專利名稱：利用固定化細胞進行汽爆秸稈酶解耦合發(fā)酵制氫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工藝技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及利用固定化細胞進行汽爆秸稈酶解 耦合發(fā)酵制氫的方法
背景技術(shù)：
氫氣是一種清潔、高效的能源，是化石燃料良好的替代品。常規(guī)的制氫方法， 如電解水法和化石原料熱裂解法(Adnan M. Int J Hydrogen Energy, 2001:26:29-27; Ayhan D. Energy Sources, 2002:24:59-68.)，存在著能耗高，產(chǎn)物 成分復雜，分離成本高等缺點，不能從根本上解決能源和環(huán)境問題。以可再生的 生物質(zhì)資源為原料，依靠微生物發(fā)酵的生物制氫日益成為研究的方向和熱點。
秸稈是一類來源非常豐富，價格極為低廉的可再生性資源，經(jīng)汽爆處理后， 秸稈中的部分半纖維素發(fā)生降解，纖維素的致密結(jié)構(gòu)被破壞，易于降解而成能夠 被微生物所利用的小分子糖類。在以汽爆秸稈為底物的微生物發(fā)酵過程中，添加 纖維素酶使底物中的纖維素和半纖維素降解以產(chǎn)生微生物能夠利用的小分子可 溶性糖，是提高汽爆秸稈原料利用率的關(guān)鍵。
丁酸梭菌(Cfo彌誠"w 6"0WC"An)肖灘利用包括葡萄糖、木糖、纖維二糖等多種 糖類在內(nèi)的大部分木質(zhì)纖維素水解物，是以秸稈為原料進行發(fā)酵產(chǎn)氫的理想菌種 (Hawkes FR. Int J Hydrogen Energy 2002,27:1339-1347.)。常用的利用汽爆秸稈發(fā)酵制 氫的方式是同步糖化發(fā)酵，即將纖維素酶和菌種同時加入以汽爆秸稈為主要原料配制 的培養(yǎng)基中，邊酶解邊發(fā)酵(陳洪章，李佐虎。使用汽爆植物秸稈發(fā)酵制備氫氣的方 法。國家發(fā)明專利，CN1500879A)。但是，由于纖維素酶解的最iSMJ變?yōu)?0°C，而以 C ^0r/cw/ 為產(chǎn)氫菌時，發(fā)酵罐的溫度須保持在C. 6W0r/CWW的ftit生長溫度35°C， 兩者之間的最i^溫差有15。C，導致纖維素酶的活性難以正常發(fā)揮，發(fā)酵效率難以提高。 因此，有必要探索新的發(fā)酵方式以解決這一矛盾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對以汽爆秸稈為原料進行同步糖化發(fā)酵制氫的過程中，纖 維素酶解的最適溫度和微生物發(fā)酵的最適溫度不一致的問題，提供一種使酶解和 發(fā)酵分別在不同的反應(yīng)器中，在各自最適的溫度下同時進行的新方法。
本發(fā)明利用海藻酸鈉為固定化材料制取固定化細胞，汽爆秸稈原料置于酶解 罐中，溫度保持在5(TC;固定化細胞置于發(fā)酵罐中，溫度保持在35'C。利用循 環(huán)泵將發(fā)酵液在兩個罐之間循環(huán)，酶解產(chǎn)生的糖不斷被洗脫下來，隨著循環(huán)液體 進入發(fā)酵罐中，補充被微生物消耗的糖。在同步糖化發(fā)酵中，纖維素酶和微生物 都保持在較高的活性狀態(tài)，從而提高氫氣產(chǎn)率和底物轉(zhuǎn)化率。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供的利用固定化細胞進行汽爆秸稈酶解耦合發(fā)酵制取氫氣的方法， 其步驟如下
(1) 制備丁酸梭菌固定化細胞
將處于對數(shù)生長期的丁酸梭菌(C. 6"0^'c"w AS 1.209)種子液與質(zhì)量百分比 濃度為2 5%海藻酸鈉溶液混合，得丁酸梭菌種子液海藻酸鈉混合液；所述丁 酸梭菌種子液與海藻酸鈉溶液混合的體積比為l:3 6;
用無菌注射器吸取丁酸梭菌種子液海藻酸鈉混合液，推動注射器，將混合液 滴入濃度為0.05mol/l的無菌CaCl2溶液中，保持30分鐘，制取丁酸梭菌固定化 細胞；所述混合液與無菌CaCl2溶液的體積比為l: 3 6;
(2) 在制取固定化細胞的同時，將汽爆秸稈料置于在酶解罐中，在5(TC下 靜置制備酶解液；
所述酶解液的制備如下將汽爆秸稈料置于酶解罐中，加入纖維素酶和用硫 酸調(diào)節(jié)pH4.8的水溶液，5(TC下酶解得酶解液；每克汽爆秸稈料加25IU纖維素酶; 每升所述水溶液含尿素或酵母抽提物2g， KH2P04 0.51g和MgS04 0.31g;所述汽
爆秸稈重量與水溶液體積的固液比是1: 8 12(W/V);
(3) 酶解耦合發(fā)酵制取氫氣
固定化細胞制取好以后，開啟安裝在酶解罐與發(fā)酵罐之間的連接管路上的循 環(huán)泵把一部分酶解液泵入發(fā)酵罐，待固定化細胞被浸沒后，關(guān)閉循環(huán)泵停止循環(huán), 迅速向發(fā)酵罐通入氮氣除氧，于35r下進行固定化細胞預培養(yǎng)；
待細胞預培養(yǎng)6 12小時后，再次開啟循環(huán)泵源源不斷地將酶解液泵入發(fā)酵罐
中，同時發(fā)酵罐中的發(fā)酵液不斷被循環(huán)泵回酶解罐中，進行酶解耦合發(fā)酵制得氫氣；
發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)生的氫氣從發(fā)酵罐頂端排出，用排水集氣法收集所制得的氫氣。 所述的固定化細胞預培養(yǎng)是利用酶解產(chǎn)生的糖液進行的。 所述固定化細胞預培養(yǎng)6 12小時后，再開啟循環(huán)泵將酶解液泵入發(fā)酵罐中
的速度為10 20ml/min。
所述的汽爆秸稈料為汽爆玉米秸稈料、汽爆高梁秸稈料或汽爆小麥秸稈料。
在上述步驟(2)和(3)中還包括反應(yīng)器和管道的滅菌過程。
在上述步驟(3)中，發(fā)酵所用菌種丁酸梭菌購自中國微生物保藏管理委員
會普通微生物保藏中心，其保藏號為CGMCC AS 1.209。 所述的秸稈為小麥秸稈，玉米秸稈，稻草或高粱秸稈。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點
1、 本發(fā)明的方法，酶解罐的溫度保持在5(TC,發(fā)酵罐的溫度保持在35'C， 從而使汽爆秸稈酶解和微生物發(fā)酵分別在各自最適的溫度條件下進行；
2、 本發(fā)明的方法，發(fā)酵罐中的發(fā)酵液不斷地被循環(huán)進入酶解罐中，使酶解 產(chǎn)生的糖能夠不斷進入水溶液中，同時，水溶液不斷循環(huán)回流進入發(fā)酵罐中；一 方面解除了纖維素酶解產(chǎn)生的糖所造成的產(chǎn)物抑制，另一方面，發(fā)酵液中不斷的 補充營養(yǎng)成分，使微生物細胞能夠保持在高活性的狀態(tài)；
3、 本發(fā)明的方法，微生物以固定化細胞的形式停留在發(fā)酵罐中，避免了隨 糖液循環(huán)進入酶解罐中而失去活性；固定化細胞作為生物催化劑，能反復活化使 用和連續(xù)運轉(zhuǎn)，與游離細胞相比，固定化細胞對雜菌的污染和代謝產(chǎn)物的抑制作 用有更高的抵抗性，發(fā)酵產(chǎn)物易于與菌體分離。
圖1顯示以汽爆玉米秸稈為底物利用丁酸梭菌固定化細胞進行汽爆秸稈酶 解耦合發(fā)酵制氫與在單一發(fā)酵罐中進行同步糖化發(fā)酵的實驗結(jié)果對比，由圖1 可知，采用固定化細胞進行汽爆秸稈酶解耦合發(fā)酵制氫，由于固定化細胞有一個 預培養(yǎng)過程，發(fā)酵延遲期較長，但總產(chǎn)氫量顯著提高。


圖1顯示以汽爆玉米秸稈為底物利用丁酸梭菌固定化細胞進行汽爆秸稈酶
解耦合發(fā)酵制氫與在單一發(fā)酵罐中進行同步糖化發(fā)酵的實驗結(jié)果對比示意圖。
圖2顯示以汽爆玉米秸稈為底物利用丁酸梭菌固定化細胞進行汽爆秸稈酶 解耦合發(fā)酵制氫的裝置簡圖。
具體實施例方式
圖2為顯示以汽爆玉米秸稈為底物利用丁酸梭菌固定化細胞進行汽爆秸稈 酶解耦合發(fā)酵制氫的裝置簡圖；圖中，酶解罐1下部通過第一循環(huán)泵3與發(fā)酵罐 2頂端相連通，發(fā)酵罐2下部通過第二循環(huán)泵4與酶解罐1頂端相連通，以形成 酶解一酶解的循環(huán)；發(fā)酵罐2的上端設(shè)有產(chǎn)氣出口。
實施例1.用本發(fā)明提供的方法以汽爆玉米秸稈為原料進行酶解耩合發(fā)酵制氫， 具體步驟如下
1、 將汽爆玉米秸稈原料置于酶解罐中，加入纖維素酶25IU/g-底物和用硫酸調(diào) 節(jié)pH4.8的自來水，水中含有尿素2g/1, KH2PO40.51g/l， MgS04 0.31g/l，汽爆秸 稈和水溶液的固液比是1: 8(w/v)，于50'C下酶解；
2、 制備丁酸梭菌(C 6"0^c腦AS 1.209)種子培養(yǎng)
每升種子培養(yǎng)基包括以下組分葡萄糖20g，酵母抽提物3g，KH2PO40.2g， K2HP04 1.6g, MgS04'7H20 0.2g， NaCl O.lg， CaCl2 O.Olg， Na2S'9H20 0.25g, NaMo04.2H20 O.Olg， NaHC03 0.2g and (NH4)2S04 3.0g;將丁酸梭菌接種于種子
培養(yǎng)基，35'C厭氧培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即制得丁酸梭菌種子液接種；
3、 將處于對數(shù)生長期的丁酸梭菌(C.^O^'c"w AS 1.209)種子液與重量百
分比濃度2%的海藻酸鈉溶液混合，得丁酸梭菌種子液海藻酸鈉混合溶液；丁酸
梭菌種子液與海藻酸鈉溶液的體積比為1: 3;用無菌的注射器吸取丁酸梭菌種
子液海藻酸鈉混合溶液并慢慢滴入濃度為0. 05mol/l的無菌CaCl,溶液中，丁酸 梭菌種子液海藻酸鈉混合溶液與CaCl2溶液的體積比為l: 4,制得丁酸梭菌固定 化細胞，浸泡放置30分鐘后，傾去液體，加入無菌去離子水，沖洗3次后，用 于發(fā)酵反應(yīng)；
4、 制取固定化細胞顆粒的同時，將酶解相靜置酶解，固定化細胞制取好以 后，置于發(fā)酵罐中，用泵把酶解相的酶解液泵入發(fā)酵罐，將固定化細胞浸沒后停
止循環(huán)，迅速通入氮氣除氧，在35'C下進行細胞預培養(yǎng)6小時后，開啟整個系 統(tǒng)進行循環(huán)，控制循環(huán)速度為15ml/min，用排水集氣法收集產(chǎn)生的氣體。
連續(xù)發(fā)酵86小時，發(fā)酵產(chǎn)物中只有氫氣和二氧化碳，其中，氫氣含量為43 %，比產(chǎn)氫率為72ml/g-底物。
實施例2.用本發(fā)明提供的方法以汽爆麥秸稈為原料進行酶解耦合發(fā)酵制氫 具體步驟如下
1、將汽爆麥秸稈原料置于酶解罐中，加入纖維素酶25IU/g-底物和用硫酸調(diào)節(jié) pH4.8的自來水，水中含有酵母抽提物2g/1， KH2PO40.51g/l, MgS040.31g/l，汽 爆秸稈和水溶液的固液比是1: 10(w/v)，于50'C下酶解；
步驟2同實施例1;
3、 將處于對數(shù)生長期的丁酸梭菌(C.^O^'c^n AS 1.209)種子液與無菌的 3%海藻酸鈉溶液混合，種子液與海藻酸鈉溶液的體積比為1:4。用無菌的注射器 吸取混合液，將混合液慢慢滴入無菌的0. 05mol/l CaCl2溶液中，混合液與CaCl2 溶液的體積比為l: 3，制得固定化細胞，浸泡放置30分鐘后，傾去液體，加入 無菌去離子水，沖洗3次后，用于發(fā)酵反應(yīng)；
4、 制取固定化細胞顆粒的同時，將酶解相靜置酶解，固定化細胞制取好以 后，用泵把酶解相的酶解液泵入發(fā)酵罐，將固定化細胞浸沒后停止循環(huán)，迅速通 入氮氣除氧后，置于發(fā)酵罐中，在35'C下進行細胞預培養(yǎng)。IO小時后，開啟整 個系統(tǒng)進行循環(huán)，控制循環(huán)速度為20ml/min，用排水集氣法收集產(chǎn)生的氣體。
連續(xù)發(fā)酵86小時，發(fā)酵產(chǎn)物中只有氫氣和二氧化碳，其中，氫氣含量為42.5 %，比產(chǎn)氫率為66ml/g-底物。
實施例3.用本發(fā)明提供的方法以汽爆稻草秸稈為原料進行酶解耦合發(fā)酵制 氫具體步驟如下
1、將汽爆稻草秸稈原料置于酶解罐中，加入纖維素酶25IU/g-底物和用硫酸調(diào) 節(jié)pH4.8的自來水，水中含有尿素2g/1， KH2PO40.51g/l， MgS04 0.31g/l，汽爆秸 稈和水溶液的固液比是1: 12(w/v)，于5(TC下酶解。
步驟2同實施例1。
3、 將處于對數(shù)生長期的丁酸梭菌(C. 6"077'cww AS 1.209)種子液與無菌的 4%海藻酸鈉溶液混合，種子液與海藻酸鈉溶液的體積比為1:5。用無菌的注射器 吸取混合液，將混合液慢慢滴入無菌的0.05mol/lCaCl2溶液中，混合液與CaCl2 溶液的體積比為l: 5，制得固定化細胞，浸泡放置30分鐘后，傾去液體，加入 無菌去離子水，沖洗3次后，用于發(fā)酵反應(yīng)。
4、 制取固定化細胞顆粒的同時，將酶解相靜置酶解，固定化細胞制取好以 后，置于發(fā)酵罐中，用泵把酶解相的酶解液泵入發(fā)酵罐，將固定化細胞浸沒后停 止循環(huán)，迅速通入氮氣除氧后，進行細胞預培養(yǎng)。8小時后，開啟整個系統(tǒng)進行 循環(huán)，控制循環(huán)速度為18ml/min，用排水集氣法收集產(chǎn)生的氣體。
連續(xù)發(fā)酵86小時，發(fā)酵產(chǎn)物中只有氫氣和二氧化碳，其中，氫氣含量為45 %，比產(chǎn)氫率為68ml/g-底物。
實施例4.用本發(fā)明提供的方法以汽爆高粱秸稈為原料進行酶解耦合發(fā)酵制 氫具體步驟如下
1、將汽爆高粱秸稈原料置于酶解罐中，加入纖維素酶25IU/g-底物和用硫酸調(diào) 節(jié)pH4.8的自來水，水中含有酵母抽提物2g/1， KH2PO40.51g/l， MgS04 0.31g/l， 汽爆秸稈和水溶液的固液比是1: 10(w/v)，于5(TC下酶解。 步驟2同實施例1。
3、 將處于對數(shù)生長期的丁酸梭菌(C. 6w>ria/m AS1.209)種子液與無菌的 5%海藻酸鈉溶液混合，種子液與海藻酸鈉溶液的體積比為1:6。用無菌的注射器 吸取混合液，將混合液慢慢滴入無菌的0.05mol/lCaCl2溶液中，混合液與CaCl2 溶液的體積比為l: 4，制得固定化細胞，浸泡放置30分鐘后，傾去液體，加入 無菌去離子水，沖洗3次后，用于發(fā)酵反應(yīng)。
4、 制取固定化細胞顆粒的同時，將酶解相靜置酶解，固定化細胞制取好以 后，置于發(fā)酵罐中，用泵把酶解相的酶解液泵入發(fā)酵罐，將固定化細胞浸沒后停 止循環(huán)，迅速通入氮氣除氧后，在35'C下進行細胞預培養(yǎng)。12小時后，開啟整 個系統(tǒng)進行循環(huán)，控制循環(huán)速度為12ml/min，用排水集氣法收集產(chǎn)生的氣體。
連續(xù)發(fā)酵86小時，發(fā)酵產(chǎn)物中只有氫氣和二氧化碳，其中，氫氣含量為44.6 %，比產(chǎn)氫率為67ml/g-底物。
權(quán)利要求
1、一種利用固定化細胞進行汽爆秸稈酶解耦合發(fā)酵制取氫氣的方法，其步驟如下(1)制備丁酸梭菌固定化細胞將處于對數(shù)生長期的丁酸梭菌種子液與質(zhì)量百分比濃度為2～5％海藻酸鈉溶液混合，得丁酸梭菌種子液海藻酸鈉混合液；所述丁酸梭菌種子液與海藻酸鈉溶液混合的體積比為1∶3～1∶6；用無菌注射器吸取丁酸梭菌種子液與海藻酸鈉的混合液，推動注射器，將混合液滴入濃度為0.05mol/l的無菌CaCl2溶液中，保持30分鐘，制取丁酸梭菌固定化細胞；所述丁酸梭菌種子液海藻酸鈉混合液與無菌CaCl2溶液的體積比為1∶3～1∶6；(2)在制取固定化細胞的同時，將汽爆秸稈料置于在酶解罐中50℃下靜置制備酶解液；所述酶解液的制備如下將汽爆秸稈料置于酶解罐中，加入纖維素酶和用硫酸調(diào)節(jié)pH4.8的水溶液，50℃下酶解得酶解液；每克汽爆秸稈料加25IU纖維素酶；每升所述水溶液含尿素或酵母抽提物2g，KH2PO4 0.51g和MgSO4 0.31g；所述汽爆秸稈重量與水溶液體積的固液比是1∶8～12(w/v)；(3)酶解耦合發(fā)酵制取氫氣固定化細胞制取好以后，開啟安裝在酶解罐與發(fā)酵罐之間的連接管路上的循環(huán)泵把一部分酶解液泵入發(fā)酵罐，待固定化細胞被浸沒后，關(guān)閉循環(huán)泵停止循環(huán)，迅速向發(fā)酵罐通入氮氣除氧，于35℃下進行固定化細胞預培養(yǎng)；待細胞預培養(yǎng)6-12小時后，再次開啟循環(huán)泵源源不斷地將酶解液泵入發(fā)酵罐中，進行酶解耦合發(fā)酵制得氫氣；發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)生的氫氣從發(fā)酵罐頂端排出，用排水集氣法收集所制得的氫氣。
2、 按權(quán)利要求1所述的利用固定化細胞進行汽爆秸稈循環(huán)酶解發(fā)酵制取氫 氣的方法，其特征在于，所述的固定化細胞預培養(yǎng)是利用酶解產(chǎn)生的糖液進行的。
3、 按權(quán)利要求1所述的利用固定化細胞進行汽爆秸稈循環(huán)酶解發(fā)酵制取氫氣的方法，其特征在于，所述固定化細胞預培養(yǎng)6 12小時后，再開啟循環(huán)泵將 酶解液泵入發(fā)酵罐中的速度為10 20ml/min。
4、按權(quán)利要求1所述的利用固定化細胞進行汽爆秸稈循環(huán)酶解發(fā)酵制取氫 氣的方法，其特征在于，所述的汽爆秸稈料為汽爆玉米秸稈料、汽爆高梁秸稈料 或汽爆小麥秸稈料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用固定化細胞進行汽爆秸稈酶解耦合發(fā)酵制取氫氣的方法，該方法將汽爆秸稈和丁酸梭菌微生物分別置于不同的反應(yīng)器中，使兩者能夠同時在各自最適的溫度下進行；利用丁酸梭菌固定化細胞使菌體停留在發(fā)酵相，發(fā)酵液不斷被泵入進入酶解相，將酶解產(chǎn)生的糖洗脫下來，并不斷循環(huán)回到發(fā)酵罐中，使微生物保持在高活性狀態(tài)，提高了反應(yīng)效率，氫氣產(chǎn)率高。
文檔編號C12P3/00GK101173303SQ20061011430
公開日2008年5月7日 申請日期2006年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月3日
發(fā)明者李冬敏, 陳洪章 申請人:中國科學院過程工程研究所