土壤降解菌及其組合對耕地胡敏酸降解的實(shí)驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種土壤胡敏酸降解特征的實(shí)驗(yàn)方法，具體地說，涉及一種土壤降解 菌及其組合對耕地胡敏酸降解的實(shí)驗(yàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胡敏酸（humicacid，HA)是土壤腐殖酸中分子量中等，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，化學(xué)及生物學(xué) 性質(zhì)較活躍的組分。HA與土壤微生物的關(guān)系密切，其結(jié)構(gòu)中所含有的脂肪C、小分子碳水化 合物、芳香環(huán)支鏈中的C、N均能夠充當(dāng)C、N源以供微生物代謝。以往有關(guān)降解菌與HA相互 關(guān)系的研宄主要集中在HA降解菌分離鑒定方面。本研宄自五種植被類型（農(nóng)田、油松、刺 槐、沙棘、混交林）土壤分離5株HA降解菌，進(jìn)一步選取B.licheniformis、M.resistens、 S.maltophilia3株降解菌，探討這3株菌及其組合對耕地HA的降解程度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種土壤降解菌及其組合對耕 地胡敏酸降解的實(shí)驗(yàn)方法，首先，以耕地土壤HA作為培養(yǎng)基唯一C、N源，而以往的研宄所用 培養(yǎng)基往往選用單一物質(zhì)補(bǔ)充C源（葡萄糖）及N源（酵母浸出粉、酒石酸銨、順4勵3等）。 第二，對3株土壤HA降解菌進(jìn)行了單菌落及不同組合處理，結(jié)合紅外光譜研宄了降解菌對 HA中C的降解程度及結(jié)構(gòu)特征的影響。以期為耕地HA降解過程中結(jié)構(gòu)特征變化及有機(jī)碳 固定提供依據(jù)。
[0004] 其具體技術(shù)方案為：
[0005] -種土壤降解菌及其組合對耕地胡敏酸降解的實(shí)驗(yàn)方法，包括如下步驟：
[0006] (1)呼吸量碳測定：將90mm培養(yǎng)皿組合，連接處使用阿拉伯膠封口，外層粘貼封口 膜以保證氣密性，HA固體培養(yǎng)基粘附在頂部，以1.Omol?I71的NaOH10.OmL收集降解菌呼 吸所釋放的C02，每24h用0. 5mol?L-1的HC1滴定一次，HC1具體濃度用Na2B407 ? 10H20標(biāo) 定，于28°C培養(yǎng)14d，滴定過程中為培養(yǎng)基補(bǔ)充3min無菌空氣，該時(shí)間內(nèi)所損失的0)2量通 過30min的C02吸收量換算；
[0007] (2)培養(yǎng)結(jié)束后選取一個(gè)典型重復(fù)，將所有菌落挑出，之后使用NaOH與Na4P207混 合浸提劑進(jìn)行HA二次提取，NaOH及Na4P207&度均為0.lmol*L―1，首先使用40mL浸提劑緩 慢沖洗HA固體培養(yǎng)基，邊沖洗邊以0. 45ym微孔濾膜過濾，該過程持續(xù)4h，之后使用100mL 混合浸提劑分5次浸泡HA固體培養(yǎng)基，第4次時(shí)培養(yǎng)基已經(jīng)透明，此時(shí)浸提工作已經(jīng)基本 完成，浸泡時(shí)間均為24h，所有浸提溶液均轉(zhuǎn)移至150mL容量瓶用于測定紅外光譜。
[0008] 進(jìn)一步，呼吸量碳指降解菌通過呼吸作用消耗的C量。按照下式計(jì)算：
[0009] RC= (2V「VV〇)WX6
[0010] 式中：VpVyV。分別表示空白、3minC02損失量、處理滴定所消耗HC1體積mL;W為 HC1濃度mol?L4#為轉(zhuǎn)換系數(shù)；
[0011] 微生物生物量碳指降解菌機(jī)體的C量，采用熏蒸培養(yǎng)法測定，以皿為單位換算，按 下式計(jì)算：
[0012]MBC= (MrM〇)/k
[0013] 式中：MpM。分別代表熏蒸及未熏蒸培養(yǎng)基釋放的C0 2量mg?皿是常數(shù)，取 0. 411〇
[0014] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Excel2013、SAS8. 1完成數(shù)據(jù)處理及方差分析，紅外光譜吸收峰 面積使用OPUS6. 5軟件計(jì)算。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0016] 1)3號菌的生長狀況最好，在129~226CFU?皿―1之間，說明3號菌對HA有很強(qiáng) 的適應(yīng)能力。各組合處理中1號菌長勢穩(wěn)定，落差較小，2號菌在組合處理中長勢最差，尤以 在T12與T123中明顯，所占比重僅為總菌落數(shù)的25. 00%與1.94%。組合處理中各菌落之 間無相互覆蓋現(xiàn)象，說明不同菌落之間可共存。
[0017] 2)各處理呼吸量碳均存在顯著差異（P< 0.05)，表現(xiàn)為組合處理大于單菌落處 理，T1的呼吸量碳較T2與T3高出105. 69%及26. 87%，說明1號菌的呼吸能力較強(qiáng)。T3、 T1及T13的MBC明顯高于其他處理（P< 0. 05)，T2的MBC最低，僅為T3的26. 61 %，可見 1、 3號菌的固碳能力較強(qiáng)，2號菌固碳能力較弱。T23與T13總降解率明顯高于其他處理（P< 0? 05)，分別為 59. 78%及 56. 71%，T123、T12、T3 及T1 總降解率在 42. 68%~50. 91% 之間，T2僅為21. 73%。
[0018] 3)培養(yǎng)結(jié)束HA紅外光譜顯示，各處理多糖類及醇類物質(zhì)增加，尤其以T12、T123增 幅明顯。含1號菌的各處理對芳香碳有較強(qiáng)的降解能力，使得HA結(jié)構(gòu)趨于簡單，腐殖化程 度降低。2號菌的1151/1637、（1045+1075)/1637及1357/1637三處吸收峰強(qiáng)度區(qū)域比值 均高于降解前水平，但是增幅低于其他處理。
【附圖說明】
[0019]圖 1 是掃描電鏡圖，圖la為B.licheniformis，圖lb為M.resistens，圖lc為 S.maltophilia；
[0020] 圖2是降解菌菌落數(shù)隨時(shí)間變化圖；
[0021] 圖3是呼吸量碳隨時(shí)間變化趨勢圖；
[0022] 圖4是降解結(jié)束后HA紅外光譜。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0024] 1材料與方法
[0025]1. 1土樣采集
[0026] 供試土樣來自陜西永壽縣馬蓮灘林場，按照典型性和恢復(fù)階段相近的原則，于5 種植被類型（農(nóng)田、油松、刺槐、沙棘、混交林）表層〇 -l〇cm土壤中各取3個(gè)土樣。將土樣 分2部分處理，一部分于室內(nèi)風(fēng)干，過2mm篩制備HA。另一部分于4°C冷藏，待用時(shí)室溫培 養(yǎng)24h，過2mm篩制備土壤菌懸液。
[0027] 1. 2 土壤HA降解菌的分離與鑒定
[0028] 按照文啟孝所用方法提取土壤HA，利用各植被類型土壤所提取HA為唯一C、N源 制作培養(yǎng)基，具體成分包括：擬0.2300左右8、恥(：10.258、4 8&1'1.0(^、(11120 50.01111，調(diào) 節(jié)pH為7. 3。0.IMPa蒸汽滅菌30min后無菌操作轉(zhuǎn)移至90mm培養(yǎng)皿，每皿15.OmL。研宄 所用HA培養(yǎng)基含碳量均為28. 34mg。稱10. 00g土樣于250mL三角瓶，加入100.OmL無菌 蒸餾水，搖床震蕩30min后，吸取100uL上清液均勻涂于上述HA固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)14d，期 間測定了降解菌對HA的降解率（表1)。待菌落明顯后分離菌種，經(jīng)作者之前的研宄，共得 到Bacilluslicheniformis(99. 65%)、Rhizobiumnepotum(99. 78%)、Microbacterium resistens(98. 71 %)、Stenotrophomonasmaltophilia(99. 23 %)、Streptomyces azureus(99. 78% ) 5 株降解菌。
[0029] 1.3實(shí)驗(yàn)用菌選擇
[0030] 實(shí)驗(yàn)中以選用的菌種菌落數(shù)之和占總體的比重較大、長勢較好為標(biāo)準(zhǔn)（表1)，選 取B.licheniformis、M.resistens及S.maltophilia3 株降解菌，分別編號 1 號、2 號、3 號 (圖1)，設(shè)7處理Tl、T2、T3、T12、T13、T23、T123,進(jìn)一步研宄這3株降解菌及其組合對耕 地HA中C的降解狀況，為便于表達(dá)，將T1、T2、T3合稱單菌落處理，1'12、1'13、123、1'123合 稱為組合處理。耕地HA固體培養(yǎng)基組分同1. 2。0.IMPa蒸汽滅菌30min，稍冷卻無菌操作 轉(zhuǎn)移至90mm培養(yǎng)皿，每皿15.OmL，每個(gè)處理設(shè)4重復(fù)。耕地HA中含C為41. 08%，含N為 4. 32%〇
[0031] 用接種環(huán)自菌種1號、2號、3號純化后菌落點(diǎn)取少量降解菌，轉(zhuǎn)移至含有10.OmL 耕地HA液體培養(yǎng)基的滅菌小試管（HA液體培養(yǎng)基除無agar外，組份同前述），于37°C搖床 培養(yǎng)，每24h取15yL定容于150mL容量瓶，充分搖勻后，取100yL菌液均勻涂于HA固體 培養(yǎng)基。觀察各降解菌在培養(yǎng)基中的菌落數(shù)（colonyformingunit，CFU)，數(shù)量以皿為單 位計(jì)數(shù)。待各降解菌菌落數(shù)穩(wěn)定后（第5天，圖2)，T1、T2、T3各取15. 0yL相應(yīng)降解菌的 HA液體培養(yǎng)基定容于150mL容量瓶，充分搖勾，吸取100yL涂于HA固體培養(yǎng)基。T12取含 1號、2號降解菌的HA液體培養(yǎng)基各7. 5yL定容于150mL容量瓶，其余過程同T1 (T23、T13 同理），T123則各取5. 0yL，操作過程同上述。每皿HA含C為28. 34mg，菌液稀釋倍數(shù)為 1X104 倍。
[0032] 表1供試菌種形態(tài)特征
[0033]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 土壤降解菌及其組合對耕地胡敏酸降解的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 呼吸量碳測定：將90_培養(yǎng)皿組合，連接處使用阿拉伯膠封口，外層粘貼封口膜以 保證氣密性，HA固體培養(yǎng)基粘附在頂部，以I.Omol?I71的NaOH10.OmL收集降解菌呼吸所 釋放的CO2，每24h用0. 5mol?I/1的HCl滴定一次，HCl具體濃度用Na2B407 ?IOH2O標(biāo)定， 于28°C培養(yǎng)14d，滴定過程中為培養(yǎng)基補(bǔ)充3min無菌空氣，該時(shí)間內(nèi)所損失的CO2量通過 30min的CO2吸收量換算； (2) 培養(yǎng)結(jié)束后選取一個(gè)典型重復(fù)，將所有菌落挑出，之后使用NaOH與Na4P2O/混合浸 提劑進(jìn)行HA二次提取，NaOH及Na4P207&度均為0.Imol噸―1，首先使用40mL浸提劑緩慢沖 洗HA固體培養(yǎng)基，邊沖洗邊以0. 45ym微孔濾膜過濾，該過程持續(xù)4h，之后使用IOOmL混合 浸提劑分5次浸泡HA固體培養(yǎng)基，第4次時(shí)培養(yǎng)基已經(jīng)透明，此時(shí)浸提工作已經(jīng)基本完成， 浸泡時(shí)間均為24h，所有浸提溶液均轉(zhuǎn)移至150mL容量瓶用于測定紅外光譜。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤降解菌及其組合對耕地胡敏酸降解的實(shí)驗(yàn)方法，其特征 在于，呼吸量碳指降解菌通過呼吸作用消耗的C量；按照下式計(jì)算： RC=(2Y,-Y2-Y0)^X6 式中：V1J2Jtl分別表示空白、3minCO2損失量、處理滴定所消耗HCl體積mL;W為HCl濃度mol 為轉(zhuǎn)換系數(shù)； 微生物生物量碳指降解菌機(jī)體的C量，采用熏蒸培養(yǎng)法測定，以皿為單位換算，按下式 計(jì)算： MBC= (M1-M0)/k 式中：M1 Jtl分別代表熏蒸及未熏蒸培養(yǎng)基釋放的CO2量mg?皿、k是常數(shù)，取0.411; 實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Excel2013、SAS8. 1完成數(shù)據(jù)處理及方差分析，紅外光譜吸收峰面積 使用OPUS6. 5軟件計(jì)算。
【專利摘要】本發(fā)明公開了土壤降解菌及其組合對耕地胡敏酸降解的實(shí)驗(yàn)方法，選取3株土壤胡敏酸降解菌，研究三者及其不同組合對耕地HA的降解程度及結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響。降解14天后，菌落數(shù)總量為T13＞T3＞T123＞T23＞T1＞T2＞T12，T1、T2的菌落數(shù)為T3的53.95％及26.98％，含1號菌的處理對芳香碳結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的降解能力，HA培養(yǎng)基的腐殖化程度低于降解前，結(jié)構(gòu)趨于簡單，而2號菌這種能力。各處理脂類及含氮類物質(zhì)較降解前分別增加了2.33-3.23倍及1.48-1.74倍，更說明了1號菌及其與3號菌的組合對于復(fù)雜有機(jī)碳的講解能力和趨勢。
【IPC分類】G01N21-3577
【公開號】CN104819951
【申請?zhí)枴緾N201510244441
【發(fā)明人】劉夢云, 付東磊, 石志華, 吳健利, 劉麗雯, 劉效棟, 虞亞楠
【申請人】西北農(nóng)林科技大學(xué)
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年5月9日