專利名稱：：通過同步化植物細(xì)胞培養(yǎng)的次級代謝產(chǎn)物批量生產(chǎn)的穩(wěn)定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：植物在我們生活中的應(yīng)用越來越重要了，它不僅是我們食物的供應(yīng)者，而且還是許多化學(xué)物質(zhì)的來源，如藥物、香精、顏料、農(nóng)業(yè)化學(xué)藥品和染料等都來源于植物。由植物生產(chǎn)的生物活性物質(zhì)大部分是次級代謝產(chǎn)物。因?yàn)榻^大多數(shù)次級代謝產(chǎn)物用作生理活性物質(zhì)，所以人們對這些次級代謝產(chǎn)物具有很大的興趣，諸如生物堿、過敏原、氨基酸、蒽醌、白血病抑制劑、殺菌劑、腫瘤抑制劑、抗病毒試劑、酶、類黃酮、殺蟲劑、鴉片劑、香料、色素、維生素和多糖等。根據(jù)Zhong(2002)報(bào)道，大約存在100，000種次級代謝產(chǎn)物已被人們所知；在實(shí)踐使用的藥物中有25%以上來源于植物。每年都有新發(fā)現(xiàn)的次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生。在獲得這些代謝產(chǎn)物的方法中仍然存在許多問題，諸如，雖然近年來有機(jī)化學(xué)飛速發(fā)展但是仍難于化學(xué)合成這些代謝產(chǎn)物，因過度開采和污染環(huán)境造成對自然界的破壞和因季節(jié)、地區(qū)和氣候等生產(chǎn)條件的變化代謝產(chǎn)物的成分發(fā)生改變并造成生產(chǎn)成本增加。因此，通過體外培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的方法正處在積極研制階段，這種體外培養(yǎng)技術(shù)即使在很小的空間內(nèi)也可以適當(dāng)控制外部環(huán)境條件進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
：根據(jù)韓國專利0130100，通過植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物活性物質(zhì)比直接從植物中提取這些物質(zhì)有更多的優(yōu)點(diǎn)。植物細(xì)胞培養(yǎng)不僅不受環(huán)境影響而且可以解決生態(tài)破壞的問題，所以這種方法被認(rèn)為是能夠進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)的最佳方法。但是，Nail和Roberts(2004)指出用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物生長速率慢且產(chǎn)率較低。為了解決這一問題，Zhong(2002)進(jìn)行了優(yōu)化培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、工藝和誘導(dǎo)條件等從而提高產(chǎn)率的研究)。在國際專利W093/17121中，各種培養(yǎng)基被用于培養(yǎng)多種紫杉以便增加細(xì)胞生長速率和紫杉醇(paclitaxel)產(chǎn)率。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果指出了生產(chǎn)大量紫杉醇的誘導(dǎo)條件。盡管這種方法提高了有價(jià)值的次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，然而對于從紫杉中生產(chǎn)紫杉醇或從許多植物中生產(chǎn)有價(jià)值的代謝物質(zhì)來說可變性仍然是主要問題。只有當(dāng)在長期培養(yǎng)過程中穩(wěn)定地保持細(xì)胞快速生長和代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)量時(shí)，通過大規(guī)模的植物細(xì)胞培養(yǎng)來生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物才有商業(yè)化的可能。可產(chǎn)生獨(dú)特代謝產(chǎn)物的細(xì)胞系的性能不穩(wěn)定，這種不穩(wěn)定在繼代培養(yǎng)中導(dǎo)致細(xì)胞系喪失它們最初的產(chǎn)率；還不能太多的說成功和失敗取決于我們?nèi)绾慰朔@些問題。在植物細(xì)胞培養(yǎng)中，盡管細(xì)胞來源于一種植物，但每個(gè)細(xì)胞系代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率不同且不穩(wěn)定。因此，建立具有高產(chǎn)率和遺傳穩(wěn)定性的細(xì)胞系比任何其它事情都重要。來自單細(xì)胞和多細(xì)胞的細(xì)胞系來自單細(xì)胞植物細(xì)胞系比來自多細(xì)胞的植物細(xì)胞系具有較低的可變性；這導(dǎo)致細(xì)胞系的產(chǎn)率來自單細(xì)胞高于來自多細(xì)胞的。在在先發(fā)明中，莖、根、種子、針葉和葉子被用作最好的外植體來誘導(dǎo)細(xì)胞系的產(chǎn)生。這些莖、根、種子、針葉和葉子是由不同功能和形態(tài)的細(xì)胞構(gòu)成的組織。來自這些組織中的愈傷組織細(xì)胞系不止一種。因此，在試圖降低來自由多細(xì)胞構(gòu)成的組織的愈傷組織的變種產(chǎn)率方面存在一些限制。細(xì)胞凝集植物細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)明顯特征是細(xì)胞凝集。根據(jù)專利0364478記載，植物細(xì)胞的直徑為30-300pm，大約比動(dòng)物細(xì)胞大30倍。由于植物細(xì)胞具有粘附在一起的天然趨勢，所以不可能得到僅僅由分散的單個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的懸浮液。細(xì)胞凝集的比例和尺寸隨植物種類和培養(yǎng)物生長的培養(yǎng)基變化而變化。Nail和Roberts指出，細(xì)胞凝集導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外局部環(huán)境的不同，這導(dǎo)致了培養(yǎng)物的異質(zhì)性并最終可導(dǎo)致生長和代謝的變化。懸浮培養(yǎng)的目的是得到純的單個(gè)細(xì)胞。為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，可以使用過濾、離析和通過酶的原生質(zhì)培養(yǎng)方法。但是，過濾和離析并不能獲得完全純化的單個(gè)細(xì)胞。去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)培養(yǎng)技術(shù)是產(chǎn)生單細(xì)胞的最可靠方法，但是用于培養(yǎng)原生質(zhì)的酶可引起細(xì)胞壁損傷或破損，最終導(dǎo)致細(xì)胞生理系統(tǒng)的變化。此外，疏水的次級代謝產(chǎn)物諸如紫杉醇可儲(chǔ)存在細(xì)胞壁中，使細(xì)胞壁的變化與產(chǎn)率之間具有意義深遠(yuǎn)的關(guān)系。而且，細(xì)胞凝集已經(jīng)是對細(xì)胞生長的計(jì)數(shù)精確測定和對獨(dú)立細(xì)胞的生物化學(xué)分析的主要障礙。根據(jù)Nail和Roberts(2004)報(bào)道，如果單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成為可能，將會(huì)容易地獲得關(guān)于培養(yǎng)中細(xì)胞單位活動(dòng)的更快的信息，諸如次級代謝產(chǎn)物中的生物合成、儲(chǔ)存和降解等信息。去分化由于無性系變異，作為愈傷組織的去分化細(xì)胞系在次級代謝方面有很大的可變性。即便微環(huán)境略微不同，來自永久組織諸如由具有不同功能和形態(tài)的細(xì)胞構(gòu)成的葉片、莖、根和種子的愈傷組織也通常顯示戲劇性的變化，因?yàn)槠錇橥ㄟ^去分化形成的次級分裂組織。由于這種敏感性，Hirasuna等(1996)的調(diào)查證實(shí)了細(xì)胞培養(yǎng)的條件，尤其是初始細(xì)胞密度，繼代培養(yǎng)間隔和溫度，并盡可能精確地保持它們。按比例擴(kuò)大為了通過植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物以便商業(yè)化，按比例擴(kuò)大是必須的。在許多專利和已出版的文章報(bào)道了有關(guān)通過實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)成功產(chǎn)生代謝產(chǎn)物之后，生物反應(yīng)器已經(jīng)被用于大規(guī)模生產(chǎn)。根據(jù)專利0290004記載，通過生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的培養(yǎng)環(huán)境條件解決了在實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)代謝產(chǎn)物生長速率慢和產(chǎn)率低的問題。當(dāng)生物反應(yīng)器被用于大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，生長速率、產(chǎn)率和代謝產(chǎn)物的變化變成了通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物活性物質(zhì)商業(yè)化的問題。在植物細(xì)胞培養(yǎng)的按比例擴(kuò)大中，通過外部動(dòng)力接收空氣的生物反應(yīng)器或者通過混合和通風(fēng)率的具有葉輪的生物反應(yīng)器是優(yōu)選的。但是，在生物反應(yīng)器中細(xì)胞發(fā)育能力突然下降是因?yàn)橹参锛?xì)胞對于切變很脆弱。因此，降低切變的方法成為了必須要解決的問題。植物細(xì)胞的切變敏感性的原因在于其較大的尺寸、剛性細(xì)胞壁、凝集和廣泛形成的液泡(Yokoi等，1993)。為了解決生物反應(yīng)器中的這些問題，過去通過控制其攪拌速度并修改葉輪類型，從而研究了切變生成較低的生物反應(yīng)器。但是，這仍然沒有得到積極的結(jié)果，因?yàn)榧?xì)胞系不能克服微環(huán)境差別的影響。低溫儲(chǔ)藏低溫儲(chǔ)藏通過在極低溫度下停止細(xì)胞的絕大部分新陳代謝來長期保持細(xì)胞。這意味著在低溫儲(chǔ)藏以后，細(xì)胞的遺傳、特性和生物合成的變化都處于停止?fàn)顟B(tài)。使用低溫儲(chǔ)藏可消除因?yàn)槲廴驹斐傻募?xì)胞損失并且可最小化連續(xù)細(xì)胞系中的遺傳變異。在環(huán)鳥苷酸(cGMP)中，為了穩(wěn)定供應(yīng)原材料，必須強(qiáng)制保證細(xì)胞系的長期保藏。通常培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞可低溫儲(chǔ)藏許多年，但用類似的低溫儲(chǔ)藏技術(shù)保藏培養(yǎng)的植物細(xì)胞卻具有很大的挑戰(zhàn)性。培養(yǎng)的植物細(xì)胞是不均質(zhì)的并顯示出生理和形態(tài)上的差異。因此，植物懸浮細(xì)胞要求許多程序才能低溫儲(chǔ)藏，不充分的低溫儲(chǔ)藏可引起變異。調(diào)節(jié)因子Kim等(2000)證明如果把具有分裂活性培養(yǎng)物的培養(yǎng)基加入到喪失細(xì)胞分裂能力的培養(yǎng)物中，可刺激細(xì)胞分裂。在通過玫瑰花懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)花青素時(shí)，當(dāng)將一些草莓懸浮培養(yǎng)物的培養(yǎng)基加入到玫瑰花懸浮培養(yǎng)物中時(shí)花青素產(chǎn)率會(huì)增加。在該方式中，從培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生和分泌刺激細(xì)胞生長的或者次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的因子被稱為調(diào)節(jié)因子。然而，這些調(diào)節(jié)因子并沒有被具體地鑒別，僅僅理解為用于細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的化學(xué)信號。而且，很少有報(bào)道認(rèn)為它們是有效物質(zhì)，諸如被認(rèn)為是調(diào)節(jié)因子的磷酸鹽和鈣調(diào)素(calmodulin)等。調(diào)節(jié)因子可通過條件培養(yǎng)基或者輔助細(xì)胞供應(yīng)。灌流培養(yǎng)法在細(xì)胞培養(yǎng)方法中，有一種在開始時(shí)一起接種細(xì)胞和培養(yǎng)基并且不再添加養(yǎng)分的成批培養(yǎng)法。另有一種連續(xù)培養(yǎng)法，其在培養(yǎng)過程中，當(dāng)回收用過的培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物的同時(shí)以一致的速度補(bǔ)充新的培養(yǎng)基以防止養(yǎng)分損耗。由于產(chǎn)率較低，成批培養(yǎng)法很難商業(yè)化。在連續(xù)培養(yǎng)方法中，近年來灌流培養(yǎng)逐漸引起了注意。在灌流培養(yǎng)中，細(xì)胞保持在生物反應(yīng)器中，當(dāng)回收用過的培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物的同時(shí)補(bǔ)充新的培養(yǎng)基。根據(jù)Zhang等(2000)報(bào)道，誘導(dǎo)是在細(xì)胞培養(yǎng)中促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的最有效方式之一。誘導(dǎo)雖然促進(jìn)了次級代謝產(chǎn)物的合成，但其抑制了細(xì)胞生長和降低了細(xì)胞發(fā)育能力。因此，通過誘導(dǎo)的次級代謝產(chǎn)物合成僅僅可被保持很短一段時(shí)間，且數(shù)量非常有限。如同Wang等(2001)所提出的那樣，灌流培養(yǎng)法是一種能使這些誘導(dǎo)產(chǎn)生的負(fù)面效果最小化和使產(chǎn)率最大化的策略。Wang等(2001)，Wu和Lin(2003)報(bào)道了如下內(nèi)容。通過誘導(dǎo)產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物被存儲(chǔ)在細(xì)胞內(nèi)部(液泡或者細(xì)胞壁中)或者被釋放到細(xì)胞之外(培養(yǎng)基中)。在培養(yǎng)過程中，從細(xì)胞中釋放次級代謝產(chǎn)物并將其從培養(yǎng)基中除去可使純化更容易并可減小生物合成和降解的反饋抑制以及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。因此，通過回收用過的培養(yǎng)基并提供新的培養(yǎng)基，內(nèi)外代謝產(chǎn)物的分泌物可延長細(xì)胞的發(fā)育能力和生物合成。并且這種方法可顯著地增加產(chǎn)率。由于細(xì)胞系的不同，次級代謝產(chǎn)物的儲(chǔ)存和分泌也有非常大的差異。紫杉培養(yǎng)基細(xì)胞系(Wickremesinhe和Arteca，1994)沒有分泌任何物質(zhì)。因此，需要建立具有顯著分泌能力的細(xì)胞系。前形成層或形成層培養(yǎng)前形成層或形成層是位于植物側(cè)面上的側(cè)生分生組織。在裸子植物和木本雙子葉植物中，由于分生組織的連續(xù)不斷的增長造成了增殖性生長；結(jié)果，存在具有11,000年以上生長輪的巨大植物。在遺傳學(xué)中，前形成層或形成層可被分為初級分生組織和次級分生組織。初級分生組織以種子萌發(fā)后在植物生長過程中胚胎發(fā)生和生長過程中形成的分生組織為代表。次級分生組織以由植物永久組織去分化形成的分生組織為代表。形成層是前形成層的連續(xù)性分生而沒有永久組織介入的初級分生組織。初級分生組織的生長是不確定的，如果條件適合還可繼續(xù)生長。因此，前形成層或形成層培養(yǎng)已經(jīng)被用于細(xì)胞的快速大量繁殖中。在前述研究中，形成層外植體制備如下在樹皮被剝?nèi)ズ?，樹干上切有兩個(gè)約lmm深間隔為5mm的縱向切口以便到達(dá)木質(zhì)部。這些外植體被稱為'形成層'，其由部分韌皮部、形成層和小片木質(zhì)部構(gòu)成(Jouria等，1998)。合理地說，通過上述方法誘導(dǎo)的細(xì)胞不僅僅是形成層來源，而是多種組織的來源，其在解剖學(xué)上可嚴(yán)格地被劃分為諸如韌皮部、形成層和木質(zhì)部。因此，可指出上述方法不是從構(gòu)成樹干的各種組織中僅僅分離形成層的理想技術(shù)。也因此需要發(fā)明從樹干的各種組織僅分離前形成層或形成層的創(chuàng)造性方法
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的是產(chǎn)生通過僅僅從短枝和樹干分離和培養(yǎng)前形成層或形成層的生產(chǎn)單細(xì)胞克隆的方法。為了使其更具體，本發(fā)明的目標(biāo)是解決植物細(xì)胞培養(yǎng)的變化，并通過結(jié)合物理細(xì)胞分離法和生理化學(xué)細(xì)胞分離法，利用解剖刀分離前述純的前形成層或形成層，創(chuàng)造植物生物學(xué)活性物質(zhì)的穩(wěn)定生產(chǎn)方法。本發(fā)明的另一目的是僅僅分離并培養(yǎng)來自紫杉短枝的前形成層或形成層和創(chuàng)造紫杉醇的生產(chǎn)方法。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明通過分離并培養(yǎng)來自紫杉短枝或者樹干的前形成層或形成層而得到單細(xì)胞克隆并提供穩(wěn)定的細(xì)胞增殖和紫杉醇的生產(chǎn)方法。特別是，通過得到單細(xì)胞克隆的穩(wěn)定的細(xì)胞增殖和生產(chǎn)紫杉醇的方法如下1)制備植物材料并分離前形成層或形成層；2)從分離的前形成層或形成層誘導(dǎo)單細(xì)胞克?。?)建立長期培養(yǎng)；4)建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物；5)按比例擴(kuò)大；6)通過誘導(dǎo)子、調(diào)節(jié)因子和灌流培養(yǎng)進(jìn)行紫杉醇生產(chǎn)；7)用低溫儲(chǔ)藏建立細(xì)胞庫。有益效果根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠培養(yǎng)單細(xì)胞克隆，單細(xì)胞克隆不通過從木本植物短枝或樹干的各種組織僅僅精確分離前形成層或形成層的去分化而具有初級分生組織的連續(xù)分生性。由于在長期培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長率和生長模式變化的變少，本發(fā)明的細(xì)胞系能夠保持生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定生產(chǎn)。其對于商業(yè)水平大規(guī)模生產(chǎn)來說同樣是理想的，因?yàn)榕c來自于前述技術(shù)的細(xì)胞系相比，由于凝集和多液泡的減少，其對生物反應(yīng)器中切變的敏感性降低。通過向細(xì)胞系中添加調(diào)節(jié)因子可剌激代謝產(chǎn)物的活化，并且通過灌流培養(yǎng)細(xì)胞將相當(dāng)大量的產(chǎn)物釋放到細(xì)胞外培養(yǎng)基中可延長細(xì)胞活力和生物合成性能。由于在低溫儲(chǔ)藏之后這種細(xì)胞系的均質(zhì)性和分裂能力能夠很好地恢復(fù)，所以設(shè)計(jì)了用低溫儲(chǔ)藏建立細(xì)胞庫。本發(fā)明確認(rèn)了培養(yǎng)物的均質(zhì)性和次級代謝產(chǎn)物的變異之間具有密切關(guān)系。由于本發(fā)明的方法控制并降低了不同生物活性物質(zhì)產(chǎn)生的變異性，所以本發(fā)明的方法可用于商業(yè)化的戰(zhàn)略。圖l顯示從前形成層或形成層誘導(dǎo)單細(xì)胞克隆過程中被分離的部分。圖2顯示來自前形成層或形成層、胚芽和針葉的三種不同細(xì)胞培養(yǎng)物的總生物產(chǎn)量表達(dá)得生長率。圖3顯示來自兩種不同組織(胚芽或針葉和形成層)的培養(yǎng)物的細(xì)胞凝集圖像。圖4顯示紫杉懸浮培養(yǎng)過程中紫杉醇產(chǎn)生方面的誘導(dǎo)效果。圖5是紫杉懸浮培養(yǎng)過程中紫杉醇產(chǎn)生方面的調(diào)節(jié)因子的效果。具體實(shí)施例方式下面將解釋本發(fā)明的實(shí)施例。從前形成層或形成層誘導(dǎo)和增殖單細(xì)胞克隆的方法不僅在紫杉醇生產(chǎn)系統(tǒng)中被利用，而且還可在所有植物次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)系統(tǒng)中利用。下列實(shí)施例僅作為說明，而不是對本發(fā)明的限制。<實(shí)施例1>植物材料的制備和前形成層或形成層的分離收集紫杉樹的種子、針葉、短枝。收集完后，將它們立即沉淀在100mg/L抗氧化劑和抗壞血酸溶液(L-抗壞血酸，DUCHEFA，Netherlands)中并轉(zhuǎn)移和保藏。考慮材料的形態(tài)和生理特性，對它們的表面進(jìn)行滅菌。①種子用70%的酒精對種子滅菌一分鐘，之后將它們浸入到1%的次氯酸鈉溶液中48小時(shí)，隨后用無菌水洗滌3到4次。接著，在0.5%的PVP(聚乙烯吡咯烷酮，DUCHEFA，Netherlands)和50mg/L抗壞血酸(L-抗壞血酸，DUCHEFA，Netherlands)以及70mg/L擰檬酸(DUCHEFA，Netherlands)溶液中，胚芽從種子中分離并在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。②針葉和短枝用含有1%苯菌靈(DongbuHannongChemical,Korea)+1%百菌清(DongbuHannongChemical，Korea)+1%硫酸鏈霉素(DUCHEFA，TheNetherlands)+0.1%頭孢噻月虧鈉(DUCHEFA，TheNetherlands)的溶液處理24小時(shí)之后,將針葉和短枝用自來水漂洗30秒以除去殘余化學(xué)物質(zhì)和酚化合物。將它們按順序用70%的酒精(DCChemical,Korea)滅菌1分鐘、30%過氧化氫(LGChemical,Korea)滅菌15分鐘，1%CLOROX溶液滅菌15分鐘、3%CLOROX溶液滅菌5分鐘后，將它們用蒸餾水洗滌3到4次。為了防止氧化，將針葉的兩端在0.5y。PVP，50mg/L抗壞血酸和70mg/L擰檬酸溶液中切割并在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。③從短枝或莖制備前形成層或形成層通過用鉗子保持短枝或莖的中心區(qū)的木質(zhì)部，剝?nèi)テ?、表皮組織和包括前形成層或形成層的韌皮部。將剝下的含有前形成層或形成層的組織放置在培養(yǎng)基上；允許前形成層或形成層與培養(yǎng)基表面接觸。<實(shí)施例2>從分離的前形成層或形成層誘導(dǎo)單細(xì)胞克隆從培養(yǎng)的第4到7天之后觀察前形成層或形成層的細(xì)胞分裂，培養(yǎng)的第15天愈傷組織開始從皮層、表皮組織和韌皮部的上部即前形成層或形成層中形成。在培養(yǎng)的第30天，前形成層或形成層開始從包含韌皮部和皮層以及表皮的上層組織中分離；在這兩層完全自然分離之后，分別將它們在不同的培養(yǎng)板上培養(yǎng)(圖1)。為了誘導(dǎo)細(xì)胞和愈傷組織，可使用植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的公知培養(yǎng)基例如mB5(改性的Gamberg，sB5培養(yǎng)基)，MS(Murashige&Skoog培養(yǎng)基)，WPM(Lloyed&McCown)，SM(schenk&Hildebrand培養(yǎng)基)，LP(Quoirin&Lepiovre)。所有這些培養(yǎng)基都可以應(yīng)用。在需要時(shí)，可添加各種添加劑，并且根據(jù)需要培養(yǎng)基的成分可減少或除去。在這些培養(yǎng)基中，最合適的培養(yǎng)基是mB5。表l列出了mB5的成分。表l紅豆杉中細(xì)胞系誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>L-精氨酸175甘氨酸75脯氨酸115激素a-醋酸萘2蔗糖10,000活性炭100Gelrite2,000在25士rc黑暗環(huán)境下，培養(yǎng)物在添加植物生長調(diào)節(jié)因子、植物激素(l-3mg/L)的培養(yǎng)基中生長。前形成層或形成層由均質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，所以其細(xì)胞以均勻方式分裂并且以板的形式增殖。另一方面，韌皮部、皮層及表皮的組織因?yàn)榧?xì)胞組成不同造成細(xì)胞分裂后產(chǎn)生不同的細(xì)胞，從而表皮層以不規(guī)則的形式增殖。于是，前形成層或形成層和含有韌皮部、皮層及表皮的組織之間自動(dòng)分層(圖1)。前形成層或形成層是均質(zhì)的，含有韌皮部、皮層及表皮的組織是異質(zhì)的，所以上下層之間的自動(dòng)裂層視為不同分裂速率造成的結(jié)果。培養(yǎng)的第15天之后，在由異質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的胚芽和針葉的外植體上經(jīng)過分化形成愈傷組織，并且由于各種細(xì)胞的分裂速率不同，這些愈傷組織以不規(guī)則的形式增殖，就像包含韌皮部、皮層以及表皮的組織那樣(圖l)。<實(shí)施例3〉長期培養(yǎng)的建立在這些愈傷組織中，白色的、易碎的愈傷組織具有良好生長率，這些部分每21天在新的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。來源于胚芽和針葉的培養(yǎng)物的生長速率非常不穩(wěn)定，通常顯示變褐的趨勢。相反，來源于前形成層或形成層的培養(yǎng)物的生長速度很快并且培養(yǎng)物沒有顏色變化。因此，這樣的培養(yǎng)物能夠選出穩(wěn)定的細(xì)胞。在培養(yǎng)六個(gè)月之后，絕大多數(shù)來源于胚芽和針葉的培養(yǎng)物為黃色或者淺褐色并形成凝集。來源于前形成層或形成層的培養(yǎng)物為白-黃色并以單個(gè)細(xì)胞或者小的細(xì)胞蔟形式存在。轉(zhuǎn)變成褐色并凝集的形成使培養(yǎng)物的生長速率降低，培養(yǎng)物由于它們所分泌的酚類化學(xué)物質(zhì)存在而逐漸死亡。本發(fā)明表明維持和大量增殖來源于胚芽和針葉的培養(yǎng)物在6個(gè)月后就變得很困難；但對于來源于前形成層或形成層的培養(yǎng)物來說，穩(wěn)定維持20個(gè)月以后，細(xì)胞生長速率、生長模式和凝集水平仍沒有任何變化(圖2)。換言之，生長模式方面的變化，取決于初始植物材料均質(zhì)性和異質(zhì)性。<實(shí)施例4〉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的建立來源于胚芽和針葉以及來源于前形成層或形成層的培養(yǎng)物分別在含有液體培養(yǎng)基的長頸瓶中培養(yǎng)(表2)。表2紅豆杉中的懸浮培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>以兩周為繼代間隔，培養(yǎng)物在25士rC黑暗的100rpm搖床上培養(yǎng)，這樣培養(yǎng)物可以連續(xù)保持較高活力即指數(shù)生長期。測定作為細(xì)胞產(chǎn)率變化的主要原因的凝集水平。用生物顯微鏡(CX31,Olympus,Japan)測定細(xì)胞凝集量。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。表3紫杉長期培養(yǎng)的細(xì)胞凝集類型<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>大細(xì)胞凝集尺寸大于1.5xl0^im;中等細(xì)胞凝集lxl03jnm;小細(xì)胞凝集4xl0^mK尺寸〈xl()3^im在來自胚芽和針葉的培養(yǎng)物懸浮液中，大約60%的細(xì)胞凝集尺寸超過1.5mm，但在來自前形成層或形成層的培養(yǎng)物懸浮液中，90%的細(xì)胞都以單個(gè)細(xì)胞形式培養(yǎng)。<實(shí)施例5>按比例擴(kuò)大在25±rc的黑暗環(huán)境下，來自胚芽和針葉以及來自前形成層或形成層的培養(yǎng)物在3L氣升式生物反應(yīng)器(Sung-WonSdTech，Korea)中培養(yǎng)。與在長頸瓶中培養(yǎng)物相比，來自胚芽和針葉的培養(yǎng)物的細(xì)胞大小和形狀有很大變化。凝集細(xì)胞的直徑可大到2-3mm，從而抑制了生物反應(yīng)器內(nèi)物質(zhì)的流動(dòng)性增加了未混合區(qū)域。由粘附在生物反應(yīng)器的內(nèi)壁上的細(xì)胞為準(zhǔn)形成生長環(huán)。因?yàn)椴荒芴峁┏浞峙囵B(yǎng)基，生長環(huán)中心的細(xì)胞在20天后死亡。死亡的細(xì)胞會(huì)分泌毒性物質(zhì)并且這些毒性物質(zhì)會(huì)降低生物反應(yīng)器中所有細(xì)胞的活力。相反，來自前形成層或形成層培養(yǎng)物細(xì)胞的較少凝集會(huì)引起生物反應(yīng)器中空氣的平緩循環(huán)；因此其能夠?qū)⑺蜌饬繌拿糠昼?00ml降低到每分鐘150ml，在培養(yǎng)基表面上形成的氣泡的量也因此極大地減少。來自胚芽和針葉的培養(yǎng)物在長頸瓶中的倍增時(shí)間為12天，但在生物反應(yīng)器中延長為21天。這是因?yàn)橛捎诩?xì)胞凝集和剛性細(xì)胞壁對切變敏感而導(dǎo)致了生長環(huán)形成和細(xì)胞活力的快速下降。來自前形成層或形成層的培養(yǎng)物的倍增時(shí)間為4到5天，并且在長頸瓶和生物反應(yīng)器中沒有差別，甚至倍增時(shí)間在生物反應(yīng)器中變短(表4)。來自前形成層或形成層的培養(yǎng)物在生物反應(yīng)器中形成非常小的生長環(huán)，并且生長環(huán)很容易通過以簡單的刺激攪拌培養(yǎng)基而溶解。此外，由于細(xì)胞凝集較少和更多的液泡，對切變敏感性較低，因此細(xì)胞活力沒有下降。表4東北紅豆杉(7:cMpWato)細(xì)胞培養(yǎng)物在長頸瓶和生物反應(yīng)器中倍<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><實(shí)施例6>誘導(dǎo)子誘導(dǎo)子能夠控制植物細(xì)胞中的分子信號，因此對于增加次級代謝物的產(chǎn)率有廣泛的應(yīng)用。在用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo)子和其它IO種誘導(dǎo)子處理之后，我們觀察到茉莉酮酸甲酯對紫杉醇生產(chǎn)具有積極影響。通過結(jié)合茉莉酮酸甲酯與其它誘導(dǎo)子能夠得到相當(dāng)高的代謝物產(chǎn)率。特別是，使用茉莉酮酸甲酯、殼聚糖和苯丙氨酸進(jìn)行處理對于紫杉醇生產(chǎn)非常有效(圖4)。<實(shí)施例7>調(diào)節(jié)因子當(dāng)細(xì)胞正在生長或者停止生長時(shí)會(huì)產(chǎn)生來源于次級代謝的物質(zhì)。因此，兩階段培養(yǎng)對于生產(chǎn)代謝產(chǎn)物是合適的，例如紫杉醇的細(xì)胞生長階段和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生階段是分開的，這樣非常適合生產(chǎn)代謝產(chǎn)物。在第一階段，通過優(yōu)化細(xì)胞生長使細(xì)胞最大化增殖，在第二階段，通過改變培養(yǎng)條件來優(yōu)化產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。與具有低產(chǎn)率的細(xì)胞系相比，具有高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)率的細(xì)胞系長得更慢但死得更快。因此，大量增殖是困難的并代謝產(chǎn)物的大量生產(chǎn)是不可能的。在本發(fā)明中，沒有將具有低增殖和高產(chǎn)率能力的細(xì)胞系用于大規(guī)模增殖，而將它們用作有助于次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因子的輔助細(xì)胞。在加入輔助細(xì)胞之后我們觀察到產(chǎn)生了紫杉醇。其結(jié)果可參見圖5。<實(shí)施例8>灌流培養(yǎng)在培養(yǎng)的第14天，用誘導(dǎo)子處理來自胚芽和針葉以及來自前形成層或形成層的培養(yǎng)物。從誘導(dǎo)的那一時(shí)間起，每5天用吸液管在無菌狀態(tài)下回收用過的培養(yǎng)基并同時(shí)補(bǔ)充相同量的新培養(yǎng)基。在45天長期培養(yǎng)后可觀察到細(xì)胞和培養(yǎng)基中紫杉醇的產(chǎn)生。其結(jié)果可參見表5。表5來源于各種外植體的東北紅豆杉細(xì)胞的紫杉醇的產(chǎn)生和釋放紫杉醇產(chǎn)量(mg/kg)紫杉醇釋放<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>誘導(dǎo)5天之后將更新培養(yǎng)基一起合成到細(xì)胞培養(yǎng)物中，即將50mg/L殼聚糖、0.1mM苯基丙氨酸和10(HiM茉莉酸甲酯添加到用過14天的培養(yǎng)物中。以每5天重復(fù)更新培養(yǎng)基而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中的紫杉醇依細(xì)胞系不同而不同。來源于前形成層或形成層的培養(yǎng)物的釋放能力高于現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)物的釋放能力。此外，灌流培養(yǎng)的應(yīng)用有利于次級代謝產(chǎn)物釋放到培養(yǎng)基中。周期性地更換培養(yǎng)基對加強(qiáng)由來源于前形成層或形成層的單細(xì)胞克隆向細(xì)胞外釋放次級代謝產(chǎn)物是非常重要的，因?yàn)槠湓试S生物量和簡單純化的連續(xù)循環(huán)。換言之，在來源于前形成層或形成層的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)中培養(yǎng)基的周期性更換可被認(rèn)為是在長期培養(yǎng)中產(chǎn)生有價(jià)值的代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定方法，因?yàn)樗乐沽思?xì)胞中積累的代謝產(chǎn)物的反饋抑制、培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物的降解和轉(zhuǎn)化。<實(shí)施例9>低溫儲(chǔ)藏在培養(yǎng)的第6或第7天，懸浮的細(xì)胞在含有0.16M甘露醇的培養(yǎng)基中室溫下預(yù)培養(yǎng)3天，然后在4"下保持3小時(shí)。收集細(xì)胞并將其置于含有40%乙二醇(Sigma,USA)和30%山梨醇(DUCHEFA，TheNetherlands)的培養(yǎng)基的4ml冷凍管中，在4C下培養(yǎng)3分鐘。細(xì)胞在液氮中浸泡后，用低溫冷凍儲(chǔ)藏法處理懸浮細(xì)胞。為了融化，將放入液氮中超過10分鐘的培養(yǎng)細(xì)胞在4(TC水浴中融化1-2分鐘。為了使細(xì)胞再生長，低溫儲(chǔ)藏的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到含有0.5M山梨醇的半固體生長培養(yǎng)基(表1)上并在室溫下緩解(alleviate)30分鐘。細(xì)胞在含有0.1M山梨醇的半固體生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)。然后，細(xì)胞在不含山梨醇的半固體生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，兩次。評估細(xì)胞活力。<實(shí)施例IO紫杉醇含量分析將細(xì)胞從回收的樣品培養(yǎng)基中分離之后，分析紫杉酮的含量。在用真空烘干器(SamShinGlass,Korea)完全干燥細(xì)胞后，測定細(xì)胞量。在室溫下混合大約lOOmg(干重)細(xì)胞與4ml甲醇(Sigma,USA)溶液(1:1v/v)以及氯甲烷(Sigma,USA)，以一小時(shí)為間隔用超聲波除垢器(Branson,USA)提取3次。待細(xì)胞完全干燥后，用4ml氯甲烷多次提取。真空干燥分離的有機(jī)溶劑層并且將殘?jiān)芙庠?ml甲醇中。溶解的提取物同樣通過超聲波除垢器攪拌。然后，離心后除去顆粒(8，000gX5min)。從細(xì)胞分離的培養(yǎng)基(l-5ml)與相同體積的氯甲烷混合并在充分?jǐn)嚢韬筇崛?次。有機(jī)溶劑經(jīng)完全真空干燥后，將其再次溶解到0.5ml的甲醇中。用HPLC(高效液相色譜，Shiseido,Japan)進(jìn)行含量分析，用Sigma產(chǎn)品進(jìn)行紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定。通過使用爐子用Capcellpak(C18,MGII，5um，3.0mmX250mm,Shiseido,Japan)保持在40。C的溫度，以水和氰化甲烷(acetonitril，Burdick&Jackson,USA)(50:50,v/v)為流動(dòng)相，并以0.5ml/min的速度有規(guī)律的滴落。使用UV-VIS探測器(227nm,Shiseido,Japan)。工業(yè)實(shí)用性在本發(fā)明中，通過單純從短枝或樹干中分離由于比現(xiàn)有技術(shù)的細(xì)胞系更短的倍增時(shí)間而導(dǎo)致的更高產(chǎn)率的前形成層或形成層，獲得單克隆細(xì)胞、具有分裂組織連續(xù)性而不去分化的初級分裂組織。由于在長期培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長和生長模式中更小地變化，還允許穩(wěn)定的產(chǎn)率，并且由于細(xì)胞系的更少凝集和多個(gè)液泡，按比例擴(kuò)大是可能的。在低溫儲(chǔ)藏之后該細(xì)胞系可被回收而在遺傳上沒有任何變化。權(quán)利要求1、一種植物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，從植物組織分離前形成層或形成層，其包括下列步驟①收集植物組織后滅菌②從滅菌的植物組織分離前形成層或形成層③從前形成層或形成層誘導(dǎo)單細(xì)胞系2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的植物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，通過使用單細(xì)胞克隆利用具有用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的調(diào)節(jié)因子的輔助細(xì)胞進(jìn)行植物細(xì)胞培養(yǎng)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，通過回收單細(xì)胞克隆培養(yǎng)的用過的培養(yǎng)基并供給新的培養(yǎng)基來延長細(xì)胞活力和生物合成。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的植物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，使用單細(xì)胞克隆的低溫儲(chǔ)藏建立細(xì)胞庫。5、一種植物生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，利用通過權(quán)利要求1所述的方法利用單細(xì)胞克隆或其培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，通過茉莉酮酸甲酯處理來增加產(chǎn)率。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，通過茉莉酮酸甲酯、苯丙氨酸和殼聚糖處理來增加產(chǎn)率。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，通過使用單細(xì)胞克隆利用具有用于植物生物活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)因子的輔助細(xì)胞進(jìn)行植物生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)。9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，回收單細(xì)胞克隆培養(yǎng)的用過的培養(yǎng)基并供給新的培養(yǎng)基來延長細(xì)胞活力和生物合成。10、根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，使用單細(xì)胞克隆的低溫儲(chǔ)藏建立細(xì)胞庫。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過改進(jìn)均質(zhì)細(xì)胞系使細(xì)胞生長和生產(chǎn)的變化最小化的方法。更具體地，其為從前形成層或形成層分離并增殖單細(xì)胞克隆的方法，通過解決在長期培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長和產(chǎn)率的下降問題，增強(qiáng)來自植物的生物活性物質(zhì)生產(chǎn)的穩(wěn)定性。文檔編號C12N5/04GK101297028SQ200680039945公開日2008年10月29日申請日期2006年4月25日優(yōu)先權(quán)日2005年10月31日發(fā)明者陳榮雨申請人:云火