA;Peutherer,J.F.(Eds.).第16章.ChurchillLivingstone,Edinburgh,UK:pp.174-188，2002，ISBN0443070776)，它們被釋放到培養(yǎng)基中。這使得用鏈球菌菌林制備的乙酰透明質(zhì)酸的純化和分離更困難。尤其對(duì)于藥物應(yīng)用，制劑中外毒素和溶血素的存在是個(gè)問(wèn)題。US4,801,539描述了通過(guò)發(fā)酵誘變的細(xì)菌菌林(S^r/^occ附z卯^fcw/c附)制備乙酰透明質(zhì)酸。經(jīng)誘變的細(xì)菌菌林不再合成p溶血素。實(shí)現(xiàn)的產(chǎn)率為每升培養(yǎng)物3.6g乙酰透明質(zhì)酸。EP0694616描述了培養(yǎng)Are/toc0cc"s^oe^附/c"s或馬鏈球菌(&r印tococc附e《M,')的方法，其中在所用的培養(yǎng)條件下，不合成鏈球菌溶血素，但是乙酰透明質(zhì)酸的量增加。實(shí)現(xiàn)的產(chǎn)量為每升培養(yǎng)物3.5g乙酰透明質(zhì)酸。在培養(yǎng)期間，鏈球菌菌林向培養(yǎng)基釋放酶透明質(zhì)酸酶，結(jié)果在該生產(chǎn)系統(tǒng)中，分子量在純化期間也降低。在US4,782,046中描述了使用透明質(zhì)酸酶陰性鏈球菌菌林或者產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸的方法，其中培養(yǎng)期間透明質(zhì)酸酶的產(chǎn)生被抑制。實(shí)現(xiàn)的產(chǎn)率高達(dá)每升培養(yǎng)物2.5g乙酰透明質(zhì)酸，并且實(shí)現(xiàn)的最大平均分子量為3.8x106Da，分子量分布為2.4x106到4.0x106。US20030175902和WO03054163描述了借助來(lái)自似馬鏈球菌(&"/7to"cc附^M/w7m7/s)的乙酰透明質(zhì)酸合酶在枯草芽孢桿菌(丑""7/附sw6似/s)中的異源表達(dá)制備乙酰透明質(zhì)酸。為了實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生足夠量的乙酰透明質(zhì)酸，除了異源表達(dá)乙酰透明質(zhì)酸合酶外，還需要在芽孢桿菌細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)UDP葡萄糖脫氫酶。US20030175卯2和WO03054163沒(méi)有陳述借助枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)中得到的乙酰透明質(zhì)酸的絕對(duì)量。實(shí)現(xiàn)的最大平均分子量為約4.2x106。然而，該平均分子量?jī)H僅為重組芽孢桿菌菌株實(shí)現(xiàn)，其中編碼來(lái)自似馬鏈球菌的乙酰透明質(zhì)酸合酶的基因和編碼來(lái)自枯草芽孢桿菌的UDP葡萄糖脫氫酶的基因被整合到枯草芽孢桿菌基因組中處于"附y(tǒng)Q啟動(dòng)子控制下，其中同時(shí)失活枯草芽孢桿菌內(nèi)源c矽Y基因(其編碼細(xì)胞色素P450氧化酶)。WO05012529描述了轉(zhuǎn)基因煙草植物的制備，其用編碼來(lái)自感染小球藻的病毒的乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子轉(zhuǎn)化。在WO05012529中，一方面，利用編碼小球藻病毒毒林CVHIl的乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸序列，另一方面，利用小球藻病毒毒林CVKA1轉(zhuǎn)化煙草植物。僅僅可以為用編碼從小球藻病毒毒林CVKA1分離的乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸轉(zhuǎn)化的植物闡明乙酰透明質(zhì)酸的合成。對(duì)于用編碼從小球藻病毒毒林CVHI1分離的乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸序列轉(zhuǎn)化的煙草植物，在對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物中不可能檢測(cè)到乙酰透明質(zhì)酸合成。在WO05012529中唯一的產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)基因煙草植物合成的乙酰透明質(zhì)酸的量被陳述為每ml測(cè)量的體積約4.2ng乙酰透明質(zhì)酸，考慮進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)的描述，對(duì)應(yīng)于每克鮮重植物材料產(chǎn)生最多12JLlg量的乙酰透明質(zhì)酸。乙酰透明質(zhì)酸合酶催化從原料UDP-N-乙酰基—葡糖胺和UDP-葡糖醛酸合成乙酰透明質(zhì)酸。所提到的兩種原料都存在于植物細(xì)胞中。在植物細(xì)胞中，UDP-葡糖醛酸作為抗壞血酸的幾種可能的合成途徑之一的代謝物(Lorence等人，2004，PlantPhysiol134，1200-1205)和作為細(xì)胞壁組分果膠和半纖維素合成的中心代謝物，它們?cè)谥参锛?xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成(Reiter，1998，PlantPhysiolBiochem36(1)，167-176)。最重要的和最經(jīng)常遇到的果膠單體是D-半乳糖醛酸(2004，H.W.Heldt在"PlantBiochemistry",第三版，AcademicPress,ISBN0120883910)，其使用UDP-葡糖酪酸合成。此外，還可能使用UDP-葡糖醛酸合成半纖維素和果膠合成的代謝物UDP-木糖、UDP-阿拉伯糖、UDP-半乳糖醛酸和UDP-齊菜糖(Seitz等人，2000，PlantJournal,21(6)，537-546)。在植物細(xì)胞中，UDP國(guó)葡糖醛酸可以通過(guò)己糖磷酸代謝合成，所述代謝包括通過(guò)UDP-Glc-DH將UDP葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP-葡糖醛酸，或通過(guò)氧化肌醇代謝途徑，其包括通過(guò)葡糖醛酸l-磷酸尿苷酰(uridilyl)轉(zhuǎn)移酶將葡糖醛酸l-磷酸轉(zhuǎn)化為UDP-葡糖醛酸。葡糖醛酸合成的兩種代謝途徑似乎相互獨(dú)立地存在，或者備選地在擬南芥植物的不同組織/發(fā)育階段存在(Seitz等人，2000，PlantJournal21(6)，537-546)。所提到的兩種代謝途徑(己糖磷酸和氧化性肌醇代謝途徑)關(guān)于UDP-葡糖醛酸合成的各自的貢獻(xiàn)迄今還沒(méi)有闡明(Kark6nen，2005，PlantBiosystems139(1)，46-49)。酶UDP-Glc-DH催化UDP葡萄糖向UDP-葡糖醛酸的轉(zhuǎn)化。Samac等人(2004，AppliedBiochemistryandBiotechnology113-116,HumanaPress,EditorAshokMulehandani，1167-1182)描述了來(lái)自大豆的UDP-Glc-DH在苜蓿的韌皮部細(xì)胞中的組織特異性過(guò)表達(dá)，目的是增加這些植物的莖干中的果膠含量。與對(duì)應(yīng)的野生型植物相比，UDP-Glc-DH的活性可以被增加200%以上；然而，對(duì)應(yīng)的植物產(chǎn)生的果膠的量低于對(duì)應(yīng)的野生型植物產(chǎn)生的果膠的量。所述轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞壁級(jí)分中木糖和鼠李糖單體的量增加了，而細(xì)胞壁級(jí)分中甘露糖單體的量減少了。UDP-Glc-DH在擬南芥植物中組成型過(guò)表達(dá)導(dǎo)致所述植物與對(duì)應(yīng)的野生型植物相比顯示出異常生長(zhǎng)并且具有矮小表型。對(duì)應(yīng)植物的細(xì)胞壁級(jí)分與對(duì)應(yīng)的野生型植物相比具有增加量的甘露糖和半乳糖和減少量的木糖、阿拉伯糖和糖醛酸類(Roman，2004，"StudiesonTheRoleofUDP-Glc-DHinPolysaccharideBiosynthesis",Dissertation,ActaUniversitatisUpsaliensis，ISBN91-554-6088-7,ISSN0282-7476)。從而，這些結(jié)果與Samac等人(2004，AppliedBiochemistryandBiotechnology113-116,HumanaPress,EditorAshokMulehandani，1167-1182)的結(jié)果至少部分矛盾，Samac等人發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞壁級(jí)分中減少量的甘露糖和增加量的木糖。通過(guò)細(xì)菌菌林的發(fā)酵產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸與高成本相關(guān)，因?yàn)榧?xì)菌必須在密閉的無(wú)菌容器中在昂貴的受控的培養(yǎng)條件下發(fā)酵(見(jiàn)例如，US4,897,349)。此外，通過(guò)細(xì)菌菌林發(fā)酵產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量受到每種情況下存在的生產(chǎn)設(shè)施的限制。這里，必須考慮發(fā)酵罐，由于物理法則，其不能建造為過(guò)大的培養(yǎng)體積。特別可以提到的是從外界喂飼的物質(zhì)(例如，細(xì)菌的必需營(yíng)養(yǎng)源、用于調(diào)節(jié)pH的試劑、氧)與有效生產(chǎn)所需的培養(yǎng)基的均勻混合，其在大的發(fā)酵罐中只可以以大的技術(shù)消耗(如果存在)來(lái)確保。由于在動(dòng)物組織中存在其他粘多糖類和特異結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸的蛋白質(zhì)，從動(dòng)物有機(jī)體純化乙酰透明質(zhì)酸復(fù)雜化。在患者中，使用動(dòng)物蛋白污染的含有乙酰透明質(zhì)酸的藥物制劑可以導(dǎo)致身體的不想要的免疫反應(yīng)(US4,141,973)，尤其患者對(duì)動(dòng)物蛋白(例如，雞卵白)過(guò)敏的情況下。此外，可以以滿意的質(zhì)量和純度從動(dòng)物組織得到的乙酰透明質(zhì)酸的量(產(chǎn)率)是低的(雞冠0.079%w/w，EP0144019,US4,782,046)，其使得必須處理大量的動(dòng)物組織。從動(dòng)物組織分離乙酰透明質(zhì)酸的另一問(wèn)題在于純化期間乙酰透明質(zhì)酸的分子量降低，因?yàn)閯?dòng)物組織也含有乙酰透明質(zhì)酸降解酶(透明質(zhì)酸酶)。除了所提到的透明質(zhì)酸酶和外毒素外，鏈球菌菌林還產(chǎn)生內(nèi)毒素，其當(dāng)存在于藥學(xué)產(chǎn)品中時(shí)，對(duì)患者的健康造成危險(xiǎn)。在科學(xué)研究中，表明甚至市場(chǎng)上的含有乙酰透明質(zhì)酸的藥品也含有可檢測(cè)量的細(xì)菌外毒素(Dick等人，2003，EurJOpthalmol.13(2),176-184)。用鏈球菌菌林產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的另一缺點(diǎn)是分離的乙酰透明質(zhì)酸具有比從雞冠分離的乙酰透明質(zhì)酸低的分子量(Lapcik等人1998，ChemicalReviews98(8)，2663-2684)。US20030134393描述了使用鏈球菌菌林產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸，其合成尤其顯著的乙酰透明質(zhì)酸莢膜(超莢膜化)。發(fā)酵后分離的乙酰透明質(zhì)酸具有9.1xl06的分子量。然而，產(chǎn)量為每升僅僅350mg。通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵或從動(dòng)物組織分離產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸的一些缺點(diǎn)可以通過(guò)用轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸來(lái)避免；然而，使用轉(zhuǎn)基因植物可以產(chǎn)生的當(dāng)前實(shí)現(xiàn)的乙酰透明質(zhì)酸量將需要相對(duì)大面積的栽培以產(chǎn)生相對(duì)大量的乙酰透明質(zhì)酸。此外，從具有較低乙酰透明質(zhì)酸含量的植物分離或純化乙酰透明質(zhì)酸被認(rèn)為比從具有較高乙酰透明質(zhì)酸含量的植物分離或純化更復(fù)雜和昂貴。盡管乙酰透明質(zhì)酸具有不尋常的性質(zhì)，但是由于它的稀少性和高價(jià)格，其很少(如果有)用于工業(yè)應(yīng)用。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供手段和方法，其允許以足夠的量和質(zhì)量提供乙酰透明質(zhì)酸并且使得可能提供甚至用于工業(yè)應(yīng)用和食品和飼料領(lǐng)域應(yīng)用的乙酰透明質(zhì)酸。通過(guò)權(quán)利要求中列出的實(shí)施方案實(shí)現(xiàn)了該目的。從而，本發(fā)明涉及遺傳修飾的植物細(xì)胞或遺傳修飾的植物，其具有穩(wěn)定整合到它們的基因組中的核酸分子，所述核酸分子編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶，其特征是所述植物細(xì)胞或所述植物與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物相比，額外具有升高活性的具有(酶促)UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)活性的蛋白質(zhì)。這里，根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的遺傳修飾可以是任何遺傳修飾，其導(dǎo)致編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞或植物中，并且與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物相比，在遺傳修飾的植物細(xì)胞或遺傳修飾的植物中增加了具有UDP-Glc-DH的(酶促)活性的蛋白質(zhì)的活性。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"野生型植物細(xì)胞"將被理解為指用作制備根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞的原材料的植物細(xì)胞，即它們的遺傳信息除了所導(dǎo)入的遺傳修飾和導(dǎo)致編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子穩(wěn)定整合和增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的活性外，對(duì)應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞的遺傳信息。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"野生型植物"將被理解為指用作制備根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的原材料的植物，即它們的遺傳信息除了所導(dǎo)入的遺傳修飾和導(dǎo)致編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子穩(wěn)定整合和增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的活性外，對(duì)應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的遺傳信息。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"對(duì)應(yīng)的"指當(dāng)比較多種目標(biāo)時(shí)，被相互比較的所述目標(biāo)處于相同的條件下。在本發(fā)明上下文中，在野生型細(xì)胞或野生型植物的上下文中的術(shù)語(yǔ)"對(duì)應(yīng)的"指相互比較的植物細(xì)胞或植物在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)并且它們具有相同的(培養(yǎng))年齡。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"乙酰透明質(zhì)酸合酶，，(EC2.4丄212)理解為指從底物UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)和N-乙?；?葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成乙酰透明質(zhì)酸的蛋白質(zhì)。根據(jù)下面的反應(yīng)圖催化乙酰透明質(zhì)酸合成nUDP-GlcA+nUDP畫GlcNAc—卩-l，4-[GlcA誦p陽(yáng)l，3國(guó)GlcNAcn+2nUDP蛋白質(zhì)序列兔(Ozjcto/"g附c朋/cw/附)ocHas2(EMBLAB055978.1,US20030235893)、ocHas3(EMBLAB055979.1，US20030235893);狒狒(尸"/7,》"w函)paHasl(EMBLAY463695.1);蛙(AT卿戸/畫》xlHasl(EMBLM22249.1,US20030235893)、xlHas2(DG42)(EMBLAF168465.1)、x舊as3(EMBLAY302252.1);人(Fo附os"/7/e"s)hsHASl(EMBLD84424.1，US20030235893)、hsHAS2(EMBLU54804.1,US20030235893)、hsHAS3(EMBLAF232772.1,US20030235893);小鼠(Af附/w""w/附)，mmHasl(EMBLD82964.1,US20030235893)、mmHAS2(EMBLU52524.2,US20030235893)、mmHas3(EMBLU86408.2,US20030235893);牛,似"尸附)btHas2(EMBLAJ004951.1,US20030235893);雞(GW/附g"/,"s)ggHas2(EMBLAF106940.1，US20030235893);大鼠(i""附朋fwg/c附)rnHas1(EMBLAB097568.1，Itano等人，2004，J.Biol.Chem.279(18)18679-18678)、rnHas2(EMBLAF008201.1);rnHas3(NCBINM—172319.1，Itano等人，2004，J.Biol.Chem.279(18)18679-18678)，馬(五《"wsc"6"〃附)ecHAS2(EMBLAY056582.1，GI:23428486)，豬(5""s^ro/ff)sscHAS2(NCBINM—214053.1，GI:47522921)、sscHas3(EMBLAB159675)，斑馬魚(ZM"/。簡(jiǎn)》)brHasl(EMBLAY437407),brHas2(EMBLAF190742.1)brHas3(EMBLAF190743.1);多殺巴斯德菌(i>fl1stewre//fl附w/to"V/fl)pmHas(EMBLAF036004.2);酉良膿鏈球菌(5V/r/to"ccws/;j^ww")spHas(EMBL，L20853.1，L21187.1，US6,455,304，US20030235893);馬鏈球菌(^"/7tococc附qw/s)seHas(EMBLAF347022.1,AY173078.1),乳房鏈球菌(S^卬似cocc附"&Ws)suHasA(EMBLAJ242946.2，US20030235893)，似馬鏈球菌(竿/s/附船)seqHas(EMBLAF023876.1,US20030235893);5W/o/M附^//"似Wc附ssHAS(US20030235893),5Ti(/b/o6wstoA:o</a/ZstHas(AP000988.1),緣草履蟲(Pflm附ec/w附6wra"/7a)小球藻病毒1，cvHAS(EMBLU42580.3，PB42580，US20030235893)。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)"(E.C.1.1.1.22)理解為指從UDP-葡萄糖(UDP-Glc)和NAD+合成UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)和NADH的蛋白質(zhì)。該催化根據(jù)下面的反應(yīng)式進(jìn)行UDP-Glc+2NAD+—UDP畫GlcA+2NADH在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"具有UDP-Glc-DH的(酶促)活性的蛋白質(zhì)的增加的活性"指編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因的增加的表達(dá)和/或編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物的增加的量和/或具有UDP-Glc-DH的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中增加的量和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中增加的酶促活性。例如，通過(guò)測(cè)量編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物的量(例如，通過(guò)RNA印跡分析或RT-PCR)，可以測(cè)定增加的表達(dá)。這里，增加優(yōu)選指與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物相比，轉(zhuǎn)錄物的量增加至少50%，尤其至少70%，優(yōu)選至少85%，尤其優(yōu)選至少100%。編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物的量的增加也指沒(méi)有可檢測(cè)量的編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物?？梢詼y(cè)定導(dǎo)致所述植物細(xì)胞中這些蛋白質(zhì)的增加活性的具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的量的增加，例如，可以通過(guò)免疫學(xué)方法，如蛋白質(zhì)印跡分析、EUSA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)或者RIA(放射免疫測(cè)定法)。制備與具體蛋白質(zhì)特異反應(yīng)，例如，特異結(jié)合所述蛋白質(zhì)的抗體的方法是本領(lǐng)^U支術(shù)人員已知的(見(jiàn)，例如，Lottspeich和Zorbas(Eds.)，1998,Bioanalytik[Bioanalysisj，Spektrumakad.Verlag，Heidelberg,Berlin,ISBN3-8274-0041-4)。一些公司(例如，Eurogentec，比利時(shí))提供此類抗體的制劑作為訂單服務(wù)。這里，蛋白質(zhì)量的增加優(yōu)選指與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物相比，具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的量增加至少50%，尤其至少70%，優(yōu)選至少85%，尤其優(yōu)選至少100%。具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的量的增加也指具有不可檢測(cè)量的具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的植物或植物細(xì)胞在根據(jù)本發(fā)明的遺傳#"飾后具有可檢測(cè)量的具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法描述植物提取物中具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的增加的活性，如WO0011192中所述。測(cè)定具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的活性量的優(yōu)選方法在一般方法(第5項(xiàng))中給出。具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的增加量的(酶促)活性優(yōu)選指此類蛋白質(zhì)的活性與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或者沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物相比增加至少50%,優(yōu)選至少70%，特別優(yōu)選至少85%,尤其優(yōu)選至少100%。具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的增加量的(酶促)活性也指沒(méi)有可檢測(cè)量的具UDP-Glc-DH活性蛋白質(zhì)的植物或植物細(xì)胞在根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾后具有可檢測(cè)量的具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"基因組，，理解為指植物細(xì)胞中存在的全部遺傳物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，除了細(xì)胞核，其他隔室(例如，質(zhì)體、線粒體)也含有遺傳物質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定整合的核酸分子"理解為指核酸分子整合到植物基因組中。穩(wěn)定整合的核酸分子的特征在于在對(duì)應(yīng)的整合位點(diǎn)復(fù)制期間，它與宿主的整合位點(diǎn)邊界的核酸序列一起復(fù)制，從而，復(fù)制的DNA鏈中的整合位點(diǎn)被作為復(fù)制模板的閱讀鏈上相同的核*列包圍。用于將核酸分子穩(wěn)定整合到植物宿主細(xì)胞的多種技術(shù)是可以得到的。這些技術(shù)包括使用根瘤土壤桿菌(Jgro6"cten7i附m附e/fl"'e附)或發(fā)根土壤桿菌(j^y^fl"^7'w附z7i&m柳m)作為轉(zhuǎn)化工具用t-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、原生質(zhì)體融合、DNA的注射、電穿孔、通過(guò)生物射彈方法導(dǎo)入DNA，以及其他選擇("TransgenicPlants",Leandroed.，HumanaPress2004，ISBN1-59259-827-7中綜述)。使用土壤桿菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化已經(jīng)進(jìn)行了深入研究并且已經(jīng)在EP120516;Hoekema，IN:TheBinaryPlantVectorSystemOffsetdrukkerijKantersB.V.Alblasserdam(1985)，ChapterV;Fraley等人，Crit.Rev.PlantSci.4，1-46和在An等人EMBOJ.4，(1985)，277-287中詳細(xì)描述。對(duì)于馬鈴薯的轉(zhuǎn)化，見(jiàn)例如Rocha-Sosa等人，EMBOJ.8，(1989)，29-33)，對(duì)于番茄才直物的轉(zhuǎn)化，見(jiàn)例如US5，565，347。也已經(jīng)描述了使用基于土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體轉(zhuǎn)化單子葉植物(Chan等人，PlantMol.Biol.22，(1993)，491-506;Hiei等人，PlantJ.6，(1994)271-282;Deng等人，ScienceinChina33，(19卯)，28-34;Wilmink等人，PlantCellReports11,(1992)，76-80;May等人，Bio/Technology13，(1995)，486-492;ConnerandDomisse，Int.J.PlantSci.153(1992)，550-555;Ritchie等人，TransgenicRes.2，(1993)，252-265)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的備選系統(tǒng)是使用生物射彈方法轉(zhuǎn)化(Wan和Lemaux，PlantPhysiol.104，(1994)，37-48;Vasil等人，Bio/Technology11(1993)，1553-1558;Ritala等人，PlantMol.Biol.24，(1994)，317-325;Spencer等人，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、部分透化細(xì)胞的電穿孔、使用玻璃纖維導(dǎo)入DNA。具體地，在文獻(xiàn)中已經(jīng)多次描述了玉米的轉(zhuǎn)化(參考例如，WO95/06128,EP0513849,EP0465875,EP0292435;Fromm等人，Biotechnology8，(19卯)，833-844;Gordon-Kamm等人，PlantCell2，(1990)，603-618;Kozid等人，Biotechnology11(1993)，194-200;Moroc等人，Theor.Appl.Genet.80,(19卯)，721-726)。也已經(jīng)描述了其他草，如柳枝稷(尸"ai/cm附v/rgff似附)的轉(zhuǎn)4匕(Richards等人，2001，PlantCellReporters20，48-54)。也已經(jīng)描述了其他谷類物種的成功的轉(zhuǎn)化，例如，大豆(Wan和Lemaux，s.o.;Ritala等人，s.o.;Krens等人，Nature296，(1982)，72-74)和小麥(Nehra等人，PlantJ.5，(1994)，285-297;Becker等人，1994，PlantJournal5，299-307)的轉(zhuǎn)化。所有上面的方法在本發(fā)明的上下文中都是合適的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物提供了如下優(yōu)點(diǎn)它們比僅僅具有乙酰透明質(zhì)酸合酶活性的植物產(chǎn)生更高量的乙酰透明質(zhì)酸。這允許以很小的支出產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸，因?yàn)閺木哂休^高乙酰透明質(zhì)酸含量的植物分離乙酰透明質(zhì)酸較不復(fù)雜并且更劃算。此外，與現(xiàn)有技術(shù)中描述的植物相比，使用根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物需要較小的栽培區(qū)面積來(lái)產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸。這導(dǎo)致可能甚至對(duì)于工業(yè)應(yīng)用以足夠的量提供乙酰透明質(zhì)酸，在工業(yè)應(yīng)用中，由于它的稀少和高價(jià)格而在當(dāng)前沒(méi)有使用乙酰透明質(zhì)酸。小球藻屬的病毒感染的植物生物不適于產(chǎn)生相對(duì)大量的乙酰透明質(zhì)酸。在乙酰透明質(zhì)酸的生產(chǎn)中，病毒感染的藻類具有乙酰透明質(zhì)酸合成所需的基因不穩(wěn)定整合到它們的基因組中的缺點(diǎn)(VanEtten和Meints，1999，Annu.Rev.Microbiol.53，447-494),因此，為了產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸，必須重復(fù)病毒感染。因此，不可能分離連續(xù)合成所希望的質(zhì)量和數(shù)量的乙酰透明質(zhì)酸的個(gè)別小球藻細(xì)胞。此外，在病毒感染的小球藻中，僅在有限的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸，并且由于病毒引起的裂解,僅僅在感染后約8小時(shí)藻類就被殺死(VanEtten等人，2002，ArchVirol147，1479-1516)。相比，本發(fā)明提供了如下優(yōu)點(diǎn)根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞和根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物以無(wú)限制的方式進(jìn)行無(wú)性或有性繁殖并且它們連續(xù)產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸。WO05012529中描述了轉(zhuǎn)基因植物，其具有編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子，合成相對(duì)小量的乙酰透明質(zhì)酸。相比，本發(fā)明提供了如下優(yōu)點(diǎn)顯更高量的乙酰透明質(zhì)酸。因此，本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物，其合成乙酰透明質(zhì)酸。已經(jīng)觀察到乙酰透明質(zhì)酸隨著發(fā)育時(shí)間在植物組織中積累；因此，將特別優(yōu)選在所述植物細(xì)胞或所述植物收獲期間或者收獲前(1或2)天測(cè)定干重中乙酰透明質(zhì)酸的量。這里，就將用于進(jìn)一步處理的乙酰透明質(zhì)酸的量而言，尤其使用植物材料(例如，塊莖、種子、葉子)。合成乙酰透明質(zhì)酸的根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物可以通過(guò)分離它們合成的乙酰透明質(zhì)酸和證明其結(jié)構(gòu)來(lái)鑒定。因?yàn)橹参锝M織具有不含有透明質(zhì)酸酶的優(yōu)點(diǎn)，所以可以用簡(jiǎn)單而快速的植物中存在乙酰透明質(zhì)酸。為此，向待檢查的植物組織加入水，然后機(jī)械搗碎(借助例如，玻珠研磨機(jī)、打漿機(jī)、韋林?jǐn)嚽衅?、液汁提取器?植物組織。如果需要，然后向混懸液加入更多水，并通過(guò)離心或過(guò)篩除去細(xì)胞殘?jiān)退蝗苄越M分。使用例如特異結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸的蛋白質(zhì)可以闡明離心后得到的上清液中乙酰透明質(zhì)酸的存在。借助特異結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸的蛋白質(zhì)檢測(cè)乙酰透明質(zhì)酸的方法描述于例如US5,019,498。用于實(shí)施US5,019,498中所述方法的測(cè)試試劑盒可通過(guò)商業(yè)途徑獲得(例如，來(lái)自Corgenix，Inc.,Colorado,USA的透明質(zhì)酸(HA)測(cè)試試劑盒，產(chǎn)品號(hào)029-001);也見(jiàn)一般方法第4項(xiàng))。平行地，可以用透明質(zhì)酸酶最初消化所得離心上清液的等分試樣，然后借助特異結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸的蛋白質(zhì)證實(shí)乙酰透明質(zhì)酸的存在，如上述。通過(guò)平行批中透明質(zhì)酸酶的作用，降解其中存在的乙酰透明質(zhì)酸，從而完全消化后，不再可能顯著檢測(cè)顯著量的乙酰透明質(zhì)酸。離心上清液中乙酰透明質(zhì)酸的存在可以進(jìn)一步使用其他分析方法來(lái)證明，所述方法為例如IR、NMR或者質(zhì)鐠法。如上文已經(jīng)提到的，迄今還沒(méi)有闡明哪條代謝途徑(己糖磷酸或氧化性肌醇代謝途徑)是用于在植物細(xì)胞中合成UDP-葡糖醛酸的主要途徑，和兩條代謝途徑是否對(duì)于UDP-葡糖醛酸的合成取決于植物的組織和/或發(fā)育階段而具有不同量的貢獻(xiàn)。此外，UDP-Glc-DH在轉(zhuǎn)基因植物中的過(guò)表達(dá)不得到一致的結(jié)果，并且不能使用此類方法實(shí)現(xiàn)增加細(xì)胞壁的果膠含量的目的。此外，使用UDP-Glc-DH的活性對(duì)蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)受到UDP-木糖的抑制。這對(duì)于來(lái)自procaryonts(Campbell等人，1997，J.Biol.Chem.272(6)，3416-3422;Schiller等人，1973，Biochim.BiophysActa293(1)，1-10)、來(lái)自動(dòng)物生物(Balduini等人，1970，Biochem.J.120(4)，719-724)和來(lái)自才直物(Hinterberg，2002，PlantPhysiol.Biochem.40，1011-1017)的所述蛋白質(zhì)進(jìn)行了闡明。在文獻(xiàn)中沒(méi)有闡明什么可能限制植物細(xì)胞中合成的乙酰透明質(zhì)酸的因此，已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)與(僅)具有乙酰透明質(zhì)酸合酶活性的遺傳修飾的植物細(xì)胞或遺傳修飾的植物相比，具有編碼乙酰透明質(zhì)酸的核酸分子并且額外具有增加的UDP-Glc-DH活性的遺傳修飾的植物細(xì)胞或遺傳修飾的植物產(chǎn)生明顯更高量的乙酰透明質(zhì)酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物，其特征在于它們與(僅)具有乙酰透明質(zhì)酸合酶活性的遺傳修飾的植物或遺傳修飾的植物細(xì)胞相比或者與具有乙酰透明質(zhì)酸合酶活性并且具有UDP-Gk-DH活性的蛋白質(zhì)活性沒(méi)有增加的遺傳修飾的植物或遺傳修飾的植物細(xì)胞相比產(chǎn)生增加量的乙酰透明質(zhì)酸。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"(僅)具有乙酰透明質(zhì)酸合酶活性的植物細(xì)胞或植物"將被理解為指遺傳修飾的植物細(xì)胞或遺傳修飾的植物，其中所述遺傳^奮飾在于與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物相比，它包含編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子。具體地，"(僅)具有乙酰透明質(zhì)酸合酶活性的植物細(xì)胞或植物"的特酸分子導(dǎo)入沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物之外沒(méi)有額外的遺傳修飾。優(yōu)選地，此類植物不具有增加活性的具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)。植物細(xì)胞或植物產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量可以借助上面已經(jīng)描述的方法測(cè)定，例如，使用商業(yè)測(cè)試試劑盒(例如，來(lái)自Corgenix，Inc.，Colorado,USA的透明質(zhì)酸(HA)測(cè)試試劑盒，產(chǎn)品號(hào)029-001)。在本發(fā)明上下文中優(yōu)選用于測(cè)定植物細(xì)胞或植物中乙酰透明質(zhì)酸含量的方法在下面的一般方法(第4項(xiàng))中描述。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物分別是合成乙酰透明質(zhì)酸的綠色陸生植物的植物細(xì)胞或綠色陸生植物。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"綠色陸生植物(有胚植物)"理解為如Strasburger，"LehrbuchderBotanik，，[植物學(xué)課本，第34版，Spektr腿Akad.Verl.，1999,(ISBN3-8274-0779-6)中定義。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及多細(xì)胞植物的根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物，其是多細(xì)胞生物。因此，該實(shí)施方案涉及不來(lái)自單細(xì)胞植物(原生生物)或不是原生生物的植物細(xì)胞或植物。根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物原則上可以分別是任何植物種類，即單子葉或雙子葉植物的植物細(xì)胞或植物。它們優(yōu)選是作物植物，即為了人和動(dòng)物的食物或?yàn)榱水a(chǎn)生生物量和/或?yàn)榱酥苽溆糜诩夹g(shù)、工業(yè)目的的物質(zhì)而被人類栽培的植物(例如，玉米、稻、小麥、苜蓿、黑麥、燕麥、大麥、樹(shù)薯、馬鈴薯、番茄、柳枝稷CP"m'c"附v/z^fl似附)、西米、綠豆、pas、高粱、胡蘿卜、茄子、小蘿卜、油籽油菜、大豆、花生、黃瓜、南瓜、甜瓜、韭蔥、大蒜、巻心菜、菠菜、紅薯、蘆筍、小西葫蘆、萵苣、朝鮮薊、甜玉米、歐洲防風(fēng)、鴉蔥屬、耶路撒冷洋薊、香蕉、甜菜、甘蔗、甜菜根、綠花椰菜、巻心菜、洋蔥、黃甜菜、蒲公英、草莓、蘋果、杏子、李子、桃、葡萄樹(shù)、花椰菜、芹菜、青椒、蕉青甘藍(lán)、大黃)。尤其優(yōu)選番茄或馬鈴薯植物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物，其中編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子的特征在于它編碼病毒乙酰透明質(zhì)酸合酶。編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子優(yōu)選編碼感染藻類的病毒的乙酰透明質(zhì)酸合酶。關(guān)于感染藻類的病毒，編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子優(yōu)選編碼感染小球藻的病毒的乙酰透明質(zhì)酸合酶，尤其優(yōu)選緣草履蟲小球藻病毒l的乙酰透明質(zhì)酸合酶，特別優(yōu)選緣草履蟲小球藻病毒的Hl毒林的乙酰透明質(zhì)酸合酶。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物，其中編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子的特征在于編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子的密碼子與編碼該乙酰被#^飾。特別優(yōu)選地，已經(jīng)修飾了乙酰透明質(zhì)酸合酶的密碼子使得它們適于植物細(xì)胞或植物的密碼子使用頻率，所述密碼子被整合或?qū)⒄显谒鲋参锛?xì)胞或植物的基因組中。由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性，氨基酸可以由一種或多種密碼子編碼。在不同的生物中，編碼氨基酸的密碼子以不同的頻率使用。編碼核酸序列的密碼子對(duì)它們?cè)谥参锛?xì)胞或植物(待表達(dá)的序列將整合在它們的基因組中)中使用的頻率的適應(yīng)可以促進(jìn)在特定植物細(xì)胞或植物細(xì)胞中增加量的翻譯的蛋白質(zhì)和/或所述mRNA的穩(wěn)定性。密碼子在所討論的植物細(xì)胞或植物中的使用頻率可以由技術(shù)人員確定，他們通過(guò)對(duì)所述生物中盡可能多的編碼核酸序列檢查用于編碼某個(gè)氨基酸的某些密碼子的頻率來(lái)確定。某些生物中密碼子使用頻率是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以使用計(jì)算機(jī)程序用簡(jiǎn)單和快速的方式確定。合適的計(jì)算機(jī)程序可以公開(kāi)獲得并且在因特網(wǎng)上自由提供(侈'^口，http:〃gcua.schoedl.de/;http:〃www.kazusa.or.jp/codon/;htti3:〃www.entdechoii.com/en2/cutanalysis.htmr)。通過(guò)體外誘變或優(yōu)選地，基因序列的從頭合成可以進(jìn)行編碼核酸序列的密碼子與它們?cè)谥参锛?xì)胞或植物中頻率的適應(yīng)，其中所述序列將在所述植物細(xì)胞或植物的基因組中表達(dá)或整合到基因組中。從頭合成核列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，通過(guò)最初合成各核酸寡核苷酸，將這些與其互補(bǔ)寡核苷酸雜交，從而它們形成DNA雙鏈，然后連接各雙鏈寡核苷酸使得得到所希望的核酸序列，可以進(jìn)行從頭合成。從頭合成核酸序列(包括將密碼子使用的頻率與某種靶標(biāo)生物相適應(yīng))也可以由提供這些服務(wù)的公司完成(例如，EntelechonGmbH，Regensburg，德國(guó))。編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子的特征優(yōu)選在于它編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶，其氨基酸序列與SEQIDNO2所示的氨基酸序列具有至少70%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少卯％,特別優(yōu)選至少95%同一性。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子的特征在于它編碼具有SEQIDNO2中所示氨基酸序列的乙酰透明質(zhì)酸合酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子與SEQIDN01或SEQIDN03所示的核酸序列具有至少70。/。、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少90%，特別優(yōu)選至少95%同一性。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子的特征在于它具有SEQIDNO3中所示的核絲列。在2004年8月25日，根據(jù)布達(dá)佩斯條約將質(zhì)粒IC341-222(包含編碼緣草履蟲小球藻病毒乙酰透明質(zhì)酸合酶的合成的核酸分子)保藏在德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，MascheroderWeglb，38124Brunswick,德國(guó))，寸呆藏號(hào)為DSM16664。SEQIDN02中所示的氨基酸序列可以來(lái)自整合到質(zhì)粒IC341-222中的核酸序列的編碼區(qū)并且編碼緣草履蟲小球藻病毒乙酰透明質(zhì)酸合酶。因此，本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物，其中編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子的特征在于它編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以來(lái)自插入到質(zhì)粒DSM16664中的核酸序列的編碼區(qū)或者它編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與可以來(lái)自插入到質(zhì)粒DSM16664的核酸序列的編碼區(qū)的氨基酸序列具有至少70%、優(yōu)選至少80o/o、優(yōu)選至少90%，特別優(yōu)選至少95%同一性。修飾的植物，其中編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子的特征在于它是整合到質(zhì)粒DSM16664中的乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼核酸或者它可以與整合到質(zhì)粒DSM16664中的核酸序列具有至少70%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少90%，特別優(yōu)選至少95%同一性。修飾的植物，其特征在于它們與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或?qū)?yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物相比具有穩(wěn)定整合到它們的基因組中的外源核酸分子，所述外源核酸分子增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的活性。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"外源核酸分子"理解為指分子，其不天列天然存在或位于野生型植物細(xì)胞的基因組中它不天然存在的位置上。優(yōu)選地，所述外源核酸分子是重組分子，其包含多種元件，它們的組合或特定空間排列不天然存在于植物細(xì)胞中。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"重組核酸分子"理解為指包含多種核酸分子的核酸分子，所述多種核酸分子天然存在的組合不像重組核酸分子中存在的組合。從而，重組核酸分子除了包含編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸分子外，還包含不與所提到的核酸分子組合天然存在的核酸序列。與編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸分子組合的重組核酸分子上存在的所述額外核酸序列可以是任何序列。例如，它們可以是基因組的植物核酸序列。額外的核酸序列可以優(yōu)選是調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子、終止信號(hào)、增強(qiáng)子)，尤其優(yōu)選在植物組織中有活性的調(diào)節(jié)序列，尤其優(yōu)選在植物組織中有活性的調(diào)節(jié)序列，特別優(yōu)選在植物組織中有活性的組織特異性調(diào)節(jié)序列。產(chǎn)生重組核酸分子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且包括遺傳工程方法，如通過(guò)連接方法連接核酸分子、遺傳重組或從頭合成核酸分子(見(jiàn)，例如，Sambrok等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual，第三版(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY.ISBN:0879695773，A謂bel等人,ShortProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons;第五版(2002)，ISBN:0471250929)。分別與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞或沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物相比在基因組中穩(wěn)定整合外源核酸分子或者在基因組中整合多個(gè)外源核酸分子(所述核酸分子編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶并且增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的活性)的遺傳修飾的植物細(xì)胞和遺傳修飾的植物可以與所述野生型植物細(xì)胞或所述野生型植物分別通過(guò)如下事實(shí)相區(qū)子，或者這種分子整合在根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞的基因組中或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的基因組中的它分別不在野生型植物細(xì)胞和野生型植物中發(fā)生的位置上，即處于不同的基因組環(huán)境中。此外，此類根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞和根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物可以分別與沒(méi)有遺傳^f"飾的野生型植物細(xì)胞和沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物相區(qū)別，因?yàn)樗鼈?如果合適)除了天然存在于野生型植物細(xì)胞或野生型植物中的這種分子的拷貝外，還包含穩(wěn)定整合到它們基因組中的外源核酸分子的至少一個(gè)拷貝。如果導(dǎo)入根據(jù)本發(fā)明的遺傳4務(wù)飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的型植物中的額外拷貝，那么根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞和根據(jù)本發(fā)明的遺傳纟務(wù)飾的植物可以分別與野生型植物細(xì)胞和野生型植物通過(guò)如下事實(shí)相區(qū)別該額外的拷貝/這些額外的拷貝位于基因組中的位置上，在所述位置上它們分別不存在于野生型植物細(xì)胞和野生型植物中。核酸分子向植物細(xì)胞或植物的基因組的穩(wěn)定整合可以通過(guò)遺傳方法和/或分子生物學(xué)方法闡明。核酸分子向植物細(xì)胞基因組或植物基因組的穩(wěn)定整合的特征在于在已經(jīng)遺傳了所述核酸分子的后代中，穩(wěn)定整合的核酸分子存在于與親代相同的遺傳環(huán)境中。核酸序列在植物細(xì)胞基因組中或植物基因組中穩(wěn)定整合的存在可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法闡明，如借助DNA印跡分析或RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)分析(Nam等人，1989，ThePlantCell1,699-705;LeisterandDean，1993，ThePlantJournal4(4)，745-750)，使用基于PCR的方法，如擴(kuò)增片段長(zhǎng)度差異分析(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，AFLP)(Castiglioni等人，1998，Genetics149，2039-2056;Meksem等人,2001，MolecularGeneticsandGenomics265，207-214;Meyer等人，1998,MolecularandGeneralGenetics259，150國(guó)160)或使用用限制性內(nèi)切核酸酶切割的擴(kuò)增片段(切割擴(kuò)增的多態(tài)性序列，CAPS)(Konieczny和Ausubel，1993,ThePlantJournal4，403-410;Jarvis等人，1994，PlantMolecularBiology24，685-687;Bachem等人，1996，ThePlantJournal9(5)，745-753)。原則上，外源核酸分子可以是任一核酸分子，其在植物細(xì)胞或植物中增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的活性。在本發(fā)明上下文中，通過(guò)使用插入誘變可以制備根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞和根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物(綜述Thorneycroft等人，2001，JournalofexperimentalBotany52(361)，1593-1601)。在本發(fā)明上下文中，將插入誘變理解為具體指轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)移DNA(t-DNA)向編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的基因中或基因附近的插入，從而增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)在所述細(xì)胞中的活性。轉(zhuǎn)座子可以是天然存在于細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座子(內(nèi)源轉(zhuǎn)座子)或者不天然存在于所述細(xì)胞中而是通過(guò)遺傳工程，如細(xì)胞的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入細(xì)胞中的那些轉(zhuǎn)座子(異源轉(zhuǎn)座子)。通過(guò)轉(zhuǎn)座子對(duì)基因表達(dá)的修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。內(nèi)源和異源轉(zhuǎn)座子作為植物生物技術(shù)中工具的綜述在Ramachandran和Sundaresan(2001，PlantPhysiologyandBiochemistry39，234-252)中給出。t-DNA插入誘變是基于來(lái)自土壤桿菌的Ti質(zhì)粒的某些片段(t-DNA)可以整合到植物細(xì)胞的基因組這一事實(shí)。在植物染色體中的整合位點(diǎn)不是固定的，整合可以是在任何位置。如果t-DNA整合到代表基因功能的染色體區(qū)段中或附近，那么這可以導(dǎo)致增加的基因表達(dá)從而導(dǎo)致所述基因編碼的蛋白質(zhì)活性的改變。插入基因組(尤其轉(zhuǎn)座子或t-DNA)的序列的特征在于它們包含導(dǎo)致編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的基因的調(diào)節(jié)序列的活化("活化標(biāo)記")。優(yōu)選地，插入基因組中的序列(尤其轉(zhuǎn)座子或t-DNA)的特征在于它們整合到植物細(xì)胞或植物基因組中內(nèi)源核酸分子附近，所述核酸分子編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞和根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物可以例如使用活化標(biāo)記方法產(chǎn)生(見(jiàn)例如，Walden等人，PlantJ.(1991)，281-288;Walden等人，PlantMol.Biol.26(1994)，1521-1528)。該方法是基于增強(qiáng)子序列如花椰菜花葉病毒的35SRNA啟動(dòng)子增強(qiáng)子或章魚堿合酶增強(qiáng)子對(duì)內(nèi)源啟動(dòng)子的活化。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"t-DNA活化標(biāo)記"理解為指t-DNA片段包含增強(qiáng)子序列，并且，通過(guò)整合到植物細(xì)胞的基因組中，增加了具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的活性。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)座子活化標(biāo)記"理解為指轉(zhuǎn)座子，其包含增強(qiáng)子序列，并且，通過(guò)整合到植物細(xì)胞的基因組中，增加了具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的活性。本發(fā)明的尤其優(yōu)選的實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物，其特征在于外源核酸分子編碼具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，編碼具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的外源核酸分子可以來(lái)自任何生物；優(yōu)選地，所述核酸分子來(lái)自細(xì)菌、真菌、動(dòng)物、植物或病毒，尤其優(yōu)選來(lái)自細(xì)菌、植物或病毒，特別優(yōu)選來(lái)自病毒。關(guān)于病毒，編碼具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的外源核酸分子優(yōu)選來(lái)自感染藻類的病毒，優(yōu)選來(lái)自感染小球藻屬藻類的病毒，尤其優(yōu)選來(lái)自緣草履蟲小球藻病毒，特別優(yōu)選來(lái)自HI毒林的緣草履蟲小球藻病毒。也可能將通過(guò)誘變產(chǎn)生的核酸分子代替編碼具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的天然存在的核酸分子導(dǎo)入根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物，其中所述經(jīng)誘變的外源核酸分子的特征在于它編碼具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)受到代謝物的抑制減小(例如，葡萄糖醛酸代謝抑制)。編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸分子在文獻(xiàn)中描述并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。從而，編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸分子從如下生物描述病毒，如小球藻病毒l(NCBIaccNoNC—000852.3)、細(xì)菌，如大腸桿菌(EMBLaccNo:AF176356.1)、真菌，如黑曲霉(Js/^i^i7/附w&er)(EMBLaccNoAY594332.1)、新型隱球菌(C^/;tococc附weo/or附a附)(EMBLaccNoAF405548.1)、昆蟲，如黑腹果蠅(柳e/flwogflster)(EMBLaccNoAF00131(U)、脊推動(dòng)物，:((口人(^^o/wosff/7&ws)(EMBLaccNoAF061016'1)、小家鼠(Afws附^scm/ws)(EMBLaccNoAF061017'1)、歐洲牛(5os)(EMBLaccNoAF095792'1)、光滑爪蟾(A^io/ms/"ev/s)(EMBLaccNoAY762616.1),或才直物，例如白楊(EMBLaccNoAF053973.1)、芋頭(G/ocw'"escM/ewto)(EMBLaccNoAY222335.1)、鹽生杜氏藻(D"w"/^/Z"sfl/,wa)(EMBLaccNoAY795899.1)、大豆(,(EMBLaccNoU53418.1)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞和才艮據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物，其中編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的外源核酸分子選自a)編碼具有SEQIDNO5給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸分子；b)編碼蛋白質(zhì)的核酸分子，所述蛋白質(zhì)的序列與SEQIDN05給出的氨基酸序列具有至少60%同一性；c)包含SEQIDNO4中所示核苷酸序列的核酸分子或者與其互補(bǔ)的序列或者SEQIDNO6所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列；d)與a)或c)中所述核酸序列具有至少70%同一性的核酸分子；e)與a)或c)中所述核酸序列的至少一條鏈在嚴(yán)格條件下雜交的核酸分子；f)核酸分子，其核苷酸序列由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而從a)或c)所提到的核酸分子的序列衍生得到；g)核酸分子，其是a)、b)、c)、d)、e)或f)提到的核酸分子的片段、等位基因變體和/或衍生物。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"雜交"指在常規(guī)雜交條件下，優(yōu)選在嚴(yán)格條件下雜交,如Sambrock等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ed.(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)中所述。"雜交"尤其優(yōu)選指在下面的條件下雜交雜交緩沖液2xSSC;10xDenhardt溶液(Fikoll400+PEG+BSA;比例1:1:1);0.1%SDS;5mMEDTA;50mMNa2HP04;250pg/ml緋精DNA;50pg/mltRNA;或25M磷酸鈉緩沖液pH7.2;1mMEDTA;7%SDS雜交溫度T=65到68。C洗滌緩沖液O.lxSSC;0.1%SDS洗滌溫度T=65到68。C。與編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸分子雜交的核酸分子可以來(lái)自任何生物；因此，它們可以來(lái)自細(xì)菌、真菌、動(dòng)物、植物或病毒。與編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸分子雜交的核酸分子優(yōu)選來(lái)自感染藻類的病毒，優(yōu)選來(lái)自感染小球藻屬藻類的病毒，尤其優(yōu)選來(lái)自緣草履蟲小球藻病毒，最優(yōu)選來(lái)自緣草履蟲小球藻病毒的HI毒林。與所提到的分子雜交的核酸分子可以例如從基因組或cDNA文庫(kù)分分子的反向互補(bǔ)序列，例如，通過(guò)4艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法雜交(見(jiàn)例如，Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)或通過(guò)用PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定和分離。作為分離編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸序列的雜交樣品，可能使用例如精確地或基本上具有SEQIDNO4或SEQIDNO6給出的核苷酸序列的核酸分子，或者這些序列的部分。用作雜交樣品的片段可以是使用常規(guī)合成技術(shù)制備的合成片段或寡核苷酸，其序列與本發(fā)明的上下文中描述的核酸分子基本上相同。一旦鑒定和分離了與本發(fā)明上下文中描述的核酸序列雜交的基因，應(yīng)該測(cè)定序列并分析該序列編碼的蛋白質(zhì)的性質(zhì)以確定它們是否是具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)。怎樣確定蛋白質(zhì)是否具有具UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的活性的方法(例如，DeLuca等人，1976，ConnectiveTissueResearch4，247-254;Bar畫Peled等人，2004,Biochem.J.381，131-136;Turner和Botha,2002，ArchivesBiochem.Biophys.407，209-216)是本領(lǐng)域4支術(shù)人員已知的并且在文獻(xiàn)中廣泛描述。的具體片段、衍生物和等位基因變體。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)"衍生物"指那些分子的序列與上述核酸分子的序列在一個(gè)或多個(gè)位置不同并且與這些序列高度同一。與上述核酸分子的不同可以是例如由于缺失、添加、替4戈、插入或重組。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"同一性"指核酸分子的編碼區(qū)的全長(zhǎng)上或者編碼至少60%，尤其至少70%，優(yōu)選至少80%，尤其優(yōu)選至少90%,特別優(yōu)選至少95%同一性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列全長(zhǎng)上的序列同一性。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"同一性"理解為指與其他蛋白質(zhì)/核酸的相同氨基^/核苦酸數(shù)目(同一性)，以百分比表示。優(yōu)選地，與具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的同一性通過(guò)與SEQIDNO5給出的氨基*列比較來(lái)確定，并且與編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)核酸分子的同一性通過(guò)SEQIDNO4或SEQIDNO6給出的核,列與其他蛋白質(zhì)/核酸借助比較程序比較來(lái)確定。如果將相互比較的序列為不同的長(zhǎng)度，那么將通過(guò)確定較短序列與較長(zhǎng)序列共有的氨基酸數(shù)目的同一性(百分比)來(lái)確定同一性。優(yōu)選地，使用已知的和可公開(kāi)得到的計(jì)算機(jī)程序ClustalW(Thompson等人，NucleicAcidsResearch22(1994)，4673畫4680)確定同一性。ClustalW可以從JulieThompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和TobyGibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)，EuropeanMolecularBiologyLaboratory,Meyerhofstrasse1,D69117Heidelberg,德國(guó)公開(kāi)獲得。ClustalW也可以從多個(gè)因特網(wǎng)網(wǎng)頁(yè)，如從IGBMC(InstitutdeG6n6tiqueetdeBiologieMol6culaireetCellulaire，B.P.163,67404I脂rchCedex，F(xiàn)rance;ftD:〃ftD-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(ftp:Vftp.ebi.ac.uk/pub/software/)和EBI的所有鏡像因特網(wǎng)網(wǎng)頁(yè)(EuropeanBioinformaticsInstitute,WellcomeTrustGenomeCampus,Hinxton，CambridgeCB101SD，UK)獲得。優(yōu)選地，使用ClustalW計(jì)算機(jī)程序1.8版來(lái)確定本發(fā)明上下文中描述的蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)之間的同一性。這里，如下設(shè)置參數(shù)KTUPLE=1，TOPDIAG=5，WINDOW=5，PAIRGAP=3，GAPOPEN=10，GAPEXTEND=0.05，GAPDIST=8,MAXDIV=40，MATRIX=GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。優(yōu)選地，使用ClustalW計(jì)算機(jī)程序1.8版來(lái)確定例如本發(fā)明上下文中性。這里，如下設(shè)置參數(shù)KTUPLE=2，TOPDIAGS=4,PAIRGAP=5，DNAMATRIX:IUB，GAPOPEN=10，GAPEXT=5，MAXDIV=40，TRANSITIONS:不加權(quán)。同一性還指在所述核酸分子或它們編碼的蛋白質(zhì)之間存在功能和/或結(jié)構(gòu)等同物。與上述分子同源并且代表這些分子的衍生物的核酸分子通常是這些分子的變體，其代表具有相同生物學(xué)功能的修飾。它們可以是天然存在的變異，例如，來(lái)自其他物種的序列，或者是突變，其中這些突變以天然的方式發(fā)生或者通過(guò)定向誘變導(dǎo)入。此外，變體可以是合成產(chǎn)生的序列。等位基因變體可以是天然存在的變體或者合成產(chǎn)生的變體或者通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的變體。特定形式的衍生物是例如由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而與本發(fā)明上下文所述的核酸分子不同的核酸分子。編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸分子的多種衍生物具有某些共同特征。這些可以是例如生物活性、底物特異性、分子量、免疫反應(yīng)性、構(gòu)象，等等，以及物理性質(zhì)，如凝膠電泳中的遷移率性質(zhì)、層析行為、沉降系數(shù)、溶解度、光鐠性質(zhì)、穩(wěn)定性、最適pH、最適溫度，等等。具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的優(yōu)選性質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，已經(jīng)在上文提到并且將在本文以類似的方式應(yīng)用。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物，其中編碼具有UDP-Glc-DH的酶促活生物的UDP-Glc-DH的酶促活性的所述蛋白質(zhì)的核酸分子的密碼子不同。尤其優(yōu)選地，改變編碼具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的核酸分子的密碼子使得它們適應(yīng)植物細(xì)胞或植物的密碼子使用頻率，所述植物細(xì)胞或植物的基因組中被整合或?qū)⒈徽纤龊怂岱肿印１景l(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物，其特征在于穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞或植物的基因組中的編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶和/或編碼具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的外源核酸分子連接到啟動(dòng)植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元件(啟動(dòng)子)。這些可以是同源或異源啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是組成型的、組織特異性的、發(fā)育特異性的啟動(dòng)子或者受到外界因素的調(diào)節(jié)(例如，應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)后、受到非生物因子作用，如熱和/或冷、干旱、疾病等等的調(diào)節(jié))。這里，編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶或者具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的核酸分子可以在每種情況中連接到相同的啟動(dòng)子，或者各序列可以連接到不同的啟動(dòng)子，所述核酸分子整合到根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的基因組中。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物，其中選自編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶或具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的至少一種外源核酸分子，尤其優(yōu)選至少兩種外源核酸分子，特別優(yōu)選三種外源核酸分子連接到組織特異性啟動(dòng)子。優(yōu)選的組織特異性啟動(dòng)子是在植物塊莖、葉、果實(shí)或種子細(xì)胞中特異啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。為了表達(dá)編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶或具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的核酸分子，這些優(yōu)選連接到調(diào)節(jié)DNA序列，確保植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。這些包括具體的啟動(dòng)子。通常，在植物細(xì)胞中有活性的任何啟動(dòng)子都適于表達(dá)。這里，可以選擇啟動(dòng)子使得表達(dá)是組成型的或者僅在某個(gè)組織中，在植物的特定發(fā)育點(diǎn)或者在外界因素決定的時(shí)間點(diǎn)。對(duì)于植物和待表達(dá)的核酸分子，啟動(dòng)子可以是同源的或異源的。合適的啟動(dòng)子是例如，用于組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒的35SRNA啟動(dòng)子或者玉米或洋丁香(C^,rwi)YLCV的泛蛋白啟動(dòng)子(黃縮葉病毒(YellowLeafCurlingVirus);WO0173087;Stavolone等人，2003，PlantMol.Biol.53，703-713)，用于在馬鈴薯中塊莖特異性表達(dá)的patatingen啟動(dòng)子B33(Rocha-Sosa等人，EMBOJ.8(1989)，23-29)，或者番茄的果實(shí)特異性啟動(dòng)子，如來(lái)自番茄的聚半乳糖醛酸酶啟動(dòng)子(Montgomery等人，1993，PlantCell5，1049-1062)或番茄的E8啟動(dòng)子(Metha等人，2002，NatureBiotechnol.20(6)，613-618)或者來(lái)自桃的ACC氧化酶啟動(dòng)子(Moon和Callahan,2004，J.ExperimentalBotany55(402)，1519-1528)，或者確保僅在光合活性組織中表達(dá)的啟動(dòng)子，例如ST-LS1啟動(dòng)子(Stockhaus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987)，7943-7947;Stockhaus等人，EMBOJ.8(1989)，2445-2451)或用于胚乳特異性表達(dá)，如來(lái)自小麥的HMWG啟動(dòng)子、USP啟動(dòng)子、菜豆蛋白啟動(dòng)子、來(lái)自玉米的玉米醇溶蛋白基因的啟動(dòng)子(Pedersen等人，Cell29(1982)，1015-1026;Quatroccio等人，PlantMol.Biol.15(1990)，81-93)、谷蛋白啟動(dòng)子(Leisy等人，PlantMol.Biol.14(1990)，41-50;Zheng等人，PlantJ.4(1993)，357-366;Yoshihara等人，F(xiàn)EBSLett.383(1996)，213-218)，shrunken隱l啟動(dòng)子(Werr等人，EMBOJ.4(1985)，1373-1380)，球蛋白啟動(dòng)子(Nakase等人，1996，Gene170(2)，223畫226)或醇溶蛋白啟動(dòng)子(Qu和Takaiwa，2004，PlantBiotechnologyJournal2(2)，113-125)。然而，還可能使用僅在外界因素決定的時(shí)間點(diǎn)有活性的啟動(dòng)子(見(jiàn)例如，WO9307279),。這里尤其重要的是熱休克蛋白啟動(dòng)子，其允許簡(jiǎn)單的誘導(dǎo)。還可能使用種子特異性啟動(dòng)子，如來(lái)自蠶豆(Wd"的USP啟動(dòng)子，其確保在蠶豆和其他植物中的種子特異性表達(dá)(Fiedler等人，PlantMol.Biol.22(1993),669-679;Baumlein等人，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。感染藻類的病毒基因組中存在的啟動(dòng)子的使用也適于在植物中表達(dá)核^j^列(Mitra等人，1994,Biochem.BiophysResCommun204(1)，187-194;MitraandHiggins，1994，PlantMolBiol26(1)，85-93，VanEtten等人，2002，ArchVirol147，1479-1516)。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"組織特異性"理解為指表現(xiàn)(例如，轉(zhuǎn)錄起始)基本上局限于特定組織。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"塊莖、果實(shí)或種子細(xì)胞"理解為指塊莖、果實(shí)或種子中存在的所有細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"同源啟動(dòng)子，，理解為指天然存在于用于制備根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物中的植物細(xì)胞或植物的啟動(dòng)子(關(guān)于植物細(xì)胞或植物是同源的)或者指調(diào)節(jié)生物中基因表達(dá)的啟動(dòng)子，其中所述序列從所述生物分離(關(guān)于待表達(dá)的核酸分子是同源的)。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"異源啟動(dòng)子，，理解為指不天然存在于用于制備根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物動(dòng)子，其在從中分離待表達(dá)的核M列的生物中不是天然存在用于調(diào)節(jié)所述核酸序列的表達(dá)(關(guān)于待表達(dá)的核酸分子是異源的)。還存在終止序列(多聚腺苷酸化信號(hào))，其用作在轉(zhuǎn)錄物加入多聚A尾。認(rèn)為多聚A尾用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物。此類元件在文獻(xiàn)中描述(參考Gielen等人，EMBOJ.8(1989)，23-29)并且可以如所希望的交換。還可能的是內(nèi)含子序列存在于啟動(dòng)子和編碼區(qū)之間。此類內(nèi)含子序列可以導(dǎo)致表達(dá)的穩(wěn)定性和植物中增加的表達(dá)(Callis等人，1987，GenesDevel.1，1183-1200;Luehrsen，和Walbot，1991，Mol.Gen.Genet.225，81-93;Rethmeier等人，1997;PlantJournal12(4),895-899;Rose和Beliakoff,2000，PlantPhysiol.122(2)，535—542;Vasil等人，1989，PlantPhysiol.91，1575-1579;XU等人，2003，ScienceinChinaSeriesCVol.46No.6，561-569)。合適的內(nèi)含子序列是例如來(lái)自玉米的shl基因的第一個(gè)內(nèi)含子、來(lái)自玉米的多聚泛蛋白基因1的第一個(gè)內(nèi)含子、來(lái)自稻的EPSPS基因的第一個(gè)內(nèi)含子或者來(lái)自擬南芥的PATl基因的前兩個(gè)內(nèi)含子之一。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞的植物。此類植物可以通過(guò)從根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞再生產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的可處理的或可消費(fèi)的部分，其包含根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"可加工的部分"理解為指植物部分，其用于制備食品或飼料，它們用作工業(yè)過(guò)程的原材料來(lái)源，或者作為制備藥品的原材料來(lái)源或者作為制備化妝品的原材料來(lái)源。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"可消費(fèi)的部分"理解為指用作人類食品或者用作動(dòng)物飼料的植物部分。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的繁殖材料，其包含根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞。這里，術(shù)語(yǔ)"繁殖材料"包含適于通過(guò)無(wú)性或生殖途徑產(chǎn)生后代的植物的那些組分。適于無(wú)性繁殖的是例如插條、愈傷組織培養(yǎng)物、根莖或塊莖。其他繁殖材料包括例如，果實(shí)、種子、幼苗、原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物等等。繁殖材料優(yōu)選可以為塊莖、果實(shí)或種子的形式。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的可收獲的植物部分，如果實(shí)、儲(chǔ)藏根和其他根、花、芽、枝條、葉子或莖，優(yōu)選種子、果實(shí)或塊莖，這些可收獲的部分包含根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及包含乙酰透明質(zhì)酸的根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料或者根據(jù)本發(fā)明的植物的可收獲部分。尤其優(yōu)選合成乙酰透明質(zhì)酸的根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料或根據(jù)本發(fā)明的植物的可收獲部分。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"馬鈴薯植物"或"馬鈴薯"理解為指茄屬(^/朋W/H)的植物種類，尤其茄屬的產(chǎn)生塊莖的物種，尤其馬鈴薯(5W"ww附)。在本發(fā)明的上下文中，將術(shù)語(yǔ)"番茄植物"或"番茄"理解為指番茄屬(Z^co/m7c0W)，尤其番癡(Z^co/em.cwiescw/ew似附)的植物物種。本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的可收獲的部分、繁殖材料、可加工的部分或可消費(fèi)的部分包含比文獻(xiàn)中描述的合成乙酰透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)基因植物更多的乙酰透明質(zhì)酸。因此，根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物不僅尤其適于用作分離乙酰透明質(zhì)酸的原材料，而且也可以直接用作食品/飼料或用于制備具有預(yù)防或治療特征(例如，用于骨關(guān)節(jié)炎預(yù)防，US6，607，745)的食品/飼料。因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物具有比文獻(xiàn)中描述的植物更高的乙酰透明質(zhì)酸含量，所以此類食品/祠料的制備需要較低量的根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的可收獲的部分、繁殖材料、可加工的部分或可消費(fèi)的部分。如果根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的可消費(fèi)的部分被直接作為所稱作的"營(yíng)養(yǎng)治療劑，，消費(fèi)，那么甚至通過(guò)攝入相對(duì)少量的物質(zhì)也可能實(shí)現(xiàn)積極效果。這在動(dòng)物飼料生產(chǎn)中可以是尤其重要的，因?yàn)榫哂刑吆康闹参锝M分的動(dòng)物飼料不適于作為多種動(dòng)物物種的飼料。由于乙酰透明質(zhì)酸結(jié)合水的高容量，根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的可收獲的部分、繁殖材料、可加工的部分或可消費(fèi)的部分還具有如下優(yōu)點(diǎn)當(dāng)產(chǎn)生固化食品/飼料時(shí)需要減少的增稠劑。從而，例如，膠凍劑的產(chǎn)生需要較少的糖，其與對(duì)健康的額外的積極作用有關(guān)。在需要天然植物材料脫水的食品/飼料生產(chǎn)中，使用根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的可收獲的部分、繁殖材料、可加工的部分或可消費(fèi)的部分的優(yōu)點(diǎn)是需要從所述植物材料除去較少的水，導(dǎo)致較低的生產(chǎn)成本，并且由于更溫和的制備方法(例如，較低和/或較短的熱輸入)，導(dǎo)致所述食品/飼料的升高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。從而，例如，在番茄醬的生產(chǎn)中，可以引入較少的能量來(lái)實(shí)現(xiàn)所希望的稠度。本發(fā)明還提供了制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法，其包括a)遺傳修飾植物細(xì)胞，其中該遺傳修飾包括下面的步驟i到iii)向植物細(xì)胞中導(dǎo)入編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的外源核酸分子，ii)向植物細(xì)胞中導(dǎo)入遺傳修飾，該遺傳修飾導(dǎo)致具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的活性與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比活性升高其中步驟i到ii可以以任何順序單獨(dú)地進(jìn)行或者可以同時(shí)進(jìn)行步驟i到ii的任一組合，b)從步驟a)的植物細(xì)胞再生植物；c)如果合適，使用根據(jù)步驟b)的植物再生進(jìn)一步的植物，其中如果合適，從根據(jù)步驟b)i)或b)ii)的植物分離植物細(xì)胞并重復(fù)方法步驟a)到c)直到產(chǎn)生了具有編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的外源核酸分子并且與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)活性增加的植物。本發(fā)明優(yōu)選涉及制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法，其包括a)遺傳修飾植物細(xì)胞，其中該遺傳修飾包含下面任一順序的步驟i到ii，或者可以單獨(dú)或同時(shí)進(jìn)行下面步驟i到ii的任一組合，i)向植物細(xì)胞中導(dǎo)入編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的外源核酸分子，ii)向植物細(xì)胞中導(dǎo)入遺傳修飾，該遺傳修飾導(dǎo)致與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)活性增加，b)從植物細(xì)胞再生植物，所述植物細(xì)胞包含根據(jù)下面步驟的遺傳修飾i)a)iii)a)iiiii)a)i和a)ii，c)i)向根據(jù)步驟b)i的植物的植物細(xì)胞導(dǎo)入根據(jù)步驟aii)的遺傳修飾，ii)向根據(jù)步驟b)ii的植物的植物細(xì)胞導(dǎo)入根據(jù)步驟ai)的遺傳修飾，并再生植物，d)如果合適，借助步驟b)iii或c)i或c)ii的任一個(gè)得到的植物再生進(jìn)一步的植物。向植物細(xì)胞導(dǎo)入的根據(jù)步驟a)的遺傳修飾原則上可以是任一類型的修飾，其導(dǎo)致具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的增加的活性。根據(jù)本發(fā)明方法的根據(jù)步驟b)和如果合適步驟c)的植物的再生可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行(描述于例如"PlantCellCultureProtocols",1999，R.D.Hall編著，HumanaPress,ISBN0-89603-549-2)。根據(jù)本發(fā)明方法的進(jìn)一步的植物的產(chǎn)生(取決于步驟c)或步驟d)的方法)可以例如通過(guò)無(wú)性繁殖(例如，通過(guò)插條、塊莖或者愈傷組織培養(yǎng)和再生完整植物)或者通過(guò)有性繁殖進(jìn)行。在該上下文中，優(yōu)選在受控的條件下進(jìn)行有性繁殖，即，將具有特定特征的所選植物相互雜交并增殖。優(yōu)選以這樣的方式發(fā)生選擇使得進(jìn)一步的植物(取決于根據(jù)步驟C)或步驟d)產(chǎn)生的方法)包含在前面步驟中引入的修飾。在根據(jù)本發(fā)明的用于制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法中，用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞的遺傳修飾可以同時(shí)進(jìn)行或以連續(xù)步驟進(jìn)行。這里，是否使用與將編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的外源核酸分子導(dǎo)入植物細(xì)胞中的遺傳修飾相同的方法進(jìn)行連續(xù)的遺傳修飾以導(dǎo)致具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的增加的活性不是重要的。在用于制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的根據(jù)本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案中，所述遺傳修4牟在于將外源核酸分子導(dǎo)入植物細(xì)胞的基因組中，其中外源核酸分子的存在或表達(dá)導(dǎo)致植物細(xì)胞中具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的增加的活性。述的，在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟a)中為制備合成乙酰透明質(zhì)酸的植物而導(dǎo)入的是單個(gè)核酸分子或多個(gè)核酸分子。從而，編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶和/或編碼具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的外源核酸分子可以一起存在于單個(gè)核酸分子上，或者它們可以存在于分開(kāi)的核酸分子上。如果編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶和編碼具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的核酸分子存在于多個(gè)核酸分子上，那么這些核酸分子可以同時(shí)或者以連續(xù)的步驟導(dǎo)入植物細(xì)胞中。此外，為了在用于制備合成乙酰透明質(zhì)酸的根據(jù)本發(fā)明方法的實(shí)踐中導(dǎo)入外源核酸分子，可以使用突變細(xì)胞或突變體代替野生型植物細(xì)胞或野生型植物，所述突變細(xì)胞或突變體與野生型植物細(xì)胞或野生型植物是不同的，因?yàn)樗鼈兊木哂蠻DP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的活性已經(jīng)升高了。UDP-Gk-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的活性已經(jīng)升高了，那么實(shí)施用于產(chǎn)生導(dǎo)入編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的外源核酸分子;^A夠的。上面關(guān)于使用突變體制備根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳fl"飾的植物所述的其他內(nèi)容都在此處以類似的方式應(yīng)用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的本發(fā)明方法，其中步驟a)中編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子選自a)核酸分子，其特征在于它們編碼病毒乙酰透明質(zhì)酸合酶，b)核酸分子，其特征在于它們編碼感染小球藻的病毒的乙酰透明質(zhì)酸合酶，c)核酸分子，其特征在于它們編碼緣草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合酶，d)核酸分子，其特征在于它們編碼緣草履蟲小球藻病毒1的毒抹H1的乙酰透明質(zhì)酸合酶，e)核酸分子，其特征在于編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子的密碼子與編碼該乙酰透明質(zhì)酸合酶的親本生物中編碼該乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子的密碼子相比被修飾，i)核酸分子，其特征在于乙酰透明質(zhì)酸合酶的密碼子已經(jīng)被修飾，從而它們適應(yīng)植物細(xì)胞或植物的密碼子的使用頻率，在所述植物細(xì)胞或植物的基因組中整合了或?qū)⒄纤龊怂岱肿?，g)核酸分子，其特征在于它們編碼具有SEQIDNO2中所示氨基酸序列的乙酰透明質(zhì)酸合酶或者它們編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶，其氨基酸序列與SEQIDNO2中所示氨基酸序列具有至少70%同一性，優(yōu)選至少80%，尤其優(yōu)選至少卯％，特別優(yōu)選至少95%同一性，h)核酸分子，其特征在于它們編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以來(lái)自插入質(zhì)粒DSM16664的核酸序列的編碼區(qū)或者它編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與可以來(lái)自插入質(zhì)粒DSM16664的核酸序列的編碼區(qū)的氨基酸序列具有至少70%,優(yōu)選至少80%,尤其優(yōu)選至少90%，特別優(yōu)選至少95o/。同一性，i)核酸分子，其包含SEQIDNOl或SEQIDN03中所示的核酸序列或者與SEQIDNO1或SEQIDNO3中所示核酸序列具有至少70%，優(yōu)選至少80。/。，優(yōu)選至少90%，特別優(yōu)選至少95%同一性，j)核酸分子，其包含插入質(zhì)粒DSM16664的核酸序列或者與插入質(zhì)粒DSM16664的核酸序列具有至少70%，優(yōu)選至少80%，優(yōu)選至少卯％,特別優(yōu)選至少95°/。同一性，k)編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子，其中編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸序列連接到啟動(dòng)植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元件(啟動(dòng)子)或者1)4艮據(jù)k)的核酸分子，其中所述啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子，尤其優(yōu)選在植物塊莖、果實(shí)或種子細(xì)胞中特異啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的根據(jù)本發(fā)明的方法，其中編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的外源核酸分子選自a)核酸分子，其特征在于它們編碼具有來(lái)自病毒、細(xì)菌、動(dòng)物或植物的UDP-Glc-DH的活性的蛋白質(zhì)，b)核酸分子，其特征在于它們編碼具有感染小球藻的病毒的UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)，c)核酸分子，其特征在于它們編碼具有緣草履蟲小球藻病毒的UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)，d)核酸分子，其特征在于編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸分子的密碼子與編碼具有親本生物UDP-Glc-DH活性的對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的核酸分子的密碼子相比被修飾，e)核酸分子，其特征在于具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的密碼子被修飾使得它們適應(yīng)植物細(xì)胞或植物中所述密碼子的使用頻率，其中所述核酸分子將整合到或已經(jīng)整合到所述植物細(xì)胞或植物的基因組中，i)編碼具有SEQIDNO5所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸分子；g)編碼蛋白質(zhì)的核酸分子，其序列與SEQIDNO5中所示氨基酸序列具有至少70%，優(yōu)選至少80%，優(yōu)選至少卯％，特別優(yōu)選至少95%同一性；h)包含SEQIDNO4所示核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列的核酸分子或者SEQIDNO6所示核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；i)與h)所述核酸序列具有至少70%,優(yōu)選至少80%,優(yōu)選至少90%，特別優(yōu)選至少95%同一性的核酸分子；j)與f)或h)中所述的核酸分子的至少一條鏈在嚴(yán)格條件下雜交的核酸分子；k)核酸分子，其核苷酸序列由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而與f)或h)所提到的核酸分子的序列不同；和1)核酸分子，其是a)、b)、c)、d)、e)、f)或h)提到的核酸分子的片段、等位基因變體和/或衍生物；m)編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸分子，其中編碼具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸序列連接到在植物細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元件(啟動(dòng)子)；或n)才艮據(jù)m)的核酸分子，其中所述啟動(dòng)子是組織特異性的啟動(dòng)子，尤其優(yōu)選在植物塊莖、葉子、果實(shí)或種子細(xì)胞中特異啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的本發(fā)明方法用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物。可以得到的植物。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸的方法，其包括從根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞、從根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物、從根據(jù)本發(fā)明的繁殖酸的步驟。優(yōu)選地，這種方法還包括在提取乙酰透明質(zhì)酸之前收獲根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可加工的植物部分的步驟，尤其優(yōu)選還包括在收獲前培養(yǎng)報(bào)棍太勞即或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的步驟t與細(xì)菌或動(dòng)物組織相比，植物組織沒(méi)有透明質(zhì)酸酶并且不含有任何hyaladherins。因此，如上面已經(jīng)描述的，使用相對(duì)簡(jiǎn)單的方法從植物組織提取乙酰透明質(zhì)酸是可能的。如果需要，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)一步純化上述含有乙酰透明質(zhì)酸的植物細(xì)胞或組織的水性提取物，如用乙醇反復(fù)沉淀。優(yōu)選的純化乙酰透明質(zhì)酸的方法在一般方法第3項(xiàng)中描述。已經(jīng)關(guān)于從根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物提取乙酰透明質(zhì)酸描述的方法也適于從根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、明方法可以得到的植物或這些植物的部分分離乙酰透明質(zhì)酸。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可加工的部分或通過(guò)制備乙酰透明質(zhì)酸的本發(fā)明方法可以得到的植物的用途。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞的組合物。這里，植物細(xì)胞是完整的還是不再是完整的并不是重要的，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)例如被處理破壞。所迷組合物優(yōu)選是食品或飼料、藥品或化妝品。本發(fā)明優(yōu)選提供了組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物或根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、或根據(jù)本發(fā)明方法可以得到的植物的組分，并且包含重組核酸分子，其中所述重組核酸分子的特征在于它們包含編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶和具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的核酸分子。外源核酸分子向植物細(xì)胞或植物的基因組中的穩(wěn)定整合導(dǎo)致所述外源核酸分子被整合到植物細(xì)胞或植物的基因組中后側(cè)翼為基因組植物核^列。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物的特征在于根據(jù)本發(fā)明的組合物中存在的重組核酸分子側(cè)翼是基因組植物核酸序列。這里，基因組植物核酸序列可以是天然存在于用于制備所述組合物的植物細(xì)胞或植物的基因組中的任何序列。根據(jù)本發(fā)明的組合物中存在的重組核酸分子可以是單個(gè)或多種重組核酸分子，所述編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶和具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的核酸分子存在于單個(gè)核酸分子上，或者這些核酸分子可以存在于分開(kāi)的重組核酸分子上。取決于編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶或編碼具有UDP-Glc-DH的酶促活性的蛋白質(zhì)的核酸分子怎樣存在于根據(jù)本發(fā)明的組合物中，它們側(cè)翼可以是相同或不同的基因組植物核酸序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法闡明根據(jù)本發(fā)明的組合物包含重組核酸分子，如基于雜交的方法，或優(yōu)選使用基于PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的方法。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含至少0.005%，優(yōu)選至少0.01%，尤其優(yōu)選至少0.05%，特別優(yōu)選至少0.1%的乙酰透明質(zhì)酸。如上文已經(jīng)提到的，可能使用根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可加工的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可消費(fèi)的植物部分或根據(jù)本發(fā)明方法可以得到的植物制備食品或伺料。然而，不分離乙酰透明質(zhì)酸而用作工業(yè)應(yīng)用的原料也是可能的。從而，例如，根據(jù)本農(nóng)業(yè)栽培區(qū)域以實(shí)現(xiàn)土壤的增加的水結(jié)合。此外，根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞可以用于制備干燥劑(例如，當(dāng)運(yùn)輸水分敏感產(chǎn)品時(shí)使用)或者作為液體吸收劑(例如，用于尿布或用于吸收泄漏的水性液體)。對(duì)于此類應(yīng)用，如果需要，可能使用根據(jù)本發(fā)明的完整的遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物的部分或搗碎(例如，碾磨)的根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物或根據(jù)本發(fā)明的植物部分。適于在使用碾磨的植物或植物部分的應(yīng)用中使用的尤其是含有乙酰透明質(zhì)酸但是僅僅含有低比例水的植物部分。這些優(yōu)選是谷類植物(玉米、稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、西米或高粱)的谷粒。因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的遺傳i夕.賴物具有更高的乙酰透明質(zhì)酸含量，相比，當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物時(shí)，可以在工業(yè)應(yīng)用中使用較少的這些材料。本發(fā)明還提供了制備根據(jù)本發(fā)明的組合物的方法，其中使用根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可加工的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可消費(fèi)的植物部分或用于產(chǎn)生合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的根據(jù)本發(fā)明方法可以得到的植物。用于制備本發(fā)明組合物的方法優(yōu)選是制備食品或飼料的方法、制備藥品的方法或制備化妝品的方法。制備食品或飼料的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在工業(yè)領(lǐng)域使用根本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且包括搗碎或碾磨根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物或根據(jù)本發(fā)明的植物部分；然而，它們不限于這些。在上文已經(jīng)描述了使用根據(jù)本發(fā)明的主題制備食品/飼料或用于工業(yè)領(lǐng)域產(chǎn)生的一些優(yōu)點(diǎn)。用于制備組合物的本發(fā)明方法尤其優(yōu)選是制備包含乙酰透明質(zhì)酸的組合物的方法。發(fā)明提供。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可加工的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可消費(fèi)的植物部分或根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)生合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法可以得到的植物的用途，用于制備根據(jù)本發(fā)明的組合物。優(yōu)選使用根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細(xì)胞、根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物、根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料、根據(jù)本發(fā)明的可收獲的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可加工的植物部分、根據(jù)本發(fā)明的可消費(fèi).明的產(chǎn)生合成乙酰透"的植物制備食品或飼料、制備藥品或制備化妝，_品<序列描述SEQIDNOl:編碼緣草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸序列。SEQIDN02:緣草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合酶的氨基酸序列。所示氨基酸序列可以來(lái)自SEQIDNOl。SEQIDN03:編碼緣草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合酶的合成的核酸序列?？梢赃M(jìn)行所示序列的密碼子的合成使得它適于植物細(xì)胞中密碼子的用法。所示的核酸序列編碼具有SEQIDN02中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。SEQIDN04:編碼具有緣草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸序列。SEQIDN05:具有緣草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可以來(lái)自SEQIDN04。SEQIDN06:編碼具有緣草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的合成的核酸序列。進(jìn)行所示序列密碼子的合成使得它適于植物細(xì)胞中密碼子的用法。所示的核酸序列編碼具有SEQIDN05中所示氨基M列的蛋白質(zhì)。SEQIDNO7:用于實(shí)施例1的合成寡核苷酸。SEQIDNO8:用于實(shí)施例1的合成寡核苷酸。附圖描述圖1:顯示了用于計(jì)算植物組織中乙酰透明質(zhì)酸含量的校準(zhǔn)曲線和回歸線的對(duì)應(yīng)方程。使用商業(yè)測(cè)試試劑盒(透明質(zhì)酸(HA)測(cè)試試劑盒，來(lái)自CorgenixInc.,Colorado,USA,產(chǎn)品號(hào)029-001)和隨之提供的標(biāo)準(zhǔn)溶液建立校準(zhǔn)曲線。一般方法在下文描述可以用于本發(fā)明的方法。這些方法是特定實(shí)施方案；然而，本發(fā)明不限于這些方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知通過(guò)修改所述方法和/或通過(guò)實(shí)施本發(fā)明。1.馬鈴薯植物的轉(zhuǎn)化用土壤桿菌轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物，如Rocha-Sosa等人(EMBOJ.8，(1989)，23-29)中所述。2.從植物組織分離乙酰透明質(zhì)酸為了檢測(cè)乙酰透明質(zhì)酸的存在和確定植物組織中的乙酰透明質(zhì)酸含量，如下建立植物材料向約0.38塊莖材料加入200^11水(去礦物質(zhì)，電導(dǎo)率a8Mil)，并將混合物在實(shí)驗(yàn)室擺動(dòng)式球磨機(jī)(MM200，來(lái)自Retsch，德國(guó))中搗碎(30Hz下30秒)。然后再加入800jil水(去礦物質(zhì)，電導(dǎo)率^18MQ)，并將混合物充分混合(使用例如，Vortex混合器)。通過(guò)在16000xg下離心5分鐘分離細(xì)胞殘?jiān)筒蝗芙M分與上清液。3.乙酰透明質(zhì)酸的純化將約100g塊莖去皮，切成約1cm3大小的塊，加入100ml水(去礦物質(zhì)的，電導(dǎo)率^18MH),以約30秒的最大速度在韋林?jǐn)嚽衅髦袚v碎。然后使用茶篩除去細(xì)胞碎片。將除去的細(xì)胞碎片重懸浮在300ml水(去礦物質(zhì)的，電導(dǎo)率^18Mft)中，并再次使用茶篩(teasieve)除去。將得到的兩個(gè)懸浮液(lOOml十300ml)合并并以13000xg離心15分鐘。向所得的離心上清液中加入NaCl直到達(dá)到1°/。的終濃度。NaCl進(jìn)入溶液后，通過(guò)加入兩倍體積的乙醇，接著充分混合并在-20。C過(guò)夜溫育進(jìn)行沉淀。然后以13000xg離心混合物15分鐘。將該離心后得到的沉降的沉淀物溶解在100ml緩沖液(50mMTrisHC1，pH8，lmMCaCh)中，然后加入蛋白酶K至終濃度為100jig/ml并在42。C下溫育溶液2小時(shí)。接著在95。C溫育10分鐘。再次向該溶液中加入NaCl直到達(dá)到終濃度1%。NaCl進(jìn)入溶液中后，通過(guò)加入兩倍體積的乙醇，充分混合并在-20。C再次溫育約96小時(shí)進(jìn)行另一次沉淀。接著以13000xg離心15分鐘。將該離心后得到的沉降的沉淀物溶解在30ml水(去礦物質(zhì)的，電導(dǎo)率^18MQ)中，再次加入NaCl至終濃度1%。通過(guò)加入兩倍體積的乙醇，充分混合并在-20。C過(guò)夜溫育后，進(jìn)^f亍另一次沉淀。將隨后在13000xg下離心15分鐘后得到的沉淀溶解在20ml水(去礦物質(zhì)的，電導(dǎo)率218MH)中。通過(guò)離心過(guò)濾進(jìn)行進(jìn)一步的純化。為此，在每種情況中，對(duì)濾膜(CentriconAmicon，孔寬度10000NMWL，產(chǎn)品號(hào)UCF801096)應(yīng)用5ml溶解的沉淀物，并將樣品以2200xg離心直到在濾器上保留約3ml溶液。再進(jìn)行兩次如下操作在每種情況下向膜上的溶液加入3ml水(去礦物質(zhì)的，電導(dǎo)率^18Mfl)并且在每種情況下在相同條件下再次離心直到最后在濾器上僅僅保留約3ml溶液。取走離心過(guò)濾后仍然存在于膜上方的溶液，用約1.5ml7jC(去礦物質(zhì)的，電導(dǎo)率^18Mft)反復(fù)沖洗(3到5次)膜。將仍然存在于膜上方的所有溶液和沖洗得到的溶液合并，加入NaCl至終濃度1%，NaCl進(jìn)入溶液中后，加入兩倍體積的乙醇，混合樣品并通過(guò)在-20。C下過(guò)夜保存得到沉淀物。將以13000xg離心15分鐘后得到的沉淀物溶解在4ml水(去礦物質(zhì)的，電導(dǎo)率^:18Mft)中，然后凍干(0，37毫巴壓力下24小時(shí)，來(lái)自Christ,Osterode，德國(guó)的凍干裝置ChristAlpha1-4)。4.乙酰透明質(zhì)酸的檢測(cè)和乙酰透明質(zhì)酸含量的測(cè)定4吏用商業(yè)試劑盒(透明質(zhì)酸(HA)測(cè)試試劑盒，來(lái)自Corgenix，Inc.，Colorado,USA，產(chǎn)品號(hào)029-001)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明(將其引入本文作為參考)檢測(cè)乙酰透明質(zhì)酸。測(cè)試原理是基于特異結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸的蛋白質(zhì)(HABP)的可得性并且與ELISA類似的進(jìn)行，其中顏色反應(yīng)表明所檢測(cè)的樣品中的乙酰透明質(zhì)酸含量。因此，為了定量測(cè)定乙酰透明質(zhì)酸，待測(cè)量的樣品應(yīng)該以所述極限內(nèi)的濃度使用(例如稀釋所述樣品或者使用較少的水從植物組織提取乙酰透明質(zhì)酸，這取決于極限是被超過(guò)還是沒(méi)有達(dá)到)。在平行的批次中，將待測(cè)定樣品的等分試樣最初進(jìn)行透明質(zhì)酸酶消化，然后使用商業(yè)測(cè)試試劑盒(來(lái)自Corgenix，Inc.，Colorado,USA的透明質(zhì)酸(HA)測(cè)試試劑盒，產(chǎn)品號(hào)029-001)測(cè)量。通過(guò)加入5fig(3單位)透明質(zhì)酸酶(來(lái)自Sigma的透明質(zhì)酸酶III型，產(chǎn)品號(hào)H2251)，使用透明質(zhì)酸酶緩沖液(0.1M磷酸鉀緩沖液，pH5.3;150mMNaCl)中的400pl番茄塊莖提取物并在37。C下溫育30分鐘進(jìn)行透明質(zhì)酸酶消化。在每種情況下，在1:10的稀釋液中，所有樣品用于測(cè)定乙酰透明質(zhì)酸含量。5.UDP-Gk-DH活性的測(cè)定如Spicerl等人(1998，J.Bacteriol.273(39)，25117-25124)中所述的測(cè)定具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的活性。實(shí)施例1.植物表達(dá)載體IR47-71的制備質(zhì)粒pBinAR是雙元載體質(zhì)粒pBin19(Bevan，1984，NuclAcidsRes12:8711-8721)的4汙生物，其可以如下構(gòu)建將包含花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子的核苷酸6卯9-7437的529bp長(zhǎng)的片段分離為來(lái)自質(zhì)粒pDH51的五"/I//T/mI片段(Pietrzak等人，1986NucleicAcidsRes.14，5858)并連接在pUC18的多聚接頭的五oRI和K/mI限制性位點(diǎn)之間。以這種方式，形成質(zhì)粒pUC18-35S。使用限制性內(nèi)切酶歷7H/III和戶v"II，從質(zhì)粒pAGV40分離192bp長(zhǎng)的片段，其包括Ti質(zhì)粒pTiACH5(Gielen等人，1984，EMBOJournal3,835-846)的T-DNA的章魚堿合酶基因(基因3)的多聚腺苷酸化信號(hào)(3'末端)(核苷酸11749-11939)(Herrera-Estrella等人，1983Nature,303，209-213)。在II限制性位點(diǎn)加入I接頭后，將片段連接在pUC18-35S的I和/^Vif/ni限制性位點(diǎn)之間。這得到質(zhì)粒pA7。這里，使用EcoRI和i7ZwdIII除去包含35S啟動(dòng)子和Ocs終止子的完整多聚接頭并將其連接到適當(dāng)切割的載體pBinl9中。這得到植物表達(dá)載體pBinAR(H6fgen和Wilhnitzer，19卯，PlantScience66，221-230)。將來(lái)自馬鈴薯的patatin基因B33的啟動(dòng)子(Rocha-Sosa等人，1989，EMBOJ.8,23-29)作為I片段(核苷酸-1512-+14)連接到I-切割的載體pUC19中，該載體的末端已經(jīng)使用T4-DNA聚合酶平末端化。這得到質(zhì)粒pUC19-B33。使用E"7I和I從該質(zhì)粒除去B33啟動(dòng)子并連接到適當(dāng)限制性消化的載體pBinAR中。這得到植物表達(dá)載體pBinB33。為了方便進(jìn)一步克隆步驟，將MCS(多克隆位點(diǎn))延伸。為此，合成兩個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸，在95。C加熱5分鐘，緩慢冷卻到室溫以允許良好的退火并克隆到pBinB33的1和Apw1限制性位點(diǎn)中。用于該目的的寡核苷酸具有下面的序列5'畫TCgACAggCCTggATCCTTAATTAAACTAgTCTCgAggAgCTCggTAC國(guó)3'5'-CgAgCTCCTCgAgACTAgTTTAATTAAggATCCAggCCTg-3'將所得的質(zhì)粒命名為IR47-71。2.植物表達(dá)載體pBinARHyg的制備使用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和仔/wJIII從pA7除去包含35S啟動(dòng)子、Ocs終止子和整個(gè)多克隆位點(diǎn)的片段并將其克隆到載體pBIBHyg(Becker，1990，NucleicAcidsRes.18，203)中，該載體已經(jīng)用相同的限制性內(nèi)切核酸酶切割。將所得的質(zhì)粒命名為pBinARHyg。3.核酸分子的合成a)編碼緣草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子的合成由MedigenomixGmbH(Munich,德國(guó))合成編碼緣草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸序列并將其克隆到來(lái)自Invitrogen的載體pCR2.1(產(chǎn)品號(hào)K2000-01)中。將得到的質(zhì)粒命名為IC323-215。編碼來(lái)自緣草履蟲小球藻病毒l的HAS蛋白質(zhì)的合成核^^列在SEQIDN03中顯示。最初從緣草履蟲小球藻病毒1分離的對(duì)應(yīng)的核酸序列在SEQIDNOl中顯示。b)編碼具有緣草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸分子的合成由EntdechonGmbH合成編碼具有緣草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的核酸序列并將其克隆到來(lái)自Invitrogen的載體pCR4Topo中(產(chǎn)品號(hào)K4510-20)。將得到的質(zhì)粒命名為IC"9-222。編碼來(lái)自緣草履蟲小球藻病毒l的UDP-Glc-DH蛋白質(zhì)的合成的核酸序列在SEQIDN06中顯示。最初從緣草履蟲小球藻病毒l分離的對(duì)應(yīng)的核酸序列在SEQIDN04中顯示。4.包含緣草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合酶的編碼核酸序列的植物表達(dá)載體IC341-222的制備使用iff附/yI和I進(jìn)行限制性消化，從質(zhì)粒IC323-215分離包含乙酰透明質(zhì)酸合酶的編碼序列的核酸分子并將其克隆到質(zhì)粒IR47-71的必tf附//1和AT^I限制性位點(diǎn)中。將得到的植物表達(dá)載體命名為IC341-222。5.制備包含具有緣草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的編碼核酸序列的植物表達(dá)載體IC349-222用BamHI和KpnI進(jìn)行限制性消化，從質(zhì)粒IC339-222分離包含具有緣草履蟲小球藻病毒l的UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的編碼序列的核酸分子并將其克隆到已經(jīng)通過(guò)相同的限制性內(nèi)切酶切割的質(zhì)粒pA7中。將所得的質(zhì)粒命名為IC342-222。通過(guò)用XbaI和KpnI限制性消化從質(zhì)粒IC342-222分離包含具有緣草履蟲小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的編碼序列的核酸分子并將其克隆到已經(jīng)用AT6"I和/T/mI切割的表達(dá)載體pBinARHyg中。將所得的質(zhì)粒命名為IC349-222。物用一般方法第l項(xiàng)中給出的方法，使用植物表達(dá)載體IC341-222轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物(cvD6sir6e)，所述載體包含來(lái)自緣草履蟲小球藻病毒1的乙酰透明質(zhì)酸合酶的編碼核酸序列，其處于來(lái)自馬鈴薯的patatin基因B33的控制下(Rocha-Sosa等人，1989，EMBOJ.8，23-29)。得到用質(zhì)粒IC341-222轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物，將該植物命名為365ES。7.用包含編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物的分析a)校準(zhǔn)曲線的構(gòu)建使用隨商業(yè)測(cè)試試劑盒(來(lái)自Corgenix，Inc.,Colorado,USA的透明質(zhì)酸(HA)測(cè)試試劑盒，產(chǎn)品號(hào)029-001)通過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)生產(chǎn)商描述的方法構(gòu)建校準(zhǔn)曲線。為了測(cè)定1600ng/ml乙酰透明質(zhì)酸的消光，使用基于生產(chǎn)商指出的標(biāo)準(zhǔn)供應(yīng)量的兩倍量，所述標(biāo)準(zhǔn)供應(yīng)量包含800ng/ml乙酰透明質(zhì)酸。在每種情況下，進(jìn)行三次獨(dú)立的測(cè)量系列，并且測(cè)定對(duì)應(yīng)的平均值。這得到下面的校準(zhǔn)曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表l:構(gòu)建校準(zhǔn)曲線的值，所述校準(zhǔn)曲線用于定量測(cè)定植物組織中的乙酰透明質(zhì)酸含量。借助軟件(MicrosoftOfficeExcel2002，SP2)，所得到的測(cè)量值進(jìn)入簡(jiǎn)圖中并確定趨勢(shì)線函數(shù)方程(見(jiàn)圖1)。E45o畫指在450nm波長(zhǎng)下的消光，標(biāo)準(zhǔn)差是各個(gè)值的理論平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。b)林系365ES的馬鈴薯塊莖的分析在溫室中，在6cm盆的土壤中栽培林系365ES的個(gè)體植物。在每種情況中，根據(jù)一般方法第2項(xiàng)中描述的方法處理各植物的約0.3mg馬鈴薯塊莖材料。使用一般方法第4項(xiàng)中描述的方法，借助實(shí)施例7a)和圖1中所示的校準(zhǔn)曲線測(cè)定各自植物提取物中存在的乙酰透明質(zhì)酸的量。這里，離心后得到的上清液以1:10的稀釋度使用，用以測(cè)定乙酰透明質(zhì)酸含量。對(duì)應(yīng)所選的植物，得到下面的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表2:林系365ES的獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的乙酰透明質(zhì)酸的量(每g鮮重乙酰透明質(zhì)酸的JLig數(shù))。第一列指用于收獲塊莖材料的植物(這里，"野生型，，指未轉(zhuǎn)化的植物，然而其具有用作轉(zhuǎn)化的起始材料的基因型)。第二列指出用于測(cè)定乙酰透明質(zhì)酸含量的所述植物的塊莖的量。第3列含有各自植物提取物的1:10稀釋度下測(cè)量的消光。第4列是借助回歸線方程計(jì)算的(見(jiàn)圖1)，考慮稀釋系數(shù)，如下((第3列值-0.149)/0.00185)x10。第5列指出基于使用的鮮重的乙酰透明質(zhì)酸的量，并且如下計(jì)算(第4列值/第2列值)/1000。"n.d."是檢測(cè)不到的量。8.用包含具有UDP-Glc-DH活性的蛋白質(zhì)的編碼核酸序列的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合成乙酰透明質(zhì)酸的植物使用一般方法第1項(xiàng)中給出的方法，在每種情況下用植物表達(dá)載體349-222轉(zhuǎn)化林系365ES13和365ES74的馬鈴薯植物。權(quán)利要求1.遺傳修飾的植物細(xì)胞，其具有穩(wěn)定整合到它的基因組中的編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸分子，其中所述植物細(xì)胞與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比額外具有升高活性的具有UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)活性的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求1所述的遺傳修飾的植物細(xì)胞，其中具有UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)活性的蛋白質(zhì)的升高的活性是由外源核酸分子向所述植物細(xì)胞的導(dǎo)入引起的。3.權(quán)利要求l所述的遺傳修飾的植物細(xì)胞，其中所述外源核酸分子編碼具有UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)的酶促活性的蛋白質(zhì)。4.權(quán)利要求1、2或3任一項(xiàng)所述的遺傳修飾的植物細(xì)胞，其與具有乙酰透明質(zhì)酸合酶活性并且沒(méi)有UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)的升高活性的植物細(xì)胞相比，合成增加量的乙酰透明質(zhì)酸。5.包含如權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的遺傳修飾的植物細(xì)胞的植物。6.如權(quán)利要求5所述的植物的繁殖材料，其包含如權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的遺傳纟務(wù)飾的植物細(xì)胞。7.如權(quán)利要求5所述的植物的可收獲的植物部分，其包含如權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的遺傳修飾的植物細(xì)胞。8.產(chǎn)生合成乙酰透明質(zhì)酸的植物的方法，其包括a)遺傳修飾植物細(xì)胞，其中該遺傳修飾包括下面的步驟i到ii:i)向植物細(xì)胞中導(dǎo)入編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的外源核酸分子，ii)向植物細(xì)胞中導(dǎo)入遺傳修飾，該遺傳修飾與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的野生型植物細(xì)胞相比導(dǎo)致具有UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)的酶促活性的蛋白質(zhì)的活性升高，其中步驟i到ii可以以任何順序各自進(jìn)行，或者可以同時(shí)進(jìn)行步驟i到ii的任一組合，b)從步驟a)的植物細(xì)胞再生植物；如果合適，使用根據(jù)步驟b)的植物產(chǎn)生進(jìn)一步的植物，C)其中如果合適，從根據(jù)步驟b)i)或b)ii)得到的植物分離植物細(xì)胞，并重復(fù)方法步驟a)到c)直到產(chǎn)生植物，該植物與對(duì)應(yīng)的沒(méi)有遺傳修飾的GFAT的酶促活性的蛋白質(zhì)的升高的活性。9.制備乙酰透明質(zhì)酸的方法，其包括從如權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的遺傳修飾的植物細(xì)胞、如權(quán)利要求5所述的植物、如權(quán)利要求6所述的繁殖材料、如權(quán)利要求7所述的可收獲的植物部分或通過(guò)如權(quán)利要求8所述的方法可以得到的植物提取乙酰透明質(zhì)酸。10.權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的遺傳修飾的植物細(xì)胞、權(quán)利要求5所述的植物、權(quán)利要求6所述的繁殖材料、權(quán)利要求7所述的可收獲的植物部分或通過(guò)權(quán)利要求8所述的方法可以得到的植物用于制備乙酰透明質(zhì)酸的用途。11.包含如權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的遺傳修飾的植物細(xì)胞的組合物。12.制備包含乙酰透明質(zhì)酸的組合物的方法，其中使用如權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的遺傳修飾的植物細(xì)胞、如權(quán)利要求5所述的植物、如權(quán)利要求6所述的繁殖材料、如權(quán)利要求7所述的可收獲的植物部分或通過(guò)如權(quán)利要求8所述的方法可以得到的植物。13.如權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的遺傳修飾的植物細(xì)胞、如權(quán)利要求5所述的植物、如權(quán)利要求6所述的繁殖材料、如權(quán)利要求7所述的可收獲的植物部分或通過(guò)如權(quán)利要求8所述的方法可以得到的植物在制備如權(quán)利要求11所述的組合物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及合成增加量的乙酰透明質(zhì)酸的植物細(xì)胞和植物，還涉及制備此類植物的方法，以及借助這些植物細(xì)胞或植物制備乙酰透明質(zhì)酸的方法。這里，根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞或遺傳修飾的植物與野生型植物細(xì)胞或野生型植物相比具有乙酰透明質(zhì)酸合酶活性和額外的增加的UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-Glc-DH)活性。本發(fā)明還涉及具有增加的乙酰透明質(zhì)酸合成的植物在制備乙酰透明質(zhì)酸和含有乙酰透明質(zhì)酸的食品或飼料中的用途。文檔編號(hào)C12P19/00GK101297041SQ200680040334公開(kāi)日2008年10月29日申請(qǐng)日期2006年10月5日優(yōu)先權(quán)日2005年10月5日發(fā)明者C·弗羅貝格申請(qǐng)人:拜爾作物科學(xué)股份公司