專利名稱：具有經(jīng)修飾的特異性的I-CreI大范圍核酸酶變體、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
具有經(jīng)修飾的特異性的l-Orl大范圍核酸酶變體、
其制備方法及應(yīng)用
本發(fā)明涉及一種制備具有經(jīng)修飾的切割特異性的I-CmI大范圍核酸 酶(megaimclease )變體的方法。本發(fā)明還涉及通過所述方法可獲得的 I-CVd大范圍核酸酶變體以及它們或者用于切割新DNA靶標(biāo)或者用于 非治療目的的遺傳工程和基因組工程的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及編碼所述變體的核酸、包含所述核酸的表達(dá)盒、包含所 述表達(dá)盒的栽體、被所述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或生物，植物或非人動(dòng)物。
大范圍核酸酶是識(shí)別大(>12bp;通常14-40bp) DNA切割位點(diǎn)的 序列特異性內(nèi)切核酸酶(Thierry and Dujon， 1992 )。野生型的大范圍核 酸酶基本上以歸巢內(nèi)切核酸酶為代表，通常由可移動(dòng)遺傳元件如內(nèi)含肽 和I型內(nèi)含子編碼(Belfort and Roberts, 1997; Chevalier and Stoddard, 2001 )。歸巢指由所述大范圍的內(nèi)切核酸酶活性啟動(dòng)的這些元件的動(dòng)員， 這依賴于DNA雙鏈斷裂(DSB )修復(fù)。早期對(duì)HO ( Haber， 1998; Klar "fl/.， 1984; Kostriken " a/" 1983 )、 I-5"cd ( Colleaux W fl/.， 1988; Jacquier and Dujon, 1985; Perrin " 1993; Plessis " a/" 1992 )和 I-化v/ ( Bell-Pedersen " /" 1990; Bell-Pedersen " 1989; Bell-Pedersen W "/., 1991; Mueller W a;.， 1996 )蛋白的研究已經(jīng)闡明了 歸巢過程的生物學(xué)特性。另一方面，這些研究也已經(jīng)提供了在活細(xì)胞中 研究DSB修復(fù)的范例。
歸巢核酸內(nèi)切酶的靼序列通常是不對(duì)稱的，這與大多數(shù)限制性酶識(shí) 別位點(diǎn)為典型的二分對(duì)稱是不同的。已經(jīng)表明，某些由內(nèi)含子ORF或 內(nèi)含肽編碼的歸巢核酸內(nèi)切酶促進(jìn)它們各自的遺傳元件歸巢至等位基 因的無內(nèi)含子或無內(nèi)含肽位點(diǎn)。通過在無內(nèi)含子或無內(nèi)含肽等位基因中 引入位點(diǎn)特異性的雙鏈斷裂，這些核酸酶產(chǎn)生引起重組的末端，其參與 復(fù)制編碼序列并導(dǎo)致在DNA水平插入內(nèi)含子或間插序列的基因轉(zhuǎn)換過 程。
歸巢核酸內(nèi)切酶基于非常保守的氨基酸基序分為4個(gè)獨(dú)立的家族 [綜述參見Chevalier and Stoddard (Nucleic Acids Research, 2001， 29，3757-3774)1 。其中之一是十二肽家族(十二聚體， D0D，D1-D^AGLIDADG，P1-PZ )。這是通過其最通用的保守序列基序劃分的
最大的蛋白質(zhì)家族，所述保守序列基序?yàn)?一個(gè)或兩個(gè)拷貝(絕大多數(shù)) 的十二殘基序列，即十二肽(dodecapeptide)。具有一個(gè)十二肽(D) 的歸巢核酸內(nèi)切酶的分子量約為20 kDa并以同源二聚體起作用。那些 具有兩個(gè)拷貝(DD)的范圍從25kDa(230個(gè)氨基酸)到50kDa(HO， 545個(gè)氨基酸)并且在每個(gè)基序之間有70至150個(gè)殘基，并以單體起作 用。切割在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部，交錯(cuò)切割保留4nt的3，OH突出端。含有單 拷貝LAGLIDADG基序的酶，如和作為同源二聚體發(fā)揮 作用并識(shí)別近乎回文的歸巢位點(diǎn)。
歸巢核酸內(nèi)切酶I-Oe/ (pdb登記碼lg9y)的序列和結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定 (Rochaix JD et al.， NAR, 1985, 13, 975-984; Heath pi et al., Nat. Struct. Biol.， 1997, 4,
468-476; Wang et aU NAR， i997， 25, 3767-3776; Jurica et al. Mol. Ce]l， 1998, 2, 469-476:)， 并且已使用X-射線結(jié)晶學(xué)產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)模型(Heath et al.， 1997 )。
包含163個(gè)氨基酸(pdb登記碼lg9y);所述內(nèi)切核酸酶作 為二聚體進(jìn)行切割。LAGLIDADG基序?qū)?yīng)于殘基13至21;在 LAGLIDADG a-螺旋的任意一側(cè)，四個(gè)|3-片層(21-29位；37-48位； 66-70位和73-78位)提供了 DNA結(jié)合界面，該界面驅(qū)使該蛋白質(zhì)與耙 DNA序列的半位點(diǎn)相互作用。該二聚化界面包括兩個(gè)LAGLIDADG螺 旋以及其它殘基。
I-Oel識(shí)別和切割的歸巢位點(diǎn)的長(zhǎng)度為22-24bp,并且是簡(jiǎn)并的回 文序列(參見Jurica MS et al， 1998的圖2以及SEQ ID NO:65 )。更精 確地說，所述I-CVeI歸巢位點(diǎn)是22bp的半回文序列，在每個(gè)半位點(diǎn)中 的llbp中有7bp是一致的(Seligman LM et al.， NAR， 2002， 30, 3870-3879 )。
也已經(jīng)描述了該內(nèi)切核酸酶-DNA界面(參見Jurica MS et al， 1998
的圖4),并導(dǎo)致關(guān)于特異性蛋白質(zhì)-DNA接觸的諸多預(yù)測(cè) (Seligman LM et al,, Genetics, 1997， JiZ， 1653-1664; Jurica MS etal.， 1998; ChevalierB. etal.
Biochemistry, 2004,組14015-14026:)。 從所述的文獻(xiàn)可以看出
-殘基G19、 D20、 Q47、 R51、 K98和D137是I-O乂'I的內(nèi)切核酸
位點(diǎn)的一部分；
-歸巢位點(diǎn)序列必須具有至少20bp從而獲得0.2nM的最大結(jié)合親 和力；
-序列特異性接觸分布于歸巢位點(diǎn)的全部長(zhǎng)度上；
-在許多不同的歸巢位點(diǎn)位置堿基對(duì)替換可以被耐受，而沒有嚴(yán)重 地破壞歸巢位點(diǎn)的結(jié)合或切割；
-R51和K98位于酶活性位點(diǎn)中并且在酶切反應(yīng)中作為L(zhǎng)ewis酸或 激活質(zhì)子供體的候選者；已觀察到這些殘基中每一個(gè)的突變會(huì)急 劇地降低I-OeI內(nèi)切核酸活性(R51G， K98Q)。
-5個(gè)額外的殘基，其被突變時(shí)完全破壞I-Od內(nèi)切核酸酶活性， 位于酶活性位點(diǎn)中或附近(R70A、 L39R、 L91R、 D75G、 Q47H)。
這些研究已經(jīng)為大范圍核酸酶普遍用于基因組工程鋪平了道路。同 源基因打靶是穩(wěn)定修飾活細(xì)胞中染色體基因座位的最精確方法，但是其 低效率成為主要的阻礙。因?yàn)榇蠓秶怂崦刚T導(dǎo)的DSB刺激同源重組 高達(dá)10000倍，所以大范圍核酸酶當(dāng)前是提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因打乾 效率(Choulika " fl/" 1995; Cohen-Tannoudji " a/" 1998; Donoho " a/" 1998; Elliott e, fl/" 1998; Rouet ef 1994 ) k乂及在i者3口植物(Puchta ef fl/.，1993; Puchta " 1996 )和昆蟲(Rong and Golic, 2000; Rong and Golic, 2001; Rong "a/., 2002 )等生物體中提供可行效率的最好方式。
大范圍核酸酶已被用于誘導(dǎo)多種類型的同源重組事件，如哺乳動(dòng)物 細(xì)胞(Liang " 1998 )、植物(Siebert and Puchta, 2002 )、昆蟲(Rong C"/.，2002)和細(xì)菌(Posfai W fl/.， 1999 )中的直接重復(fù)重組，或染色體 間重組(Moynahan and Jasin, 1997; Puchta, 1999; Richardson " a/" 1998 )。
然而，該技術(shù)仍受限于大范圍核酸酶的潛在天然靶位點(diǎn)的數(shù)目低 雖然已鑒定了幾百種天然歸巢內(nèi)切核酸酶(Belfort and Roberts, 1997; Chevalier and Stoddard, 2001 )，但是存在切割目的基因的天然大范圍核 酸酶的可能性還極低。制造具有指定特異性的人工大范圍核酸酶將避開這種限制。
基于內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域與鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相融合，已經(jīng)制備 出具有新特異性的人工核酸內(nèi)切酶(Bibikova et al.， 2003; Bibikova et al" 2001; Bibikova et al" 2002; Porteus and Baltimore, 2003 )。
歸巢核酸內(nèi)切酶還已用作骨架來制備新的內(nèi)切核酸酶，或者通過不 同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的融合(Chevalier e"/" 2002; Epinat 2003 ),或
者通過單個(gè)特異性氨基酸殘基的突變(Seligman C "/.， 1997, 2002; Sussman " 2004;國(guó)際PCT申請(qǐng)WO2004/067736 )。
國(guó)際PCT申請(qǐng)WO2004/067736描述了用于從初始的大范圍核酸酶 定制生產(chǎn)大范圍核酸酶的一般方法，所述大范圍核酸酶變體能夠切割與 初始大范圍核酸酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)不同的DNA靶序列。該一般性方 法包括以下步驟制備在與DNA靶序列接觸或者直接或間接與所述 DNA靶標(biāo)相互作用的位置具有突變的大范圍核酸酶變體文庫，和選擇 能夠切割所述DNA靶序列的的變體。當(dāng)初始大范圍核酸酶是I-Od N75 蛋白時(shí)，建立其中殘基44、 68和7(H皮突變的文庫，并針對(duì)接近I-CVeI 天然靶位點(diǎn)的一系列6個(gè)靼標(biāo)進(jìn)行篩選；與I-OdN75骨架蛋白相比， 篩選出的突變體具有經(jīng)修飾的結(jié)合特性；然而，它們切割I(lǐng)-Od天然靶 位點(diǎn)。
Seligman et al., 2002描述了改變的切割特異性的突變。更具 體地，他們已研究了 I-CVeI的預(yù)測(cè)直接與DNA耙標(biāo)接觸的9個(gè)氨基酸 (Q26、 K28、 N30、 S32、 Y33、 Q38、 Q44、 R68和R70)的作用。在 這9個(gè)氨基酸中，7個(gè)被認(rèn)為在對(duì)稱位置與核苷酸相互作用(S32、 Y33、 N30、 Q38、 R68、 Q44和R70 )。構(gòu)建含有所述9個(gè)氨基酸中每一個(gè)以 及預(yù)測(cè)參與水介導(dǎo)相互作用的轉(zhuǎn)換為丙氨酸的第10個(gè)(T140)的突變 體，并在基于大腸桿菌的分析中進(jìn)行檢測(cè)。
得到的突變體與野生型歸巢位點(diǎn)相比較分為四類獨(dú)特的表
型
-S32A和T14()A的接觸似乎對(duì)于歸巢位點(diǎn)識(shí)別最不重要，
-N30A、 Q38A和Q44A在每個(gè)分析中表現(xiàn)出中等水平的活性，
-Q26A、 R68A和Y33A無活性，
-K28A和R70A是無活性的并且無毒性。
從所述結(jié)果得出，l-Ot，l的第30、 38、 44、 26、 68、 33、 28和70 位突變體與野生型l-Ox'I的歸巢位點(diǎn)相比較具有行為變化。
關(guān)于改變I-CVeI歸巢位點(diǎn)中7個(gè)對(duì)稱位置的突變體，從得到的結(jié)果 得出，在每個(gè)半位點(diǎn)7個(gè)對(duì)稱位置中的5個(gè)似乎對(duì)野生型在體內(nèi) 進(jìn)行有效的位點(diǎn)識(shí)別是關(guān)鍵的2/21、 3/20、 7/16、 8/15和9/14 (對(duì)應(yīng) 于SEQIDNO:65中的-10/+10、 -9/+9、 -5/+5、 -4/+4和-3/+3位)。在這 些位置發(fā)生改變的所有突變體對(duì)野生型的體內(nèi)切割具有抗性；然 而，使用大腸桿菌的體外分析似乎比體內(nèi)試驗(yàn)更加敏感，并且允許比體 內(nèi)實(shí)驗(yàn)更高效地檢測(cè)野生型的歸巢位點(diǎn)；因此體外檢測(cè)顯示野生 型I-Oel的DNA靼標(biāo)可能如下參照SEQ ID NO:65在-5至-3位的gtc (在所有引用文獻(xiàn)中均被認(rèn)為是歸巢位點(diǎn))、gcc或gtt三聯(lián)體。
Seligman et al.還研究了在的33位和歸巢位點(diǎn)堿基2和21 (±10)之間或者在I-Crel的32位和歸巢位點(diǎn)堿基1和22 (±11)之間 的相互作用；發(fā)現(xiàn)Y33C、 Y33H、 Y33R、 Y33L、 Y33S和Y33T突變 體切割在土IO位已修飾并且不被切割的歸巢位點(diǎn)(表3 )。另 一方 面，發(fā)現(xiàn)S32K和S32R切割在士ll位已^f務(wù)飾并且仍被切割的歸 巢位點(diǎn)(表3)。
Sussman et al.， 2004,才艮道了他們的研究，其中同源二聚體 LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶I-Orl在26位、并最終在66、或在33 位被改變，分別在士6和±10位接觸歸巢位點(diǎn)堿基。得到的酶構(gòu)建體 (Q26A、 Q26C、 Y66R、 Q26C/Y66R、 Y33C、 Y33H)驅(qū)使選定DNA 靶標(biāo)在體內(nèi)特異性消除并在體外表現(xiàn)出DNA結(jié)合和切割的特異性改 變。
選擇和表征針對(duì)單個(gè)靶位點(diǎn)變體的酶點(diǎn)突變的總體結(jié)果是結(jié)合特 異性以及底物切割的動(dòng)力學(xué)都有變化和擴(kuò)展。
與野生型酶相比，每種突變體針對(duì)原始的野生型靶位點(diǎn)表現(xiàn)出更高 的解離常數(shù)(更低的親和力)；并且與野生型酶相比，每種突變體針對(duì) 其新的靶標(biāo)表現(xiàn)出更低的解離常數(shù)(更高的親和力)。
所述酶突變體表現(xiàn)出底物切割的相似動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，與針對(duì)結(jié)合親和 力所描述的那些相似，它們的底物優(yōu)先性也有變化和擴(kuò)展。
為了得到更大數(shù)目的DNA靶序列，極其有價(jià)值的是產(chǎn)生具有新特 異性的新I-Crel變體，即其能夠切割不被I-Ox'l或至今已分離的少數(shù) 變體所切割的DNA乾標(biāo)。
這些變體將對(duì)遺傳或基因組工程尤其有意義。
在此，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在I-OeI的44、 68和70位的突變，由其得到 的變體能夠切割至少 一個(gè)在±3至5位改變的歸巢位點(diǎn)。
因此，本發(fā)明的主題是一種制備具有經(jīng)修飾的切割特異性的l畫C"4 大范圍核酸酶變體的方法，所述方法包括
(a) 用選自A、 D、 E、 G、 H、 K、 N、 P、 Q、 R、 S、 T和Y的氨 基酸替換參照l-Oel pdb登記碼lg9y的氨基酸Q44、 R68和/或R70;
(b) 參照雙鏈DNA靶標(biāo)中-5至-3位，選擇步驟(a)中獲得的具有 至少一個(gè)下列R3三聯(lián)體切割特征的大范圍核酸酶變體，所述-5 至-3位對(duì)應(yīng)于下式I的R3:
5'- R!CAAAR2線R,4R'3R'2TTTGR、 -3，， 其中
!^不存在或存在；并且當(dāng)存在時(shí)代表包含1至9個(gè)核苷酸的核酸片 段，所述核酸片段對(duì)應(yīng)于隨機(jī)核酸序列或?qū)?yīng)于位于從-20至-12位(從 5，向3，)的大范圍核酸酶歸巢位點(diǎn)的片段，Ri至少對(duì)應(yīng)于所述歸 巢位點(diǎn)的-12位，
R2代表核酸雙聯(lián)體ac或ct并且對(duì)應(yīng)于所述歸巢位點(diǎn)的-7至-6位，
R3代表對(duì)應(yīng)于所述-5至-3位的核酸三聯(lián)體，選自g、 t、 c和a，并 排除以下的三聯(lián)體:gtc、 gcc、 gtg、 gtt和gct;因此所述核酸三聯(lián)體優(yōu) 選地選自以下三聯(lián)體
ggg， gg^ ggt, ggc， gag, gaa, gat, gac, gta, gcg, gca, tgg, tga, tgt， tgc, tag， taa,tat， tac, ttg， tta， ttt, ttc, tcg， tca， tct， tcc, agg， aga, agt, agc， aag, aaa， aat， aac, atg， ata， att, atc， acg， aca， act， acc， cgg， cga， cgt, cgc, cag, caa， cat, cac， ctg， cta, ctt, ctc， ccg, cca, cct and ccc and more preferably among the following triplets: ggg， ggt, ggc, gag， gat, gac, gta, gcg, gca， tag, taa， tat， tac, ttg, ttt, ttc， tcg， tct, tec, agg， aag, aat, aac， att， ate, act， acc, cag, cat, cac， ctt, etc, ccg, cct和ccc ，
R4代表核酸雙聯(lián)體gt或tc并且對(duì)應(yīng)于所述歸巢位點(diǎn)的-2至-1位，
R、不存在或存在；并且當(dāng)存在時(shí)代表包含1至9個(gè)核苷酸的核酸片 段，所述核酸片段對(duì)應(yīng)于隨機(jī)核酸序列或?qū)?yīng)于位于從+12至+20位(從 5，向3，)的大范圍核酸酶歸巢位點(diǎn)的片段，R、至少對(duì)應(yīng)于所述 歸巢位點(diǎn)的+12位，
R，2代表核酸雙聯(lián)體ag或gt并且對(duì)應(yīng)于所述歸巢位點(diǎn)的+6至+7位，
R，3代表對(duì)應(yīng)于所述+3至+5位的核酸三聯(lián)體，選自g、 t、 c和a;當(dāng) R3和R，3是非回文序歹'J時(shí)，R，3不同于gac、 ggc、 cac、 aac和agc，
R，4代表核酸雙聯(lián)體ga或ac并對(duì)應(yīng)于所述歸巢位點(diǎn)的+1至+2位。
定義
-多肽序列中的氨基酸殘基在本文中依據(jù)單字母編碼指定，其中， 例如，Q表示Gln或谷氨酰胺殘基，R表示Arg或精氨酸殘基以及D 表示Asp或天冬氨酸殘基。
-在本發(fā)明中，除非另外提及，所述殘基編號(hào)參考I-CVd序列 SWISSPROT P05725或pdb登記碼lg9y的氨基酸編號(hào)方式。依據(jù)該定 義，名為"ADR，，的變體是氨基酸殘基Q44和R68已分別被替換為丙 氨酸和天冬氨酸、而R70未被替換的大范圍核酸酶。其它不改 變所述變體的切割活性的突變不被注明，并且本文采用的命名不限制突 變僅在44、 68和70三個(gè)位置。
-核苷酸以如下方式表示單字母編碼用于指代核苷的堿基a是 腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，以及g是鳥嘌呤。對(duì)于簡(jiǎn)并核苷 酸，r代表g或a (嘌呤核苷酸)，k代表g或t, s代表g或c， w代表 a或t, m代表a或c， y代表t或c (嗜咬核苷酸)，d代表g、 a或t， v 代表g、 a或c， b代表g、 t或c, h代表a、 t或c， 以及n代表g、 a、
t或C。
-在本申請(qǐng)中，當(dāng)給出序列用于舉例說明識(shí)別或歸巢位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)該明白它代表雙鏈多核香酸從5，向3，的僅一條鏈。
-所述術(shù)語"部分回文序列"、"部分對(duì)稱序列"、"簡(jiǎn)并回文序列"、 "假回文序列"均不加區(qū)分地用于表示具有不完全對(duì)稱性的回文序列。
例如 22bp 序歹'J : C.ii&幽a^7C-6g-5"C-3g-2t ig+a+2g+3a+4C+5a+6g+7"8"9tM0g+11
(SEQ ID NO:")是部分回文序列，其中對(duì)稱性在堿基對(duì)+/-1、 2、 6和7 處被破壞。依據(jù)另一種規(guī)則，+/-8至11位以及+/-3至5位的核苷酸序 列是回文序列。對(duì)稱軸位于-1和+1位堿基對(duì)之間。使用另一種編號(hào)方 式，從5，末端到3，末端，回文序列在1至4位和19至22位，以及7 至9位和14至16位，對(duì)稱性在堿基對(duì)5、 6、 10、 11、 12、 13、 17和 18處凈皮破壞，并且對(duì)稱軸位于11和12位堿基對(duì)之間。
-如本文中使用的，術(shù)語"野生型表示具有序列 SWISSPROT P05725或pdb登記碼lg9y的I-CVeI大范圍核酸酶。
-術(shù)語"識(shí)別位點(diǎn)"、"識(shí)別序列"、"靶標(biāo)"、"靶序列"、"DNA靶標(biāo)"、 "歸巢識(shí)別位點(diǎn)"、"歸巢位點(diǎn)"、"切割位點(diǎn)"均不加區(qū)分地用于表示14 至40bp的雙鏈、回文、非回文或部分回文的大范圍核酸酶識(shí)別并切割 的多核苷酸序列。這些術(shù)語指大范圍核酸酶誘導(dǎo)雙鏈斷裂(切割)的獨(dú) 特DNA位置，優(yōu)選染色體位置。
例如，野生型I-CVd的已知?dú)w巢識(shí)別位點(diǎn)表示為22bp序列 5,-caaaacgtcgtgagacagtttg-3， (SEQ ID NO: 71)或者圖 2A 所示的 24bp 序列
5'-tcaaaacgtcgtgagacagtttgg-3，(》匕處命名為C1234 ， SEQ ID NO: 65; gtc位于
-5至-3位并且gac位于+3至+5位)。此特定位點(diǎn)在之后還被稱為"I-CVd
天然靶位點(diǎn)"。來自于天然靼標(biāo)可以通過在+1、 +2、 +6和+7位或者-1、
-2、 -6和-7位核普酸進(jìn)行突變而得到兩個(gè)回文序列C1221( SEQ ID NO:
12 )和C4334 ( SEQ ID NO: 66)，見圖2A所示。二者均在-5至-3位具
有g(shù)tc，以及在+3至+5位具有g(shù)ac，并且在體外和在酵母中被所切割。
-術(shù)語"變化特異性"涉及能夠切割在相同條件下不被其來源的初 始大范圍核酸酶(骨架蛋白)所切割的歸巢位點(diǎn)的大范圍核酸酶變體；
所述的初始或骨架蛋白可能是野生型大范圍核酸酶或其突變體。
實(shí)際上，當(dāng)在酵母菌林中使用體內(nèi)分析時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)野生型 不僅切割在-5至-3位的回文序列為gtc (與C1234、 C1221或C4334中 一樣)的歸巢位點(diǎn)，而且切割gcc、 gac、 ggc、 atc、 etc和ttc (圖9a )。
所述I-OeI D75N突變體(I-Oel N75)，其也可以用作骨架蛋白，用 于制備具有新特異性的變體，其不僅切割在-5至-3位的回文序列是gtc 的歸巢位點(diǎn)，而且切割所述在-5至-3位的回文序列是gcc、 gtt、 gtg或 gct的歸巢位點(diǎn)(圖8和9a)。
-異源二聚體形式例如可以通過將兩個(gè)單體進(jìn)行融合處理而獲得。
得到的異源二聚大范圍核酸酶能夠切割至少 一 個(gè)不被同源形式切割的 靶位點(diǎn)。因此，當(dāng)大范圍核酸酶變體以異源聚合體形式使用時(shí)仍是本發(fā) 明的一部分。另一種選作形成異源二聚體大范圍核酸酶的單體可以是另 一種變體單體，但是它也可以是野生型單體，例如單體或 單體。
因此，發(fā)明人從骨架蛋白(I-Oel D75N)構(gòu)建了 變 體文庫，其中每一個(gè)在44、 68和/或70位(pdb編碼lg9y )的氨基酸 殘基中呈現(xiàn)出至少一個(gè)突變，并且其中每一個(gè)能夠切割至少一個(gè)不被 骨架蛋白所切割的靶位點(diǎn)。
在這種特定方法中，所述突變由將至少一個(gè)位于44、 68和/或70的 氨基酸殘基替換為另一個(gè)選自包括A、 D、 E、 G、 H、 K、 N、 P、 Q、 R、 S、 T和Y的組中的殘基組成。獨(dú)立于其他殘基改變每個(gè)突變的氨 基酸殘基，并且所選的氨基酸殘基可以相同于或可以不同于44、 68和/ 或70位的其它氨基酸殘基。在該方法中，除了在-5至-3位的三聯(lián)體序 列(對(duì)應(yīng)于式I中R3)和/或在+3至+5位的三聯(lián)體序列(對(duì)應(yīng)于式I中 R'3)與被骨架蛋白切割的歸巢位點(diǎn)中相同位置的三聯(lián)體序列不 同以外，被依據(jù)本發(fā)明的I-CVeI大范圍核酸酶變體切割但不被 骨架蛋白所切割的歸巢位點(diǎn)與前述相同并示例于圖2中。
出乎意料地發(fā)現(xiàn)，通過上述方法可獲得的、即具有"經(jīng)修飾的特異 性"的所述I-Oe大范圍核酸酶變體能夠切割至少一個(gè)與-5至-3位和/ 或+3至+5位I-Orl骨架蛋白靶標(biāo)不同的靶標(biāo)。必須注意的是所述DNA 靶標(biāo)在+/-3至5位不必然是回文序列。同源二聚體形式的I-CVd有活性， 但是異源二聚體形式也可能有活性。因此，依據(jù)本發(fā)明的I-CVd變體不 僅以同源二聚體形式、而且以異源二聚體形式、以及在兩種情況下均可 以是有活性的，它們可以識(shí)別在+/-3至5位具有回文或非回文序列的靶 標(biāo)，前提是當(dāng)I-OdN75蛋白用作骨架蛋白時(shí)，在-5至-3位和/或+3至 十5位的三聯(lián)體分別不同于gtc、 gcc、 gtg、 gtt和gct、以及不同于gac、 ggc、 cac、 aac和agc。因?yàn)镮-CVt'I變體的每個(gè)單體結(jié)合歸巢位點(diǎn)的一 半，所以能夠切割多種靶標(biāo)的變體也可以切割在+/-3至5位序列不是回 文序列的靼標(biāo)。另外，變體以同源二聚體形式和異源二聚體形式都可以 工作。I-CVd變體可以形成異源二聚體大范圍核酸酶，其中另一種變體 可以是野生型I-Oel單體、另一種野生型大范圍核酸酶單體如I-D附oI, 另一種1-C"'1變體單體，或者非I-CVd之外另一種大范圍核酸酶的變體 的單體。
依據(jù)所述方法的一個(gè)有利的實(shí)施方案，由步驟(b)獲得的 大范圍核酸酶變體選自
A44/A68/A70， A44/A68/G70， A44/A68/H70， A44/A68/K70， A44/A68/N70，
A44/A68/Q70,A44/A68/R70,A44/A68/S70,A44/A68/T70,A44/D68/H70,
A44/D68/K70,A44/D68/R70,A44/G68/H70,A44/G68/K70,A44/G68/N70,
A44/G68/P70,A44/G68/R70,A44/H68/A70,A44/H68/G70,A44/H68/H70,
A44/H68/K70，A44/H68/N70,A44/H68/Q70,A44/H68/R70，A44/H68/S70,
A44/H68/T70,A44/K68/A70,A44/K68/G70,A44/K68/H70，A44/K68/K70，
A44/K68/N70，A44/K68/Q70，A44/K68/R70,A44/K68/S70,A44/K68/T70，
A4頓68/A70,A4標(biāo)68/E70,A44/N68/G70，A4頓68/H70，A44/N68/K70,
A44/N68/N70,A44/N68/Q70,A44/N68/R70,A44/N68/S70,A44/N68/T70,
A44/Q68/A70,A44/Q68/D70'A44/Q68/G70，A44/Q6菌0，A44/Q68/N70，
A44/Q68/R70，A44/Q68/S70,A44/R68/A70，A44/R68/D70,A44/R68/E70，
A44/R68/G70，A44/R68/H70，A44/R68/K70,A44/R68/L70,A44/R6謝70,
A44/R68/R70,A44/R68/S70，A44/R68/T70，A44/S68/A70,A44/S68/G70,
A44/S68/K70，A44/S6,70，A德68/Q70,A44/S68/R70,A44/S68/S70， A44/S68/T70，
A術(shù)6謝70，
D44/D68/H70,
D4德8/Q70，
E4傷8/A70，
E44/S68/T70,
G44/T68/D70,
H44/R68/A70,
H44麵/R70,
H4德8/T70，
K44/A68/E70,
K44/A68/S70，
K44/E68/N70，
K44/G68/S70,
K44服8/N70，
K44/K68/H70,
K44/N68/G70，
K44/N68/T70，
K44/Q68/S70,
K44/R68/G70，
K44/R68/T70,
K44/S68/S70，
K44腦/G70，
K44/T68/T70,
N44/K68/G70,
蒸歸/D70,
N44/R68/E70,
N44/R68/R70，
N44/S68/K70,
N44/T68/R70,
Q44/A68/H70:
Q44/N68/A70:
A44/T68/A70, A44/T68/Q70, D44/N68/S70, D44/R68/R70, E44/R68/H70， G44/H68/K70， G44/T68/P70, H44/R68/D70， H44/R68/S70, H44腦/S70, K44/A68/G70, K44/A68/T70, K44/E68/S70, K44/G68/T70， K44服8/S70, K44/K68/T70, K4頓68/H70, K44/P68/H70, K44/Q68/T70， K44/R68/H70， K44/S68/A70, K德68/T70， K44/T68/H70, N44/A68/H70, N44/K68/H70, 簡(jiǎn)/Q68/H70， N44/R68/G70, N44/R68/S70， N44/S68/R70， N44/T68/S70, Q44/A68/R70， Q44/N68/H70:
A44/T68/G70, A44/T68/R70, D44/R68歸， D44麵/S70, E44/R6薩0， G44/Q68/H70, G44腦/R70， H44/R6脂0， H4概8/T70， H44簡(jiǎn)/T70， K44/A68/H70， K44/D68/A70, K44/G68/A70， K44/H68/D70， K44/H68/T70， K4頓68/A70,
K44/Q68/A70， K44/R68/A70， K44/R68/N70, K44/S68/D70, K44簡(jiǎn)/A70， K44/T68/N70, N44/A6脂0， 腿/K68/R70, N44/Q68/R70, N44/R68/H70， N44/R68/T70， N44腦/H70， P4頓68/D70， Q44/G68/K70, Q44/N68/S70:
A44/T68/H70, A44腦/S70, D44/R68/K70， D44/R68/T70， E4傷8/S70， G44/R68/Q70, H4德8/S70， H44/R68/G70, H4楊8/G70, K44/A68/A70, K44/A68/N70， K44/D68/T70, K44/G68/G70, K44/H6衡0， K4復(fù)68/A70， K44/N68/D70, K44/N68/Q70: K44/Q68/D70, K44/R68/D70， K44雌/Q70， K44/S68/H70, K44/T68/D70, K44腕/Q70: N44/H68/N70, N44/K68/S70, 麗鐘/A70， N44/R68/K70， N44/S68/G70, N44/T68/K70, P44/T68/T70, Q44/G68/R70, Q4秦8/P70,
A44脂/K70, A44/T68/T70， D德6,70， E44/H68/H70, E44/R68/T70， G44/R6,0, H44/A68/T70， H44/R68/N70， H44/S68/S70, K44/A68/D70， K44/A68/Q70， K44/E68/G70， K44/G68/N70, K44服8/G70, K44/K68/D70, K44扁8/E70， K44/N68/S70， K44/Q68/E70， K44/R6S/E70, K44/R68/S70, K44脂/N70， K44/T68/E70, K44/T68/S70, N44/H68/R70, N44/N6面0, N44麵歸: N44/R68/N70: N44/S68/H70: N44腕/Q70: Q44/A68/A70: Q44/K6S/G70: Q44/Q68/G70,Q44/R68/A70，Q44/R68/D70,Q44/R68/E70,Q44/R68/G70，Q4德8/H70,
Q44細(xì)/N70,Q44鍵/Q70,Q44艦/S70,Q44/S68/H70,Q44/S瞎70,
Q4德8/S70,Q44/T68/A70，Q44聰/G70，Q44/T68/H70,Q44腕/R70，
R德68/G70,R德68/T70,歸G68/T70，R4德8/D70，R44服8/T70,
R44/N68/T70，R44/R68/A70,R4概謹(jǐn)0，R4德脂0，R44腕/G70，
R44/R6謝70,R44/R68/Q70,R44/R6S/S70，R4概8/T70，R44纖/G70,
R44/S68/N70,R44/S68/S70,R44/S瞎70，S44/D68/K70，S44/H68/R70,
S機(jī)68/G70，S44鍵/N70,S德鍾70,S44/R68/S7"T德68/K70,
T44/A68/R70，T44/H68/R70,T44/K68/R70,T44/N68脂，T44/N68/R70,
丁44/Q68/K70，T44/Q68/R70,T44/R68/A70，T4極8/D70,T44/R68/E70,
T44雄/G70，T44/R68/H70,T44麵/K70，T44/R68/N70，T44/R68/Q70，
T4傷8/R70,T44/R68/S70,T44雄/T70，T44/S68/K70，T4橋8/RJ0，
T44脂/K70,和丁44/T68織
依據(jù)所述方法的另一個(gè)有利的實(shí)施方案，選擇所述I-CreI大范圍核 酸酶變體的步驟(b)在酵母細(xì)胞中活體內(nèi)進(jìn)行。
本發(fā)明的主題還有本文如上定義、即通過如上所述方法可獲得的 大范圍核酸酶變體，在體外或體內(nèi)為非治療性目的，用于切割包 含至少20-2化p部分回文序列的雙鏈核酸靶標(biāo)的用途，其中在+/-8至11 位的序列至少為回文序列，并且在-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體和/或在+3 至+5位的核苷酸三聯(lián)體分別不同于gtc、 gcc、 gtg、 gtt和gct、以及不 同于gac、 ggc、 cac、 aac和agc。式I描述了這樣的DNA乾標(biāo)。
依據(jù)所述用途的一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述l-C"4大范圍核酸酶變 體選自A44/A68/A70，
A44/A68/G70, A44/A68/H70,
A44/A68/R70， A44/A68/S70，
A44/D68/R70, A44/G68/H70,
A44/G68/R70, A44/H68/A70,
A44/H68/N70， A44/H68/Q70:
A44/K68/A70, A44/K68/G70:
A44/A68/K70, A44/A68/T70， A44/G68/K70, A44鵬8/G70, A4柳68/R70: A44/K68/H70，
A44/A6蘭0' A44/D68/H70， A44/G6隨70: A44鵬8/H70, A4柳68/S70: A44/K68/K70.
A44/A68/Q70, A44/D68/K70: A44/G68/P70: A44/H68/K70: A44/H68/T70: A44/K68/N70:
A44/K68/Q70,A44/K纖70,A44/K68/S70,A44/K68/T70,A44/N68/A70,
A44/N68/E70,A4傷8/G70,A44/N68/H70，A4頓68/K70,A4頓6薩0，
A44麵/Q70,A44/N68/R70，A44繊/S70，A44/N68/T70,A44/Q68/A70,
A44/Q68/D70,A44/Q68/G70,A44/Q68/H70，A44/Q68/N70，A44/Q68/R70,
A44/Q68/S70，A44/R68/A70，A44/R68/D70,A44yR68/E70,A44麵/G70,
A44/R68/H70,A44/R68/K70，A44/R68/L70，A44/R6,70,A44雌/R70,
A44/R68/S70,A44/R68/T70,A44/S68/A70,A44/S68/G70，A44/S68/K70,
A44/S68/N70,A4德8/Q70，A4德8/R70，A44/S68/S70，A44/S68/T70,
A44/T68/A70，A44/T68/G70,A44脂/H70,A44/T68/K70,A44/T68/N70,
A44/T68/Q70,A4頻8/R70，A44/T68/S70，A44腦/T70,D44/D68/H70,
D44/N68/S70，D44/R68/A70,D44/R68/K70,D44/R6謝70，D44腦/Q70,
D44/R68/R70,諸/R68/S70，D44/R68/T70,E44/H68/H70,E44/R68/A70，
E44/R68/H70,E44/R68/N70,E44/R68/S70,E44/R68/T70,E44/S68/T70,
G44/H68/K70,G44/Q68/H70,G44/R68/Q70,G44/R68/R70,G44/T68/D70,
G44/T68/P70,G44/T68/R70，H44/A68/S70，H44/A68/T70，H44/R68/A70，
H44/R68/D70，H44/R68/E70,H44/R68/G70，H44/R68/N70，H44/R68/R70，
H44/R68/S70,H44/R68/T70，H44/S68/G70,H4德8/S70,H44細(xì)/T70,
H44/德/S70，H44/T68/T70，K44/A68/A70，K44/A68/D70，K44/A68/E70,
K44/A68/G70,K44/A68/H70,K44/A6謹(jǐn)70，K44/A68/Q70,K44/A68/S70,
K44/A68/T70,K44/D68/A70,K44/D68/T70,K44/E68/G70，K44/E68/N70，
K44/E68/S70,K44/G68/A70,K44/G68/G70，K44/G68/N70,K44/G68/S70,
K44/G68/T70,K44/H68/D70,K44/H68/E70,K44/H68/G70,K44服8/N70,
K44服8/S70,K44/H68/T70,K44/K68/A70,K44/K68/D70,K44/K68/H70,
KL44/K68/T70,K44/N68/A70，K44/N68/D70，K44/N68/E70，K44/N68/G70,
K4頓68/H70,K44/N6畫70,BC4頓68/Q70，K44扁8/S70，K4傷8/T70,
K44纖/H70，K44/Q68/A70，K44/Q68/D70，K44/Q6脂0，K44/Q68/S70,
K44/Q68/T70，K44/R68/A70，K44細(xì)/D70,K44/R68/E70，K44/R68/G70，
K44/R68/H70,K44/R68/N70，K44/R68/Q70，K44/R68/S70，K44/R68/T70,
K44/S68/A70，K44/S68/D70,K44雄/H70，K44/S68緒0，K44/S68/S70，
K44/S68/T70，K44/T68/A70,K44腦/D70,K44/T68/E70,K44腦/G70,
K44/T68/H70,K44腦/N70，K44/T68/Q70,K44/T68/S70，K44/T68/T70,
N44/A68/H70，N44/A68/R70,N44/H6謹(jǐn)0，N44/H68/R70,麗/K68/G70,
N44/K68/H70,N44/K6脂0，N44/K68/S70,N4頓68/R70,N44/P68/D70，
N44/Q68/H70,N44/Q68/R70，N44/R68/A70，畫/R68/D70,蒸/R6窗0，
N4概8/G70,N祖68/H70,N44雄/K70,N44雄/N70,N44/R68/R70,
N44/R68/S70,N44/R68/T70,N44/S68/G70,N44/S68/H70，N4楊8/K70,
N44/S68/R70,N44/T68/H70,藤/T68/K70，N44/T68/Q70，N44/T6簡(jiǎn)0，
N44/T68/S70,P4柳68/D70，P44/T68/T70,Q44/A68/A70,Q44/A鐘70，
Q44/A68/R70,Q44/G68/K70,Q44/G68/R70,Q44/K68/G70,Q44/N68歸，
Q4頓68/H70,Q44/N68/S70,Q44歸/P70， /G70,Q44/R68/A70，
Q44麵/D70,Q44/R68/E70,Q44/R68/G70,Q44麵/H70,Q44/R68/N70,
Q4懇8/Q70，Q44/R68/S70,Q44/S68/H70，Q44/S68/R70,Q44/S68/S70,
Q44簡(jiǎn)/A70,Q44/T68/G70,Q44/T68/H70,Q44/T68/R70,R44/A68/G70,
R44/A68/T70，R44/G68/T70，R44/H68/D70,R44/H68/T70,R44/N68/T70,
R44腦/A70，R44/R68/D70,諸/R68/E70，R44/R68/G70,R44/R68/N70，
R44/R68/Q70,R44/R68/S70,R44/R68/T70,R44/S68/G70,R44/S68/N70,
R44/S68/S70,R44/S68/T70,S44/D68/K70，S44/H6S/R70,S44/R68/G70，
S44/R68/N70，S44/R68/R70，S44編/S70,T44/A68/K70，雨A68/R70,
T44/H68/R70,T44/K68/R70,T4頓68/P70,T44麵8/R70,T44/Q68/K70,
T44/Q68/R70，T44/R68/A70，T44/R68/D70，T44/R68/E70，T44/R68/G70,
T4德8/H70，T44/R68/K70,T44細(xì)/N70,T44/R68/Q70,T44/R敏70,
T44/R68/S70, T44/R68/T70, T44/S68/K70， T44/S68/R70， T44/T68/K70, 和 T44/T68/R70.
依據(jù)所述用途的另一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述I-CVd大范圍核酸酶 變體是同源二聚體。
依據(jù)所述用途的另一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述I-Od大范圍核酸酶 變體是異源二聚體。
所述異源二聚體可以是由本發(fā)明中定義的兩種不同I-Odt變體融合 或者I-Od骨架蛋白與本發(fā)明中定義的I-O^I變體融合而組成的單鏈嵌
合分子?；蛘?，所述異源二聚體可以由選自本發(fā)明中定義的兩種不同
1-C"'I變體或l-Ox'I骨架蛋白以及本發(fā)明中定義的變體的兩種分
離單體組成。
依據(jù)所述用途-或者所述I誦Od大范圍核酸酶變體能夠切割在其+/-3至5位序列 為回文序列的DNA靼標(biāo)，
-或者所述大范圍核酸酶變體能夠切割在其+/-3至5位序列 為非回文序列的DNA靼標(biāo)，
依據(jù)所述用途的另一個(gè)有利的實(shí)施方案，被切割的核酸靶標(biāo)是在-11 至-8位和+8至+11位的回文序列分別為caaa和tttg的DNA耙標(biāo)。
依據(jù)所述用途的另一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述的大范圍核酸 酶變體還包含75位的突變，優(yōu)選地為不帶電荷的氨基酸突變，更優(yōu)選 地為天冬酰胺或纈氨酸(D75N或D75V )。
依據(jù)所述用途的另一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述的大范圍核酸 酶變體在44位具有丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)，用于切割在-4位包 含核苷酸a和/或在+4位包含t的DNA乾標(biāo)。
依據(jù)所述用途的另一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述的大范圍核酸 酶變體在44位具有谷胺酰胺(Q)，用于切割在-4位包含核苷酸t(yī)和/ 或在+4位包含a的DNA靼標(biāo)。
依據(jù)所述用途的另一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述的大范圍核酸 酶變體在44位具有賴氨酸(K),用于切割在-4位包含核苷酸c和/或在 十4位包含g的耙標(biāo)。
本發(fā)明的主題還有大范圍核酸酶變體
-通過以上定義的制備方法可以獲得；
-在l-Od的44、 68和70位中至少一個(gè)氨基酸殘基處具有一個(gè)突 變；所述的突變可以是在與DNA靶標(biāo)直接接觸的氨基酸中僅有 的一個(gè)；并且
-在±3至5位具有經(jīng)修飾的切割特異性。
這種新的l-CVd大范圍核酸酶可以作為體外消化中非常特異的內(nèi)切 核酸酶用于限制性酶切或作圖，或者在體內(nèi)或者離體用作基因組工程的 工具。另外，每種可以作為新的骨架用于第二輪的突變和選擇/篩選, 目的是制備新的、第二代歸巢核酸內(nèi)切酶。
依據(jù)本發(fā)明的大范圍核酸酶僅在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的44、 68 和/或70位進(jìn)行突變。然而，本發(fā)明還包括能夠形成異源二聚體的不同 蛋白質(zhì)來自以上列表兩種不同蛋白質(zhì)的異二聚化還導(dǎo)致非回文序列的 切割，這種非回文序列由來自被親本蛋白單獨(dú)切割之位點(diǎn)的兩半構(gòu)成。 這可以通過體外在反應(yīng)緩沖液中加入兩種不同的pod變體而獲得，以
及體內(nèi)或離體過表達(dá)而獲得。另一種可能性是構(gòu)建如Epinat W /, (Epinat ""/ ， 2003)所述的單鏈分子。該單鏈分子是兩種不同 變體的融合體，并且還應(yīng)該導(dǎo)致嵌合的非回文序列的切割。
依據(jù)所迷I-OeI大范圍核酸酶變體的一個(gè)有利的實(shí)施方案，選用于 替換44、 68和/或70位氨基酸的氨基酸殘基選自包含A、 D、 E、 G、 H、 K、 N、 P、 Q、 R、 S、 T和Y的組。
依據(jù)另一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述的I-Oel大范圍核酸酶變體選自
A44/A68/A70，
A44/A68/G70,A44/A68/H70,A44/A68/K70,A44/A6,70，A44/A68/Q70，
A44/A68/S70,A44/A68/T70，A44細(xì)/H70,A44/D68/K70，A44/D68/R70,
A44/G68/H70，A44/G68/K70，A44/G68/N70,A44/G68/P70,A44/H68/A70,
A44/H68/G70,A44/H68/H70，A44/H68/K70,A44/H68/N70,A44服8/Q70，
A44/H68/S70，A44/H68/T70,A44/K68/A70,A44/K68/G70，A44/K6,0,
A44/K6,70,A44/K68/Q70，A概6,0,A44/K68/S70,A44/脇/T70,
A4頓68/A70,A44/N6脂0，A44/N68/G70,A44/N68/H70，A4頓68/K70，
A44/N68/N70,A44扁8/Q70，A44/N6衡0，A4頓68/S70，A4頓68/T70,
A44/Q68/A70,A44/Q6隨0，A44/Q68/G70,A44/Q68/H70,A44/Q6謝70,
A44/Q68/S70,A44/R68/E70,A44/R68/K70,A44/R68/L70,A4楊歸0，
A44/S68/G70,A44/S68/N70，A44/S68/Q70,A44/S68/R70,A44/S68/S70,
A44/S68/T70,A44簡(jiǎn)/A70，A44腦/G70,A44/T68/H70,A44/T6,70,
A44/T68/Q70,A44/T68/S70,A44/T68/T70,D44/D68/H70，D44/N68/S70,
D44/R68/A70,D44/R6歸0，D44/R68/Q70,D44/R68/R70,D44麵/S70,
D44雌/T70，E44/H68/H70,E44細(xì)/A70,E44/R68/H70,E4德8/N70,
E4德8/S70,E44纖/T70,E44/S68/T70,G4娜8/K70,G44/Q68/H70,
G44麵/Q70,G44/T6瞎0，G44脂7P70,G44/T68/R70,H44/A68/S70，
H4德8/T70，H植6薩0，H44/R68/E70,H44/R68/G70,H44/R68/N70,
H44/R68/R70，H44/R68/S70，H術(shù)68/G70，H44/S68/S70，H44/S68/T70，
H44/麗S70，H44/T68/T70,K44歸/A70,K44/A68/D70，K44/A68/￡70，
K44/A68/G70,K44/A68/H70，K4德薩0，K44/A68/Q70，K44/歸A70，
K44/D68/T70，K44/E68/G70,K44/E68/S70，K44/G68/A70,K44/G68/G70，
K44/G68/N70，K44/G68/S70,K44/G68/T70，K44/H68/D70,K44/H6,0，
K4德8/G70,K44/H6歸0，K額68/S70，K44/H68/T70，K44/K68/A70,
K4復(fù)68/D70，K44/K68/H70，K44/K68/T70,K4頓68/A70,K44/N68/D70,
K44/N68/E70，K44/N68/G70,K44/N68/H70,K44/N68/N70，K4頓68/Q70，
K44麵8/S70，K44/N68/T70,K44/P68/H70,K44/Q68/A70,K44/Q68/D70，
K44/Q68/E70，K44/Q68/S70,K44/Q68/T70，K44/R68/A70,K44麵/D70,
K44/R68/E70,K44/R68/G70,K44/R68/H70,K44/R6,70,K44麵/S70，
K4條8/A70,K44/S68/D70,K4德8/H70,K44/S6S/N70,K44/S68/S70，
K44/S68/T70,K44/T68/A70,K44/T6S/D70,K44/T68/E70,K44/T68/G70,
K44/T68/H70,K44脂/N70，K44腦/Q70,K44/T68/S70,K44脂/T70，
N44/A68/H70,N44/H68/N70，N44/H68/R70,N44/K68/G70,N44/K68/H70,
建/K68/R70,N44/K68/S70，菌扁/D70，簡(jiǎn),/H70,N44/R68/A70，
N4德8/D70，N44/R68/E70，N44/R68/K70，N44/S68/G70,N44/S68/H70,
N44雄/K70,N44/S68/R70,頻頭/H70，N44/T68/K70,N44/T68/Q70,
N44/T68/S70,P44感8/D70,P44/T68/T70,Q44/G68/K70,Q44/G68/R70,
Q44/K68/G70,Q44/N68/A70，'Q44顏/H70，Q44/N68/S70,Q44/P6諮0，
Q44/Q68/G70,Q44/R6S/D70，Q44/R68/E70,Q44/R68/G70,Q機(jī)68/Q70,
Q44細(xì)/S70,Q44/T68/A70,Q44腦/G70,Q44/T68/H70，R44/A68/G70,
R44/A68/T70，R44/G68/T70,R44服,0,R44/H68/T70，R44/N68/T70,
R44/R68/A70,R44/R68/D70，R44/R68/E70,R44/R68/G70,R44/R68/Q70,
R44/R68/S70，R44/R68/T70,R4楊8/G70,R44/S6S/N70，R44/S68/S70,
R44/S68/T70,S44/D68/K70,S44/R6節(jié)0，S44/R68/S70,T44/A68/K70，
T44/N68/P70， T44/N68/R70, T44/R68/E70， T44/R68/Q70:和T44/S68/K70;戶斤述j.Oel大'范
圍核酸酶變體能夠切割至少一個(gè)如前定義的不祐:N75骨架蛋白 所切割的靼標(biāo)。
依據(jù)另一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述大范圍核酸酶變體在44 位具有丙氨酸(A)或天冬酰胺(N),并切割在-4位包含核苷酸a和/ 或在+4位包含t的乾標(biāo)，但排除國(guó)際PCT申請(qǐng)WO 2004/067736的表4 和表5中所示的變體，優(yōu)選所述變體具有丙氨酸或天冬酰胺。
依據(jù)另一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述I-CVdt大范圍核酸酶變體在44 位具有谷胺酰胺(Q)并切割在-4位包含核苷酸t(yī)和/或在+4位包含a 的靶標(biāo)，但排除國(guó)際PCT申請(qǐng)WO 2004/067736的表3、表4和表5中 所示的變體。
依據(jù)另一個(gè)有利的實(shí)施方案，本發(fā)明的大范圍核酸酶變體在 44位具有賴氨酸(K)，并切割在-4位包含核苷酸c和/或在+4位包含g 的靶標(biāo)，但排除國(guó)際PCT申請(qǐng)WO 2004/067736的表5中所示的變體。
如前所具體描述的，在本應(yīng)用申請(qǐng)中大范圍核酸酶變體的定 義范圍內(nèi)，所述I-OeI大范圍核酸酶變體可以是同源二聚體或異源二聚 夠切割回文或非回文DNA靼標(biāo)。它還可以包含75位突變， 如前面所具體描述的。
本發(fā)明的主題也是多核苷酸，其特征在于它編碼依據(jù)本發(fā)明的 大范圍核酸酶變體。
另外，本發(fā)明的主題也是包含所述多核苷酸和調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子的 表達(dá)盒，以及包含所述表達(dá)盒的表達(dá)栽體。當(dāng)所述變體是由兩個(gè)不同單 體組成的異源二聚體時(shí)，每個(gè)單體可以從單一載體(雙重表達(dá)載體)或 從兩個(gè)不同栽體中表達(dá)。
本發(fā)明的主題也是如前所述的進(jìn)一步包含靶向DNA構(gòu)建體的表達(dá) 載體。
術(shù)語"栽體"指能夠運(yùn)送與其連接的另一核酸的核酸分子。優(yōu)選的 載體類型之一為附加體，即能夠在染色體外復(fù)制的核酸。優(yōu)選的載體能 夠自主復(fù)制和/或表達(dá)與其連接的核酸。能夠指導(dǎo)與其操作性連接的基 因表達(dá)的栽體在本文稱為"表達(dá)栽體"。依據(jù)本發(fā)明的栽體包含但不限 于，YAC(酵母人工染色體)、BAC(細(xì)菌人工染色體)、桿狀病毒載體、 噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒載體、質(zhì)粒、RNA栽體或者線性或環(huán)狀 DNA或RNA分子，其可以由染色體的、非染色體的、半合成的或合成的DNA組成。通常，用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)載體常常是"質(zhì)粒"形 式，其通常表示其載體形式不與染色體結(jié)合的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。大量 的合適載體已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知并且有市售，比如以下細(xì)菌載體
pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen)， pbs, pDIO， phagescript， psiX174. pbluescript SK， pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a， pKK223-3， pKK233-3， pDR540, pRJT5 (Pharmacia); pWLNEO,pSV2CAT, pOG44， pXTI， pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV， pMSG, pSVL (Pharmacia); pQE-30 (Q〗Aexpress)， pET
(Novagen )。
病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、細(xì)小病毒(例如，腺伴隨病毒)、 冠狀病毒、負(fù)鏈RNA病毒如正黏病毒(例如，流感病毒)、彈狀病毒(例 如，狂犬病和皰滲性口炎病毒)、副黏病毒(例如，麻滲和仙臺(tái))、正鏈 RNA病毒如小RNA病毒和甲病毒、以及雙鏈DNA病毒包括腺病毒、 皰滲病毒(例如，1型和2型單純皰瘆病毒、Epstein-Barr病毒、巨細(xì) 胞病毒)和痘病毒(例如，痘苗、禽痘和金絲雀痘)。其它病毒包括， 例如，Norwalk病毒、披膜病毒、黃熱病毒、呼腸孤病毒、乳多空病毒、 嗜肝DNA病毒以及肝炎病毒。
載體可以包含選擇標(biāo)記，例如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的新霉素磷酸轉(zhuǎn) 移酶、組氨醇脫氫酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、單純皰疹 病毒胸苷激酶、腺苷脫氨酶、谷胺酰胺合成酶、和次黃嘌呤鳥噤呤磷酸 核糖基轉(zhuǎn)移酶；用于釀酒酵母(51. c^MWs/fle)的TRP1;大腸桿菌中的 四環(huán)素、利福平或氨節(jié)青霉素抗性。
優(yōu)選地所述載體為表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明多肽的序列被置于適 當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的控制之下，從而允許所述多肽的產(chǎn)生或合 成。因此，所述多核苷酸包含在表達(dá)盒中。更具體地，所述載體包含復(fù) 制起點(diǎn)、與所述編碼多核苷酸操作性連接的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、 RNA剪接位點(diǎn)(當(dāng)使用基因組DNA時(shí))、多聚腺苷化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止 位點(diǎn)。它還可以包含增強(qiáng)子。啟動(dòng)子的選擇將依賴于在其中表達(dá)多肽的 細(xì)胞。
依據(jù)所述表達(dá)栽體的一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述靶向DNA構(gòu)建體 包含與本發(fā)明l-Crel大范圍核酸酶變體的切割位點(diǎn)附近區(qū)域具有同源
性的序列。
依據(jù)所述表達(dá)載體的另一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述靶向DNA構(gòu)建 體包含
a )與依據(jù)要求保護(hù)的大范圍核酸酶變體的切割位點(diǎn)附近區(qū) 域具有同源性的序列，以及
b)其側(cè)翼為a)中序列的待引入序列。
本發(fā)明的主題還是細(xì)胞，其特征在于它被如前定義的多核苷酸或被 如前定義的載體修飾。
本發(fā)明的主題還是轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于它包含如前定義的多核 苷酸，或如前定義的載體。
本發(fā)明的主題還是非人的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于它包含如前 定義的多核苷酸或如前定義的載體。
編碼如本發(fā)明所定義多狀的多 員已知的任何方法來制備。例如，它們利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用特異性 引物從cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。優(yōu)選地，選擇所述cDNA的密碼子以有利 于所述蛋白質(zhì)在期望表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。
包含所述多核苷酸的重組載體可以通過眾所周知的重組DNA和遺 傳工程技術(shù)而獲得并引入到宿主細(xì)胞中。
本發(fā)明的異源二聚體大范圍核酸酶通過表達(dá)兩種如前定義的多肽 而產(chǎn)生；優(yōu)選地所述多肽在適于所述多肽共表達(dá)的條件下在宿主細(xì)胞中 共表達(dá)，所述宿主細(xì)胞被兩種表達(dá)載體^務(wù)飾，其中每種表達(dá)栽體包含編 碼如前定義不同多肽的多核苷酸片段，或者所述宿主細(xì)胞被包含如前定 義兩種多核苷酸片段的雙重表達(dá)載體修飾，并且從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回 收所述異源二聚體大范圍核酸酶。
本發(fā)明的主題還有如前定義的大范圍核酸酶變體、 一種或兩 種多核苷酸(優(yōu)選都包括在一個(gè)表達(dá)載體中(雙重表達(dá)栽體)或分別包 括在不同表達(dá)載體中)、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物、非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物在分 子生物學(xué)、體內(nèi)或體外遺傳工程以及體內(nèi)或體外基因組工程中用于非治 療性目的的用途。
非治療性目的包括例如(i)在包裝細(xì)胞系中進(jìn)行特異基因座位的基 因打靶，用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)，(ii)在農(nóng)作物植物中進(jìn)行特異基因座位的基
因打耙，用于品系改良和代謝工程，(m)乾向重組，用于去除遺傳修
飾農(nóng)作物中的標(biāo)記物，(iv)靶向重組，用于去除遺傳修飾微生物菌林
中的標(biāo)記物(例如用于抗生素生產(chǎn))。
依據(jù)所述用途的一個(gè)有利的實(shí)施方案，它用于在包含DNA靶序列 的目的位點(diǎn)引入雙鏈斷裂，從而誘導(dǎo)DNA重組事件，DNA丟失或細(xì)胞 死亡。
依據(jù)本發(fā)明，所述雙鏈斷裂用于修復(fù)特定序列，修飾特定序列， 恢復(fù)突變基因位置處的功能基因，削弱或激活目的內(nèi)源基因，在目的位 點(diǎn)引入突變，引入外源基因或其一部分，失活或刪除內(nèi)源基因或其一部 分，使染色體臂易位或者使DNA不祐J務(wù)復(fù)以及降解。
依據(jù)所述用途的另 一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述I-CVeI大范圍核酸酶、 多核苷酸、載體、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物或非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物與如前定 義的耙向DNA構(gòu)建物相結(jié)合。
本發(fā)明的主題還是遺傳工程方法，其特征在于它包括以下步驟在 位于載體上的目的位點(diǎn)斷裂雙鏈核酸，所述載體包含如前定義的I-CVd 大范圍核酸酶變體的DNA靶標(biāo)，這是通過將所述載體與如前定義的 大范圍核酸酶變體接觸，從而謙導(dǎo)與表現(xiàn)出與所述I-Q^1大范圍 核酸酶變體切割位點(diǎn)附近序列具有同源性的另 一種載體的同源重組。
本發(fā)明的主題還有基因組工程的方法，其特征在于它包括以下步 驟1)通過將所述切割位點(diǎn)與所述I-CVeI大范圍核酸酶變體接觸，從 而雙鏈斷裂基因組基因座位，該基因座位包含如前定義的大范圍 核酸酶變體的至少一個(gè)識(shí)別和切割位點(diǎn)；2)在適于與靶向DNA構(gòu)建體 同源重組的條件下維持所述斷裂基因組基因座位，所述靶向DNA構(gòu)建 體包含待引入所述基因座位的序列，該基因座側(cè)翼為有與靶基因座位具 有同源性的序列。
本發(fā)明的主題還是基因組工程的方法，其特征在于它包含以下步 驟1)通過將所述切割位點(diǎn)與所述I-CVeI大范圍核酸酶變體接觸，雙 鏈斷裂基因組基因座位，該基因座位包含如前定義的大范圍核酸 酶變體的至少一個(gè)識(shí)別和切割位點(diǎn)；2)在適于與染色體DNA同源重 組的條件下維持所述斷裂基因組基因座位，所述染色體DNA與切割位 點(diǎn)附近區(qū)域具有同源性。
本發(fā)明的主題還是組合物，其特征在于它包含至少一種如前定義的 大范圍核酸酶變體、多核苷酸或載體。
在所述組合物的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，它包含靶向DNA構(gòu)建體， 該靶向DNA構(gòu)建體包含修復(fù)目的位點(diǎn)的序列，所述目的位點(diǎn)側(cè)翼是與 靶基因座位具有同源性的序列。
本發(fā)明的主題還是至少一種如前定義的大范圍核酸酶變體、 多核苷酸或載體用于制備藥物的用途，所述藥物用于預(yù)防、改善或治療 有此需要的個(gè)體中的遺傳性疾病，所述藥物通過任意方式施用給所述個(gè) 體。
本發(fā)明的主題還是至少一種如前定義的大范圍核酸酶變體、 多核苷酸或載體用于制備藥物的用途，所述藥物用于預(yù)防、改善或治療 有此需要的個(gè)體中由提呈DNA中間體的傳染因子引起的疾病，所述藥 物通過任意方式施用給所述個(gè)體。
本發(fā)明的主題還是至少一種如前定義的I-CVd大范圍核酸酶變體、 多核苷酸或載體的用途，體外用于在生物來源產(chǎn)品或者意在生物應(yīng)用的 產(chǎn)品中抑制增殖、失活或消除提呈DNA中間體的傳染因子，或者用于 消毒目標(biāo)對(duì)象。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述傳染因子為病毒。
除了前述的特征，本發(fā)明還包含從以下說明以及附圖中得出的其它 特征，說明書包括舉例說明本發(fā)明的I-CVel大范圍核酸酶變體及其應(yīng)用 的實(shí)施例，其中附圖中
-

圖1舉例說明試驗(yàn)的基本原理。(a)與其DNA靶標(biāo)結(jié)合的1-C"4 的結(jié)構(gòu)。(b)顯示選用于隨機(jī)化的殘基44、 68、 70以及D75與相互作 用堿基對(duì)的結(jié)構(gòu)的放大。(c)文庫和靶標(biāo)的設(shè)計(jì)。標(biāo)明了 I-Od的殘基 Q44、 R68和R70與DNA耙標(biāo)的相互作用(上方)。與所述DNA耙標(biāo)
直接或間接相互作用的其它氨基酸殘基未示出。1-C"'I單體的44位精 氨酸殘基(R)與靶序列的-5位鳥嘌呤直接相互作用，而44位谷氨酰 胺(Q)殘基和70位精氨酸(R)殘基分別與互補(bǔ)鏈的+4位腺嘌呤和 +3位鳥嘌呤直接相互作用。本文所描述的耙標(biāo)(C1221, SEQ ID NO: 12 ) 是源自I-Od天然乾標(biāo)(C1234, SEQ ID NO:65 )的回文序列，并被I-OeI 所切割(Chevalier et al.， 2003,預(yù)先引用)。切割位置用箭頭注明。在 文庫中，殘基44、 68和70用ADEGHKNPQRST替換。因?yàn)镮-Od是 同源二聚體，所以所述文庫用回文耙標(biāo)進(jìn)行篩選。產(chǎn)生了 64個(gè)源自±3、
±4和±5位替換的回文乾標(biāo)。顯示了這些把標(biāo)的一些實(shí)例(下方；SEQ ID NO: 1至7)。
-圖2舉例說明研究中4吏用的耙標(biāo)。A.兩個(gè)源自天然I-Oel耙標(biāo) (本文稱為C1234, SEQ ID NO:65 )的回文耙標(biāo)。所述I-Od天然靶標(biāo) 含有兩個(gè)回文序列，用灰色框顯示 一方面為-8至-12和+8至+12位核 苷酸，另一方面為-5至-3和+3至+5位核苷酸。垂直虛線，從此編碼核 苷酸堿基，其代表回文序列的對(duì)稱軸?？梢詮奶烊话袠?biāo)衍生兩個(gè)回文序 列，即C1221 ( SEQ ID NO: 12 )和C4334 ( SEQ ID NO:66 )。 二者均 在體外和在酵母中被I-CVd所切割。僅顯示每個(gè)靶位點(diǎn)的一條鏈。B. 64 個(gè)靶標(biāo)。這64個(gè)靶標(biāo)(SEQ ID NO: 1至64 )源自C1221 ( SEQ ID NO: 12 )，并被I-Od所切割(C1234, SEQ ID NO:65 )( Chevalier et al., 2003, 預(yù)先引用)，所述C1221是源自I-Oel天然靶標(biāo)的回文序列。它們對(duì)應(yīng) 于得自在-5、 -4、 -3、 +3、 +4和+5位進(jìn)行替換的所有24&卩回文序列。
-圖3舉例說明變體的篩選。(a)用表達(dá)大范圍核酸酶的以 基因作為標(biāo)記的載體轉(zhuǎn)化酵母，并單獨(dú)地與轉(zhuǎn)化有報(bào)告質(zhì)粒的以2TW^ 基因作為標(biāo)記的酵母進(jìn)行接合。在所述報(bào)告質(zhì)粒中，LacZ報(bào)告基因被 含有目的位點(diǎn)的插入片段打斷，其側(cè)翼是兩個(gè)直接重復(fù)。在二倍體 (丄五tZ2 7T W)中，大范圍核酸酶(白色橢圓)切割乾位點(diǎn)誘導(dǎo)兩個(gè) LacZ重復(fù)之間發(fā)生同源重組，得到有功能的P-半乳糖苷酶基因(灰色 橢圓)，這可用X-Gal染色監(jiān)測(cè)。(b)試驗(yàn)流程。使用PCR構(gòu)建I-OeI 變體的文庫，將其克隆到復(fù)制型酵母表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化入釀酒酵母菌株 FYC2-6A (廣《吵城&"風(fēng)to3扁:)。所述64個(gè)回文乾標(biāo)被克隆到
基于LacZ的酵母報(bào)告栽體中，并且所得克隆轉(zhuǎn)化入菌林FYBL2-7B
(廁化，w/^巡W,印"私/et^A , /"^I2W:)。使用機(jī)器人輔助在濾膜上劃網(wǎng)格
進(jìn)行表達(dá)大范圍核酸酶變體的單個(gè)克隆與攜帶報(bào)告質(zhì)粒的單個(gè)克隆之間的接合。在初步高通量篩選后，陽性克隆的ORF通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增 并測(cè)序。從2100個(gè)陽性克隆中鑒定出410種不同變體，并以低密度進(jìn) 行檢測(cè)，以建立完整的模式，并且驗(yàn)證了 350個(gè)克隆。同時(shí)，294個(gè)突 變體被再次克隆入酵母載體，并在二次篩選中進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)了那 些獲得的未再次克隆的突變體。然后，在類似的基于CHO的分析中并 最終在體外分析所選克隆的切割活性。
一圖4表示編碼I-CVel N75骨架蛋白的cDNA序列以及用于Ulib2 文庫構(gòu)建的簡(jiǎn)并引物。A.所述骨架蛋白(SEQIDNO:69)的編碼序列 (CDS )從第一個(gè)堿基對(duì)至第501個(gè)堿基對(duì)，并且"終止，，密碼子TGA (未示出)在第501個(gè)堿基對(duì)后。除了D75N突變以外，該蛋白還包含 不改變其活性的突變；在該蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO:70)中，N末端 前兩個(gè)殘基是曱硫氨酸和丙氨酸(MA)，并且C末端三個(gè)殘基為丙氨 酸、丙氨酸和天冬氨酸(AAD)。 B.簡(jiǎn)并引物(SEQIDNO:67、 68)。
一圖5表示pCLS0542大范圍核酸酶表達(dá)載體圖。該大范圍核酸 酶表達(dá)栽體以LEU2作為標(biāo)記。編碼大范圍核酸酶變體的cDNA 克隆到已用7Vt^T和五flgJ消化的該載體中，以侵j皮i秀導(dǎo)型Gall0啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)表達(dá)所述變體。
-圖6表示pCLS0042報(bào)告載體圖。該報(bào)告載體以7T^W和L/iL43 作為標(biāo)記。LacZ辜聯(lián)重復(fù)具有800bp的同源性，并且被1,3kb的DNA 分離開。它們被啟動(dòng)子和終止子序列所包圍。靶位點(diǎn)被克隆到 位點(diǎn)。
-圖7舉例說明292個(gè)具有經(jīng)修飾特異性的l-Orl大范圍核酸酶 變體的切割特征。所述變體來源于I-CVdN75骨架蛋白。通過存在于第 44、 68和70位的氨基酸(前三列)來定義蛋白質(zhì)。氨基酸的編號(hào)依據(jù) pdb登記碼lg9y。通過在-5至-3位的核苷酸來定義靶標(biāo)。對(duì)于每種蛋 白質(zhì)，顯示出64個(gè)靶標(biāo)中每一個(gè)的觀察到切割(1 )或未觀察到切割(0 )。
-圖8舉例說明I-Oe[變體切割模式的8個(gè)實(shí)例。所述大范圍核 酸酶針對(duì)圖2B中描述的64個(gè)耙標(biāo)各檢測(cè)4次。不同靼標(biāo)的位置在左上 部框中標(biāo)出。來源于I-OdN75骨架蛋白的變體根據(jù)第44、 68和70位 氨基酸來識(shí)別(例如KSS是K44、 S68、 S70和N75,或者K44/S68/S70 )。 所述氨基酸的編碼方式依據(jù)pdb碼lg9y。 QRR對(duì)應(yīng)于IOel N75。被切割的靶標(biāo)在框旁邊注明。
-圖9舉例說明變體的切割模式。突變體用三個(gè)字母表示，對(duì)應(yīng) 于第44、 68和70位的殘基。針對(duì)來自天然乾標(biāo)的64個(gè)靶標(biāo)以 及一系列對(duì)照靶標(biāo)檢測(cè)每個(gè)突變體。靶標(biāo)圖標(biāo)注在右上部框內(nèi)。(a)野 生型l-Ot，I (I-CW'1)和N75 ( QRR )蛋白以及7種I-CVd N75 蛋白的衍生物在酵母中(左側(cè))和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(右側(cè))的切割模式。 對(duì)于酵母而言，顯示最初的原始數(shù)據(jù)(filter )。對(duì)于CHO細(xì)胞而言， 顯示定量的原始數(shù)據(jù)(ONPG測(cè)量)，高于0.25的值用方框框住，高于 0.5的值用中灰色高亮顯示，高于l的值用深灰。LacZ:陽性對(duì)照。0: 無靶標(biāo)。Ul、 U2和U3: 3個(gè)不同的未切割對(duì)照。(b)體外切割。針對(duì) 一組2或4個(gè)靶標(biāo)檢測(cè)和4個(gè)突變體，所述耙標(biāo)包括在酵母和 CHO中產(chǎn)生最強(qiáng)信號(hào)的靶標(biāo)。如方法部分所述，與2nM線性化底物在 37。C消化l小時(shí)。顯示I-CVel與兩個(gè)不同靶標(biāo)的原始數(shù)據(jù)。帶有g(shù)gg和 cct的耙標(biāo)，沒有檢測(cè)到對(duì)其的切割。
-圖10表示統(tǒng)計(jì)分析。(a)被切割的靶標(biāo)被I-CVeI變體切割 的靶標(biāo)用灰色表示。切割每個(gè)靶標(biāo)的蛋白質(zhì)的數(shù)目顯示在下方，并且灰 色著色程度與在酵母中這些切割蛋白得到的平均信號(hào)強(qiáng)度成比例。(b) 對(duì)7個(gè)聚類中3個(gè)的分析。對(duì)于每個(gè)突變體聚類(聚類1、 3和7)，計(jì) 算每個(gè)靶標(biāo)的累計(jì)強(qiáng)度，并且柱形圖(左側(cè)柱圖)以降序顯示經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化 的強(qiáng)度。對(duì)于每個(gè)聚類，每種類型在每個(gè)位置(44、 68和70)的氨基 酸的數(shù)目在右欄中顯示為帶編碼柱狀圖。氨基酸顏色代碼的圖注在圖底 部。(b)酵母中突變體和靶標(biāo)數(shù)據(jù)的層級(jí)聚類。使用Eudidean距離和 Ward's方法(Ward, J. H., American statist. Assoc., 1963， 58， 236-244 ) 用層級(jí)聚類分析將突變體和靶標(biāo)進(jìn)行聚類。使用R軟件包中的hclust 命令進(jìn)行聚類分析。重新排序突變體和靶標(biāo)的系統(tǒng)樹狀圖以優(yōu)化聚類的 位置，并且所述突變體的系統(tǒng)樹狀圖以推導(dǎo)出的聚類在高度為8處切割。 QRR突變體和GTC靶標(biāo)用箭頭標(biāo)注。灰階反映了信號(hào)的強(qiáng)度。
-圖11舉例說明雜合或嵌合位點(diǎn)的實(shí)例gtt ( SEQ ID NO: 79 ) 和ctt ( SEQ ID NO: 77 )是兩個(gè)源自IOd位點(diǎn)的回文位點(diǎn)。該gtt/ctt 雜合位點(diǎn)(SEQ ID NO: 80)顯示了頂部鏈上-5、 -4、 -3位的gtt序列以 及底部鏈上5、 4、 3位的cct序列。
-圖12舉例說明異源二聚體變體的切割活性。用KTG和QAN
變體共轉(zhuǎn)化酵母。靶標(biāo)結(jié)構(gòu)顯示于頂部的框中具有單個(gè)gtt、 cct或gcc 半位點(diǎn)的耙標(biāo)用粗體顯示；具有兩個(gè)這些半位點(diǎn)的靶標(biāo)用粗體并且灰色 高亮顯示，該靶標(biāo)預(yù)期會(huì)被同源和/或異源二聚體切割；0:無靶標(biāo)。結(jié) 果顯示于下面的三個(gè)框上。僅對(duì)于分別被KTG和QAN切割的gtc/cct 和gtt/gte觀察到意料之外的微弱信號(hào)。
-圖13表示異源二聚體變體的切割活性的定量分析。(a)選定突 變體共同轉(zhuǎn)化酵母。為了更清楚，只顯示了相關(guān)的雜合靶標(biāo)的結(jié)果。 aac/acc靶標(biāo)總是作為不相關(guān)靶標(biāo)的實(shí)例而顯示。對(duì)于KTG x AGR雜 交，回文的tac和tct靶標(biāo)序列(雖然未示出)分別被AGR和KTG切 割。RRN突變體對(duì)cat靶標(biāo)的切割非常低，并且在酵母中不能定量。(b) CHO細(xì)胞中的瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染。對(duì)于(a)和(b)，黑色柱單獨(dú)第一個(gè)突 變體的信號(hào)；灰色柱單獨(dú)第二個(gè)突變體的信號(hào)；條紋柱通過共表達(dá) 或共轉(zhuǎn)染得到的信號(hào)。
-圖14舉例說明組裝的異源二聚體ARS-KRE在所選小鼠染色體 17的DNA乾標(biāo)上的活性。用等摩爾的靶標(biāo)LagoZ質(zhì)粒、ARS和KRE表 達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-Kl細(xì)胞系，并測(cè)量P-半乳糖苷酶活性。用所述LagoZ 質(zhì)粒和I-S"I、 I-Orl、 ARS或KRE重組質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為 對(duì)照。
本文以下的實(shí)施例僅舉例說明本發(fā)明，并不限制其范圍。其它使 用適當(dāng)引物由序列不同于SEQ ID NO: 69的cDNA獲得的變體仍是本發(fā) 明的一部分。
實(shí)施例1:篩選新的功能性內(nèi)切核酸酶
所述用于生產(chǎn)大范圍核酸酶變體的方法以及哺乳動(dòng)物或酵母細(xì)胞 中基于切割誘導(dǎo)重組的分析在國(guó)際PCT申請(qǐng)WO 2004/067736中已描 述，它們被用于篩選具有改變特異性的變體。這些分析得到功能性LacZ 報(bào)告基因，該報(bào)告基因可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測(cè)(圖3a)。
A) 材料和方法
a)突變體文庫的構(gòu)建
如前所述(Epinat et al" N.A.R.， 2003， 31， 2952-2962 )，合成wt和l-Ot'l D75N (或N75 )的開放讀碼框(SEQ ID NO:69,圖 4A)。通過將第75位密碼子替換為aac而引入突變D75N。通過使用來 自Sigma的簡(jiǎn)并引物以及所述D75N基因作為DNA模板進(jìn)行 PCR來產(chǎn)生大范圍核酸酶文庫的多樣性，其中簡(jiǎn)并引物在第44、 68和 70位帶有密碼子VVK (18個(gè)密碼子，氨基酸ADEGHKNPQRST),這些
位置與位于3至5位的堿基直接相互作用。這些引物使得44、 68和70
位殘基可發(fā)生理論多樣性為12的突變。簡(jiǎn)要地說，使用正向引物
(:5,-gtttaaacatcagctaagcttgacctttwkgtgacttcaaaagacccag-3，， SEQ ID NO: 67:)和反向引物
(5，-gatgtagttggaaacggatccrabbatcmbbtacgtaaccaacgcc-3，， seq IDnO: 68:)在50jxl PCR
反應(yīng)中擴(kuò)增PCR片段合并PCR產(chǎn)物，用乙醇沉淀然后重懸于50^1 10mM Tris。將PCR產(chǎn)物克隆入含有I-Odt D75N基因的pET表達(dá)載 體中，該表達(dá)載體已用適當(dāng)?shù)南拗菩悦高M(jìn)行消化。栽體和插入片段DNA 的消化分兩步進(jìn)行(單酶消化)，在其間DNA樣品被提取出來(使用經(jīng) 典的基于苯酚氯仿異戊醇的方法)并用乙醇沉淀。10pg消化后載 體DNA用于連接反應(yīng)，其中插入片段DNA為5:1過量。用所得載體通 過電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI細(xì)胞。為了得到超過文庫的理論多樣性的 許多細(xì)胞克隆，產(chǎn)生了 6xi0"個(gè)克隆。從平板刮下細(xì)菌克隆，并且提取 和純化對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒載體。
通過亞克隆含有完整I-Od D75N ORF的A^ I-五agl DNA片段， 該文庫^f皮再次克隆入酵母pCLS0542載體(圖5)。在該基于2p的可復(fù) 制并以Z^t/2基因?yàn)闃?biāo)記的栽體中，變體在半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 (Epiimt et al.，先前引用)的控制下。在向大腸桿菌電穿孔后，獲得7 乂104個(gè)克隆，其代表了 DNA水平理論多樣性(183 = 5832 )的12倍。 將DNA提取出來并轉(zhuǎn)化入釀酒酵母菌林FYC2-6A (M/4ra、 ^p7Zl63、 /^2Z/、 /i"3Zl2^ )。 4吏用菌落挑取工具(QpixII， GENETIX)挑取出 13824個(gè)菌落，并生長(zhǎng)在144個(gè)微量滴定板中。
b)靶標(biāo)克隆的構(gòu)建
C1221 24bp回文序列(:tcaaaacgtcgtacgacgttttga， SEQ ID NO: 12:)是
近乎回文的天然靼標(biāo)(:tcaaaacgtcgtgagacagtttgg， SEQ ID NO: 65 )的半位
點(diǎn)的重復(fù)。C1221在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中體外和離體都如I-Orl天然
把標(biāo)一樣被高效切割。如下產(chǎn)生64個(gè)回文乾標(biāo)64對(duì)寡核苷酸 (:ggcatacaagtttcaaaacnnngtacnnngttttgaoaatcgtctgtca (seq ID NO: 72)以及反向互補(bǔ)序
列)對(duì)應(yīng)于64個(gè)DNA靶標(biāo)的兩條鏈，在所述寡核苷酸每側(cè)具有12bp 非回文的額外序列，從Sigma定購所述寡核苷酸，退火并克隆入 PGEM-T Easy ( PROMEGA )。然后，從64個(gè)pGEM-T衍生載體的每 個(gè)中切出 400bp的片段，并克隆入前述酵母栽體 pFL39國(guó)ADH-LACURAZ ( Epinat et al.,先前引用)中，該載體也叫 pCLS0042 (圖6)，得到了 64個(gè)酵母報(bào)告載體。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的經(jīng)典方法進(jìn)行切除、消化和連接的步驟。在pCLS0042的位 點(diǎn)插入靼序列。該64個(gè)回文耙標(biāo)描述于圖2B中(-5至-3位和+3至+5 位，SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 64 )。
c) 酵母菌株和轉(zhuǎn)化
將大范圍核酸酶表達(dá)變體的文庫和A44/R68/L70變體轉(zhuǎn)化入 FYC2-6A (M4Tcr、吵M6丄/ew2A 、 / WZA，)菌林中。
將所述耙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母菌林FYBL2-7B: (Af」ra, imi3ZU5J、
對(duì)于轉(zhuǎn)化，可以使用經(jīng)典的化學(xué)/熱激方案，常規(guī)地每pgDNA產(chǎn) 生106個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化體；在亮氨酸缺乏的合成培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化體(Gietz and Woods, 2002 )。
d) 酵母中大范圍核酸酶表達(dá)克隆的接合和篩選
I-CVd變體克隆以及酵母報(bào)告菌林貯存在甘油(20 o/。)儲(chǔ)備液中， 并在新微板中進(jìn)行復(fù)制。突變體以網(wǎng)格方式培養(yǎng)在覆蓋有尼龍濾膜的 YPD培養(yǎng)板上，并使用高網(wǎng)格密度(大約20個(gè)點(diǎn)/cm2)。在同樣的濾膜 上進(jìn)行第二次網(wǎng)格培養(yǎng)，針對(duì)每個(gè)變體點(diǎn)樣由64或75個(gè)不同的帶報(bào)告 基因的酵母菌林組成的第二層。簡(jiǎn)要地說，每個(gè)報(bào)告菌林在尼龍膜上點(diǎn) 樣13824次，并且在每一個(gè)該點(diǎn)上^C點(diǎn)樣13 824個(gè)表達(dá)變體大范圍核酸 酶酵母克隆中的一個(gè)。將膜放在固體瓊脂YPD豐富培養(yǎng)基上，并在30'C 孵育過夜，使之發(fā)生接合。然后，將濾膜轉(zhuǎn)移至缺乏亮氨酸和色氨酸并 以半乳糖(1% )為碳源(并以G418用于共表達(dá)實(shí)驗(yàn))的合成培養(yǎng)基， 在37。C孵育5天，以選擇攜帶表達(dá)和靶標(biāo)載體的二倍體。5天后，將濾 膜放在固體瓊脂糖培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基在0.5M磷酸鈉緩沖液(pH 7.0 )、 0.1%SDS、 6%二甲基曱酰胺(DMF)、 7mM(3-巰基乙醇、1%瓊脂糖中
含有0.02%的X-Gal,并在37。C孵育，以檢測(cè)P-半乳糖苷酶活性。在孵 育2天后依據(jù)染色情況鑒定陽性克隆。通過掃描對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，并使 用專用軟件進(jìn)行定量。對(duì)第二次篩選來說，對(duì)292個(gè)所選陽性克隆使用 同樣的步驟，但是在同樣的膜上對(duì)每個(gè)突變體進(jìn)行4次檢測(cè)(參見圖8 和9a)。
d)初步篩選結(jié)果的序列以及再克隆
在酵母中初步篩選所鑒定的陽性克隆的開放讀碼框(ORF)通過 PCR進(jìn)4亍擴(kuò)增并測(cè)序。然后使用Gateway方案(Invitrogen )將ORF 再次克隆。通過對(duì)酵母菌落進(jìn)行PCR來擴(kuò)增ORF (Akada et al., Biotechniques， 28， 668-670， 672-674 )，使用以下引物來自PROLIGO
的 ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc (SEQ ID NO: 73)和 ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc (SEQ ID NO: 74)pcR產(chǎn)物克隆
入(i)攜帶半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、作為選擇標(biāo)記的Zj^72或KanR以 及2n復(fù)制起點(diǎn)的酵母gateway表達(dá)載體，以及(ii)來自NOVAGEN 的pET24d(+)載體。所得克隆通過測(cè)序(MILLEGEN)來驗(yàn)證。
B)結(jié)果
I-CVd是二聚體歸巢內(nèi)切酶，其切割22bp的假回文靶標(biāo)。分析與 其天然靶標(biāo)相結(jié)合的I-Od的結(jié)構(gòu)已顯示出，在每個(gè)單體中8個(gè)殘基與 7個(gè)堿基建立了直接相互作用(Jurka et al.， 1998，先前引用)。殘基 Q44、 R68、 R70與3至5位(以及-3至-5位，圖1)的三個(gè)連續(xù)堿基 對(duì)相接觸。使用窮舉蛋白質(zhì)文庫對(duì)比耙標(biāo)文庫方法以局部地改造DNA 結(jié)合界面的該部分。首先，將所述I-Oel骨架從D75突變?yōu)镹，從而降 低文庫中由堿性殘基R68和R70的替換引起的可能的能量限制，以滿 足I-Od結(jié)構(gòu)中被包埋的D75的氫受體潛能。D75N突變體的同源二聚 體(從大腸桿菌細(xì)胞中純化，其中使用pET表達(dá)載體使之過表達(dá))顯 示出切割I(lǐng)-Od歸巢位點(diǎn)。該D75N突變不影響蛋白結(jié)構(gòu)，但是降低了 在過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中的的毒性。接著，第44、 68和70位,皮隨機(jī)改變， 并且如圖1和2B所述，并產(chǎn)生通過由所切割的回文耙標(biāo)中±3、 士4和士5位的替換而得到的64個(gè)回文耙標(biāo)(Chevalier etal,， 2003，先 前引用)。最后，蛋白質(zhì)文庫中的突變體對(duì)應(yīng)于在三個(gè)殘基位置由vvk 密碼子編碼的12種氨基酸的任意一種獨(dú)立組合。結(jié)果，蛋白質(zhì)文庫的 最大(理論)多樣性為123或1728。然而，對(duì)核酸而言,該多樣性為183
或5832。
所得文庫被克隆入攜帶丄五J72營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因的酵母復(fù)制型 表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化入leu2突變體單倍體酵母菌林(FYC2-6A)中。所 述64個(gè)靶標(biāo)被克隆入適當(dāng)?shù)慕湍笀?bào)告栽體中并轉(zhuǎn)化入單倍體菌林 (FYBL2-7B)中，得到64個(gè)檢測(cè)林。
使用機(jī)器人輔助的接合方案以從我們的文庫中篩選大量的大范圍 核酸酶。通用的篩選策略描述于圖3b中。13,8247個(gè)大范圍核酸酶表達(dá) 克隆(大約2.3倍于理論多樣性)以高密度(20個(gè)點(diǎn)/cm2)被點(diǎn)樣在尼 龍濾膜上，并針對(duì)64個(gè)靶標(biāo)菌林中每一種單獨(dú)進(jìn)行檢斷884,608個(gè)點(diǎn))。 2100個(gè)顯示出針對(duì)至少一個(gè)靶標(biāo)有活性的克隆被分離出來(圖3b)，并 且PCR擴(kuò)增編碼大范圍核酸酶的ORF并測(cè)序。410個(gè)不同的序列:帔鑒 定出來，并且相似數(shù)目的對(duì)應(yīng)克隆被選作進(jìn)一步分析。將點(diǎn)樣密度降低 至4個(gè)點(diǎn)/cm2,并且對(duì)每個(gè)克隆針對(duì)64個(gè)報(bào)告菌林進(jìn)行一式四份地檢 測(cè)，從而創(chuàng)造出完整的特征語(如圖8和9a)。 350個(gè)陽性克隆可以被 證實(shí)。然后，為了避免含有多于一個(gè)克隆的菌林的可能性，突變體的 ORF通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并再次克隆入酵母載體中。得到的質(zhì)粒被單 個(gè)轉(zhuǎn)化回到酵母中。得到294個(gè)這樣的克隆，并以低密度進(jìn)行檢測(cè)(4 個(gè)點(diǎn)/cm2)。觀察到與初步篩選的差異主要是弱信號(hào)，28個(gè)弱的切割酶 現(xiàn)在顯示為陰性。只有一個(gè)陽性克隆顯示出與在初步篩選中觀察到的不 同特征謙。
實(shí)施例2:具有不同切割模式的卜^el大范圍核酸酶變體
來自實(shí)施例1的驗(yàn)證的克隆顯示了非常不同的基序。這些新基序 中的某些與最初的骨架蛋白具有一些相似性，而許多其它的則完全不 同。各種才莫式的實(shí)例，包括野生型10d和I-C"，IN75，示于圖8和9a。 整體結(jié)果(僅針對(duì)292個(gè)具有經(jīng)修飾特異性的變體)總結(jié)于圖7。
歸巢核酸內(nèi)切酶通?？梢栽谒鼈兊陌行蛄兄写嬖谝恍┖?jiǎn)并性，我 們的第一個(gè)發(fā)現(xiàn)之一就是初始的I-C"4自身切割酵母中7種不同靶標(biāo)。 我們得到的突變體中有許多也遵循這樣的規(guī)則，切割序列的數(shù)目范圍從 1至21個(gè)，平均為5.0個(gè)切割序列(標(biāo)準(zhǔn)偏差=3.6 )。有趣的是，在50 個(gè)突變體中(14%)，特異性被改變以致它們只切割一個(gè)靶標(biāo)。37個(gè)(11 % )切割兩個(gè)靶標(biāo)，61個(gè)(17% )切割3個(gè)乾標(biāo)以及58個(gè)(17% )切
割4個(gè)耙標(biāo)。對(duì)于5個(gè)靶標(biāo)和以上的，百分率低于10%?？傆?jì)，38個(gè) 靶標(biāo)被突變體所切割(圖10a)。值得注意的是，在土3位為A的靶標(biāo)上 幾乎沒有觀察到,皮切割，并且在±5、 ±4、 ±3位為tgn和cgn的靶標(biāo) 從不被切割。
這些結(jié)果不限制本發(fā)明的范圍，因?yàn)閳D7僅顯示從292個(gè)變體(291 個(gè)來自從完整文庫中可獲得的1728 (或123)個(gè)I-CVd大范圍核酸酶變 體)獲得的結(jié)果。
實(shí)施例3:新的大范圍核酸酶可以切割新的靶標(biāo)，同時(shí)保持高活性和窄 特異性。
A) 材料和方法
a) 構(gòu)建靶克隆
如實(shí)施例1所述，將所述64個(gè)回文靼標(biāo)克隆入pGEM-T Easy (PROMEGA)。然后，如前所述(Epinatetal.，先前引用)，切除400bp 的PvmII片段，并克隆入哺乳動(dòng)物載體pcDNA3.1-LACURAZ-AURA。 參照以下克隆75個(gè)雜合靶序列設(shè)計(jì)寡核苷酸使之含有兩個(gè)不同的每 種突變體回文序列的半位點(diǎn)(PROLIGO)。
b) 初始篩選結(jié)果的再次克隆
在酵母中初步篩選所鑒定的陽性克隆的開放讀碼框(ORF)被再 次克隆入(i) CHO gateway表達(dá)栽體pCDNA6.2 ，參照供應(yīng)商 (INVITROGEN )的說明書，以及(ii)來自NOVAGEN的pET 24d(+) 載體。得到的克隆通過測(cè)序(MILLEGEN)來驗(yàn)證。
c) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞分析
將來自American Type Culture Collection ( ATCC )的CHO-K1 細(xì)胞系培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%胎牛血清的Ham's F12K培養(yǎng)基中。對(duì)于瞬時(shí) "單鏈退火(SSA， Single Strand Annealing )，，分析而言，在轉(zhuǎn)染前一天 將細(xì)胞以每孔13.103個(gè)細(xì)胞接種于12孔板中。在第二天用400ng DNA 使用EFFECTENE轉(zhuǎn)染試劑盒(QIAGEN )進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。使用等摩爾 量的靼LagoZ質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒。第二天，更換培養(yǎng)基并且將細(xì)胞再孵 育72小時(shí)。用PBS漂洗CHO-K1單層細(xì)胞一次。然后用150pl加入用于P-半乳糖苷酶液體分析的裂解/暴露(revelation)緩沖液(100ml裂 解緩沖液(Tris誦HCl 10mMpH7.5、 NaCl 150mM、 Triton X100 0.1 % 、 BSA0.1mg/ml、蛋白酶抑制劑)和900ml暴露緩沖液(10ml的Mg 100X 緩沖液(MgCl2 100mM、 |3-巰基乙醇35%)、 110ml ONPG ( 8mg/ml) 以及780ml的辨酸鈉0.1 M pH7.5 ))在冰上裂解所述細(xì)胞30分鐘。卩-半乳糖苷酶活性通過測(cè)定415nm處光密度進(jìn)行分析。整個(gè)過程在自動(dòng) Velocity 11 BioCel平臺(tái)上進(jìn)行。p-半乳糖苷酶活性被計(jì)算成以蛋白質(zhì)濃 度、孵育時(shí)間和轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)單位。
d) 蛋白質(zhì)表達(dá)和純化
在大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS細(xì)胞中使用pET-24d(+)載體 (NOVAGEN )過表達(dá)帶His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。用IPTG ( 0.3mM )在25°C 進(jìn)行誘導(dǎo)。在含有蛋白酶抑制劑(Complete EDTA-free片，Roche )和 5% (v/v)甘油的50mM磷酸鈉(pH8 )、 300mM氯化鈉溶液中將細(xì)胞 進(jìn)行超聲處理。細(xì)胞裂解物以100000g離心60分鐘。然后使用負(fù)載鈷 的5ml Hi國(guó)Trap螯合HP柱(Amersham Biosciences )對(duì)His標(biāo)簽蛋白 質(zhì)進(jìn)行親和純化。在用線性梯度的咪唑(高至0.25M咪唑，然后為0.5M 咪唑、0,3MNaCl和50mM磷酸鈉(pH8 )的平臺(tái)期)進(jìn)行洗脫期間收 集凡個(gè)級(jí)分。富含蛋白質(zhì)的級(jí)分(通過SDS-PAGE測(cè)定)施加到第二 個(gè)柱。該粗純化樣品調(diào)整至pH6，并施加到用20mM磷酸鈉(pH6.0 ) 平衡的5ml HiTrap Heparin HP柱(Amersham Biosciences )。結(jié)合蛋白 質(zhì)用20mM磷酸鈉以及1M氯化鈉的氯化鈉連續(xù)梯度進(jìn)行洗脫。純化級(jí) 分進(jìn)行SDS-PAGE并濃縮(10kDa截留分子量centriprep Amkon Ultra 系統(tǒng))，冷凍在液氮中并貯存在-80。C。純化蛋白質(zhì)i PBS或10mM Tris-HCl ( pH 8 )緩沖液中4吏用PD10柱(Sephadex G誦25M， Amersham Biosciences)進(jìn)4亍脫鹽處理。
e) 體外切割分析
帶有單個(gè)大范圍核酸酶DNA靶切割位點(diǎn)的pGEM質(zhì)粒首先用 Xmnl進(jìn)行線性化處理。于37。C在lOmM Tris-HCl( pH 8 )、50mM NaCl、 10mMMgCl2、 lmM DTT和50pg/ml BSA中進(jìn)行切割分析。2nM用作 靶標(biāo)底物濃度。在25pl終體積反應(yīng)中，用于每種蛋白質(zhì)的稀釋范圍在O 和85nM之間。1小時(shí)后通過加入5fU的45 %甘油、95mM EDTA ( pH 8 )、 1.5 % ( w/v ) SDS、 1.5mg/ml蛋白酶K和0.048 % ( w/v )溴酚藍(lán)(6XBuffer Stop )并在37。C孵育30分鐘從而終止反應(yīng)。消化物在瓊脂糖電 泳凝膠上跑膠，并在渙化乙錠染色后將片段定量，以計(jì)算切割的百分比。
B)結(jié)果
選擇8個(gè)代表性突變體(屬于6個(gè)不同的聚類，參見以下)用于 進(jìn)一步表征(圖9)。首先，通過使用如先前報(bào)道中所述的基于將表達(dá)大 范圍核酸酶的載體和靶標(biāo)載體瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染的分析將酵母中的數(shù)據(jù)在哺 乳動(dòng)物細(xì)胞中驗(yàn)證。該8個(gè)突變體ORF和64個(gè)靼標(biāo)被克隆入適當(dāng)?shù)妮d 體中，并使用機(jī)器人輔助的基于微量滴定板的方案將每種所選變體與64 個(gè)不同^^艮告質(zhì)粒的每一種共轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞。大范圍核酸酶誘導(dǎo)的重 組通過標(biāo)準(zhǔn)定量ONPG分析進(jìn)行測(cè)量，該ONPG分析測(cè)定功能性(3-半 乳糖普酶基因的恢復(fù)。在5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)特征模式可以定性及定量 重復(fù)。如圖9a所示，在酵母和CHO細(xì)胞中幾乎總是觀察到強(qiáng)的和中等 的信號(hào)(ADK除外)，因此驗(yàn)證了酵母HTS方法的關(guān)聯(lián)性。然而，在 酵母中觀察到的弱信號(hào)在CHO細(xì)胞中常常檢測(cè)不到，可能因?yàn)闄z測(cè)水 平的不同(參見QRR和靼標(biāo)gtg、 gct和ttc)。也在大腸桿菌中產(chǎn)生4 種突變體并且通過金屬親和層析進(jìn)行純化。對(duì)它們針對(duì)野生型位點(diǎn)及其 同類位點(diǎn)的相對(duì)體外切割效率進(jìn)行測(cè)定。在寬范圍突變體濃度下在標(biāo)準(zhǔn) 條件下估計(jì)切割程度(圖9b)。類似地，分析了 I-Od野生型(wt)針 對(duì)這些靶標(biāo)的活性。在許多情況下，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)底物100 0/。切割，可能 反映出這些蛋白質(zhì)可能有^f艮少或沒有轉(zhuǎn)換的事實(shí)(Perrin et al.， EMBO J" 1993, 12， 2939-2947; Wang et al.， Nucleic Acids Res.， 1997， 25， 3767-3776)。通常，體外分析證實(shí)了從酵母和CHO細(xì)胞中獲得的數(shù)據(jù)， 但是令人驚奇地，gtt靶標(biāo)被高效地切割。
從酵母和CHO中獲得的特征模式明顯看出特異性轉(zhuǎn)移 偏好的gtc靶標(biāo)不被切割或幾乎不被切割，而新的靼標(biāo)則觀察到信號(hào)。 這種特異性轉(zhuǎn)換通過對(duì)QAN、 DRK、 RAT和KTG的體外分析得到證 實(shí)，如圖9b所示。另外，這四個(gè)在酵母和CHO中展示不同水平活性 (圖9a)的突變體顯示出在體外切割17-60%的其偏好靶標(biāo)(圖9b)， 這與的動(dòng)力學(xué)(13畫25nM達(dá)到最大切割的一半)相似。因此，通 過改造，活性大部分被保留。第三，切割靶標(biāo)的數(shù)目在突變體之間有所 不同:強(qiáng)的切割酶如QRR、 QAN、 ARL和KTG具有在l-Ot，l所觀察 范圍的切割謙(酵母中為5-8個(gè)可檢測(cè)信號(hào)，CHO中為3-6個(gè))。與切割較弱的突變體比較特異性比較困難。例如，DRK中觀察到單個(gè)弱信 號(hào)，但是這可能代表從更加復(fù)雜模式中減弱而得的僅有的可檢測(cè)信號(hào)。 然而，強(qiáng)切割變體的表現(xiàn)顯示出改造保留了非常窄的特異性。
實(shí)施例4:層級(jí)聚類定義7個(gè)i-￡ rel變體家族。
A) 材料和方法
使用來自R軟件包的hchist進(jìn)行聚類分析。我們使用從初始、低 密度篩選得到的定量數(shù)據(jù)。變體和耙標(biāo)均使用Euclidean距離和Ward's 方法(Ward, J.H.， American Stat. Assoc., 1963, 58， 236-244 )的標(biāo)準(zhǔn)層 級(jí)聚類分析法進(jìn)行聚類分析。突變體和靶標(biāo)的系統(tǒng)樹圖被重新排序以優(yōu) 化聚類的位置，并且在高度為8時(shí)切割突變體系統(tǒng)樹狀圖來定義聚類。
B) 結(jié)果
然后，使用層級(jí)聚類分析來確定是否可以在變體的眾多且多樣的 切割模式中定義家族。因?yàn)槌醪胶投魏Y選給出合適的結(jié)果，所以來自 第一輪的酵母低密度篩選的定量數(shù)據(jù)用于分析以允許較大的樣品大小。 變體和乾標(biāo)均使用Euclidean距離和Ward's方法(Ward, J.H.，先前引 用)的標(biāo)準(zhǔn)層級(jí)聚類分析法進(jìn)行聚類分析，并定義了 7個(gè)聚類(圖10b )。 顯示了對(duì)其中3個(gè)的詳細(xì)分析(圖10c )，并且結(jié)果總結(jié)于表I中。
表I:聚類分析
三個(gè)優(yōu)選靶標(biāo) 第4位 優(yōu)選的氨基酸
， 核苦酸
聚類 實(shí)例
(圖3a)序列%切割(%}，446870
gU46.2g0.5Q
gtc18.332.0肌5%
77個(gè)蛋白質(zhì)9tg13.6t82.4(62/77)
2=78.1C15.1
2 QRRgtt13.4g0QR
gtc".8a4.9100.0%100.0%
8個(gè)蛋白質(zhì)tct".4t56.9(8/8)(8/8)
c38.2
3 ARLgat27.9g2.4AR
tat23.238B.963.0%33.8。/。
65個(gè)蛋白質(zhì)gag15.7t5.7(41/65)(22/65)
66.8C3.0
4 AGRgac22.7g0.3A&NRR
51.6% &
tac14.5391.935.4%48.4%67.7%
31個(gè)蛋白質(zhì)gat13.4t6.6(16&11/3"15/3121/31
￡- 50.6C1.2
5 ADKgat29.21g1.6
DRKtat15.4373.8
81個(gè)蛋白質(zhì)gac".4t13.4
Z> 56.05.9C11.2
6 KTGcct30.190K
RAT19.634.062.7%
51個(gè)蛋白質(zhì)toc13.96.3(32/51)
S= 63.6C89.7
"7cct20.8g0K
tct19.60.291.9。/。
37個(gè)蛋白質(zhì)lcc15.3t14.4(34/37)
S= 55.7C85.4
i依據(jù)切割指數(shù)的頻率，如圖10e所述
2在每個(gè)位置，標(biāo)明在該聚類的多于1/3中存在的殘基
對(duì)于每個(gè)聚類而言，可以基于信號(hào)的頻率和強(qiáng)度而鑒定一組優(yōu)選 的靶標(biāo)(圖10c)。所述每個(gè)聚類的三個(gè)優(yōu)選乾標(biāo)標(biāo)于表1中，以及它們
的切割頻率。這些頻率的總計(jì)為該聚類之特異性的量度。例如，在聚類
1中，三個(gè)優(yōu)選靶標(biāo)(gtt/c/g )，占所觀察切割的78.1%,其中g(shù)tt單獨(dú) 占46.2 % ，顯示出非常窄的特異性。實(shí)際上，該聚類包括幾種蛋白質(zhì)，如QAN其大多切割gtt (圖9a)。相反地，在聚類2中三個(gè)優(yōu)選靼標(biāo)僅 代表所有觀察信號(hào)的36.6%。依據(jù)在該聚類中觀察到的相對(duì)較廣且多樣 的模式，QRR切割5種靶標(biāo)(圖9a )，而其它聚類成員的活性不限于這 5種靶標(biāo)。
在每個(gè)聚類中所發(fā)現(xiàn)殘基的分析顯示出對(duì)第44位Q的強(qiáng)烈偏好 在聚類l和2中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，但是A和N在聚類3和4中更常出現(xiàn)， 并且在聚類6和7中更偏好K。同時(shí)，這些偏好性與±4位DNA的強(qiáng) 堿基優(yōu)先性相關(guān)聯(lián)，在聚類1和2中大多數(shù)為t:a堿基對(duì)，在聚類3、 4 和5中為a:t，以及在聚類6和7中為c:g(參見表I)。與其靶標(biāo)結(jié)合的
的結(jié)構(gòu)顯示出Q44殘基與底部鏈的-4位(以及頂部鏈的+4位， 參見圖lb和lc)相互作用。這些結(jié)果提示該相互作用在我們的突變體 中很大程度上是保守的，并且顯示出"編碼"，其中Q44會(huì)建立與腺噤 呤的接觸，A44 (或更少出現(xiàn)的N44)與胸腺嘧啶的接觸，以及K44與 鳥嘌呤的接觸。這樣的相關(guān)性在68位和70位沒有觀察到。
實(shí)施例5:變體可以組裝成功能性異源二聚體從而切割新DNA靶序列
A) 材料和方法
所述75個(gè)雜合靶序列如下進(jìn)行克隆設(shè)計(jì)寡核苦酸使之含有兩個(gè) 每個(gè)突變體回文序列的不同的半位點(diǎn)(PROLIGO)。通過PCR擴(kuò)增單 鏈寡核苷酸獲得的雙鏈把DNA使用Gateway方案(INVITROGEN ) 克隆到酵母和哺乳動(dòng)物報(bào)告栽體中。將酵母報(bào)告載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母菌 林FYBL2-7B (M4rcr、歸3Z^5J、 一ZU3、 /ew2Z^、 )中。
B) 結(jié)果
變體是能夠切割回文位點(diǎn)的同源二聚體。為了檢測(cè)可切割耙標(biāo)列 表是否可以通過產(chǎn)生可以切割雜合切割位點(diǎn)(如圖11所述)的異源二 聚體而得以擴(kuò)展，選擇具有獨(dú)特特征模式的變體的亞組并將其克 隆到兩個(gè)不同的以或iL4iV基因?yàn)闃?biāo)記的酵母載體中。然后，將 在44、 68和/或70位具有突變以及75位為N的突變體的組合與一組回 文和非回文的嵌合DNA靶標(biāo)共表達(dá)在酵母中。一個(gè)例子顯示在圖12中 將K44、 T68、 G70、 N75 (KTG)和Q44、 A68、謂、N75 ( QAN) 突變體共表達(dá)，導(dǎo)致兩個(gè)嵌合靶標(biāo)gtt/gcc和gtt/cct的切割，所述嵌合
靶標(biāo)不凈皮單獨(dú)任一突變體所切割?；匚男蛄術(shù)tt、 cct和gcc乾標(biāo)(以及 KTG和QAN的其它靶標(biāo))也被切割，可能由于同源二聚體的形成所導(dǎo) 致，但是不相關(guān)的靶標(biāo)則不被切割。另外，gtt、 cct或gcc半位點(diǎn)不足 以發(fā)生切割，因?yàn)檫@些靶標(biāo)是完全抗性的(參見圖12中g(shù)gg/gcc、gat/gcc、 gcc/tac，以及許多其它)。意料之外的切割僅在gtc/cct和gtt/gtc中分別 對(duì)于KTG和QAN同源二聚體觀察到，但是信號(hào)非常弱。因此，有效 的切割需要兩個(gè)突變體單體的協(xié)同結(jié)合。這些結(jié)果表明異源二聚體種類 的良好特異性水平。
總之，14個(gè)不同蛋白質(zhì)的總共112種組合在酵母中進(jìn)行了檢測(cè)， 并且37.5%的組合(42/112)顯示出對(duì)其預(yù)期的嵌合靶標(biāo)的陽性信號(hào)。 在圖13a中顯示了 6個(gè)實(shí)例的定量數(shù)據(jù)，并且對(duì)于相同的6種組合，用 一組相關(guān)靶標(biāo)在CHO細(xì)胞的瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了結(jié)果(圖13b)。 作為一般規(guī)則，當(dāng)兩個(gè)表達(dá)蛋白之一作為同源二聚體表現(xiàn)出強(qiáng)的信號(hào)時(shí) 總是獲得功能性異源二聚體。例如，兩種低活性突變體DRN和RRN， 與強(qiáng)的切割酶如KTG或QRR形成功能性異源二聚體(圖13a和13b)， 而將同樣的弱突變體共表達(dá)則不能檢測(cè)到嵌合靶標(biāo)的切割。
實(shí)施例6:組裝的異源二聚體對(duì)天然DNA耙標(biāo)的切割
A)材料與方法
a) 基因組搜索
被變體潛在切割的天然靶標(biāo)通過掃描公共數(shù)據(jù)庫而被識(shí) 別，對(duì)于匹配咖咖1^"111^^加&模式的基因組序列，其中n為a、 t、 c
或g ( SEQ ID NO:78 )。在小鼠17號(hào)染色體中鑒定到天然DNA靶序列
caaaactatgta印gggttttg (SEQ ID NO: 75)
i亥 DNA序歹'J蜂皮分另'J +刀割tcaaaac敏tg幽gttttga (SEQ ID NO: 76)和 tcaaaac幽tg紹gggttttga(SEQIDNO: 77)序列的兩種變體的組合潛在切割。
b) 大范圍核酸酶變體的分離
如實(shí)施例1所述，4吏用序列tcaaaac敏tgast5gttttga (SEQ IDNO: 76)或序歹'J toaaaacseigtg^gggttttga (SEQ ID NO: 7"作為乾標(biāo)，通過酵母中切割誘導(dǎo)的重組
分析來選擇變體。
C)靶標(biāo)質(zhì)粒的構(gòu)建
設(shè)計(jì)寡核苷酸使之含有各自突變體回文序列的兩個(gè)不同半位點(diǎn)
(PROLIGO)。使用Gateway方案(INVITROGEN),將通過PCR擴(kuò) 增單鏈寡核苷酸得到的雙鏈靶標(biāo)DNA克隆到哺乳動(dòng)物報(bào)告栽體 pcDNA3.1-LACURAZ-AURA中，如前所述(Epinat et al"先前引用)， 從而得到靼LagoZ質(zhì)粒。
d) 大范圍核酸酶表達(dá)載體的構(gòu)建
如實(shí)施例l所述，在酵母中進(jìn)行篩選時(shí)所鑒定克隆的開放閱讀框 (ORF)通過對(duì)酵母菌落PCR而擴(kuò)增，并分別克隆到CHO表達(dá)載體 pCDNA6.2 (INVITROGEN )中。在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)I-Od 變體。
e) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞分析
用等摩爾量的靶LagoZ質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì) 胞系，并且如實(shí)施例3和5所述測(cè)量P-半乳糖苷酶活性。
B)結(jié)果
被I-Od變體潛在切割的天然DNA靶標(biāo)通過進(jìn)行基因組搜索與 模式caaaacnnnnnnnnnngttttg(SEQIDNO: S)匹配的序列來鑒定。將隨機(jī)選捧的
在小鼠17號(hào)染色體中鑒定的DNA序列(SEQIDNO:78)克隆到報(bào)告 質(zhì)粒中。該DNA乾標(biāo)被變體A44,R68，S70,N75 ( ARS )和 K44,R68,E70,N75 ( KRE )的組合潛在地切割。
這兩種變體在CHO細(xì)胞中的共表達(dá)導(dǎo)致如圖14所顯示的功能性 異源二聚體蛋白質(zhì)的形成。實(shí)際上，當(dāng)變體單獨(dú)表達(dá)時(shí)，雖然 KRE蛋白顯示了殘余活性，但是對(duì)小鼠DNA靶標(biāo)的切割活性幾乎不能 檢測(cè)到。相反地，當(dāng)這兩種變體與帶有潛在靶標(biāo)的質(zhì)粒一起共表達(dá)時(shí)， 可以測(cè)量到強(qiáng)的P-半乳糖苷酶活性。所有這些數(shù)據(jù)表明異源二聚化發(fā)生 在CHO細(xì)胞中，并且異源二聚體是有功能的。
這些數(shù)據(jù)表明通過組裝同源二聚體變體而形成的異源二聚體蛋白 質(zhì)將天然存在的DNA靶序列的列表擴(kuò)展至所有潛在的雜合可切割靶 標(biāo)，這些靶標(biāo)從所有可能的變體組合得到。
而且，這些數(shù)據(jù)表明，了解其同源二聚體各自的DNA靶標(biāo)，則可以 預(yù)測(cè)可被變體組合切割的DNA序列。另外，靶標(biāo)的1和2 (以及-1和-2 ) 位核苷酸可以不同于gtac,表明它們?cè)贒NA/蛋白質(zhì)相互作用中起較小作 用。
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權(quán)利要求
1.制備具有經(jīng)修飾的切割特異性的I-CreI大范圍核酸酶變體的方法，所述方法包括(a)參照I-CreI pdb登記碼1g9y，將氨基酸Q44、R68和/或R70替換為選自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T和Y的氨基酸；(b)選擇步驟(a)中獲得的針對(duì)雙鏈DNA靶標(biāo)中-5至-3位而言具有至少一個(gè)下列R3三聯(lián)體切割模式的I-CreI大范圍核酸酶變體，所述-5至-3位對(duì)應(yīng)于下式I的R35’-R1CAAAR2R3R4R’4R’3R’2TTTGR’1-3’，其中R1不存在或存在；并且當(dāng)存在時(shí)代表包含1至9個(gè)核苷酸的核酸片段，所述核酸片段對(duì)應(yīng)于隨機(jī)核酸序列或?qū)?yīng)于位于從-20至-12位(從5’向3’)的I-CreI大范圍核酸酶歸巢位點(diǎn)的片段，R1至少對(duì)應(yīng)于所述歸巢位點(diǎn)的-12位，R2代表核酸雙聯(lián)體ac或ct并且對(duì)應(yīng)于所述歸巢位點(diǎn)的-7至-6位，R3代表對(duì)應(yīng)于所述-5至-3位的核酸三聯(lián)體，選自g、t、c和a，并排除以下的三聯(lián)體gtc、gcc、gtg、gtt和gct，R4代表核酸雙聯(lián)體gt或tc并且對(duì)應(yīng)于所述歸巢位點(diǎn)的-2至-1位，R’1不存在或存在；并且當(dāng)存在時(shí)代表包含1至9個(gè)核苷酸的核酸片段，所述核酸片段對(duì)應(yīng)于隨機(jī)核酸序列或?qū)?yīng)于位于從+12至+20位(從5’向3’)的I-CreI大范圍核酸酶歸巢位點(diǎn)的片段，R’1至少對(duì)應(yīng)于所述歸巢位點(diǎn)的+12位，R’2代表核酸雙聯(lián)體ag或gt并且對(duì)應(yīng)于所述歸巢位點(diǎn)的+6至+7位，R’3代表對(duì)應(yīng)于所述+3至+5位的核酸三聯(lián)體，選自g、t、c和a；當(dāng)R3和R’3是非回文序列時(shí)，R’3不同于gac、ggc、cac、aac以及agc，R’4代表核酸雙聯(lián)體ga或ac并對(duì)應(yīng)于所述歸巢位點(diǎn)的+1至+2位。
2. 依據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于所述核酸三聯(lián)體113優(yōu)選地選自下列三聯(lián)體ggg， gga, ggt， ggc, gag, gaa， gat， gac， gta， gcg, gca， tgg, tg^ tgt, tgc, tag, taa， tat, tac, ttg， tta, ttt, ttc， tcg， tca， tct, tcc, agg, aga, agt, agc, aag, aaa, aat, aac, atg, ata， att, atc, acg， aca, act, acc， cgg, cga, cgt， cgc, cag， caa, cat, cac， ctg, cta， ctt, etc， ccg, cca， cct和ccc，更優(yōu)選地選自以下三聯(lián)體ggg, ggt, ggc， gag， gat, gac, gta, gcg, gca, tag,taa， tat， tac, ttg， ttt， ttc' tcg， tct, tcc, agg, aag， aat， aac， att， ate, act acc, cag， ca^ cac， ctt，ctc,ccg,cct和a"
3.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于步驟(b)獲得的I-OrfA44/A68/A/70, A44/A68/G70， A44/A68/H70, A44/A68/K70,大范圍核酸酶變體選自A44/A68/N70,A44/D68/H70,A44/G68/N70,A44服8/H70,A44/H68/S70，A44/K68/K70,A44/K68/T70，A44/N68/K70，A44/N68/T70，A44/Q6謝70，A44/R68/E70，A44/R68/N70，A4條8/G70，A44/S68/S70,A44脂/K70，A44/T68/T70,A44/A68/Q70,A44/D68/K70，A44/G68/P70,A44/H68/K70，A44/H68H70,A44/K6,70,A4頓68/A70，A4頓6,0，A44/Q68/A70,A44/Q軀70，A44/R68/G70,A44/R68/R70，A44雄/K70，A44/S68/T70，A44/T68/N70,D44/D68/H70，A44/A68/R70, A44/D68/R70, A44/G68/R70， A44服廳70， A44/K68/A70, A44/K68/Q70, A4頓68/E70， A4頓闊70, A44/Q飾70, A44/Q68/S70, A44/R68/H70， A44/R68/S70， A44/S6認(rèn)70, A44/T68/A70, A44/T68/Q70， D4頓68/S70，A44/A68/S70，A44/G68/H70，A44/H68/A70，A44/H68/Q70，A44/K68/G70，A44/K6塑0，A44/N68/G70,A4頓68/R70，A44/Q68/G70，A44麵/A70,A44/R68/K70，A44/R68/T70,A44/S68/Q70，A44/T68/G70,A44/T68/R70,D44/R68/A70,A44/A68/T70' A4德8/K70， A44/H68/G70, A44服8/R70, A44/K6謹(jǐn)0， A44/K68/S70， A4頓68/H70， A44/N68/S70， A44/Q68/H70, A44脇/D70, A44/R68/L70， A44歸/A70， A44/S68/R70, A44脂/H70, A44/T68/S70， D44/R68/K70,權(quán)利要求書D機(jī)6謝70,D44歸/Q70,D44/R6窗0，D44/R68/S70,D44/R68/T70,E44/H68/H70,E44鐘/A70,E4德薩0，E4秦8/N70,E4德8/S70，E4德8/T70，E44/S68/T70,G44鵬/K70,G44/Q68/H70,G44/R68/Q70，G44/R68/RJ0，G44/T68/D70，G44/T68/P70,G44簡(jiǎn)簡(jiǎn)，H44/A68/S70,H44鐘/T70,H44/R68/A70,H44/R68/D70，H44/R68/E70,H44/R68/G70，H44/R6,0,H44鏡/R70，H44/R68/S70,H44/R68/T70,H44/S68/G70，H44膽/S70,H44/S68/T70，H44/T68/S70,H44/T68/T70，K44/A68/A70,K44/A68/D70，K44/A68/E70,K44/A68/G70,K44/A68/H70,K44/A6,70，K44/A68/Q70，K44/A6固0，K44/A68/T70,K44/D68/A70,K44/D68/T70，K德68/G70,K44/E68/N70,K44/E68/S70，K44/G68/A70,K44/G68/G70，K44/G68/N70,K44/G68/S70,K44/G68A70,K44服8/D70，K44/H68簡(jiǎn)，K44/H68/G70,K44/H68/N70，K44/H68/S70,K44/H68/T70,K44/K68/A70,K44/K6畫0,K44/K68/H70,K44/K68/T70,K44/N68/A70,K4頓68/D70,K44/N68/E70,K4頓68/G70,K44腿8/H70,K44/N68/N70，K44/N68/Q70，K44/N68/S70,K44/N68/T70，K44/P68/H70,K44/Q68/A70，K44/Q6薩0，K44/Q68/E70，K44/Q68/S70,K44/Q68/T70,K44/R68/A70，K44/R68/D70，K44/R68/E70,K44/R68/G70,K44/R68/H70，K44/R68/N70，K44/R68/Q70,K44/R68/S70,K44/R68/T70,K44/S68/A70，K44/S68/D70,K44/S68/H70,K44/S68/N70,K德68/S70,K44/S68/T70,K44/T68/A70，K44/T68/D70,K44/T68/E70,K44/T68/G70，K44/T68/H70,K44/T6謂0，K44/T68/Q70，K44/T68/S70，K44脂/T70,N44/A68/H70,N44/A68/R70,N44/H68/N70，N44/H68/R70,N44/K68/G70，N44/K6簡(jiǎn)0，N44/K68/R70,N44/K6S/S70,N44/N68/R70,N44/P68/D70,N44/Q68/H70，N44/Q68/R70,N44/R68/A70,鹿/R68/D70，N4娜諸0，N44/R68/G70,N4德窗0，N44/R68/K70，N44鍵/N70，N44/R6諮0，N44/R68/S70,N44雄/T70，N4楊8/G70，N44/S68/H70,N44/S68/K70，N4楊8/R70，腦/T68/H70,N44/T68/K70，N44簡(jiǎn)/Q70，N44/T68/R70,N44/T68/S70,P44/N68/D70,P44/T68/T70，Q44/A68/A70，Q44/A68/H70，Q44/A68/R70,Q44/G68/K70，Q44/G6脂0，Q痕68/G70，Q44/N68/A70，Q權(quán)68/H70,Q44惡8/S70,Q44/P6諮0，Q44/Q68/G70，Q44/R68/A70,Q44鵬/D70,Q44/R68/E70,Q44/R68/G70，Q44/R68/H70,Q44/R68/N70,Q44/R68/Q70,Q44/R68/S70,Q44/S68/H70，Q44/S68/R70,Q4機(jī)8脂，Q44/麗A70，Q44腦/G70,Q44脂/H70，Q44/T68/R70,諸/A68/G70,R44/A68/T70,R44/G68/T70,腿廳/D70'R44/H68/T70,R44/N6S/T70,R4救68/A70,R44/R68/D70,R44腿婦，R機(jī)68/G70，R44/R68/N70,R4傷即0，R44雌/S70，諸/R68/T70,R44/S68/G70，R4德,70，R4德8/S70,R44/S68/T70,S44/D68/K70,S4傷8/R70，S44雌/G70，S44雄/N70，S44/R6諮0，S機(jī)68/S70,T44/A68/K70,T44/A68/R70,T44/H68/R70,T44/K68/R70，T4傷8/P70,T44/N68/R70，T44/Q68/K70，T44/Q68/R70，T44/R68/A70,T44/R68/D70，T44/R68/E70，T4德8/G70，T44/R68/H70，T44/R68/K70,T44/R6,0,T44/R68/Q70,T44/R68/R70,T44/R68/S70,T44/R68/T70,T44/S68/K70，T44/S68/R70, T44/T68/K70:和T44/T68/R70.。
4. 依據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法,其特征在于選擇所迷I-Cn4 大范圍核酸酶變體的步驟(b)在酵母細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行。
5. 通過依據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法可獲得的大范圍核酸 酶變體在體外或體內(nèi)為非治療性目的用于切割包含至少^-:Mbp部分回文 序列的雙鏈核酸靶標(biāo)的用途，其中至少在+/-8至11位的所述序列為回^ 列，并且在-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體和/或+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體分別 不同于gtc、 gcc、 gtg、 gtt和gct、以及gac、 ggc、 cac、 aac和agc。
6. 依據(jù)權(quán)利要求5的用途，其特征在于所述I-OeI大范圍核酸酶變 體選自A44/A68/A70，A44/A68/G70，A44/A68/H70，A44/A68/K70，A44/A6認(rèn)70,A44/A68/Q70，A44/A68/R70,A44/A68/S70，A44/A68/T70，A44/D68/H70,A44/D68/K70，A44/D68/R70，A44/G68/H70，A44/G68/K70，A44/G68/N70，A44/G68/P70,A44/G68/R70，A44服8/A70,A44服8/G70,A44服8/H70,A44服8/K70,A44/H68/N70,A4德8/Q70,A44/H68/R70,A44/H68/S70,A44/H證70,A44/KL68/A70，A44認(rèn)/G70,A44/K68/H70，A44/K68/K70,A44/K6薩0,A44/K68/Q70，A44/K68/R70，A44/K68/S70，A44/K68/T70,A4頓68/A70,A4頓68/E70,A44務(wù)8/G70,A44/N6歸0，A44/N68/K70,A4頓68/N70,A44/N68/Q70,A4頓68/R70,A4頓68/S70,A44飾8/T70，A44/Q68/A70,A44/Q68yD70，A44/Q68/G70，A44/Q,70,A4，謝70,A44/Q證70,A44/Q68/S70,A44/R68/A70，A44扁歸，A44/R68/E70,A44/R維70,A44/R68/H70,A4德8/K70,A44編/L70,A44/R麵70,A44鵬簡(jiǎn),A44/R68/S70,A4德8/T70,A44/S68/A70,A44/S68/G70，A44/S68/K70，A44/S6,70，A4德8/Q70，A44/S68/R70,A44/S68/S70,A標(biāo)68/T70,A44/T68/A70，A44/T68/G70,A44脂/H70，A44/T68/K70，A44脂歸,A44/T68/Q70，A44/T68/R70，A44腳/S70,A44/T6S/T70,D44/D68/H70，D44/N68/S70,D44/R68/A70,D44/R68/K70,D44/R6薩0，D44鍾/Q70,D44/R6訪0，D44/R68/S70,D44/R68/T70,E44服薩0,E44/R6衡0'E44/R68/H70,E44/R68/N70,E44/R68/S70，E44/R68/T70，E44/S68A70,G44/H68/K70,G44/Q68/H70,G44/R68/Q70,G44/R6脂0，G術(shù)68/D70,G44/T6諮0，G44/T68/R70，H44/A68/S70,H德68/T70，H4德8/A70，H44/R68/D70,H4像68/E70，H44/R68/G70,H44/R68/N70,H44/R6面0，H44/R68/S70，H44/R68/T70,H4德8/G70,H44/S68/S70,H44/S68/T70,H44/T68/S70,H44/T68/T70，K44/A68/A70,K44/A68/D70,K44/A68/E70，K44/A68/G70,K44/A6S/H70,K44/A6謝70,K44/A68/Q70，K44/A68/S70，K44/A68/T70,K44/D68/A70，K44/D68nT70，K44/E68/G70，K44/E68/N70,K44/E68/S70,K44賜8/線K44/G68/G70,K44/G68/N70,K44/G68/S70，K44/G68/T70，K44/H68/D70,K44/H68/E70，K44/H68/G70,K44/H6簡(jiǎn)0，K44/H68/S70,K4頓68/T70，K44/K68/A70,K44/K68/D70,K44/K68/H70,K44/K68/T70,K44/N68/A70，K44飾8/D70,K44/N68/E70,K44/N68/G70,K44藤8/H70,K4頓68/N70,K44雄8/Q70,K44/N68/S70，K44飾8/T70，K44/P68/H70,K44/Q68/A70,K44/Q68/D70,K44/Q68/E70，K44/Q68/S70，K44/Q68/T70,K44/R68/A70，K44細(xì)/D70,K44/K68/E70，K44/R68/G70,K44/R68/H70,K44鍵/N70,K44/R68/Q70,K44/R68/S70，K44腦/T70,K44/S68/A70,K144/S68/D70，K4德8/N70，K44腿/S70,K44/S68/T70，K44/T68/A70,K44/T68歸，K術(shù)68/E70，K44/T68/G70，K44/T6,0,IC44簡(jiǎn)/N70,K44/T68/Q70，K44/T68/S70,K44脂/T70，N44/A68/H70,N44/A68/R70，N44/H68緒0，N44/H68/R70,N44/K68/G70,N44/K68/H70,N44/K6萌0，N44/K68/S70，N44/N68/R70，N44脂/D70，N44/Q68/H70，N44/Q68/R70,N44/R68/A70,N44/R68/D70,N44艦/E70，N44/R68/G70,簡(jiǎn)/R6菌0，N44/R68/K70，N44/R6S/N70，菌/R6面0，N44/R68/S70,N44/R68/T70，N44/S68/G70,N4德8/H70,N44/S68/K70,<formula>complex formula see original document page 7</formula>
7. 依據(jù)權(quán)利要求5或6的用途，其特征在于所述l-Oel大范圍核酸酶變體為同源二聚體。
8. 依據(jù)權(quán)利要求5和6任一項(xiàng)的用途，其特征在于所述l-CVa大范圍核酸酶變體為異源二聚體。
9. 依據(jù)權(quán)利要求5至8任一項(xiàng)的用途，其特征在于所述DNA靶標(biāo) 的+/-3至5位的序列為回文序列。
10. 依據(jù)權(quán)利要求5至8任一項(xiàng)的用途，其特征在于所述DNA靶標(biāo) 的+/-3至5位的序列為非回文序列。
11. 依據(jù)權(quán)利要求5至10任一項(xiàng)的用途，其特征在于-11至-8位和 +8至+11位的所述回文序列分別為caaa和tttg。
12. 依據(jù)權(quán)利要求5至11任一項(xiàng)的用途，其特征在于所述I-Od大 范圍核酸酶變體進(jìn)一步包含75位的突變。
13. 依據(jù)權(quán)利要求12的用途，其特征在于所述突變?yōu)镈75N或D75V。
14. 依據(jù)權(quán)利要求5至13任一項(xiàng)的用途，其特征在于所述l-Orl大 范圍核酸酶變體在44位具有丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)，用于切割 在-4位包含核苷酸a和/或在+4位包含t的DNA靶標(biāo)。
15. 依據(jù)權(quán)利要求5至13任一項(xiàng)的用途，其中所述大范圍核酸酶變 體在44位具有賴氨酸(K)，用于切割在-4位包含核苷酸c和/或在+4位包含g的耙標(biāo)。
16. 依據(jù)權(quán)利要求6至13任一項(xiàng)的用途，其中所述大范圍核酸酶變 體在44位具有谷氨酰胺(Q )，用于切割在-4位包含核苷酸t(yī)和/或在+4 位包含a的靼標(biāo)。
17. 通過依據(jù)權(quán)利要求1至4的制備方法可獲得的大范圍核 酸酶變體；其選自A44/A68/A70,A44/A68/G70,A44/A68/H70,A44/A68/K70,A44/A6謝70，A44/A68/Q70，A44/A68/S70,A44/A68/T70，A44/D68/H70,A44雄/K70，A44/D68/R70,A44/G68/H70,A44/G68/K70,A44/G68/N70,A44/G68/P70，A44/H68/A70,A44/H68/G70，A44/H68/H70,A44/H68/K70，A44服,0，A44/H68/Q70，A44服8/S70，A44/H68/T70,A44/K68/A70，A44/K68/G70，A44/K68/H70,A44/K68脂0，A44/K68/Q70,A44/K68/R70，A44/K68/S70，A44/K68/T70,A44/N68/A70,A44/N68/E70,A44扁8/G70,A4頓68/H70,A44/N68/K70，A4頓6,70，A44/N68/Q70，A44馬8/R70,A4頓68/S70，A44/N68/T70，A44/Q68/A70,A44/Q68/D70,A44/Q68/G70，A44/Q68/H70，A44/Q6謝70，A44/Q68/S70，A44/R68/E70,A44/R68/K70,A44麵/L70，A44/S68/A70，A44/S68/G70，A44/S68/N70,A44/S6&/Q70,A44/S68/R7D,A標(biāo)68/S70,A44/S68/T70,A44/T68/A70,A44/T68/G70,A44/T68/H70,A44/T68緒0，A傳68/Q70，A4麵8/S70,A44/T68/T70,D44/D68/H70，D44/N68/S70，D44/R68/A70，D4德睛0，歸雌/Q70,D44/R68/R70,D44歸/S70，D44/R68/T70,E44/H68/H70,E44/R68/A70，E44/R68/H70，E44誠(chéng)緒0，E44雌/S70，E4德8/T70，E44/S68/T70，G44服8/K70，G44/Q68/H70,G4德8/Q70，G44/T68/D70,G44/T68/P70,G44/T6,0,H44/A68/S70，H44/A68/T70'H4德8/D70,H44/R68/E70,H44/R68/G70，H44/R6謝70，H44/R68/R70,H44腦/S70,H44/S68/G70,H4德8/S70,H祖68/T7D，H44簡(jiǎn)/S70,H44簡(jiǎn)/T70，K44/A68/A70,K44/A6薩0，K44/A68/E70,K44/A68/G70,K44/A68/H70,K44/A68/N70，K44/A68/Q70，K44/D68/A70,K44/D68/T70,K4概8/G70，K44細(xì)/S70,K44/G68/A70,K44/G68/G70,K44/G68/N70，K44/G68/S70,K44/G68/T70,K44服8/D70，K44/H68/E70,K44/H68/G70,K44/H68/N70,K44/H68/S70,K44/H68/T70，K44/K68/A70,K44/K68/D70,K44/K68/H70，K44/K68/T70，K4頓68/A70，K4頓68/D70,K4頓68/E70，K44/N68/G70,K44艦薩0，K4頓68/N70，K4頓68/Q70,K44/N68/S70，K44/N68/T70,K44歸/H70,K44/Q68/A70，K44/Q6薩0,K44/Q68/E70，K44/Q68/S70，K44/Q68/T70,K44雄/A70，K44/R68/D70,K44/R68/E70,K44觸/G70,K44/R68/H70,K44/R68/N70，K44/R68/S70,K4楊8/A70，K44纖/D70,K44/S68/H70,K44/S6謝70,K44纖/S70,K44/S68/T70,K44簡(jiǎn)/A70，K44/T68/D70,K44/T6脂0，K44/T68/G70，K44/T68/H70，K44/T68/N70，K44/T68/Q70，K44/酉S70,K44/T68/T70,N44/A68/H70,N44/H6謝70,固服膨O,N44/K168/G70，N44/K68/H70,麗/K68/R70,N44/K68/S70，N44/P68/D70，N44/Q68/H70，N44/R68/A70,麗/R68/D70,N44/R68/E70，N44/R68/K70,N44/S68/G70，N44/S68/H70,N術(shù)68/K70,N44/S68/R70,N44簡(jiǎn)/H70，N44/T68/K70，N44簡(jiǎn)/Q70，N44/T纖70，P44親8/D70，P44/T68/T70,Q44/G68/K70,Q44/G68/R70,Q44/K68/G70，Q44/N68/A70，Q44/N68/H70,Q44/N68/S70,Q44/P68/P70,Q44/Q68/G70,Q44/R6蒙0，Q44/R68/E70,Q44/R68/G70,Q44/R68/Q70,Q4條8/S70,Q44/T68/A70,Q44/T68/G70，Q44/T68/H70，R44/A68/G70,R44/A68/T70，R44/G68/T70，R44/H68/D70，R44/H6脂0,諸/N68/T70,R44/R68/A70，R44/R6&/D70,R44麵/E70,R44/R68/G70,R44/R68/Q70,R44/R68/S70，R44/R68/T70,R德68/G70，R44/S68/N70，R標(biāo)68/S70，R44/S68/T70,S44/D68/K70，S44/R68/R70,S44腕/S70，T44/A68/K70， T44/N68/P70, T44/N68/R70, T44/R68/E70, T44/R68/Q70,和 T44/S68/K70,。
18. 依據(jù)權(quán)利要求17的I-Oel大范圍核酸酶變體，其在44位具有 丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)并切割在-4位包含核苷酸3和/或在+4位 包含t的靶標(biāo)。
19. 依據(jù)權(quán)利要求17的I-Oel大范圍核酸酶變體，其在44位具有 賴氨酸(K)并切割在-4位包含核苷酸c和/或在+4位包含g的靶標(biāo)。
20，依據(jù)權(quán)利要求17的I-Od大范圍核酸酶變體，其在44位具有 谷氨酰胺(Q),用于切割在-4位包含核苷酸t(yī)和/或在+4位包含a的靶 標(biāo)。
21. 依據(jù)權(quán)利要求17至20任一項(xiàng)的I-CVeI大范圍核酸酶變體，其 為同源二聚體。
22. 依據(jù)權(quán)利要求17至20任一項(xiàng)的I-Od大范圍核酸酶變體，其 為由兩個(gè)單體組成的異源二聚體，其中每個(gè)單體來自如權(quán)利要求17至 20任一項(xiàng)的不同變體。
23. —種多核苷酸，其特征在于它編碼依據(jù)權(quán)利要求17至22任一 項(xiàng)的大范圍核酸酶變體。
24. —種表達(dá)盒，其包含依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸和調(diào)節(jié)序列。
25. —種表達(dá)栽體，其特征在于它包含依據(jù)權(quán)利要求24的表達(dá)盒。
26. 依據(jù)權(quán)利要求25的表達(dá)栽體，其特征在于它進(jìn)一步包含靶向 DNA構(gòu)建體。
27. 依據(jù)權(quán)利要求26的表達(dá)載體，其特征在于所述靶向DNA構(gòu)建 體包含與依據(jù)權(quán)利要求17至22任一項(xiàng)的大范圍核酸酶變體的切 割位點(diǎn)鄰近區(qū)域具有同源性的序列。
28. 依據(jù)權(quán)利要求27的表達(dá)栽體，其特征在于所述靶向DNA構(gòu)建 體包含a) 與依據(jù)權(quán)利要求17至22的變體的切割位點(diǎn)鄰近區(qū)域具有同源性 的序列，以及b) 側(cè)翼為如a)中序列的待引入序列。
29. —種細(xì)胞，其特征在于它被依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸或者被 依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項(xiàng)的載體所修飾。
30. —種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于它包含依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷 酸或者依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項(xiàng)的載體。
31. —種非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于它包含依據(jù)權(quán)利要求 23的多核苷酸或依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項(xiàng)的載體。
32. 依據(jù)權(quán)利要求17至22任一項(xiàng)的I-Od大范圍核酸酶變體、依 據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸、依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項(xiàng)的載體、依 據(jù)權(quán)利要求29的細(xì)胞、依據(jù)權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)基因植物、依據(jù)權(quán)利要求 31的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物用于分子生物學(xué)、用于體內(nèi)或體外遺傳工 程、以及用于體內(nèi)或體外基因組工程的用途。
33. 依據(jù)權(quán)利要求32的用途，用于在包含DNA靶標(biāo)序列的目的位 點(diǎn)誘導(dǎo)雙鏈核酸斷裂，從而誘導(dǎo)DNA重組事件、DNA喪失或細(xì)胞死亡。
34. 依據(jù)權(quán)利要求32或33的用途，其特征在于所述雙鏈核酸斷裂 用于修復(fù)特定序列，修飾特定序列，恢復(fù)功能性基因代替突變基因，減弱或激活內(nèi)源目的基因，向目的位點(diǎn)中引入突變，引入外源基因或其一部分，失活或缺失內(nèi)源基因或其一部分，將染色體臂易位，或使DNA 不被修復(fù)和降解。
35. 依據(jù)權(quán)利要求32至34任一項(xiàng)的用途，其特征在于所述I-Orl 大范圍核酸酶變體、多核苷酸、載體、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物或非人類轉(zhuǎn)基 因哺乳動(dòng)物與權(quán)利要求26中定義的靶向DNA構(gòu)建體相結(jié)合。
36. —種遺傳工程方法，其特征在于它包括以下步驟在位于載體 上的目的位點(diǎn)斷裂雙鏈核酸，所述栽體包含依據(jù)權(quán)利要求17至22的 l-O't'l大范圍核酸酶變體的DNA靼標(biāo)，這是通過所述載體與如上定義 的大范圍核酸酶變體相接觸，從而誘導(dǎo)與表現(xiàn)出與所述I-Od 大范圍核酸酶變體切割位點(diǎn)鄰近序列具有同源性的另 一種載體的同源 重組。
37. —種基因組工程方法，其特征在于它包括以下步驟l)通過將 所述切割位點(diǎn)與所述I-Od大范圍核酸酶變體相接觸，從而雙鏈斷裂基 因組基因座位，所述基因座位包含依據(jù)權(quán)利要求17至22的大范 圍核酸酶變體的至少一個(gè)識(shí)別和切割位點(diǎn)；2 )在適于與乾向DNA構(gòu)建 體同源重組的條件下維持所述已斷裂基因組基因座位，該耙向DNA構(gòu) 建體包含待引入所述基因座位的序列，側(cè)翼為與靶基因座位具有同源性 的序列。
38. —種基因組工程方法，其特征在于它包括以下步驟l)通過將 所述切割位點(diǎn)與所述I-OeI大范圍核酸酶變體相接觸，從而雙鏈斷裂基 因組基因座位，所述基因座位包含依據(jù)權(quán)利要求17至22的I-CVd大范 圍核酸酶變體的至少一個(gè)識(shí)別和切割位點(diǎn)；2 )在適于與染色體DNA進(jìn) 行同源重組的條件下維持所述已斷裂基因組基因座位，該染色體DNA 與切割位點(diǎn)的鄰近區(qū)域具有同源性。
39. —種組合物，其特征在于它包含依據(jù)權(quán)利要求17至22的至少 一種大范圍核酸酶變體、依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸或依據(jù)權(quán) 利要求25至28任一項(xiàng)的載體。
40. 依據(jù)權(quán)利要求39的組合物，其特征在于所述組合物進(jìn)一步包含 靶向DNA構(gòu)建體，該靼向DNA構(gòu)建體包含修復(fù)目的位點(diǎn)的序列，其側(cè) 翼為與所靶向基因座位具有同源性的序列。
41. 依據(jù)權(quán)利要求17至22的至少一種l-Ox4大范圍核酸酶變體、 依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸或者依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項(xiàng)的載體 用于制備藥物的用途，所述藥物用于預(yù)防、改善或治愈有此需要的個(gè)體中的遺傳性疾病，所述藥物通過任何方式施與所述個(gè)體。
42. 依據(jù)權(quán)利要求17至22的至少一種I-CVeI大范圍核酸酶變體、 依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸或者依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項(xiàng)的栽體 用于制備藥物的用途，所述藥物用于預(yù)防、改善或治愈有此需要的個(gè)體 中的由提呈DNA中間體的傳染因子引起的疾病，所述藥物通過任何方 式施與所述個(gè)體。
43. 依據(jù)權(quán)利要求17至22的至少一種l-Ox'l大范圍核酸酶變體、 依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸或者依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項(xiàng)的載體 的用途，其在體外用于在生物來源產(chǎn)品或意圖生物應(yīng)用的產(chǎn)品中抑制其 擴(kuò)增、滅活或消除提呈DNA中間體的傳染因子，或者用于消毒目標(biāo)對(duì) 象。
44. 依據(jù)權(quán)利要求41至43任一項(xiàng)的用途，其特征在于所述傳染因 子為病毒。
全文摘要
制備具有經(jīng)修飾的切割特異性的1-CreI大范圍核酸酶變體的方法，通過所述方法可獲得的變體及其或者用于切割新DNA靶標(biāo)或者用于非治療目的的遺傳工程和基因組工程的應(yīng)用。編碼所述變體的核酸、包含所述核酸的表達(dá)盒、包含所述表達(dá)盒的載體、被所述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或生物，植物或非人動(dòng)物。
文檔編號(hào)C12N9/22GK101198694SQ200680012709
公開日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月15日
發(fā)明者弗雷德里克·帕克, 菲利普·迪沙托 申請(qǐng)人:賽萊克蒂斯公司