專利名稱：：具有新切割特異性的I-CreI歸巢核酸內(nèi)切酶變體及其用途的制作方法具有新切割特異性的歸巢核酸內(nèi)切酶變體及其用途本發(fā)明涉及一種改造出能夠切割突變I-CVeI位點的I-Od歸巢核酸內(nèi)切酶變體的方法，所述突變位點在士8到±10位有改變。本發(fā)明還涉及可得自所述方法的歸巢核酸內(nèi)切酶變體、編碼所述變體的載體、經(jīng)所述載體修飾的細(xì)胞、動物或植物，并涉及所述I-OeI核酸內(nèi)切酶變體及其衍生產(chǎn)物在遺傳工程、基因組治療和抗病毒治療中的用途。大范圍核酸酶是具有大(>14bp)切割位點的序列特異性核酸內(nèi)切酶，其可引發(fā)活細(xì)胞中特定基因座的DNA雙鏈斷裂(double-strandbreak,DSB)(Thierry和Dujon,NucleicAcidsRes.，1992，20,5625-5631)。大范圍核酸酶已用于在培養(yǎng)的細(xì)胞和植物中刺激其靶序列周圍發(fā)生同源重組(Rouet等，Mol.Cell.Biol"1994，14,8096-106;Choulika等，Mol.Cell.Biol"1995，15,1968-73;Donoho等，Mol.Cell.Biol，1998,18，4070-8;Elliott等，Mol.Cell.Biol"1998，18，93-101;Sargent等，Mol.Cell.Biol"1997，17,267-77;Puchta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，5055-60;Chiurazzi等，PlantCell,1996，8，2057-2066)，這使得大范圍核酸酶誘導(dǎo)的重組成為用于基因組工程的有效且有力的方法。大范圍核酸酶誘導(dǎo)重組的應(yīng)用長期以來受到天然大范圍核酸酶種類的限制，當(dāng)前技術(shù)的主要限制在于需要預(yù)先在目的基因座引入大范圍核酸酶切割位點。因此，人們對產(chǎn)生具有特定底物特異性的人工大范圍核酸酶進(jìn)行了深入地研究。這樣的蛋白質(zhì)可用于切割真正的染色體序列，并開啟了基因組工程在多種應(yīng)用中的新前景。例如，大范圍核酸酶可用于誘導(dǎo)修正與單基因遺傳病相關(guān)的突變，避免目前基因治療方法中使用的隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因所導(dǎo)致的風(fēng)險(Hacdn-Bey國Abina等，Science,2003,302，415-419)。最近，Cys2-His2型鋅指蛋白(ZFP)的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可與核酸內(nèi)切酶的催化結(jié)構(gòu)域融合，從而誘導(dǎo)多種類型細(xì)胞(包括人淋巴樣細(xì)胞)中的重組(Smith等，NucleicAcidsRes，1999，27，674-81;Pabo等,Annu.Rev.Biochem,2001,70,313-40;Porteus和Baltimore,Science,2003,300,763;Urnov等,Nature,2005，435,646-651;Bibikova等，Science,2003,300，764)。ZFP的結(jié)合特異性相對容易操作，目前得到了一組能夠結(jié)合許多(g/a)nn(g/a)nn(g/a)nn序列的新的人工ZFP(Pabo等，如前引用；Segal和Barbas,Curr.Opin.Biotechnol"2001,12,632-7;Isalan等，Nat.Biotechnol.,2001，19,656-60)。但是，保持非常窄的底物特異性是基因組工程應(yīng)用的主要問題之一，目前尚不清楚ZFP是否滿足治療應(yīng)用極其嚴(yán)格的要求。另外，已證明這些融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞中具有高毒性(Porteus和Baltimore,如前引用；Bibikova等，Genetics,2002,161,1169-1175),這可能是由于特異性水平低所致。在自然界中，大范圍核酸酶基本上以歸巢核酸內(nèi)切酶(homingendonuclease，HE)為代表，歸巢核酸內(nèi)切酶是由可移動遺傳元件(mobilegeneticelement)編碼的核酸內(nèi)切酶家族，其功能是在被稱為"歸巢"的過程中起始由DNA雙鏈斷裂(DSB)誘導(dǎo)的重組事件(Chevalier和Stoddard,NucleicAcidsRes.，2001，29,3757-74;Kostriken等，Cell;1983,35,167-74;Jacquier和Dujon，Cell,1985，41,383-94)。在細(xì)菌、真核生物和古細(xì)菌中已鑒定出數(shù)百種HE(Chevalier和Stoddard,如前引用)；但是在所選基因中找到HE切割位點的可能性是非常低的。由于其生物學(xué)功能以及在效率和特異性方面出色的切割特性，HE提供了理想的骨架來衍生出用于基因組工程的新核酸內(nèi)切酶。在過去十年中積累了數(shù)據(jù)，其表征了四個HE家族中最大的LAGLIDADG家族(Chevalier和Stoddard,如前引用)。LAGLIDADG指整個家族中唯一事實上保守的序列，并發(fā)現(xiàn)其在所述蛋白質(zhì)中以一個或(更經(jīng)常)兩個拷貝存在。具有單基序的蛋白質(zhì)(例如I-OeI)形成同源二聚體，并切割回文或假回文的DNA序列，而較大的雙基序蛋白質(zhì)(例如M"I)是單體，并切割非回文靶標(biāo)。已結(jié)晶了七種不同的LAGLIDADG蛋白，它們的核心結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出非常顯著的保守性，這與其一級序列水平缺乏相似性形成對比(Jurica等，Mol.Cell.,1998，2,469-76;Chevalier等，Nat.Struct.Biol"2001,8,312-6;Chevalier等J.Mol.Biol"2003,329，253-69;Moure等，J.Mol.Biol,2003，334,685-95;Moure等，Nat.Struct.Biol"2002，9，764-70;Ichiyanagi等，J.Mol.Biol.,2000,300,889-901;Duan等，Cell,1997,89,555-64;Bolduc等，GenesDev.,2003，17，2875-88;Silva等，J.Mol.Biol.，1999，286,1123-36)。在該核心結(jié)構(gòu)中，兩個特征性的appappa折疊(也稱作LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶核心結(jié)構(gòu)域，其認(rèn)自兩個單體或者兩個LAGLIDAG蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域)彼此相對并且雙重對稱。DNA結(jié)合依賴于來自每個結(jié)構(gòu)域的4個p鏈，所述4個p鏈折疊成反向平行P片層并在DNA螺旋大溝上形成鞍(saddle)。對與其天然靶標(biāo)結(jié)合的I-Od結(jié)構(gòu)的分析顯示，在每個單體中，8個殘基(Y33、Q38、N30、K28、Q26、Q44、R68和R70)與±3、4、5、6、7、9和10位的7個堿基建立了直接的相互作用(Jurica等，1998,如前引用)。另外，某些殘基與若干堿基建立了水介導(dǎo)的接觸；例如S40、K28和N30與+8和-8位的堿基對(Chevalier等，2003，如前引用)。催化核心位于中央，兩個對稱單體/結(jié)構(gòu)域均有貢獻(xiàn)。除了該核心結(jié)構(gòu)之外，還可發(fā)現(xiàn)其它結(jié)構(gòu)域例如，PI-S"I(—種內(nèi)含肽)具有蛋白質(zhì)剪接結(jié)構(gòu)域以及另外的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Moure等，2002，如前引用；Grindl等，NucleicAcidsRes"1998,26,1857-62)。兩種從歸巢核酸內(nèi)切酶衍生新大范圍核酸酶的方法正在研究之中-雜合或嵌合的單鏈蛋白質(zhì)可通過交換不同單體的LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶核心結(jié)構(gòu)域來獲得新的大范圍核酸酶(Epinat等，NucleicAcidsRes.,2003,31，2952-62;Chevalier等，Mol.Cell"2002,10，895-905;Steuer等，Chembiochem.，2004,5，206-13;國際PCT申請WO03/078619和WO2004/031346)。這些單鏈嵌合大范圍核酸酶能夠切割雜合耙標(biāo)，所述雜合靶標(biāo)相當(dāng)于兩種親本DNA靶標(biāo)序列一半的融合，其中來自不同大范圍核酸酶的兩個LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶核心結(jié)構(gòu)域由間隔區(qū)相連。這些結(jié)果意味著，I-Oel二聚體的兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域獨立地起作用；每個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA靶位點之不同的一半。構(gòu)建嵌合且單鏈的人工HE提示，組合的方法可用于獲得切割新(非回文)靶序列的新大范圍核酸酶可將不同的單體或核心結(jié)構(gòu)域融合在單個蛋白質(zhì)中，從而實現(xiàn)新的特異性。但是，因為得到的新靶標(biāo)是衍生自兩種不同的DNA靶標(biāo)半位點的組合，該方法不會顯著增加可作為歸巢核酸內(nèi)切酶靶標(biāo)的DNA序列數(shù)。-蛋白質(zhì)變體通過誘變和篩選/選擇改變DNA結(jié)合蛋白的底物特異性常被證明是困難的(Lanio等，ProteinEng.,2000，13,275-281;Voziyanov等，J.Mol.Biol"2003,326,65-76;Santoro等，P.N.A.S.,2002，99，4185-41卯；Buchholz和Stewart,Nat.Biotechnol.，2001，19,1047-1052)，更具體地，改造HE的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域長期以來被認(rèn)為是難以完成的任務(wù)(Ashworth等，Nature2006,441,656-659;Gimble等，J.Mol.BioL,2003,334,993-1008;Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355，443-458;Doyon等，J.Am.Chem.Soc"2006,128,2477-2484;Steuer等，如前引用；Seligman等，NucleicAcidsRes"2002，30，3870-3879)。對I-Oel/DNA晶體結(jié)構(gòu)的分析表明，9個氨基酸與歸巢位點直接接觸(Chevalier等，2003;Jurica等，如前引用)，所述歸巢位點的隨機(jī)改變將得到209種組合，該數(shù)目超過了任何目前的篩選能力。因此，幾個實驗室基于半推理性方法(Chica等，Curr.Opin.Biotechnol.，2005,16,378-384)來限制待處理突變體文庫的多樣性根據(jù)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)選擇一小組相關(guān)殘基。盡管如此，這仍然不足以產(chǎn)生切割所選序列的重新設(shè)計的核酸內(nèi)切酶Seligman及其同事使用推理性方法來替換I-Oelappa(3pa折疊中特定的單殘基(Sussman等，J.Mol.Biol.,2004,342，31-41;Seligman等,NucleicAcidsRes"2002，如前引用；Seligman等，Genetics,1997，147，1653-64)。然而，僅在極少的I-Oel變體(Y33C、Y33H、Y33R、Y33L、Y33S、Y33T、S32K、S32R)中觀察到顯著地切割，并且只針對在士10位經(jīng)修飾的乾標(biāo)。以類似的方式，Gimble等(如前引用)修飾了PI-SceI的另外的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；他們獲得了結(jié)合特異性改變而底物特異性不變的變體蛋白質(zhì)，并且大多數(shù)所述蛋白質(zhì)對野生型靶標(biāo)序列保持了大部分親和力。為了獲得更大數(shù)量的序列，能夠得到具有新底物特異性(即能夠切割不被親本歸巢核酸內(nèi)切酶或迄今為止已分離的極少數(shù)變體所切割的DNA靶標(biāo))的其它歸巢核酸內(nèi)切酶變體是極其有意義的。具體地，得到能夠切割新DNA靼標(biāo)的歸巢核酸內(nèi)切酶變體是極其有意義的，其中野生型大范圍核酸酶DNA靶標(biāo)的幾個核苷酸已被同時突變。然而，因為HE的DNA結(jié)合界面非常致密，并且負(fù)責(zé)基本上所有堿基特異性相互作用的兩個不同的PP發(fā)夾是單個折疊的一部分，所以此方法并不容易。因此，與在數(shù)個位點發(fā)生突變的靶標(biāo)結(jié)合所必需的若干鄰近氨基酸的突變可破壞結(jié)合界面的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人已改造了數(shù)百個新的變體，其總共靶向在士IO、±9和士8位具有差異的所有64種可能的突變I-Oel位點。這些具有新底物特異性(針對核苷酸士8、±9和/或±10)的變體增加了可作為大范圍核酸酶靶標(biāo)的DNA序列的數(shù)目。潛在的應(yīng)用包括遺傳工程、基因組工程、基因治療和抗病毒治療。因此，本發(fā)明涉及改造出具有經(jīng)修飾的切割特異性的歸巢核酸內(nèi)切酶變體的方法，其包括至少以下步驟(a)用選自A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、L、V、W和Y的^J^酸替換I-Oel中Pi卩2發(fā)夾的K28、N30、Y33、Q38和/或S40中的至少一個氨基酸；(b)選#^/或篩選來自步驟(a)的能夠切割DNA靼序列的變體，所述DNA耙序列由突變的I-Oel位點組成，其中至少-9到-8位的aa核苷酸二聯(lián)體和/或+8到+9位的tt核香酸二聯(lián)體被不同的核苷酸二聯(lián)體所替換。定義-本文中根據(jù)單字母代碼指代多肽序列中的氨基酸殘基，其中，例如，K意為Lys或賴氨酸殘基，N意為Asn或天冬酰胺殘基，Y意為Tyr或酪氨酸殘基。-核苷酸的指代如下使用單字母代碼指代核苷的堿基a是腺噤呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，g是鳥嘌呤。對于簡并核苷酸而言，r代表g或a(嘌呤核苷酸)，k代表g或t，s代表g或c,w代表a或t,mf^表a或c，y^f戈表t或c(嘧咬核苷酸)，d^表g、a或t，v4戈表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c,以及n代表g、a、t或c。-"I-OgI"指具有SWISSPROTP05725或pdb登ii^lg9y的序列的野生型I-Orf。-變體"或"變體"指通過用不同的氨基酸替換I-O^I的至少一個氨基酸而獲得的蛋白質(zhì)。-"功能性變體"指能夠切割DNA靶標(biāo)(優(yōu)選不被I-Od切割的DNA靶標(biāo))的變體。例如，這樣的變體在接觸DNA靶序列或者直接或間接與所述DNA靶標(biāo)相互作用的位點具有氨基酸改變。-"歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域"或"結(jié)構(gòu)域"指與歸巢核酸內(nèi)切酶DNA靶標(biāo)的一半相互作用并且能夠與同一歸巢核酸內(nèi)切酶的另一結(jié)構(gòu)域(與DNA靶標(biāo)的另一半相互作用)相關(guān)聯(lián)的區(qū)域，從而形成能夠切割所述DNA靶標(biāo)的功能性核酸內(nèi)切酶。-"核心結(jié)構(gòu)域"指"LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶核心結(jié)構(gòu)域"，其是LAGLIDADG家族歸巢核酸內(nèi)切酶的特征性a^^2a2P3P4a3折疊，對應(yīng)于約100個氨基酸殘基的序列。所述結(jié)構(gòu)域包含4個折疊成反向平行P片層的P鏈(h、p2、p3、p4)，所述p片層與DNA靶標(biāo)的一半相互作用。例如，在二聚體歸巢核酸內(nèi)切酶I-OeI(163個氨基酸)的情形中，所述LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶的核心結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于6到94位殘基。在單體歸巢核酸內(nèi)切酶的情形中，兩個這樣的結(jié)構(gòu)域存在于所述核酸內(nèi)切酶的序列中；例如，在(194個氨基酸)中，第一結(jié)構(gòu)域(7到99位殘基)和第二結(jié)構(gòu)域(104到194位殘基)被短接頭(100到103位殘基)分隔開。-"I-CVgI位點"指被切割的22到24bp的雙鏈DNA序列。I-CVeI位點包括野生型(天然)非回文I-OeI歸巢位點和衍生出的回文序列，其在圖1A中給出，例如也被稱為C1221的序列5，-t12c.11a-10a.9a.8a.7c_6g.5t.4c_3g.2t.1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12(SEQIDNO:3)。-"DNA靶標(biāo)"、"DNA靶序列"、"靶序列"、"靶標(biāo)"、"識別位點"、"識別序列"、"歸巢識別位點"、"歸巢位點"、"切割位點"指22到24bp的雙鏈回文、部分回文(假回文)或非回文多核苷酸序列，其被大范圍核酸酶(例如LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶，如)或源自所述大范圍核酸酶的變體或單鏈嵌合大范圍核酸酶所識別并切割。這些術(shù)語指待由所述核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)雙鏈斷裂(切割)的特定的DNA位置，優(yōu)選基因組位置。用雙鏈多核苷酸的一條鏈的5，到3'序列來定義DNA靶標(biāo)。-"DNA耙標(biāo)半位點"指DNA乾標(biāo)的一部分，其與每個LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶核心結(jié)構(gòu)域結(jié)合。—"嵌合DNA靶標(biāo)"或"雜合DNA乾標(biāo)"指每個親本大范圍核酸酶DNA耙序列不同的一半的融合物。_"具有新特異性的歸巢核酸內(nèi)切酶變體"指具有不同于親本歸巢核酸內(nèi)切酶的切割靶標(biāo)模式的變體。術(shù)語"新特異性"、"經(jīng)修飾的特異性"、"新切割特異性"、"新底物特異性"指變體針對DNA靶序列核普酸的特異性，它們是等同的以及無區(qū)別地加以使用。_"載體"指能夠運(yùn)送與其相連的另一核酸的核酸分子。-"同源的"指一序列與另一序列具有足以導(dǎo)致序列間發(fā)生同源重組的一致性，更具體地具有至少95%—致性，優(yōu)選97%—致性，更優(yōu)選99%。-"一致性"指兩個核酸分子或多肽間的序列一致性。可通過比較每個序列中的位點來確定一致性，所述序列可為了比較的目的而進(jìn)行比對。當(dāng)所比較序列的位點被相同堿基占據(jù)時，那么所述分子在此位點是一致的。核酸或氨基酸序列之間的相似或一致性程度是核酸序列共有位點處一致或匹配的核苷酸數(shù)目的函數(shù)?？墒褂枚喾N比對算法和/或程序計算兩個序列間的一致性，包括GCG序列分析軟件包一部^KUniversityofWisconsin,Madison,Wis.)的FASTA或BLAST,并且可4吏用例如默認(rèn)設(shè)置。-"個體"包括哺乳動物以及其它一些脊推動物(例如鳥類、魚類和爬行類)。本文所使用的術(shù)語"哺乳動物，，指任何哺乳喂養(yǎng)幼仔并且胎生(真哺乳亞綱(eutharian)或有胎盤哺乳類)或卵生(后哺乳亞綱(metatharian)或無胎盤哺乳類)的脊推動物，包括單孔目動物、有袋目動物和有胎盤動物。哺乳動物物種的例子包括人和其它靈長類(例如猴、黑猩猩)、嚙齒類(例如大鼠、小鼠、豚鼠)和反芻動物(例如奶牛、豬、馬)。-"遺傳病"指部分地或全部地、直接地或間接地由于一個或多個基因的異常所致的任何疾病。所述異?？梢允峭蛔?、插入或缺失。所述突變可以是點突變。所述異?？捎绊懟虻木幋a序列或其調(diào)節(jié)序列。所述異?？捎绊懟蚪M序列的結(jié)構(gòu)或者所編碼mRNA的結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性。所述遺傳病可以是隱性或顯性的。這些遺傳病可以是(但不限于)嚢性纖維化病、亨廷頓舞蹈癥、家族性高膽固醇血癥(LDL受體缺陷)、成肝細(xì)胞瘤、威爾遜病、先天性肝卟啉病、肝代謝遺傳性疾病、萊-尼綜合征、鐮狀細(xì)胞貧血、地中海貧血、著色性干皮病、范科尼貧血、視網(wǎng)膜色素變性、毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)、布盧姆綜合征、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、迪謝納肌營養(yǎng)不良和泰-薩病。根據(jù)本發(fā)明的方法，將步驟a)中的氨基酸突變引入野生型或其功能性變體中。步驟a)可包括引入另外的突變，尤其在接觸DNA靶序列或者直接或間接與所述DNA靶標(biāo)相互作用的其它位點處。功能性變體包含不影響所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的突變。例如，可將步驟(a)中的氨基酸突變引入包含一個或多個選自下述的突變I-Orl變體中24位的異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸(I24V),70位的精氨酸突變?yōu)榻z氨酸(R70S)，和75位的天冬氨酸突變?yōu)椴粠щ姾傻陌被?，?yōu)選天冬酰胺(D75N)或纈氨酸(D75V)。可通過產(chǎn)生如國際PCT申請WO2004/067736中所述的變體文庫來實施步驟a)。如國際PCT申請WO2004/067736中所述，可通過4吏用體外或體內(nèi)切割測定實施步驟(b)中的選擇和/或篩選。根據(jù)所述方法的一個有利的實施方案，步驟b)中的DNA粑標(biāo)衍生自選自C1234、C4334和C1221的位點(SEQIDNO:1到3,圖1A)。根據(jù)所述方法的另一有利的實施方案，步驟b)中的DNA靼標(biāo)包含具有下式的序列C-nnKjiMn-sm-^n-siunjk^rwm+znwnwn+srwkwn+sn+gn+Kjg+u(I)其中n是a、t、c或g,m是a或c,y是c或t，k是g或t，r是a或g(SEQIDNO:75),只要當(dāng)n-9n—s是aa時，n+8n+9不是tt，并且當(dāng)n+8n+9是tt時，n-9ii-8不是aa即可。根據(jù)所述方法的一個優(yōu)選實施方案，n-5n_4H-3Agtc和/或11+311+411+5是gac。步驟b)中的DNA靶標(biāo)可以是回文的、非回文的或假回文的。優(yōu)選地，-11到-8位和+8到+11位的核苷酸序列和/或-5到-3位和/或+3到+5位的核苷酸序列是回文的。根據(jù)所述方法的另一有利的實施方案，步驟b)中的DNA靶標(biāo)包含-9到-8位的核普酸二聯(lián)體(其選自ag、at、ac、ga、gg、gt、gc、ta、tg、tt、cg、ct或cc)和/或+8到+9的核普酸二聯(lián)體(其為-9到-8位所述核香酸二聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列，即ct、ta、gt、tc、cc、ac、gc、at、ca、aa、cg、ag或gg)。根據(jù)所述方法的另一有利的實施方案，步驟b)中的DNA靶標(biāo)還包括用不同的核苷酸替換位點-10位的核苷酸a和/或+10位的核苷酸t(yī)。優(yōu)選地，所述DNA靶標(biāo)包含-10到-8位的核香酸三聯(lián)體(其選自aac、aag、aat、acc、acg、act、aga、agc、agg、agt、ata、atg、cag、cga、cgg、ctg、gac、gag、gat、gcc、gga、ggc、ggg、ggt、gta、gtg、gtt、tac、tag、tat、tcc、tga、tgc、tgg、tgt或ttg)和/或+8到+10位的核脊酸三聯(lián)體(其為-10到-8位所述核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列)。根據(jù)所述方法的另一有利的實施方案，在某些條件下體內(nèi)實施步驟(b)，在所述條件中所述變體使得突變的DNA乾序列發(fā)生雙鏈斷裂，該雙鏈斷裂通過所述DNA雙鏈斷裂的重組介導(dǎo)的修復(fù)而導(dǎo)致正選擇標(biāo)記或報告基因的活化或者負(fù)選擇標(biāo)記或報告基因的失活。例如，可在酵母或哺乳動物細(xì)胞中使用報告載體利用同向重復(fù)重組測定來檢測本發(fā)明I-Od變體的切割活性，如PCT申請WO2004/067736中所述。所述報告載體包含兩個拷貝的截短的非功能性l艮告基因(同向重復(fù))和間插序列之中的DNA靶序列，其被克隆入酵母或哺乳動物表達(dá)載體中(圖2)。通過替換士8到10位的一至三個核苷酸,所述DNA耙序列從位點衍生出(如C1221)(圖1B)。能夠切割所述DNA靶序列的功能性變體的表達(dá)誘導(dǎo)同向重復(fù)之間的同源重組，得到功能性報告基因，其表達(dá)可通過適當(dāng)?shù)臏y定進(jìn)行監(jiān)測。根據(jù)所述方法的另一有利的實施方案，它包括另外的步驟Cl)，其表達(dá)步驟b)中獲得的一種變體從而允許形成同源二聚體。根據(jù)所述方法的另一有利的實施方案，它包括另外的步驟c2),其共表達(dá)步驟b)中獲得的一種變體和I-Orf或其功能性變體，從而允許形成異源二聚體。優(yōu)選地，共表達(dá)步驟b)中獲得的兩種不同的變體。例如，可通過編碼所述變體的一種或兩種重組表達(dá)載體對宿主細(xì)胞進(jìn)行修飾。然后在允許表達(dá)變體的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，然后從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收形成的同源/異源二聚體。根據(jù)本發(fā)明的方法，可通過將步驟b)中獲得的一種變體與歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域/單體進(jìn)行融合來構(gòu)建單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶。所述結(jié)構(gòu)域/單體可來自野生型歸巢核酸內(nèi)切酶或其功能性變體。構(gòu)建源自歸巢核酸內(nèi)切酶的單鏈嵌合分子的方法是本領(lǐng)域公知的(Epinat等，NucleicAcidsRes.，2003，31,2952-62;Chevalier等，Mol.Cell.,2002，10，895-卯5;Steuer等，Chembiochem.,2004,5,206-13;國際PCT申請WO03/078619和WO2004/031346)?？?吏用任何這才羊的方法構(gòu)建源自本發(fā)明所定義變體的單鏈嵌合分子。本發(fā)明的主題還包括可通過上文所述方法獲得的大范圍核酸酶變體，所述變體能夠切割由突變的位點組成的DNA靶序列，其中至少-9和-8位核苷酸a中的一個或者+8和+9位核苷酸t(yī)中的一個被不同的核苷酸所替換。根據(jù)所述變體的一個有利的實施方案，它在38位是精氨酸(R)或賴氨酸(K);在38位是R或K的變體能夠切割包含-9位鳥嘌呤或+9位胞嘧咬的DNA靶標(biāo)。所述變體可選自在28、30、33、38和40位分別具有選自以下氨基酸殘基的變體Q28/N30/Y33/K38/R40,R28/N30/K33/R38/Q40,Q28/N3O/R33/R38/R40,K28/N30/S33/R38/E40，K28/N3O/S33/R38/S40,N28/N3O/S33/R38/K40,R28/N30/T33/R38/A40,K2,O/R33/K38/A40，Q28/N30/S33/R38/K40,K28/E30/S33/R38/S40,K28/K30細(xì)/R38/S40,Q2,30/Y33/K3謝0，S28/N30/Y33/R38/K40，Q28/N30/Y33/R38/K40,N28/N30/S33/R38歸，Q28/N30/Y33/R38/A40，R28/N建33/K38/S40，K28/A30/H33/R38/S40,K28/N30/T33/R38/Q40,K2訓(xùn)0/S33顔/測,Q2訓(xùn)0/K33顔/T40，E28/N30/R33顔/K40,Q28/N30/Y33/R38/S鄰，A28/N30/N33織/K40,K28/H30/H33/R38/S40,K28/D30/H33/K38/S40,K28/N30/H33/R38/S40,K28/S30/H33/R38/S40和K28/G30/V33/R38/S40根據(jù)所述I-O^I變體的另一有利的實施方案，它在28、30、33、38和40位分別具有選自以下的氨基酸殘基Q28/N30/Y33/K38/R40,R28/N3D/K33/R38/Q40,Q28/N30/R33/R38/R40，Q28/N30/Y33/K38/K40，Q28/N3O/T33/Q38/K40,Q28/N30/R33/R38/K40,K28/N30/T33/Q38/R40,S28/N30/R33/S38/R40,N28/N30/Y33/Q38/R40,K28/N30/T33/R38/Q40，K2畫0/S33/R38細(xì)，K28/N30/S33/R38/D40,R28/N30/R33/D38/R40,Q2畫0/K33簡/T40，N28/N30/S33/R38/K40,Q2薩0/Y33/Q38/R40,E2訓(xùn)0/R33/R38/K40，T2訓(xùn)0/R33/Q38/R40,K2,0/R33簡/R40,Q2,0/Y33/T3謝0,Q28/N30/Y33/R38/A40，Q28/N30/Y33/E38/K40,K28/N30/R33/Q3,0,R28/N30/R33/E38/R40,K28/N30/R33/K38/A40,T28/N30/E33/S38/D40,K28/N30/Y33/Q38/N40:A28/N30/N33/R38/K40，T2,0/T33/Q38/R40,R28/N30/Y33/Q38/S40,A28/N30/R33/Q38/R40,K28/N30/T33/A38/S40,K28/D30/N33/H38/S40,K28/(330/H33/Y38/S40，K28/S30/H33/H38/S40，K28/D30/G33/H38/S40，K28/D30/H33/K38/S40,K28/Q30/T33/Q38/S40,K28/R30/G33/N38/S40,K28/H30/H33/A38/S40,K28/T30/D33/H38/S40,Q28/N30/N33/Q38/K40,K2,0/R33/E3翻0，A28/N30/S33/Q38/R40，R28/N30/A33/Y38/Q40,N28/N30/S33/R3謝0，S28/N30/R33/Q38歸,K28/N30/N33/Q38/A40，Q2謡0/T33/Q38/R40,Q28/N30/E33/D38/H40,R28/N30/T33/R38/A40，Q2畫0/Y33/A3,0，T2訓(xùn)0/N33/Q3謝0，Q2訓(xùn)0/R33/A38/R40,K28/N30/R33/A38/R40,R2薩0/A33/K38/S40,R28/N30/N33/Q38/D40,K28/N30/R33/S38/S40,K28/N30/R33/A38/T40,K2薩0/R33/Q38/Y40,Q28/N30/R33/Q38/R40,K28/N30/R33/Q38/Q40,K28/A30/H33/R38/S40,K28/E30/S33/R38/S40,K28/A30/R33/Q38/S40，K28/N30/H33/R38/S40,K28/R30/邸/G38/S40，K2圖0/H33顔/S40，K28/G30/R33/Q38/S40K28/N30/A33/Q38/S40，K28/R30/G33/S38/S40，K28/H30/H33/Q38/S40,S28/N30/Y33/R38/K40,K28/N30/S33/R38/S40,Q28/N30/Y33/R38/K40,K28/N30/R33/Q38/E4O,Q28/N30/Y33/Q38/K40,Q28/N30/R33/Q38/K40,S28/N30/Y33/Q38/K40'K28/N30/R33/T38/Q40,R28/N30/Y33/N38/A40，H28/N30/Y33/D38/S40,S28/N30/Q33/A38/A40,Q28/N30/Y33/R38/S40，Q28/N30/N33/Q38/R40，K28/N30/T33/A38/A40,It28/N30/R33/N3,0,R28/N30/R33W38/Q40,K28/N30/R33/Y38/A40,K28/N30/R33/N38/Q40,Q28/N30/S33/R38/K40,K28/N30/R33/A38/Q40,K28/N30/R33/Q38/A40,K28/H30/H33/R38/S40，K28/H30/T33/P38/S40,K28/S30/R33/G38/S40,K28/R30/R33/E38/S40,K28/A30/N33/Q38/S40,K28/Q30/N33/Q38/S40:K28/R30/P33/G38/S40,K28/N30/H33/N38/S40:K128/S30/R33/Q38/S40:K28/A30/D33/H38/S40.K28/S30/H33/R38/S40,K2畫0/A33/H38/S40:K2,0/R33/S38/S40，K28/N30/H33/S3歸0，K2,0/N33/Q38/S40:K28/N30/H33/A38/S40，K28/G30/V33/A38/S40,R2幽0/V33/Q38/S40，K28/G30/V33/H38/S40:R28/A30/V33/G38/S40，N28/T30/V33/D38/S40K28/N30/R33/A38/S40,K28/N30/H33/E38/S40，K28/A30/H33/Q38/S40，K28/Q30鵬/Q38/S40,K28細(xì)/D33/Q38胸,K28/H30/M33/A38/S40,K28/S30/V33/Q38腦,K28/G30/V33/Q38/S40,K28/G30/V33/R38/S40,K2,0/H33/Q3薩0:K28/D30/R33/T38/S40,K28/R30/G33/T38/S40,K28/N30/H33/G38/S40:K28/D30/R33/G38/S40:K28/S30/S33/H38/S叫K28/D30A^33/H38/S40:K28/G30/V33/T38/S340:K28/G30/V33/G38/S40:R28/D30/V33/R38/S40，R28/N30/V33/Q38/S40,和根據(jù)一個更優(yōu)選的實施方案，所述I-CVeI變體是能夠切割至少一個不被親本歸巢核酸內(nèi)切酶(D75N)所切割的DNA靼序列的變體，所述變體在28、30、33、38和40位分別具有選自以下的氨基酸殘基Q2,0/Y33/K38/R40,Q28/N30/R33/R38/R40，Q28/N30/R33/R38/K40，K2,0/T33/R38/Q40,K2,0/S33/R38/D40,R28/N30/R33/D38/R40，Q28/N30/K33/R38/T40，訓(xùn),/S33/R38/K40,Q28/N30/R33/Q38/K40:S2,0/Y33/Q38/K40,K28歸/R33/T38/Q40，R28/N30/丁33/R38/A40，K28/N30/R33/Q38/R40,K28/N30/R33/A3謝0,K28/N30/R33/N38/A40:K28/N30/R33/S38/S40,R28/N30/K33/R38/Q40:Q28/N30/Y33/K38/K40，K28/N30/T33/Q38/R40,K28/N30/S33/R3,0,K2訓(xùn)0/R33/E3謝0，A28/N30/S33/Q38/R40,R28/N30/A33/Y38/Q40,N28/N30/S33/R38/R40,E28/N30/R33/R38/K40,T28/N30/R33/Q38歸，K2畫0/R33/T3,0，H2訓(xùn)0/Y33/D38簡，Q28/N30/R33/A38/R40,K28/N30/T33/A38/A40,T28/N30/E33/S38/D40,K28/N30/R33/Y38/A40,Q2畫0/T33/Q38/K40，S28/N30/R33/S38/R40,S28/N30/Y33/R38/K40，K28/N30/S33/R38/S40,Q28/N30/Y33/R38/K40,K28/N30/R33/Q38/E40,S2畫0/R33/Q3,0,K28/N30/N33Q38/A40,Q28/N30/T33/Q38/R40:Q2,0/E33/D3薩0:S28/N30/Q33/A38/A40:R28/N30/R33/E38/R40,K28/N30/R33/K38/A叫R28/N30/H33/Y38/Q40:A28/N30/N33/R38/K40:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>根據(jù)另一優(yōu)選的實施方案，所述變體是能夠切割由突變的位點組成的DNA靶序列的變體，其中至少-8位的a和/或+8位的t被不同的核苷酸所替換，所述變體在28、30、33、38和40位分別具有選自以下的氨基酸殘基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>K2畫0/S33/R38/D40,R2翻0/R33/D38/R40,Q28/N30/K33/R38/T4O,N2畫0/S33/R38/K40，Q2訓(xùn)0/Y33/Q3謝0:E2S/N30/R33/R38/K40,T2畫0/R33/Q38/R40，Q28/N30/E33/D38/H40,R28/N30/T33/R38/A40,Q28/N30/Y33/A38/R40:T2畫0/N33/Q38/R40,Q28/N30/R33/A38/R40,K28/N30/R33/A38/R40,R28/N30/A33腦/S40，R28/N30/N33/Q38/D4O:K2畫0/R33/S3謝0,K28/N30/R33/A38/T40,Q28/N30/S33/R38/K40，A28/N30/R33/Q38/R40,K28/N30/T33/A38/S40,K28/D30/N33/H38/S40，K28/G30/H33/Y38/S40,K28/S30/H33/H38/S4O,K28/D30/G33/H38/S40，K28/D30/H33/K38/S40,K28/Q30/T33/Q3謝0，K28/R30/G33麵/S40,K28/H30/H33/A38/S40,K28/T30/D33/H38/S40,K28/S30/H33/R38/S40,K28/D30/A33/H38/S40,K2,0/R33/E3抓40，A28/N30/S33/Q38/R40,R28/N30/A33/Y38/Q40,N28/N30/S33/R3謝0，S2畫0/R33/Q38腳,K28/N30細(xì)/Q3謹(jǐn)0，Q2畫0/T33/Q3謝0，R2,0/Y，逢40,H2畫0/Y33/D38層，S28/N30/Q33/A38/A40，Q28/N30/Y33/R38/S40，Q2湖0/N33/Q38/R40,K28/N30/T33/A3,0，K2國0/R33/N38/A40,R28/N30/R33/Y38/Q40,K28/N30/R33/Y38/A40,T28/N30/T33/Q3謝0，R2畫0/Y33/Q38腦，K28/N30/R33/Q38/Q40,K28/A30/H33/R38/S40,K28/E30/S33/R38/S40,K28/A30/R33/Q38/S40，K2畫0/H33/R38/S40,K28/R30/H33/G38/S40,K28/K30/H33/R38/S40,K28/G30/R33/Q38/S40K28/N30/A33/Q38/S40,K2圖0/G33/S38/S40，K28/H30/H33/Q38/S40,K28/N30/R33/A38/S40，K28/N30/H33/E38/S40,K28/N30/S33/R38/S40:CJ2簡0/Y33/R3,0:K28/N30/R33/Q38/E40:Q28/N30/Y33/Q38/K40:Q2畫0膨/Q38/K40:S28/N30/Y33/Q38/K40,K28/N30/R33/T3謝0:Q28/N30/Y33/T38/R40:Q28/N30/Y33/R38/A40,Q28/N30/Y33/E3醒0，K2,0/R33/Q38/R40'R28/N30/R33/E38/R40,K28/N30/R33/K38/A40:T28/N30/E33/S38/D40,K2,0/Y33/Q38/N40:A28/N30/N33/R38/K40,K28/N30/R33/Q38/Y40，Q2,0/R33/Q3謝0'K28/N30/R33/Q38/A40,K28/H30/H33/R38/S40,K28/H30/T33/P38/S40,K28/S30/R33/G38/S40,K28/R30/R33/E38/S40,K28/A30/N33/Q38/S40:K28/Q30/N33/Q38/S40:K28/R30/P33/G38/S40:K28/N30/H33/N38/S40:K28/S30/R33/Q38/S40:K28/A30/D33/H38/S40,K28/S30/H33/Q38/S鄰:K28/D30/R33/T38/S40.K28/D30/R33/S38/S40,K2畫0/H33/S38/S40，K2薩0/N33/Q3,0:K28/N30/H33/A38/S叫K28/G30/V33/A38/S40,R28/D30/V33/Q38/S40,K28/G30/V33/H38/S40:K28/A30/H33/Q38/S40,K28/Q30/H33/Q38/S40,K2,0/D33/Q38/S40,K2,0/M33/A38/S40:K28/S30/V33/Q38/S40，K28/G30/V33/Q38/S40K28/G30/V33/R38/S40，K28/R30/G33/T38/S40,K28/N30/H33/G38/S40,K28/D30/R33/G38/S40,K28/S30/S33/H38/S40jK28/D30/V33/H38/S40,K28/G30/V33/T38/S40:K28/G30/V33/G38/S40:R28/A30/V33/G38/S40，R28/D30/V33/R38/S40,R28/N30/V33/Q38/S40,和K28/T30/V33/D38/S40_根據(jù)又一更優(yōu)選的實施方案，所述I-Od變體是能夠切割由突變的I-Oel位點組成的DNA靶序列的變體，其中至少-9位的a和/或+9位的t被不同的核苷酸所替換，所述變體在28、30、33、38和40位分別具有選自以下的氨基酸殘基Q28/N30/Y33/K3謝O，Q2畫0/Y33/K38/K40，K28/N30/T33/Q38/R4O,K28/N30/S33/R38/E40，K28/N30/R33/E38/R40,Q28/N30/Y33/R38/K40,扁/N30/S33/R3,0,K28/N30/R33/T38/Q40,R28/N30/T33/R38/A40，Q28麵/R33/A3謝0，K28/N30/T33/A38/A40,R28/N30/R33/Y38/Q40，K28/N30/R33/A38/T40,K2,0/R33/Q38/Y40,A28麵/R33/Q38/R40，K28/A30/H33/R38/S40,K28/E30/S33/R38/S40,R28/N30/K33/R38/Q40,Q28/N30/T33/Q38/K40,S28/N30/R33/S38/R40，S28/N30/Y33/R38/K40，K28/N30/S33簡/S40,R28/N30/A33/Y38/Q40，E28/N30/R33/R38/K40，K2薩(VR33/T38/R40,H28/N30/Y33/D38/S40'R28/N30/R33/E38/R40,K28/N30/R33/K38/A40,K28/N30/R33/S38/S40,K28/N30/R33/N38/Q40，Q28/N30/S33/R38/K40,K28/N30/R33/Q38/A40,K28/H30/H33/R38/S40,K28/S30/R33/G38/S40,Q28/N30/R33/R38/R40,Q28/N30/R33/R38/K40,K2,0/T33/R38/Q40,K28/N30/S33/R38/D40,R28/N憲33/D38/R40,N28/N30/S33/R38/K40,K28/N30/N33/Q38/A40,Q28/N30/E33/D38/H40，K2,0/R33/Q38/R40,K28/N30船3/A38/R4Q,K28/N30/R33/N38/A40，A28/N30/Kf33/R38/K卯,T28/N30/T33/Q38/R40，K2薩0/R33/A38/Q40,K28/N30/T33/A38/S40,K28/D30/N33/H38/S40,K28/S30/H33/H38/S40，K28/N30/H33/R38/S40，K28/D30/H33/K38/S40,K28/R30/G33/N38/S40,K28/R30/G33/S38/S40,K28/S30/H33/R38/S40，K28磨/R33/T38/S40，K2,0/H33/S38/S40，K28/D30/R33/G38/S40,K28/S30/S33/H38/S40,K28/G30/V33/T38/S340,K28/G30/V33/G38/S40K28/R30/R33/E38/S40,K28/K30/H33/R38/S40:K28/N30/H33/N38/S40,K28/T30/D33/H38/S40，K28/N30/R33/A38/S40,K28/D30/R33/S38/S40,K28/N30/H33/G38/S40,K28/N30/H33/A38/S40，K28/G30/V33/A38/S40,K28/D30/G33/H38/S40:K28/Q30/N33/Q38/S40:K28/H30/H33/A38/S4O:K28/A30/D33/H38/S40:K28/D30/A33/H38/S40,K28/R30/G33/T38/S叫K28/N30/N33/Q38/S40:K28/H30/M33/A38/S40:K28/D30/V33/H38/S40:K28/G30/V33/H38/S40，K28/G30/V33/R38/S40，和根據(jù)所述變體的另一有利的實施方案，它包含一個或多個另外的突變。經(jīng)突變的殘基可有利地位于接觸DNA靶序列或者直接或間接與所述DNA靶標(biāo)相互作用的位點。優(yōu)選地，所述突變位于選自以下的位點124、Q26、S32、Q44、R68、R70、D75、177和T140。優(yōu)選地，所述變體包含一個或多個選自以下的突變24位的異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸(I24V),70位的精氨酸突變?yōu)榻z氨酸(R70S)，和75位的天冬氨酸突變?yōu)椴粠щ姾傻陌被?，?yōu)選天冬酰胺(D75N)或纈氨酸(D75V)。另外，可在整個序列上(特別是在的C末端一半(80到163位))突變其它一些殘基。的C末端一半中的替換優(yōu)選在I-Oel的以下位點80、82、85、86、87、94、96、100、103、114、115、117、125、129、131、132、147、151、153、154、155、157、159和160位。另外，所述變體可包含插入到NH2末端和/或COOH末端的一個或多個殘基。例如，將曱硫氨酸殘基引入到NH2端，將標(biāo)簽(tag)(表位或多組氨酸序列)引入到NH2末端和/或COOH末端；所述標(biāo)簽可用于檢測和/或純化所述變體。本發(fā)明的變體可以是同源二聚體或異源二聚體。根據(jù)所述I-CVeI變體的另一有利的實施方案，它是包含來自兩個不同變體的單體的異源二聚體。本發(fā)明還包括單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶，其包含來自如上所述的變體的單體。本發(fā)明的主題還包括編碼如上所述的變體或源自所述變體的單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶的多核苷酸片段。本發(fā)明的主題還包括重組載體，其包含至少一個如上所述的編碼變體或源自所述變體的單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶的多核苷酸片段。所述載體可包含編碼同源二聚體變體的一個單體、兩個單體或者一個單體和單鏈分子一個結(jié)構(gòu)域的多核苷酸片段。或者，所述載體可包含兩個不同多核苷酸片段，其中每個多核苷酸片段編碼異源二聚體變體的一個單體。一種類型的優(yōu)選載體是附加體，即能夠在染色體外復(fù)制的核酸。優(yōu)選的栽體是能夠自主復(fù)制和/或表達(dá)與其相連的核酸的載體。能夠指導(dǎo)與其可操縱連接的基因表達(dá)的載體在本文中稱作"表達(dá)載體"。本發(fā)明的載體包括但不限于YAC(酵母人工染色體)、BAC(細(xì)菌人工染色體)、桿狀病毒載體、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒載體、質(zhì)粒、RNA載體或者可由染色體、非染色體、半合成或合成DNA組成的線性或環(huán)狀的DNA或RNA分子。一般地，用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)載體常常為"質(zhì)粒，，的形式，其通常指以載體形式時不與染色體結(jié)合的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。大量合適的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、細(xì)小病毒(例如腺相關(guān)病毒)、冠狀病毒，負(fù)鏈RNA病毒如正勦病毒(例如流感病毒)、彈狀病毒(例如狂犬病毒和皰滲性口腔炎病毒)、副黏病毒(例如麻滲病毒和仙臺病毒)、正鏈RNA病毒如小RNA病毒和甲病毒，雙鏈DNA病毒包括腺病毒、皰滲病毒(例如1型和2型單純皰疹病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒)，以及痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒和金絲雀痘病毒)。其它病毒包括例如諾沃克病毒、披膜病毒、黃病毒、呼腸孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。載體可包含選擇標(biāo)記，例如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、組氨醇脫氫酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、單純皰疹病毒胸苷激酶、腺苷脫氨酶、谷氨酰胺合成酶和次黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酵；用于酉良酒酵母(5*.cerev/si"e)的TRP1;大腸桿菌"http://)中的四環(huán)素、利福平或氨芐青霉素抗性。優(yōu)選地，所述載體是表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明所述變體的序列置于合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的控制之下，從而允許產(chǎn)生或合成所述變體。因此，所述多核苷酸包含在表達(dá)盒中。更具體地，所述栽體包含復(fù)制起點、與所述編碼多核苷酸可操縱連接的啟動子、核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點(當(dāng)使用基因組DNA時)、聚腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止位點。它還可包含增強(qiáng)子。啟動子的選擇取決于表達(dá)多肽的細(xì)胞。優(yōu)選地，當(dāng)所述變體是異源二聚體時，編碼每個單體的兩種多核苷酸包含在同一載體中，該載體能夠驅(qū)動兩種多核苷酸同時表達(dá)。根據(jù)所述載體的另一有利的實施方案，它包含靶向構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含與如上所述的DNA耙序列周圍的區(qū)域具有同源性的序列。更優(yōu)選地，所述耙向DNA構(gòu)建體包含a)與如上所述的DNA靶序列周圍區(qū)域具有同源性的序列，和b)其側(cè)翼為a)中序列的待引4列。本發(fā)明還涉及被上文所述的多核普酸或載體(優(yōu)選表達(dá)載體)所修飾的原核或真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及非人轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物，其特征為其所有或部分細(xì)胞被上文所述的多核苷酸或載體所修飾。本文所使用的細(xì)胞指原核細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞)或真核細(xì)胞(例如動物、植物或酵母細(xì)胞)。本發(fā)明的主題還包括組合物，其包含至少一種如上所述的變體、源自所述變體的一種單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶、一種或兩種多核苷酸(優(yōu)選包含在表達(dá)載體中)。在所述組合物的一個優(yōu)選實施方案中，它含有靶向DNA構(gòu)建體，其包含修復(fù)目的位點的序列，所述序列的側(cè)翼具有與靶基因座具有同源性的序列。編碼本發(fā)明所述的變體或源自所述變體的單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶的多核苷酸序列可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備。例如，可通過使用特異性引物的聚合酶鍊式反應(yīng)從cDNA模板對它們進(jìn)行擴(kuò)增。優(yōu)選地，選擇所述cDNA的密碼子以利于在期望的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所述蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^公知的重組DNA和遺傳工程技術(shù)獲得包含所述多核普酸的重組載體，并導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。通過表達(dá)如上所述的多肽得到本發(fā)明的變體；優(yōu)選地，在適于所述多肽表達(dá)或共表達(dá)的條件下，所述多肽在經(jīng)一種或兩種表達(dá)載體修飾的宿主細(xì)胞中表達(dá)或共表達(dá)，并從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述變體。本發(fā)明的主題還包括遺傳工程方法，其包括在位于載體上的目的位點處斷裂雙鏈核酸的步驟，所述載體包含上所述的DNA乾標(biāo)，所述步驟通過將所述載體與如上所述的變體或包含所述變體的單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶接觸，從而誘導(dǎo)與另一與所述變體的切割位點周圍序列具有同源性的載體發(fā)生同源重組。本發(fā)明的主題還包括基因組工程方法，其包括以下步驟1)包含至少一個如上所述的DNA靶序列的基因座的雙鏈斷裂，其通過將所述靶標(biāo)與如上所述的變體或包含所述變體的單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶接觸來實現(xiàn)；2)保持所述斷裂的基因座處于適于與靶向DNA構(gòu)建體發(fā)生同源重組的條件下，所述靶向DNA構(gòu)建體包含待引入所述基因座的序列，其側(cè)翼具有與靶基因座具有同源性的序列。本發(fā)明的主題還包括基因組工程方法，其特征在于它包括以下步驟1)包含至少一個如上所述的DNA靶序列的基因座的雙鏈斷裂，其通過將所述切割位點與如上所述的變體或包含所述變體的單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶接觸來實現(xiàn)；2)保持所述斷裂的基因座處于適于與染色體DNA發(fā)生同源重組的條件下，所述染色體DNA與所述切割位點周圍區(qū)域具有同源性。本發(fā)明的主題還包括可通過如上文所述方法獲得的I-OeI核酸內(nèi)切酶變體在分子生物學(xué)、體內(nèi)或體外遺傳工程以及體內(nèi)或體外基因組工程中的非治療目的的用途，其用于切割如上所述的DNA靶序列。不具有限制性地，分子生物學(xué)包括DNA限制性酶切(restriction)和DNA作圖。用于非治療目的的遺傳工程和基因組工程包括例如(i)在包裝細(xì)胞系中特定基因座的基因打靶，用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)，(ii)在作物植物中特定基因座的基因打靶，用于品系改良和代謝工程，(m)在經(jīng)遺傳修飾的農(nóng)作物中用于去除標(biāo)記物的乾向重組，(iv)在經(jīng)遺傳修飾的微生物菌林中用于去除標(biāo)記物的靶向重組(例如用于抗生素生產(chǎn))。根據(jù)所述用途的一個優(yōu)選實施方案，它用于在目的位點誘導(dǎo)雙鏈斷裂，從而誘導(dǎo)DNA重組事件、DNA丟失或細(xì)胞死亡，所述目的位點包含被如上所述的變體切割的DNA耙序列。在一個具體的實施方案中，在38位為精氨酸(R)或賴氨酸(K)的I-CWI變體用于切割包含-9位鳥噤呤或+9位胞嘧咬的DNA靶標(biāo)。根據(jù)本發(fā)明，所述雙鏈斷裂用于修復(fù)特定序列，修飾特定序列，回復(fù)功能性基因而替代突變基因，削弱或活化目的內(nèi)源基因，在目的位點引入突變，引入外源基因或其部分，失活或者檢測(detecting)內(nèi)源基因或其部分，使染色體臂易位或者使DNA不被修復(fù)并被降解。本發(fā)明的主題還包括至少一種如上所述的變體的用途，其用于制備在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治愈遺傳病的藥物，所述藥物通過任意方式施用于所述個體。本發(fā)明的主題還包括用于在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治愈遺傳病的方法，所述方法至少包括通過任何方式將如上所述的組合物施用于所述個體的步驟。在一個具體實施方案中，在38位為精氨酸(R)或賴氨酸(K)的變體用于切割包含-9位鳥噤呤或+9位胞嘧啶的基因組DNA靶標(biāo)。本發(fā)明的主題還包括至少一種如上所述的I-Orl變體的用途，其用于制備在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治愈疾病的藥物，所述疾病由具有DNA中介體的傳染原導(dǎo)致，所述藥物通過任意方式施用于所述個體。本發(fā)明的主題還包括用于在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治愈疾病的方法，所述疾病由具有DNA中介體的傳染原導(dǎo)致，所述方法至少包括通過任何方式將如上所述的組合物施用于所述個體的步驟。本發(fā)明的主題還包括至少一種如上所述的變體的用途，其用于在生物來源產(chǎn)品或者用于生物學(xué)用途的產(chǎn)品中體外抑制具有DNA中介體的傳染原的增殖、或者將其滅活或消除，或者用于消毒物體。本發(fā)明的主題還包括用于在產(chǎn)品或物質(zhì)中消除具有DNA中介體的傳染原污染的方法，所述方法至少包括以下步驟，將生物來源產(chǎn)品、其用于生物學(xué)用途的產(chǎn)品或者物體與如上所述的組合物接觸足以抑制所述傳染因子的增殖、或者將其滅活或消除的時間。在一個具體的實施方案中，在38位為精氨酸(R)或賴氨酸(K)的I-CVel變體用于切割包含-9位鳥嘌呤或+9位胞嘧啶的來自所述傳染原的DNA乾標(biāo)。在另一具體的實施方案中，所述傳染原是病毒。例如所述病毒是腺病毒(Adll、Ad21)、皰滲病毒(HSV、VZV、EBV、CMV、皰療病毒6、7或8)、嗜肝DNA病毒(HBV)、乳多空病毒(HPV)、痘病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒(HTLV、HIV)。本發(fā)明的主題還包括如上所述的至少一種變體作為產(chǎn)生其它大范圍核酸內(nèi)切酶的骨架的用途。例如，可對所述變體進(jìn)行第二輪誘變和選擇/篩選，用以獲得新的第二代歸巢核酸內(nèi)切酶。根據(jù)所述用途的另一有利的實施方案，所述變體與如上所述的靶向DNA構(gòu)建體相關(guān)連。根據(jù)所述用途的另一有利的實施方案，所述變體在28、30、33、38和40位分別具有如下氨基酸KNSQS、KNRQS、KNTQS或KNHQS。本發(fā)明所述的I-CVd大范圍核酸酶變體的用途以及使用所述大范圍核酸酶變體的方法還包括以下各項的用途如上所述的源自所述變體的單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶，編碼所述變體或單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶的多核苷酸、載體、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物或非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物。除了前述特征，本發(fā)明還包括從以下說明中得出的其它特征，所述說明指舉例說明本發(fā)明的歸巢核酸內(nèi)切酶變體及其用途的實施例，以及以下附圖-圖1表示DNA靶標(biāo)。A.衍生自天然歸巢位點的兩個回文l-O^I靶標(biāo)。所述I-Oel天然靶標(biāo)含有兩個回文序列(用灰色框表示):一個是-8至-12和+8至+12位核普酸，另一個是-5至-3和+3至+5位核苷酸。可從天然耙標(biāo)(本文稱為C1234(SEQIDNO:l))衍生出回文序列C1221和C4334(SEQIDNO:2、3)。二者均在體外和酵母中被I-CVrI切割。B.64個DNA乾標(biāo)。所述64個乾標(biāo)衍生自C1221(SEQIDNO:4至67)。它們對應(yīng)于-10、-9、-8、+8、+9、十10位發(fā)生替換的所有完美的24bp回文序列。-圖2舉例說明酵母篩選測定的原理。表達(dá)待測定的大范圍核酸酶的菌林(MEGA)(其帶有Z五W基因標(biāo)記)與攜帶含有所選耙標(biāo)的報告質(zhì)粒的菌林(其帶有r及W基因標(biāo)記)接合。所述靶標(biāo)的側(cè)翼是重疊的截短LacZ基因(LAC和ACZ)。在二倍體(7Ti^)中，大范圍核酸酶對靶位點的切割誘導(dǎo)兩個LacZ重復(fù)之間的同源重組，其得到可通過X-Gal染色監(jiān)測的功能性p-半乳糖苷酶基因。-圖3表示用于構(gòu)建Ulib4和Ulib5文庫的N75骨架蛋白的序列以及簡并引物。A.所述骨架(SEQIDNO:68)是I-OeIORF,其包含D75N密碼子替換以及3，端三個另外的密碼子(AAD)。B.引物(SEQIDNO:69、70、71)。-圖4表示pCLS0542大范圍核酸酶表達(dá)載體。pCLS0542是基于2n的復(fù)制型載體，其帶有LEU2營養(yǎng)缺陷型基因標(biāo)記，以及用于驅(qū)動I-CVeI變體的表達(dá)的誘導(dǎo)型Gal10啟動子。-圖5表示pCLS0042報告載體。所述報告載體帶有TRP1和URA3標(biāo)記。LacZ串聯(lián)重復(fù)共有800bp的同源性，并且被1.3kb的DNA分隔開。它們兩側(cè)是ADH啟動子和終止子序列。乾位點被克隆至SwmI位點中。-圖6舉例說明了變體文庫的基本原理。A.與其DNA耙標(biāo)結(jié)合的同源二聚體的結(jié)構(gòu)(其根據(jù)Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003,329，253-269)以及在本研究中用于隨機(jī)改變的所選結(jié)合界面區(qū)域的定位；28、30、33、38和40位殘基在左邊單體中用黑色標(biāo)出。B.放大顯示所選用于隨機(jī)改變的28、30、33、38和40位殘基。C.在I-Oel的DNA靶標(biāo)(圖6A中黑色表示)的外部區(qū)域中I-CVrf/DNA相互作用的總結(jié)。所示乾標(biāo)(C1221(SEQIDNO:3))是被I-Oel切割的回文靼標(biāo)(Chevalier等，2003，如前引用)。僅標(biāo)出了堿基特異性接觸?？騼?nèi)是靶標(biāo)的10NNN區(qū)域(±8、±9、±10位核苷酸，圖6A中黑色表示)。D.Ulib4中隨機(jī)化堿基的位置(30、33、38)。E.Ulib5中隨機(jī)化堿基的位置(28、30、38)。F.Lib4中隨機(jī)化堿基的位置(28、33、38、40)。-圖7表示141種I-Oel變體切割37種新DNA靶標(biāo)的切割模式。對于篩選后獲得并用28、30、33、38、40、70和75位殘基定義的每種I-Oel變體而言，使用圖IB中所述的64個粑標(biāo)在酵母中監(jiān)測切割。用對應(yīng)于-10、-9和-8位核苷酸的三個字母指代靶標(biāo)。例如GGG對應(yīng)于tcgggacgtcgtacgacgtcccga乾標(biāo)(SEQIDNO:4;見圖1)。在掃描濾膜后通過適當(dāng)?shù)能浖u估的數(shù)值對應(yīng)于切割強(qiáng)度。-圖8舉例說明了切割每個靶標(biāo)的突變體的模式和數(shù)目。A.切割模式的實例。針對圖IB中所述的一系列64個回文靶標(biāo)在酵母中分析每種新核酸內(nèi)切酶的切割模式，所述靶標(biāo)在土8、±9和±10位不同于圖1A中所示的序列。如圖8B排列這些耙標(biāo)。用-10、-9、-S三聯(lián)體(IONNN)命名每個乾序列。例如，GGG對應(yīng)于tcgggacgtcgtacgacgtcccga把標(biāo)(SEQIDNO:4;見圖1B)。大范圍核酸SH1"對64個把標(biāo)測試4次。用黑色或灰色點示意由I-Od(D75)、I-OelN75或10個衍生的變體所切割的乾標(biāo)。B.切割每個耙標(biāo)的突變體的數(shù)目，以及切割的平均強(qiáng)度。用-10、-9、-8三聯(lián)體(10NNN)命名每個序列。切割每個乾標(biāo)的蛋白質(zhì)的數(shù)目顯示如下，灰色著色水平與在酵母中這些切割蛋白獲得的平均信號強(qiáng)度成比例。實施例1:具有針對士8、±9和±10位核普酸(10NNN)的新特異性的功能性核酸內(nèi)切酶用于產(chǎn)生大范圍核酸酶變體的方法以及在酵母細(xì)胞中基于切割誘導(dǎo)重組的用于篩選特異性改變的變體的測定在國際PCT申請WO2004/067736和Epinat等，N.A.R"2003，31，2952-2962中已有描述。這些測定均得到可利用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行監(jiān)測的功能性LacZ報告基因(圖2)。A)材料和方法a)構(gòu)建突變體文庫如前所述(Epinat等,N.A.R.，2003,31，2952-2962)，合成wt(I國OeID75)和I-OtID75N(N75)和I畫OeIS70N75的可讀框。通過替換兩個或三個不同組合的殘基，組合文庫源自I-OrfN75、D75或S70N75骨架，所述殘基可能參與與一個DNA靶標(biāo)半位點的土8至10位堿基的相互作用。通過使用在每個所選位點具有獨特簡并密碼子的簡并引物進(jìn)行PCR來產(chǎn)生大范圍核酸酶文庫的多樣性。通過用aac替換75位密碼子而引入突變D75N。然后，在N30、Y33和Q38位(Ulib4文庫)或者K28、N30和Q38位(Ulib5文庫)的三個密碼子被簡并密碼子VVK(18個密碼子，編碼12種不同的氨基酸A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T)戶斤替換。因jt匕，這些蛋白質(zhì)文庫的最大(理論)多樣性為123或1728。但是，對核苷酸而言，多樣性為183或者5832。在訂購自BIOMETHODES的Lib4中，首先用絲氨酸替換N75骨架的70位精氨酸(R70S)。然后，將28、33、38和40位隨機(jī)改變。用IO種氨基酸(A、D、E、K、N、Q、R、S、T、Y)之一替換原有的核苷酸(K28、Y33、Q38和S40)。對蛋白質(zhì)而言，所得文庫理論上具有10000的復(fù)雜度。另外，在N75或D75骨架中構(gòu)建僅對兩個位點隨機(jī)改變的復(fù)雜度為225(152)的小文庫，其使用NVK筒并密碼子(24個密碼子，氨基酸ACDEGHKNPQRSTWY)。使用編碼10、12或15種不同氨基酸的簡并引物對，通過PCR獲得攜帶期望的突變組合的片段，并且以I-OdN75(圖3A)、I-OdD75或S70N75的可讀框(ORF)作為DNA模板。例如，圖3B舉例i兌明了分別用于產(chǎn)生Ulib4和Ulib5文庫的兩對引物(Ulib456for和Ulib4rev;Ulib456for和Ulib5rev)。將對應(yīng)的PCR產(chǎn)物克隆回I-OelN75或I-OelD75ORF中，所述ORF在酵母復(fù)制型表達(dá)載體pCLS0542(Epinat等，如前所述；圖4)中，所述載體攜帶營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因。在該基于2p的復(fù)制型載體中，變體處于半乳糖誘導(dǎo)型啟動子的控制之下。b)構(gòu)建靶標(biāo)克隆C122124bp回文序列(tcaaaacgtcgtacgacgttttga，SEQIDNO:3)是近乎回文的天然I-Oel把標(biāo)(tcaaaacgtcgtgagacagtttgg,SEQIDNO:1)半位點的重復(fù)。在酵母和哺乳動物細(xì)胞中，在體外和離體時，C1221都如I-OeI天然乾標(biāo)一樣被高效切割。如下衍生出64個回文乾標(biāo)64對寡核香酸(ggcatacaagtttcnnnacgtcgtacgacgtnnngacaatcgtctgtca(SEQIDNO:72)以及反向互補(bǔ)序列)訂購自Sigma,將其退火并以相同方向克隆至pGEM-TEasy(PROMEGA)中。然后，切出400bp的Pv"II片段，并克隆至前述酵母載體pFL39-ADH-LACURAZ(Epinat等，如前引用，圖5)中，該載體也叫pCLS0042，得到了64個酵母報告載體(靶標(biāo)質(zhì)粒)。c)酵母菌株將大范圍核酸酶表達(dá)變體的三個文庫轉(zhuǎn)化至/e"2突變的單倍體酵母菌林FYC2-6A(M^7Yr、^p7^63、/e"2」J、/^3^2M)中。對于轉(zhuǎn)化，可以使用經(jīng)典的化學(xué)/熱激方案，其通常每ngDNA產(chǎn)生l(^個獨立轉(zhuǎn)化體(Gietz和Woods,MethodsEnzymol.，2002，350，87-96)。將單個轉(zhuǎn)化體(Leu+)分別挑入96孔微量培養(yǎng)板中。使用相同方案將所述64個靶標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至單倍體酵母菌林FYBL2-7B(AL4ra、"ni3^《57、^p7^d、/^2」/、/"2」M2)中，得到64個測試菌林。d)酵母中表達(dá)大范圍核酸酶的克隆的接合和篩選表達(dá)大范圍核酸酶的克隆與所述64個靼標(biāo)菌林接合，通過使用圖2示意的篩選測定來檢測二倍體的P-半乳糖苷酶活性。I-Orl變體克隆以及酵母報告菌林貯存在甘油(20%)中，并復(fù)制到新的微量培養(yǎng)板中。使用菌落網(wǎng)格(QpixII，GENETIX)進(jìn)行接合。將突變體以高密度(大約20個點/cm"點在覆蓋有尼龍濾膜的YPD平板上。在同樣的濾膜上進(jìn)行第二次點樣，針對每個變體點樣由64個不同的帶報告基因的酵母菌林組成的第二層。將膜置于固體瓊脂糖富含YEPD培養(yǎng)基上，并在301C孵育過夜，使之發(fā)生接合。然后，將濾膜轉(zhuǎn)移至缺乏亮氨酸和色氨酸并以半乳糖(2%)為碳源(并含有G418用于共表達(dá)實驗)的合成培養(yǎng)基，在37r孵育5天，從而選擇二倍體，允許大范圍核酸酶表達(dá)、報告質(zhì)粒切割和重組以及P-半乳糖苷酶的表達(dá)。5天后，將濾膜置于固體瓊脂糖培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基在0.5M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、0.1%SDS、6。/。二曱基甲酰胺(DMF)、7mMP-巰基乙醇、1%瓊脂糖中含有0.02%的X-Gal，并在37X:孵育，以檢測P-半乳糖苷酶的活性。在孵育2天后，通過掃描鑒定陽性克隆。使用適當(dāng)?shù)能浖λ隹寺〉腜-半乳糖普酶活性進(jìn)行定量。分離對至少一個靶標(biāo)顯示出活性的克隆(初次篩選)。然后將點樣密度降低至4個點/cm2,并針對所述64個報告菌林一式四份測試每個陽性克隆，從而建立完整的模式(二次篩選)。e)測序通過對酵母菌落進(jìn)行PCR來擴(kuò)增在酵母中初步和/或二次篩選所鑒定的陽性克隆的可讀框(ORF)，其使用來自PROLIGO的如下引物PCR-GallO-F(gcaactttagtgctgacacatacagg,SEQIDNO:73)和PCR-GallO-R(acaaccttgattgcagacttgacc,SEQIDNO:74)。簡言之，^L取酵母菌落，將其重懸于100jil的LGlu液體培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)過夜。離心后，將酵母沉淀重懸于IOjil無菌水中，并用于進(jìn)行終體積為50nl的含有1.5nl每種特異性引物(100pmol/ji1)的PCR反應(yīng)。PCR條件是94n變性10分鐘的一個循環(huán)，94"C變性30秒、55"C退火1分鐘、72匸延伸1.5分鐘的35個循環(huán)，以及最終延伸5分鐘。然后對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。f)結(jié)構(gòu)分析使用Pymol進(jìn)行對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的所有分析。I-Od的結(jié)構(gòu)對應(yīng)于pdb條目lg9y。本文中的殘基編號通常指這些結(jié)構(gòu)，只有同源二聚體的第二I-OeI蛋白結(jié)構(gòu)域中的殘基除外，其中的殘基編號根據(jù)第一結(jié)構(gòu)域進(jìn)行設(shè)置。B)結(jié)果I-Oel是二聚體歸巢核酸內(nèi)切酶，其切割22bp假回文靶標(biāo)。對與其天然靶標(biāo)結(jié)合的結(jié)構(gòu)的分析已顯示出，在每個單體中8個殘基與7個堿基建立了直接相互作用(Jurica等，1998，如前引用)。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，在±8至10位核苷酸的堿基與氨基酸N30、Y33、Q38直接接觸，并與氨基酸K28和S40間接接觸(圖6A、6B、6C)。因此，在30、33和38位具有突變的新蛋白質(zhì)可顯示出針對所述64個靶標(biāo)的新切割模式，所述64個靶標(biāo)來自對所切割的回文靶標(biāo)的±8、±9和±10位的替換(IONNN乾標(biāo))。另外，突變可改變參與與DNA堿基直接接觸的殘基的數(shù)目和位置。更具體地，除了30、33、38位之外，其它位于折疊蛋白質(zhì)上鄰近處的殘基可參與與同樣堿基對的相互作用。使用窮舉蛋白質(zhì)文庫對比靶標(biāo)文庫方法以局部地改造這一DNA結(jié)合界面部分。對5個氨基酸位點的隨機(jī)改變會導(dǎo)致理論上205=3.2xio6的多樣性。然而，通過一次隨機(jī)改變2、3或4個殘基產(chǎn)生具有較低多樣性的文庫，其得到225(152)、1728(12"或10000(104)的多樣性。該策略允許針對所述64個回文1ONNNDNA乾標(biāo)廣泛篩選這些文庫中的任一個，其使用了前述基于酵母的測定(Epinat等，2003,如前引用，以及國際PCT申請WO2004/067736)，其原理在圖2中有所描述。首先，將所述I-CVeI骨架的D75突變?yōu)镹。所述D75N突變不影響所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但是降低了過表達(dá)實驗中I-Oel的毒性。然后構(gòu)建Ulib4文庫隨機(jī)改變30、33和38位殘基(圖6A-C和6D)，并用12種氨基酸(A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T)之一替換原有的氨基酸(N30、Y33和Q38)。對于蛋白質(zhì)而言，所得文庫具有1728的復(fù)雜度(對于核酸而言是5832)。然后，構(gòu)建兩個另外的文庫Ulib5和Lib4。在Ulib5中，隨機(jī)改變28、30和38位殘基(圖6A-C和6E)，并用12種氨基酸(ADEGHKNPQRST)之一替換原有的氨基酸(K28、N30和Q38)。對于蛋白質(zhì)而言，所得文庫具有1728的復(fù)雜度(對于核酸而言是5832)。在Lib4中，首先用絲氨酸替換70位的精氨酸。然后，隨機(jī)改變28、33、38和40位(圖6A-C和6F),并用10種氨基酸(A、D、E、K、N、Q、R、S、T、Y)之一替換原有的氨基酸(K28、Y33、Q38和S40)。對于蛋白質(zhì)而言，所得文庫具有10000的復(fù)雜度。在初次篩選實驗中，將20000個來自Ulib4的克隆、10000個來自Ulib5的克隆以及20000個來自Lib4的克隆與所述64個測試菌林之每一個進(jìn)行接合，測試二倍體的半乳糖苷酶活性。在針對所述64個靶標(biāo)的第二輪篩選中，一式四份地測試對所述64個靼標(biāo)之至少一個靶標(biāo)表現(xiàn)出切割活性的所有克隆，并建立每種切割模式，如圖8中所示。然后，利用PCR從每個菌株擴(kuò)增大范圍核酸酶的ORF,并測序。在二次篩選以及對陽性克隆的整個編碼區(qū)進(jìn)行測序后，總共分離出1484個獨特的突變體，其表現(xiàn)出對至少一個靼標(biāo)的切割活性?？捎^察到不同的模式。圖7舉例說明被141種變體所切割的37個新的靶標(biāo)，其包括34個不被I-O^I切割的靶標(biāo)，以及3個被切割的靶標(biāo)(aag、aat和aac)。12種模式(包括N75和D75)的實例顯示于圖8A中。這些新模式中的某些與野生型骨架的模式具有某些相似性，而許多其它的則完全不同。歸巢核酸內(nèi)切酶通常可接受其靶序列中的某些簡并性，并且I-Orf和I-OeIN75蛋白本身分別切割一系列的16個和3個靶標(biāo)。在許多新核酸內(nèi)切酶中發(fā)現(xiàn)了切割簡并性，平均每個突變體有9.9個切割靶標(biāo)(標(biāo)準(zhǔn)差11)。然而，在1484個鑒定的突變體中，發(fā)現(xiàn)219個(15%)僅切割一個DNA耙標(biāo)，179個(12%)切割兩個，169個(11%)和120個(8%)分別能切割3個和4個靶標(biāo)。因此，與其優(yōu)選靶標(biāo)無關(guān)地，顯著數(shù)量的衍生物顯示出與N75突變體(切割3個10NNN乾序列)或(切割16個10NNN耙序列)相似的(如果不更高的話)特異性水平。同樣地，所分離的針對10NNN序列的特異性發(fā)生改變的大多數(shù)突變體不再切割圖6C所述的原始C1221靶序列(分別為61%和59%)。總之，所述大量突變體允許在士IO、±9和±8位不同的所有64種可能的DNA序列(圖8B)作為耙標(biāo)。然而，切割每種耙標(biāo)的突變體的數(shù)目顯著不同(圖8B)這些數(shù)目的范圍從3到936,平均為228.5(標(biāo)準(zhǔn)差201.5)。常常在±8位為鳥嘌呤或±9位為腺嘌呤的靶標(biāo)中觀察到切割，而在±10或±8位為胞嘧啶則與切割蛋白(cleaver)的低數(shù)量相關(guān)。另外，所有的靶標(biāo)不都以相同的效率被切割。因為取決于所述突變體，可觀察到同一靶標(biāo)的顯著差異的信號(例如比較圖8B中野生型10AAA耙標(biāo)的切割效率)，如前所報道的(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355,443-458)測定每個靶標(biāo)的平均切割效率。在圖8B中這些平均效率用灰色程度來表示。對該結(jié)果的分析表明，在所述平均效率和切割蛋白數(shù)目之間存在明顯相關(guān)性，最常被切割的靶標(biāo)也具有最有效率的切割(比較例如圖8B中的IOTCN、10CTN和10CCN耙標(biāo)與IOGAN、10AAN和10TAN)。因此，獲得了數(shù)百個新的變體，其包括具有新底物特異性的突變體；這些變體可保持高活性水平，并且新蛋白質(zhì)的特異性甚至可比野生型蛋白質(zhì)對其靶標(biāo)的特異性更窄。實施例2:I-Oel變體與其靶標(biāo)之間相互作用的統(tǒng)計學(xué)分析A)材料和方法如前所述(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006,355，443-458)，4吏用層級聚類以建立特定蛋白質(zhì)殘基和靶標(biāo)堿基之間可能的相關(guān)性。使用R軟件包的hclust對來自二次篩選的定量數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。使用EuclideaniE巨離和Ward's方法(Ward,J.H.，AmericanStat.Assoc"1963,58,236-244),使用標(biāo)準(zhǔn)層級聚類分析對變體進(jìn)行聚類分析。在高度為17處切割突變體系統(tǒng)樹狀圖以定義聚類。為了進(jìn)行分析，將聚類中靶標(biāo)切割的累計強(qiáng)度計算為所有聚類的突變體對此靶標(biāo)的切割強(qiáng)度總和，其歸一化至所有聚類的突變體對所有靶標(biāo)的切割強(qiáng)度總和。B)結(jié)果鑒定出IO種不同突變體聚類(表I)。表I:聚類分析<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>1靶標(biāo)和堿基頻率對應(yīng)于累計切割強(qiáng)度，如材料和方法中所述。2在每個位點，標(biāo)出在多于15。/。的聚類中存在的堿基分析每個聚類中的殘基顯示出所有隨機(jī)化位點均有強(qiáng)偏好性。這些殘基中沒有一個在本研究中使用的所有文庫內(nèi)均被突變，預(yù)計l-CVd骨架中的殘基會過度出現(xiàn)。實際上，在所有10個聚類中，K28、N30和S40是最常見的殘基，但是不能得出DNA/蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)論。然而，Y33僅在聚類7、8和10中最常出現(xiàn)，而在其它7個聚類中觀察到其它殘基例如H、R、G、T、C、P或S的頻繁出現(xiàn)。野生型Q38殘基在除一個以外的所有聚類中過度出現(xiàn)，在聚類4中R和K更常出現(xiàn)。同時，在殘基33和38的性質(zhì)與靶標(biāo)士IO和±9位的底物選擇之間觀察到強(qiáng)相關(guān)性。Y33的普遍存在與腺嘌呤的高頻率有關(guān)(在聚類7和10中分別為74.9%和64.3%)，而在聚類4、5和8中也觀察到此相關(guān)性，但程度較低。H33或R33與鳥噤呤相關(guān)(在聚類1、4和5中分別為63.0%、56.3%和58.5%)，T33、C33或S33與胸腺嘧咬相關(guān)(在聚類3和9中分別為45.6%和56.3%)。在聚類2中G33是相對常見的，該聚類在士IO位具有最平均的堿基分布。這些結(jié)果與Seligman及其合作者的觀察是一致的(NucleicAcidsRes.，2002，30，3870-3879)，他們先前表明Y33R或Y33H突變使I-OeI的特異性向士10位鳥噤呤遷移，Y33C、Y33T、Y33S(以及Y33L)的特異性向±10位胸腺嘧啶遷移。另外，R38和K38與聚類4中特別高頻率的鳥嘌呤相關(guān)，而在其它所有的聚類中，野生型Q38殘基以及靶標(biāo)士9位的腺嘌呤是過度出現(xiàn)的。與其靼標(biāo)結(jié)合的I-Orl的結(jié)構(gòu)(Chevalier等，2003,如前引用；Jurica等，1998,如前引用)顯示出Y33和Q38接觸-10和-9位的兩個腺嘌呤(圖6C)，此結(jié)果表明在許多所述突變體中可能保持這些相互作用。先前描述了對于44位殘基和士4位的類似結(jié)果(Arnould等，如前引用)。但是，比較下列組合33/±10、38/±9和44/±4得到的結(jié)果，表明給定的g根據(jù)其位點可與不同的氨基酸殘勤目關(guān)聯(lián)。對于鳥噤呤而言，最常見的殘基是33位的R和H,38位的R或K以及44位的K，對于腺嘌呤而言，最常見的殘基是33位的Y,38位和44位的Q，對于胸腺嘧啶而言，最常見的殘基是33位的S、C或T以及44位的A。在這三種情形中，沒有觀察到胞嘧啶的明顯模式。因此，對于接觸每個M來說，沒有通用"密碼(code)"，而是存在一系列解決方案，最佳解決方案取決于更一般的環(huán)境，這非常類似于鋅指蛋白中所觀察到的情形(Pabo等，如前引用)。40權(quán)利要求1.一種改造出具有經(jīng)修飾的切割特異性的I-CreI歸巢核酸內(nèi)切酶變體的方法，其包括至少以下步驟(a)用選自A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、L、V、W和Y的氨基酸替換I-CreI中β1β2發(fā)夾的K28、N30、Y33、Q38和/或S40中至少一個氨基酸，(b)選擇和/或篩選來自步驟(a)的能夠切割DNA靶序列的I-CreI變體，所述靶序列由突變的I-CreI位點組成，其中至少-9到-8位的aa核苷酸二聯(lián)體和/或+8到+9位的tt核苷酸二聯(lián)體被不同的核苷酸二聯(lián)體所替換。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中步驟b)中的DNA靶標(biāo)衍生自選自SEQIDNO:l至3的I-Oel位點。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟b)中的DNA靶標(biāo)包含具有下式的序列.c-"n_10n-9rum-7y-6n-5iMn-3k^y-ir+im+2n+3n+4n+5r+6k+7n+sn+9n+iog+ii(I)，其中n是a、t、c或g，m是a或c,y是c或t，k是g或t，r是a或g(SEQIDNO:75)，只要當(dāng)n_9n-8Aaa時，11+811+9不是《，并且當(dāng)n+8n+9Att時，n_9n.8不是aa即可。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中11_511.411-3是gtc和/或11+311+411+5是gac。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的方法，其中步驟b)中所述DNA靶標(biāo)的-11到-8位和+8到+11位的核苷酸序列和/或-5到-3位和/或+3到+5位的核苷酸序列是回文的。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其中步驟b)中的DNA靶標(biāo)包含-9到-8位的核苷酸二聯(lián)體和/或+8到+9位的核苷酸二聯(lián)體，所述-9到-8位的核苷酸二聯(lián)體選自ag，at，ac，ga，gg，gc，ta,@，tt，cg，"或cc，所述+8到+9位的核苷酸二聯(lián)體是-9到-8位所述核苷酸二聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的方法，其中步驟b)中的DNA靶標(biāo)還包括用不同核普酸替換位點-10位的核脊酸a和/或+10位的核普酸t(yī)。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述DNA耙標(biāo)包含-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體和/或+8到+10位的核普酸三聯(lián)體，所述-10到-8位的核普酸三聯(lián)體選自aac，aag，aat，acc,acg，act,aga,age,agg，agt,ata，atg，cag，cga，cgg'ctg，gac，gag，gat,gcc'gga,ggc,ggg,ggt,gta,gtg，gtt，tac,tag,tat,tcc，tga,tgc，tgg,tgt或ttg,戶斤述+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體是所述-10到-8位核普酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項的方法，其中在某些M下體內(nèi)實施步驟(b)，在所述條件中所述變體在突變的DNA乾序列中產(chǎn)生的雙鏈斷裂通過所述DNA雙鏈斷裂的重組介導(dǎo)的〗務(wù)復(fù)導(dǎo)致正選擇標(biāo)記或才艮告基因的活化或者負(fù)選擇標(biāo)記或報告基因的失活。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的方法，其包括另外的步驟d)，其表達(dá)步驟b)中獲得的一種變體從而允許形成同源二聚體。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的方法，其包括另外的步驟c2)，其共表達(dá)步驟b)中獲得的一種變體和I-Od或其功能性變體，從而允許形成異源二聚體。12.根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中共表ii^步驟b)中獲得的兩種不同變體。13.—種可通過根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的方法獲得的大范圍核酸酶變體，所述變體能夠切割由突變的I-Oel位點組成的DNA乾序列，其中至少-9和/或-8位的核普酸a和/或+8和/或+9位的核苷酸t(yī)被不同的核苷酸所替換，所述變體在28、30、33、38和40位分別具有選自以下的氨基酸殘基Q28/N30/^33/K38/R40，R28/N30/K33/R38/Q40,Q28/N30/R33/R38/R40,Q28/N30/Y33/K38/K40，Q28/N30/T33/Q38/K40,Q28/N30/R33/R38/K40，K28/N30/T33/Q38/R40，S28/N30/R33乂S38/R40,N28/N30/Y33/Q3,0'Q28/N30/N33/Q38/K40,K2畫她33/E3S/R40，A28/N30/S33/Q38/R4O,R2蘭0/A33/Y38/Q40，簡細(xì)/S33/R38/R40，S28/N30/R33/Q38/R40,K28/N30/N33/Q3幽O，Q2畫0/T33/Q3幽0，Q28/N30/E33/D38/H40，R28/N30/T33/R38/A40,Q28/N30/Y33/A38/R40,T2,0/N33/Q3,0，Q28/N30/R33/A38/R40，K28鵬/R33/A3,0,R28/N30/A33/K38/S40，R2翻0/N33/Q38/D40,K28細(xì)/R33/S38/S40，K28/N30/R33/A38/T40，K2,0/R33/Q38/Y40，Q2畫0/R33/Q38/R40，K28柳0/R33/Q38/Q40,K2,0/H33/R38/S40,K28/E30/S33/R38/S40,K2g/A30/R33/Q38/S40,K28/N30鵬3/R38/S40,K28/R30/H33/G38/S40，K28/K30/H33/R38/S40，K28/G30/R33攀/S40K2,0/A33/Q38/S40,K28/R30/G33/S38/S40，K28/N30/T33/R38/Q40,S讓30/Y33/R38/K鄰，K2,0/S33娜/S40,Q2,0/Y33/R38細(xì),K28/N3O/R33/Q38/E40，Q28/N30/Y33/Q38/K40,Q28/N30/R33/Q3,0,S2麵0/Y33/Q3,0，K2,0/R33/T38/Q40，R2,0/Y33/N38歸，H2,0/Y33/D3簡0，S28/N30/Q33/A38/A40,Q28/N30/Y33/R38/S40'Q2謡0/N33/Q3,0,K2,0/T纖38/A40,K28/N30/R33/N38/A40，R2,0/R33/Y38/Q40，K28/N30/R33/Y3固0，K2,0/R33/N38/Q40,Q2聽0/S33顔/K40,K28/N30/R33/A38/Q40,K28/N30/R33/Q38/A40，K28/H30/H33/R38/S40,K28/H30/T33/P38/S40,K28/S3O/R33/G38/S40,K28/R30/R33/E38/S40,K28/A30柳3/QWS40，K28/Q30細(xì)/Q38/S40,K2網(wǎng)0/P33/G3簡0，K28/N30鵬3/N38/S40,K28/S30/R33/Q38/S40，K28/N30/S33/R38腳，K28/N30/S33/R38/D40,R2,0/R33/D3,0，Q28/N30/K33/R38/T40，N28/N30/S33/R38/K40,Q28/N30/Y33/Q38/R40,E28/N30/R33/R38/K40,T28/N30/R33/Q38/R40,K28/N30/R33/T38/R40，Q2畫0/Y33/T38,,Q28/N30/Y33/R38/A40,Q28/N30/Y33/E38/K40,K2訓(xùn)0/R33/Q3,0,R28/N30/R33/E38/R40,K28/N30/R33/K38/A40,T28/N30/E33/S38/D40，K28/N30/Y33/Q38/N40，A2鵬0肌節(jié)麵0，T28/N30/T33/Q38腳，R2謝30/Y33/Q38/S40，A28/N30/R33/Q38/R40,K28/N30H33/A38/S40,K28/D30/N33/H38/S40,K28/G30/H33/Y38/S40,K28/S30/H33/H38/S40,K28/D30/G33/H38/S40:K28/D30/H33/K3固0:K28/Q30/T33/Q38/S40:K28/R30/G33/N38/S40,K28/H30/H33/A38/S40:K28/T30/D33/H38/S40:K2,0/H33/Q38/S4Q，K28/N30yR33/A38/S40，K28/N30/H33/E38/S40，K28/A30/H33/Q38/S40，K28/Q30/H33/Q38/S40，K28/N30/D33/Q3認(rèn)0，K28/H30/M33/A3固O，K28/S3(W33/Q3固0，K28AB0/V33/Q38/S40,K28/G30/V33/R38/S40，K28/A30/D33/H38/S40，K28/S30/H33/Q38/S40，K28/D30/R33/T38/S40，K28/R30/G33/T38/S40，K2畫0/H33/G38/S40，K28/D30/R33/G38/S40,K28/S30/S33/H38/S40,K28/D30/V33/H38/S40,K28/G30/V33/T38/S340，K28/G30/V33/G38/S40,K28/S30/H33/R38/S40，K28/D30/A33/H38/S4O,K28/D30/R33/S38/S40,K28/N30細(xì)/S38/S40，K2,0/N33/Q38測，K28/N30/H33/A38/S40,K28/G30/V33/A3隨0，R28/D30/V33/Q38/S40,K28/G30/V33/H38/S40,R28/A30/V33/G38/S40，R28/D30/V33/R38/S40,R28/N30/V33/Q38/S40和N28/T30/V33/D38/S40。14.一種可通過根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的方法獲得的大范圍核酸酶變體，所述變體在38位為精氨酸(R)或賴氨酸(K)，并且所述變體能夠切割由在-9位包含鳥噪呤和/或在+9位包含胞嘧啶的突變位點組成的DNA乾序列。15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的變體，其在接觸DNA靶序列或者直接或間接與所述DNA靶標(biāo)相互作用的位點包含一個或多個另外的突變。16.根據(jù)權(quán)利要求15的變體，其中，所述突變位于選自I24、Q26、S32、Q44、R68、R70、D75、177和T140的位置。17.根據(jù)權(quán)利要求16的I-Oel變體，其包含用不帶電荷的氨基酸替換75位天冬氨酸。18.根據(jù)權(quán)利要求17的I-Oel變體，其包含D75N或D75V突變。19.根據(jù)權(quán)利要求16的I-Od變體，其包含R70S突變。20.根據(jù)權(quán)利要求13至19中任一項的I-Oel變體，其包含位于I-Oel中80到163位的一個或多個另外的突變，優(yōu)選位于I-Oel中80、82、85、86、87、94、96、100、103、114、115、117、125、129、131、132、147、151、153、154、155、157、159和160位的一個或多個另外的突變。21.根據(jù)權(quán)利要求13至20中任一項的變體，其為同源二聚體。22.根據(jù)權(quán)利要求13至20中任一項的變體，其為包含來自兩個不同變體的單體的異源二聚體。23.單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶，其包含來自權(quán)利要求13至20中任一項所述變體的單體與來自LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶或其功能性變體的單體或結(jié)構(gòu)域的融合物。24.多核苷酸片段，其編碼根據(jù)權(quán)利要求13至22中任一項的變體或者根據(jù)權(quán)利要求23的源自所述變體的單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶。25.重組載體，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求24的多核苷酸片段。26.根據(jù)權(quán)利要求25的載體，其包含靶向構(gòu)建體，所述靶向構(gòu)建體包含與DNA靶序列周圍區(qū)域共有同源性的序列。27.根據(jù)權(quán)利要求26的載體，其中所述靶向DNA構(gòu)建體包含a)與所述DNA靶序列周圍區(qū)域共有同源性的序列，和b)其側(cè)翼為a)中所定義序列的待引M列。28.經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項的載體修飾的宿主細(xì)胞。29.經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求24的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項的載體修飾的非人轉(zhuǎn)基因動物。30.經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項的載體修飾的轉(zhuǎn)基因植物。31.組合物，其至少包含根據(jù)權(quán)利要求13至22中任一項的一種變體、根據(jù)權(quán)利要求23的源自所述變體的一種單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶或者根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項的重組載體。32.根據(jù)權(quán)利要求31的組合物，其含有靶向DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含修復(fù)目的位點的序列，所述序列的側(cè)翼是與靶基因座具有同源性的序列。33.—種遺傳工程方法，其包括在位于包含DNA靶序列的載體上的目的位點處斷裂雙鏈DNA的步驟，所述步驟通過將所述載體與根據(jù)權(quán)利要求13至22中任一項的變體或根據(jù)權(quán)利要求23的包含所述變體的單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶接觸來實現(xiàn)，從而誘導(dǎo)與另一與所述變體的切割位點周圍序列具有同源性的載體發(fā)生同源重組。34.—種基因組工程方法，其包括以下步驟l)使包含至少一個DNA靶序列的基因座雙鏈斷裂，其通過將所述靶標(biāo)與根據(jù)權(quán)利要求13至22中任一項的I-Odt變體或根據(jù)權(quán)利要求23的包含所述變體的單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶接觸來實現(xiàn)；2)保持所述斷裂的基因座處于適于與靶向DNA構(gòu)建體發(fā)生同源重組的條件下，所述靶向DNA構(gòu)建體包含待引入所述基因座的序列，其側(cè)翼具有與靶基因座具有同源性的序列。35.—種基因組工程方法，其包括如下步驟l)使包含至少一個DNA靶序列的基因座雙鏈斷裂，其通過將所述切割位點與根據(jù)權(quán)利要求13至22中任一項的變體或根據(jù)權(quán)利要求23的包含所述變體的單鏈嵌合核酸內(nèi)切酶接觸來實現(xiàn)；2)保持所述斷裂的基因座處于適于與染色體DNA發(fā)生同源重組的條件下，所述染色體DNA與所述切割位點周圍區(qū)域具有同源性。36.可通過根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的方法獲得的大范圍核酸酶變體用于分子生物學(xué)、體內(nèi)或體外遺傳工程以及體內(nèi)或體外基因組工程的非治療目的的用途，用于切割如權(quán)利要求1至8中任一項所述的DNA乾序列。37.可通過根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的方法獲得的至少一種變體的用途，其用于制備在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治愈遺傳病的藥物，所述藥物通過任意方式施用于所述個體。38.可通過根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的方法獲得的至少一種變體的用途，其用于制備在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治愈疾病的藥物，所述疾病由具有DNA中介體的傳染原導(dǎo)致，所述藥物通過任意方式施用于所述個體。39.可通過根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的方法獲得的至少一種I-Od變體的用途，其用于在生物來源產(chǎn)品或者旨在用于生物學(xué)用途的產(chǎn)品中體外抑制具有DNA中介體的傳染原的增殖、或者將其滅失活或消除，或者用于消毒物體。40.可通過根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的方法獲得的至少一種I-OeI變體作為產(chǎn)生其它大范圍核酸內(nèi)切酶的骨架的用途。41.根據(jù)權(quán)利要求37至39中任一項的用途，其中所述I-OeI變體在28、30、33、38和40位分別具有選自以下的氨基酸殘基KNSQS、KNRQS、KNTQS或KNHQS。42.根據(jù)權(quán)利要求36至40中任一項的用途，其中所述I-O^I變體如權(quán)利要求13至23中任一項所定義。全文摘要一種改造出能夠切割突變的I-CreI位點的I-CreI歸巢核酸內(nèi)切酶變體的方法，所述位點在±8到±10位有改變。本發(fā)明涉及可獲得自所述方法的I-CreI歸巢核酸內(nèi)切酶變體、編碼所述變體的載體、經(jīng)所述載體修飾的細(xì)胞、動物或植物。所述I-CreI核酸內(nèi)切酶變體及其衍生產(chǎn)物在遺傳工程、基因組治療和抗病毒治療中的用途。文檔編號C12N9/22GK101297032SQ200680039556公開日2008年10月29日申請日期2006年10月3日優(yōu)先權(quán)日2005年10月25日發(fā)明者弗雷德里克·帕克申請人:賽萊克蒂斯公司