專利名稱：細(xì)胞內(nèi)含有巨大葉綠體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種細(xì)胞內(nèi)含有巨 大葉綠體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗已成為目前研究的熱點。與傳統(tǒng)疫苗相比， 植物源性疫苗具有安全、穩(wěn)定、高效的特點。隨著生物技術(shù)的不斷完善，植物生 物反應(yīng)器將會成為疫苗生產(chǎn)的有效途徑，并部分替代傳統(tǒng)疫苗的生產(chǎn)方式。葉綠體基因組轉(zhuǎn)化由Boynton等20世紀(jì)80年代末首次在單細(xì)胞植物衣藻中 獲得成功，之后多家實驗室轉(zhuǎn)化高等植物葉綠體獲得成功，近年來的研究取得了 突破進(jìn)展，并成為國際植物生物技術(shù)研究的一個熱點，尤其是有關(guān)葉綠體轉(zhuǎn)化的 高效表達(dá)特性的報道，使其在植物生物反應(yīng)器的應(yīng)用日益受到重視與常規(guī)外源基因核轉(zhuǎn)化相比，葉綠體具有獨特優(yōu)點基因區(qū)域化高效表達(dá)、 母性遺傳避免轉(zhuǎn)基因花粉傳播、生物安全性高、不會產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象、可直接 表達(dá)原核基因、產(chǎn)物區(qū)域化、可高效表達(dá)外源基因、以及利于同時進(jìn)行多基因的 轉(zhuǎn)化等等。因此，植物葉綠體基因工程越來越引起人們的廣泛關(guān)注。目前該技術(shù) 主要應(yīng)用于葉綠體作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗等醫(yī)藥蛋白；獲得抗蟲、抗病、抗 除草劑和耐旱的轉(zhuǎn)基因植物。但是，植物葉綠體轉(zhuǎn)化也存在明顯的不足，高等植物細(xì)胞約有50-200個葉綠 體，葉綠體轉(zhuǎn)化經(jīng)過抗性篩選得到的植林一般是異質(zhì)的(heteroplasmic)，即轉(zhuǎn)化和 未被轉(zhuǎn)化葉綠體同時存在于轉(zhuǎn)基因植抹。這種雜合體遺傳不穩(wěn)定，目的基因表達(dá)
產(chǎn)量不高。然而，獲得同質(zhì)化(homoplasmic)轉(zhuǎn)基因植林正是葉綠體轉(zhuǎn)化相對于常 規(guī)細(xì)胞核轉(zhuǎn)化的主要困難。因此，必須設(shè)法使轉(zhuǎn)基因植抹達(dá)到同質(zhì)化(homoplasmic) 狀態(tài)。國內(nèi)自90年代初期開展葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化工作以來，已將編碼氨基糖苷3' 腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的aadA基因以及編碼PPT(Phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶的bar基因、 編碼蘇云金芽孢桿菌晶體毒蛋白的Bt基因^口人丙肝病毒融合抗原基因NS3C等成 功地導(dǎo)入到高等植物的葉綠體基因組中，有些外源基因已獲得表達(dá)。但分子檢測 表明，幾乎所有轉(zhuǎn)基因植林均未能達(dá)到完全同質(zhì)化狀態(tài)1。如何才能快速獲得同質(zhì) 化葉綠體轉(zhuǎn)基因植抹，已成為長期困擾我們而且也是亟待解決的難題。外源基因向葉綠體基因組中的整合是通過同源重組實現(xiàn)的。關(guān)于如何提高同 源重組的效率以及提高轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)基因抹系的同質(zhì)化程度，國外已有一些文獻(xiàn)對 此進(jìn)行了報道。主要有如下幾種方法(1) 在轉(zhuǎn)化前設(shè)法降低受體細(xì)胞中葉綠體DNA的含量。這可以通過使用DNA 損傷試劑(DNA damaging agents)或用葉綠體DNA合成抑制劑處理受體細(xì)胞來實 現(xiàn)。Boynton等報道在基因槍轉(zhuǎn)化前，將受體細(xì)胞(Chlamydomonas reinhardtii)用 5mmol/L的5氟脫氧尿苷(FdUrd， 5 fluorodeoxyuridine)處理，使其葉綠體基因組 的數(shù)量減少5-7倍，可使轉(zhuǎn)化效率提高20-280倍];Kindle等用O.5mmol/L的FdUrd 處理衣藻細(xì)胞，并將其置于弱光(0.1w/m2)下培養(yǎng)一段時間再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也得出了 相似的結(jié)論;Ye等報道，用DNA促旋酶抑制劑(200mmol/L萘咬酮酸或30 mmol/L 新生霉素)處理受體細(xì)胞(Solanum nigrum),可有效降低葉綠體DNA的含量，從而 可用于提高高等植物葉綠體轉(zhuǎn)化效率和同質(zhì)化程度。(2) 紫外照射法轉(zhuǎn)化前，將受體細(xì)胞用低劑量(1.7 x 105ergs/cm2)的UV (〈80nm)短暫照射，可將轉(zhuǎn)化率提高4倍。紫外照射可促進(jìn)藍(lán)細(xì)菌轉(zhuǎn)化過程中外 源序列的整合。(3) 野生型E.coli recA基因介導(dǎo)法:Cerutti等的研究結(jié)果表明，野生型E.coli RecA蛋白可使葉綠體DNA同源重組的頻率提高15倍]。因此，將E.coli recA基 因?qū)肴~綠體基因組中，可以提高DNA分子的重組頻率從而提高轉(zhuǎn)化子的同質(zhì)化 水平。上述各種方法，雖然都取得了一定的成效，但也都存在一定的局限性。如 用FdUrd處理，只適用于藻類等低等真核生物，對于高等植物的葉綠體則沒有效 果；UV照射的方法也只見于衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化的報道。而且無論是FdUrd，還是葉 綠體DNA合成抑制劑以及低劑量的UV C，雖然都能在不同程度上提高葉綠體轉(zhuǎn) 化效率和同質(zhì)化程度，但它們都對受體細(xì)胞的生長有相當(dāng)程度的抑制和損害作用。 另外，還有一種方法就是在高濃度的選擇壓力下對轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行多輪次抗性篩選。 由于細(xì)胞內(nèi)含有50-200個葉綠體，因而需要經(jīng)過多個世代的選擇與擴增才能占據(jù) 優(yōu)勢地位。要得到完全同質(zhì)化的轉(zhuǎn)基因植抹，最少也需要3 - 5年的時間。總而言之，目前葉綠體基因轉(zhuǎn)化的同質(zhì)化依然沒有很有效的解決方法，這也 給該技術(shù)的廣泛應(yīng)用帶來了困難。但是如果直接減少細(xì)胞中葉綠體的數(shù)量，甚至 每個細(xì)胞中僅有一個巨大的葉綠體，就會極大地提高葉綠體的轉(zhuǎn)化效率以及同質(zhì) 化篩選效率。發(fā)明內(nèi)容為了完成上述問題提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明解決了目前葉綠體轉(zhuǎn)化 中存在的上述問題。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)植物葉綠體與原核生物的分裂機制類似，也利用FtsZ蛋白進(jìn)行分 裂。本發(fā)明的發(fā)明人分別從煙草、龍膽、鳥巢蕨和衣藻等材料中克隆了多個ftsZ 基因，通過分析不同家族ftsZ基因的功能，證明了植物中不同家族的ftsZ基因均 參與了葉綠體的分裂過程。本發(fā)明從煙草中克隆了 1個ftsZ基因，已經(jīng)在GenBank 登陸注冊(No.AF205858)。進(jìn)一步利用ftsZ正反義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草后得到了 只有1-3個巨大葉綠體的轉(zhuǎn)基因煙草。轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體數(shù)目的明顯減少意味著葉 綠體同質(zhì)化篩選效率的提高，為研制高效葉綠體生物反應(yīng)器奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞內(nèi)含有巨大葉綠體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明的另 一 目的是提供一種制備上述細(xì)胞系的方法。本發(fā)明的再一目的是提供上述細(xì)胞系的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)含有巨大葉綠體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系包含外源導(dǎo)入的正義、或反義ftsZ基因。優(yōu)選地，所述ftsZ基因為NtFtsZ2-l基因，其GenBank登陸注 冊號為No.AF205858。優(yōu)選地，所述細(xì)胞系為包含外源導(dǎo)入的正義、或反義ftsZ基因的轉(zhuǎn)基因煙草 細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明的制備上述細(xì)胞系的方法包括以下步驟1) 構(gòu)建包含正義、或反義ftsZ基因的表達(dá)載體；和2) 用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、優(yōu)選煙草細(xì)胞系。優(yōu)選地，所述ftsZ基因為NtFtsZ2-l基因，其GenBank登陸注冊號為No. AF205858。本發(fā)明還提供了上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了如下研究工作。 煙草NtFtsZ2-l基因的克隆提取煙草幼嫩葉片的總RNA并以其為模板，分別以O(shè)ligo dT和所設(shè)計的煙草 NtFtsZ2-l cDNA特異3'端引物NP6作逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)完成后各取2ul逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作
為模板，以特異引物NP5和NP6進(jìn)行PCR擴增。結(jié)果是以特異3'引物NP6的逆 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板擴增得到約1.4kb左右的單一產(chǎn)物(圖1A)。將此擴增條帶純化回 收后，與pMD18-T Vector連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。挑取單克隆質(zhì) 粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定(圖1 B)后，選取陽性克隆測序。測序結(jié)果表明所得到 的克隆與GenBank中已注冊的煙草ftsZ cDNA ( accession number:AJ271750 )序列 一致。煙草NtFtsZ2-l基因的序列分析為了進(jìn)一步分析NtFtsZ2-l的內(nèi)含信息，將所獲得的煙草NtFtsZ2-l蛋白序列 與公共數(shù)據(jù)庫公布的其它高等植物及典型細(xì)菌的FtsZ蛋白序列做了同源性比較分 析，結(jié)果顯示NtFtsZ2-l蛋白序列具有FtsZ蛋白的典型特征，其中部的功能區(qū)非 常保守，包含了所有FtsZ蛋白的兩個保守基序FTSZ—1: VIGVGGGGSNAVNRM (PROSITE PS01134)和FTSZ一2: FATAGMGGGTGS/ TGAAPV/IV/IA (PROSITE PS01135)(圖2),并且在FTSZ_2的保守序列中還包括了真核生物微管蛋白(tubulin)的典型基序:GGGTGSG (PROSITE PS00277),有研究表明該富含谷氨酸 的保守位點為GTPase的核心序列，此序列的保守性對于維持FtsZ蛋白的GTPase 活性是必須的，定點突變實驗也證實FtsZ蛋白中的GGGTGTG序列的變化明顯影 響其GTPase的活力(Dai et al，1994;RayChaudhuri et al,1994)。 FTSZ—1保守序列的 功能現(xiàn)在還不清楚。通過與原核生物FtsZ蛋白序列的比較分析顯示，目前所發(fā)現(xiàn) 的高等植物FtsZ蛋白都有一個突出的N末端，這是與原核生物FtsZ蛋白相區(qū)別 的一個明顯標(biāo)志，而我們所克隆的NtFtsZ2-l蛋白序列N端也具有明顯的延伸序 列。此外，又將NtFtsZ2-l蛋白與NtFtsZl-1， NtFtsZl-2以及具有光合能力的藍(lán)細(xì) 菌的FtsZ蛋白序列做了蛋白序列的疏水性分析(結(jié)果見圖3)和氨基酸組成的比 較分析(結(jié)果見圖4)。為了解NtFtsZ2-l在煙草基因組中的存在狀態(tài)，對其進(jìn)行了 Southern雜交分析(圖5A)。實驗結(jié)果表明NtFtsZ2-l基因在煙草基因組中是以多拷貝的形式存在的。
為了解NtFtsZ2-1基因在煙草不同組織器官中的表達(dá)情況，分別提取了煙草根、 莖、葉、花的總RNA,以其部分序列作為探針進(jìn)行了 Northern和半定量RT-PCR 雜交分析(圖5B)。雜交結(jié)杲顯示NtFtsZ2-l基因在煙草葉片和花中的表達(dá)最強， 而在莖和根中的表達(dá)較弱，幾乎檢測不到,，以上實驗結(jié)果表明NtFtsZ2-1基因的表 達(dá)在煙草中有明顯的組織差異性，其在葉片與花部位的表達(dá)較為活躍?；虻墓δ?1) 煙草NtFtsZ2-l基因在E.coli中的表達(dá)和定位分析將煙草NtFtsZ2-l與egfp構(gòu)建成融合表達(dá)質(zhì)粒pKN后(載體鑒定如圖6)，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌后，通過顯微觀察分析了 NtFtsZ2-l:EGFP融合蛋白在大腸桿菌中的聚 合、定位及對菌體形態(tài)變化的影響。結(jié)果顯示融合表達(dá)質(zhì)粒pKN經(jīng)lmM IPTG誘導(dǎo)后，在宿主菌中大量表達(dá), 并嚴(yán)重干擾了宿主菌自身正常的細(xì)胞分裂周期，致使宿主菌體形態(tài)發(fā)生了明顯的 伸長。通過焚光觀察發(fā)現(xiàn)，沿宿主菌菌體縱軸方向有規(guī)律地分布著焚光點或焚光 帶(圖7 )。以上實驗結(jié)果表明，煙草NtFtsZ2-l蛋白能夠識別宿主菌中分裂位點的定位信 號，并且可以與宿主菌中的內(nèi)源蛋白相互作用而參與分裂裝置的組成，在分裂位 點聚集，從而在這些區(qū)域形成了熒光點或熒光帶；同時，外源NtFtsZ2-l蛋白的過 量表達(dá)也嚴(yán)重干擾了宿主菌的正常分裂過程。這一現(xiàn)象與用GFP標(biāo)記的內(nèi)源FtsZ 蛋白在大腸桿菌中的過量表達(dá)結(jié)果相似。(2) 煙草NtFtsZ2-l基因的功能分析雖然目前植物FtsZ蛋白在葉綠體分裂過程中的功能研究已經(jīng)取得了 一些進(jìn)展， 但是人們對FtsZ蛋白的功能以及葉綠體分裂分子機制的認(rèn)識還十分有限，并且對 于高等植物葉綠體分裂機制的研究主要集中在模式植物擬南芥上，而對其它物種 的研究還很少。本發(fā)明對煙草NtFtsZ2-l基因的表達(dá)及功能做了深入分析。將來自 煙草的NtFtsZ2-l基因構(gòu)建了正義和反義表達(dá)質(zhì)粒(載體鑒定如圖8 ),并通過農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草葉片，利用抗性篩選、PCR和PCR-Southern雜交對轉(zhuǎn)基 因植抹進(jìn)行了鑒定(如圖9),用微分千涉顯微鏡對所鑒定的陽性植抹進(jìn)行了表型 觀察，并對轉(zhuǎn)化植株葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，葉綠體的相對表面積以及葉綠素的舍量 進(jìn)行了測定。顯微觀察結(jié)果顯示NtFts^2-l基因的正義轉(zhuǎn)化和反義轉(zhuǎn)化均導(dǎo)致了葉肉細(xì)胞中 葉綠體的形態(tài)和數(shù)目發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞中葉綠體的數(shù)目與野生型相比明顯減 少而體積顯著增加(如圖10、 11)。但是通過對細(xì)胞內(nèi)葉綠體表面積的測定(如圖 12、 13 )則又表明在NtFtsZ2-l正反義轉(zhuǎn)基因植抹中葉綠體總的光合面積沒有發(fā)生 明顯的變化；轉(zhuǎn)化植抹的葉綠素含量測定(表l)也表明煙草NtFtsZ2-l基因的 正義和反義轉(zhuǎn)化雖然改變了煙草細(xì)胞的葉綠體形態(tài)和數(shù)目，但是植物細(xì)胞的光合 色素含量卻沒有發(fā)生明顯的變化。此外，對于內(nèi)標(biāo)分子葉綠素a，b結(jié)合蛋白Cab mRNA的半定量RT-PCR擴增結(jié)果(如圖14 )也進(jìn)一步表明在正反義轉(zhuǎn)基因煙草 中葉綠素a,b結(jié)合蛋白的表達(dá)沒有受到Nl:FtsZ2-l表達(dá)水平變化的影響，這也從側(cè) 面說明轉(zhuǎn)化植抹中的葉綠體仍然能夠進(jìn)行正常的光合作用。以上研究結(jié)果暗示著 植物細(xì)胞內(nèi)存在著某種機制協(xié)調(diào)葉綠體的總體積與細(xì)胞體積之比相對穩(wěn)定 (Pyke，1999;Robertson，1995 )，使其保持一個恒定的比值，從而保證了轉(zhuǎn)化植抹中 數(shù)目減少、體積增大的葉綠體能夠最大限度地吸收光能并使葉綠體的正常光合作 用得以維持。綜上所述細(xì)胞內(nèi)NtFtsZ2-l基因轉(zhuǎn)錄水平的升高或降低均會對葉綠體的分裂產(chǎn) 生抑制作用。這很可能是由于當(dāng)增加NtFtsZ2-l基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使細(xì)胞中的 NtFtsZ2-l蛋白過量表達(dá)時，其表達(dá)量超過正常葉綠體分裂所需，冗余的NtFtsZ2-l 蛋白會在正常的分裂位點處異常積累，從而干擾了其在分裂中正常功能的發(fā)揮， 抑制了葉綠體的分裂，并最終形成了體積膨大、數(shù)目減少的巨大葉綠體表型。反 之，反義抑制NtFtsZ2-l基因的表達(dá)會降低胞內(nèi)NtFtsZ2-l基因的轉(zhuǎn)錄量，導(dǎo)致葉
綠體正常分裂所需的NtFtsZ2-l蛋白量不足，造成葉綠體分裂事件的減少及分裂過 程的停滯。因此NtFtsZ2-l對煙草葉綠體分裂和形態(tài)的影響是遵循動態(tài)平衡和劑量 效應(yīng)的。表l:野生型及不同類型轉(zhuǎn)基因煙草中的葉綠素含量分析轉(zhuǎn)基因煙草 類型Wild typeSense-1Sense-2Sense-3Anti-lAnti-26.76±1.496.62±2.166.65±1.716.29±1.776.53±1.166.46±1.31cb2.50±0.422.51±0.632.52±0.522.55±0.562.79±0.272.51±0.41Ca+b9.30±2.459.12±2.869.28±2.158.84±2.259.33±1.268.99±1.68ca/cb2.58±0.292.63±0.262.65±0.492.46±0.382.34±0.342.58±0.30葉綠素總濃0.93±0.250.91±0.290.93±0.220.88±0.230.93±0.130.90±0.17度


圖1 :解N!FlsZ2-l OT的RT-PCR和pNF3重纟JL^N^t刀及PCR鑒定，A: M為入DNA/ EcoRI+Hind111雙切marker; lanel為Oligo dT逆轉(zhuǎn)錄后的 PCR結(jié)果；lane2為特異的3'端引物逆轉(zhuǎn)錄后的PCR結(jié)果；lane3為陰性對照；B: M為X DNA/ EcoRI+Hind111雙切marker; lanel為XhoI+EcoRI雙酶切；lane2 為HindIII單酶切;lane3為EcoRI單酶切;lane4為NtFtsZ2-l特異引物的PCR擴增結(jié)果。圖2:已知植物ftsZ2家族成員的氨基酸序列比較，下劃線示兩個保守的基序， 各序列的GenBank登錄號分別為A.thaliana FtsZ2-l, AF089738; A.thalianaFtsZ2-2, AF384167; L.longifloru FtsZ, AB042101; N.tabacum FtsZ2-l ， AJ271750; G.luteaFtsZ, AF205859。圖3 :煙草不同家族FtsZ蛋白的疏水性分析，A為N.tabacum FtsZl-l; B為N.tabacum FtsZ 1-2; C為N.tabacum FtsZ2-l 。圖4 :煙草不同家族的FtsZ蛋白及藍(lán)細(xì)菌FtsZ蛋白的氨基酸組成分析，A為N.tabacum FtsZl-l; B為N.tabacum FtsZl-2; C為N.tabacum FtsZ2-l; D為Anabaena FtsZ。圖5為煙草NtFtsZ2-1基因的核酸雜交分析，圖A: Southern雜交結(jié)果，lanel為EcoRI酶切，lane2為EcoRV酶切，lane3 為HindIII酶切；圖B:為煙草不同組織Northern雜交與半定量RT-PCR結(jié)果。圖6: 融合表達(dá)質(zhì)粒pKN的酶切及PCR鑒定圖語，1. NtFtsZ2-l特異上游引物與egfp特異下游引物的PCR擴增；2. Xbal單酶切；3. eg^特異引物的PCR擴增；4. Kpnl+EcoRI雙酶切；5. NtFtsZ2-l特異引物的PCR擴增；6. KpnI+SalI雙酶切；7. Kpnl單酶切；M.人DNA/EcoRI+HindIII雙酶切Marker。
圖7:融合表達(dá)質(zhì)粒pKN在大腸桿菌中的定位分析，A _ E為pKN重組質(zhì)粒 過量表達(dá)對于大腸桿菌菌體形態(tài)的影響(圖中標(biāo)尺為10um)。圖8:正義表達(dá)質(zhì)粒pGZS3和反義表達(dá)質(zhì)粒pGZA3的鑒定圖譜，圖A為正義表達(dá)質(zhì)粒pGZS3的PCR和酶切鑒定；圖B反義表達(dá)質(zhì)粒pGZA3的PCR和酶切鑒定。圖9:轉(zhuǎn)化植林的PCR-Southern雜交檢測，M:入DNA/EcoRI+Hindlll雙切marker, Lane3-6為正義轉(zhuǎn)化植才朱pGZS3的 PCR-Southern雜交檢測；Lane7-10為反義轉(zhuǎn)化植林pGZA3的PCR-Southern雜 交檢測；Lane2為pBI121陽性植株對照；Lanel為pBI121陰性植抹對照。圖10:正義表達(dá)7\^^22-/基因煙草葉綠體的表型觀察，A-D,E-H,I-L分別為微分千涉顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡及電鏡顯微鏡的觀察 結(jié)果；A,E,I，K:野生型煙草葉肉細(xì)胞的葉綠體表型；B-D，F(xiàn)-H,J，L:正義表達(dá)7WF"Z2-/基因的煙草葉肉細(xì)胞的葉綠體表型；(圖中 A-D,E-H,I-J,K-L的標(biāo)尺分別為10um，25um,2um，0.5um)。圖11:反義表達(dá)MFfsZ2"基因煙草葉綠體的表型觀察，A-C，D-F，G-I分別為微分千涉顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡及電鏡顯微鏡的觀察 結(jié)果；A,D,G:野生型煙草葉肉細(xì)胞的葉綠體表型；B，C,E,F，H，I反義表達(dá)MfYsZ2-/基因的煙草葉肉細(xì)胞的葉綠體表型；(圖中A-C，D-F，G-I的標(biāo)尺分別為10um,25um，2um )圖12: 野生型及不同類型轉(zhuǎn)基因煙草中葉肉細(xì)胞表面積與葉綠體數(shù)目之間 的對應(yīng)關(guān)系，A、 B、 C野生型及正義表達(dá)NtFtsZ2-l基因煙草中葉肉細(xì)胞表面積與葉綠體 數(shù)目之間的對應(yīng)關(guān)系；D、 E野生型及反義表達(dá)NtFtsZ2-l基因煙草中葉肉細(xì)胞表面積與葉綠體數(shù)目 之間的對應(yīng)關(guān)系。圖13:野生型及不同類型轉(zhuǎn)基因煙草中葉綠體面積的分布頻率，A野生型煙草中葉綠體面積的分布頻率；B、 C、 D正義表達(dá)NtFtsZ2-l基因煙草中葉綠體面積的分布頻率；E、 F反義表達(dá)NtFtsZ2-l基因煙草中葉綠體面積的分布頻率。表1: 野生型及不同類型轉(zhuǎn)基因煙草中的葉綠素含量分析表中Ca代表葉綠素a含量(|ig ml-l extraction buffer), Cb代表葉綠素b含量 (ig ml-1 extraction, buffer), Ca+b H表葉綠二素a+b含量(|ng ral-1 extraction buffer), Ca/ Cb，代表葉綠素a與b比率，葉綠素總濃度為單位組織中葉綠素含量(昭g-1 fresh weight)。圖14: 正反義轉(zhuǎn)基因煙草中NtFtsZ2-l及葉綠素a,b結(jié)合蛋白表達(dá)水平的半 定量RT-PCR分析。
具體實施方式
實施例1煙草NtFtsZ2-l基因的克隆 1、植物材料煙草
2、 煙草總RNA的提取采用異疏氰酸胍-酚-氯仿一步法提取(Chomczynski P and Sacchi N， 1987)測定 總RNA A260/A280的比值，以檢驗所提RNA的純度，瓊脂糖變性凝肢電泳檢奎 所提RNA的質(zhì)量。3、 cDNA第一鏈的合成取1 ug總RNA作為模板，分別以O(shè)lig dT和特異的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物， 用cDNA合成試劑盒RNA PCR Kit (AMV) Ver.2.1,除了引物外其余操作按AMV 反轉(zhuǎn)錄說明書加入試劑，然后30°C 10min，42。C 40min，55。C 10min，60。C 5min， 99 °C 5min,4。C保存。4、 NtFtsZ2-l基因的PCR擴增根據(jù)GenBank中注冊的煙草ftsZ基因序列(GenBank accession number: AJ271750)設(shè)計并合成PCR兩端特異引物，以引導(dǎo)ftsZ基因的擴增，為方便后續(xù) 操作分別在上下游引物的5 '端加上相應(yīng)的酶切位點Smal和EcoRI:Forward primer: 5'-TCCCCCGGGAACAATGGCTACTTGTACATCAGCTG-3'SmalReverse primer: 5'-AGGAATTCTTAAGCTCTTGGGTAGCGTGAT-3' EcoRI取5ul單鏈cDNA產(chǎn)物，分別加入特異的上游與下游引物2ul ( 50pmol)和lul (25pmol)' dNTPs (lOmM each) lul, lOxPCR buffer ( Mg2+ Plus) 5ul, Taq酶 2ul(2U/ul)， ddH20 37ul，總體積50ul。 PCR反應(yīng)條件為:94。C預(yù)變性lmin45sec, 94'C變性45sec， 55。C復(fù)性30sec, 72。C延伸lmin30sec，共30個循環(huán)，最后72°C 延伸10min。擴增完畢后將擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。 5、 煙草NtFtsZ2-l cDNA的克隆 1)煙草NtFtsZ2-l cDNA的連接反應(yīng)將純化回收的PCR產(chǎn)物直接與pMD18-T Vector進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒，命名
為pNF3。連接體系如下回收的PCR產(chǎn)物4ul， pMD18-T Vector lul， Solution I 5ul， 共10ul體積，16'C連4矣過夜。2 )連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞3 )堿裂解法提取質(zhì)粒。6、重組質(zhì)粒pNF3的鑒定與序列測定根據(jù)質(zhì)粒載體pMDl8-T Vector圖譜選取適當(dāng)?shù)拿盖形稽c,分別進(jìn)行酶切和 PCR鑒定重組質(zhì)粒pNF3。酶切反應(yīng)體系如下10xbuffer2ul，質(zhì)粒DNA10ul(約 5ug)，相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶各lul，ddH20 6ul, 37。C保溫3hr后電泳檢測。PCR反 應(yīng)體系為10xPCR buffer (Mg2+ Plus) 5ul, dNTPs ( 10mM each) 2ul,特異的 上下游引物各lul (25pmol),重組質(zhì)粒模板lul， Taq酶lul (2U/ul), ddH20 39ul, 總體積50ul。 PCR反應(yīng)的條件為:94'C預(yù)變性2min后，再進(jìn)行94°C變性30sec, 55。C復(fù)性30sec， 72。C延伸lmin 30sec,共30個循環(huán)，最后72。C延伸10min。然 后將經(jīng)過酶切和PCR鑒定的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定，此項工作由TaKaRa Biotech公司完成。NtFtsZ2-l的cDNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如下 1 atggccacca tgttaggact ctcttcaaac acaggaatcg atatattgtc ttcttcttcc 61 aattccttat cattttatca tagcactcgc ttcacacaat gcttctctcc gaaaagcctc 121 tgcaaacgac aacgacgaag attcagcatx tgcagttcct tgtcctctgc caagattaag 181 gttgtcggcg tcggtggcgg cggcaacaat gctgttaacc gtatgattgg cagcggcttg 241 cagggtgttg acttttatgc tgtaaacacg gatgctcaag cattgctgca gtctacggtt 301 g卿acccaa ttcaaattgg agaacttctg actcgtggac ttggtactgg tggcaatcct 361 ctgttggggg aacaggcagc ag鄉(xiāng)agtca aaggaacaca Ugcaaatgc tcttaa鄉(xiāng)t 421 tcggatatgg tgtttataac agcaggcatg ggtggcggta ctggatctgg tgctgctcct 481 gttgttgctc aaatagccaa agaagcaggt tatttgactg ttggtgtcgt cacgtatcca 541 ttcagctttg aaggacgtaa aagatctttg caggctttgg aagcaattga aaaacttcag 601 aaaaatgtag atactcttat agtaattccc aatgatcgtc ttctggatat tgctgatgag661C8g8caccacttcaasatgcttttcttcttgctgatgstgtactttgtcsLaggcgtccaa721ggaatatctgatataat cactatacctgggCtggt￡t￡LatgtggaUUgcagatgtt犯g781gcaatcatga犯gattctggaactgcta.tgctcggagttggggtttcttcC3gt3gg犯C841cgtgctg鄉(xiāng)犯gC3gCtggl￡LC￡L€LgC￡LSLCtctggcccctctceittggatc901tctgcaactggtg3tgt3t3taacattactatattactttgc郷郷tg961aataaggtgtcccaggttgtcacaagcttggctgatccatccgccaacatcatattcggt1021 gctgttgtgg atgagcgcta taatggag,ag atccaggtga ctctaattgc aactggtttc1081 gcacagtcat ttcagaattc tcttctaact gaccctcgag gagcaaagct agttgataag1141 agcaaaggaa ccacagaaag aacggtatca cctgatacct tgaggtcatc agagtctcct1201 tccacaaaac ctcgaccagc tactcggagg ctgttctttt agMATMLGLSSNTGIDILSSSSNSLSFYHSTRFTQCFSPKSLCKRGTIiRSSESPSTKPRPATRRLFF7、核酸雜交分析Southern雜交提取煙草基因組DNA,以煙草NtFtsZ2-l cDNA全序列作為雜 交探針，探針標(biāo)記采用Prime a Gene標(biāo)記kit(Promega)進(jìn)行Southern雜交
Northern雜交采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取煙草根、莖、葉、花的總 RNA,以煙草NtFtsZ2-l cDNA部分序列作為雜交探針，探針標(biāo)記采用Prime a Gene 標(biāo)記kit(Promega)，進(jìn)行Northern雜交。實施例2:煙草NtFtsZ2-l基因的原核表達(dá)與定位分析1 、煙草NtFtsZ2-1基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)已知的煙草NtFtsZ2-l cDNA序列重新設(shè)計了 一對融合表達(dá)引物分別為 NP7: 5，-TCTAGAAACAATGGCTACTTGTACATCAGCGT-3，，和NP8: 5，-GGTACCGCTCTTGGGTAGCGTGATC-3，，并在引物的5，端加上 相應(yīng)的酶切位點XbaI和KpnI,同時在下游特異引物中去除終止密碼子，以便與綠 色熒光蛋白基因同框翻譯。以經(jīng)過測序鑒定的pNF3質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴增， 反應(yīng)條件為94 °C 60 sec,55 °C 40sec,72。C 90 sec,共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72°C 延伸10min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，以Xbal+Kpnl雙酶切，然 后以無水乙醇-20'C沉淀回收，得到純化的NtFtsZ2-l片段，將其克隆到中間質(zhì)粒 pUC19上，再以Sall+Kpnl雙酶切，并將含有NtFtsZ2-l片段的回收產(chǎn)物連接于 Sall+Kpnl雙酶切的pEGFP質(zhì)粒栽體上，得到融合表達(dá)的pKN重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化 JM109感受態(tài)菌，在選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行DNA序列測定以確保在PCR 擴增過程中沒有錯誤堿基的引入。分別以PCR擴增和酶切方法對重組質(zhì)粒pKN 加以鑒定。 '2、融合表達(dá)質(zhì)粒pKN在大腸桿菌JM109中的表達(dá)及對照體系的建立 將轉(zhuǎn)化有融合表達(dá)質(zhì)粒pKN的大腸桿菌JM109在選擇培養(yǎng)基上劃板(Ampr 80ug/ml)培養(yǎng)后，挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中37。C搖培過夜，次日以1/100比例 取過夜培養(yǎng)物分別接種于含有OmM和lmM IPTG(Isopropyl- P -D-Thiogalactoside) 的LB液體培養(yǎng)基中(Ampr 80ug/ml),在37。C搖培4小時；同時對轉(zhuǎn)化有pEGFP 質(zhì)粒的大腸桿菌JM109做同樣的處理，最終以lmM的IPTG加以誘導(dǎo)以作為融合 表達(dá)質(zhì)粒pKN的對照體系。
(1)大腸桿菌JM109轉(zhuǎn)化菌體形態(tài)的顯微觀察復(fù)紅染色將轉(zhuǎn)化有外源質(zhì)粒的大腸桿菌JM109過夜培養(yǎng)物劃于栽玻片上， 并以酒精燈加熱固定菌體，滴加復(fù)紅染料于室溫染色lmin,然后用清水沖擊多余 的復(fù)紅染料，壓片鏡檢。熒光觀察將轉(zhuǎn)化有外源質(zhì)粒的JM109過夜培養(yǎng)物與等體積預(yù)熱的0.5%低熔 點瓊脂糖混勻后滴于無熒光載片上，壓片后采用藍(lán)光激發(fā)和標(biāo)準(zhǔn)濾光片進(jìn)行鏡檢。實施例3:煙草NtFtsZ2-l基因的功能分析1、 真核表達(dá)栽體的構(gòu)建為了解煙草NtFtsZ2-l基因在葉綠體分裂過程中的功能，我們將所克隆的建了正義和反義表達(dá)質(zhì)粒pBZS3和pBZA3，然后將正義和反義表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5 a ，并提取質(zhì)粒對其進(jìn)行相應(yīng)的酶切和PCR鑒定。2、 真核表達(dá)質(zhì)粒向農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化采用凍融法將正義和反義表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中(An,1988 )。將菌 液涂布于YEP選擇培養(yǎng)基上(Sm 100ng/ml, Rif 100ug/ml,Kan 80ug/ml), 28。C倒 置培養(yǎng)l-2天。挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒，分別以酶切和PCR方法進(jìn)行鑒定， 具體操作同前。3、 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草葉片及轉(zhuǎn)化植抹的再生 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草葉片用1/2 MS液體培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌原液稀釋5倍，取生長約一個月左右的煙草無 菌苗葉片，將其切成邊長約為lcm的小片，浸于農(nóng)桿菌懸液中15min，然后用無 菌濾紙吸去多余的菌液，將外植體置于MS基本培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)兩天。轉(zhuǎn)化植抹的再生將預(yù)培養(yǎng)兩天的煙草葉片轉(zhuǎn)移到MS分化培養(yǎng)基中(Kan 80ug/ml,Cb 500ug/ml)繼續(xù)培養(yǎng)，待幼芽長到約1cm長時，將其移至生根培養(yǎng)基上(Kan18 80ug/ml,Cb 500ug/ml)繼續(xù)培養(yǎng)，待生根完全后將生根后的煙草幼苗移栽到含有 1/3蛭石的營養(yǎng)土中，以25-28。C條件下16/8小時的光/暗下進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化植抹的鑒定轉(zhuǎn)化植抹的PCR鑒定分別選用NPTII的特異上下游引物及CaMV35S與NtFtsZ2-l特異引物組合對 轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR鑒定。所用引物序列如下 NPTII特異上游引物 5'-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3，， 特異下游引物 5 ， -ATCGGG AGCGGCGATACCGTA-3 ，； CaMV35S特異引物 5 ，- AATATCCGGAAACCTCCTCG-3 ，； NtFtsZ2-l特異上游引物NF7 5，陽TCCCCCGGGAACAATGGCTACTTGTACATCAGCTG-3', 特異下游引物NF8 5'-AGGAATTCTTAAGCTCTTGGGTAGCGTGAT-3';此外，為了進(jìn)一步區(qū)分NtFtsZ2-l正反義轉(zhuǎn)化植林中PCR擴增帶的大小，又 在 NtFtsZ2-l 的中部合成了 一條新的特異下游引物 NF9 5'-ATCCACATTTACTAGCCCAG-3' 。 PCR的反應(yīng)體系為10xPCR buffer 5ul， Mg2十(10mM) 3ul， dNTPs ( 10mMeach) 2ul，引物各lul (25pmo1),模板lul, Taq酶lul (2U/ul )， ddH20 36ul,總體積50ul。 PCR反應(yīng)的條件為94。C預(yù)變性 2min后，再進(jìn)行94。C變性30sec, 55。C復(fù)性30sec, 72。C延伸45sec，共30個循環(huán)， 最后72。C延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)結(jié)果。PCR-Southern雜交檢測PCR擴增后的NPTII產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用堿法將DNA轉(zhuǎn)移至
尼龍膜上(具體操作過程如前所述)。以0.4M NaOH作為轉(zhuǎn)移液進(jìn)行轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印 時間大于2hr。最后于8(TC烘箱中烘膜2hr,此膜即可用于雜交或置干燥器中備用。 以NPTII作為雜交探針，探針標(biāo)記采用Prime a Gene標(biāo)記kit ( Promega )。雜交采 用Church Buffer系統(tǒng)，其余操作同Southern雜交步驟。4、 轉(zhuǎn)化植抹的葉綠體數(shù)目和形態(tài)觀察待轉(zhuǎn)化植抹生長約一個月時，按Pyke等(Pyke and Leech,1991)的方法處理其葉 片將材料用3.5%的戊二醛黑暗中處理lhr后，用0.1MNa2EDTA(pH 9.0)替換戊 二醛，置于6CTC保溫2.5hr。處理好的樣品可以直接進(jìn)行壓片賴j全或置于4'C冰箱 中備用。顯微觀察用Leica DMRE多功能顯微鏡進(jìn)行，用微分干涉顯微鏡觀察葉 綠體的數(shù)目和形態(tài)，葉綠體數(shù)目的統(tǒng)計以50個細(xì)胞中葉綠體數(shù)目的平均值來表示。 葉肉細(xì)胞及葉綠體的面積使用Spot Enhanced軟件測量，按Pyke等方法計算每個 葉肉細(xì)胞中的葉綠體總面積(Pyke and Leech RM, 1994a; Pyke et al., 1994b)。圖像 采集用Leica DC200 Digital Camera或通過Leica MPS60自動攝相系統(tǒng)用Kodak ISP 200膠巻記錄結(jié)果，圖像處理用Adobe Photoshop 5.0圖像處理軟件完成。此外， 為了進(jìn)一步分析葉綠體形態(tài)特征，我們同時采用Leica TCS激光共聚焦顯微鏡對葉 綠體的數(shù)目和形態(tài)進(jìn)行了觀察，所用物鏡為Leica 40x,用于葉綠素分子的激發(fā)波 長為458士20nm, Leica TCS PowerScan軟件用于圖像采集。5、 超微切片及電鏡觀察電鏡觀察的樣品按Dormann等(1995)及Itoh等(1998)所描述的方法準(zhǔn)備。將 3-4周植林未展開的幼嫩葉片在4。/0(V/V)戊二趁磷酸緩沖液(0.1 M,pH 7.2)中4°C固 定過夜。用磷酸緩沖液(O.l M，pH7.2)漂洗后，再用1。/。(V/V)的鋨酸4。C固定2h，然 后用上述緩沖液漂洗，系列乙醇脫水，然后樣品包埋于環(huán)氧樹脂中，經(jīng)超薄切片 和醋酸雙氧鈾染色后，在透射電鏡(HitachiH600ATEM)下觀察，并照相記錄結(jié)果。6、 轉(zhuǎn)化植林葉綠素含量的測定葉綠素含量的測定參照Lichtenehaler(1987)的方法轉(zhuǎn)化4直才朱生長約一個月時，
稱取O.lg葉片，液氮研磨后用80%的丙酮進(jìn)行4由提，并以濾紙過濾，最后定容抽 提液為10ml。用紫外分光光度計測定其在645nm和663nm處的光吸收值，葉綠 素含量的計算按Ca=12.7A663-2.69A645, Cb=22.9A645-4.68A663， Ca+b=8.02A645+20.20A663進(jìn)行。(l)轉(zhuǎn)化植林中NtFtsZ2-l基因表達(dá)水平的半定量RT-PCR分析 分別取具有異常葉綠體表型的煙草NtFtsZ2-l基因正義和反義轉(zhuǎn)化植林葉片 0.5g,用異硫氰酸胍-酚-氯仿法提取總RNA。取5yg總RNA作為模板，以O(shè)ligo dT為下游引物合成cDNA第一鏈，取等量cDNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行半定量PCR擴 增。用于檢測NtFtsZ2-l mRNA的特異上游引物為 5'-TCCCCCGGGAACAATGGCTACTTGTACATCAGCTG-3', 特異下游引物為5'-AGGAATTCTTAAGCTCTTGGGTAGCGTGAT-3'; 用于檢測內(nèi)標(biāo)分子ubiquitin的特異上游引物為 5，-TGGAAACGGCTGCTAATACC- 3', 特異下游引物為5，-ACGGGTTGACTCTTTCTGGATA-3，； 用于檢測內(nèi)標(biāo)分子actin的特異上游引物為 5 ，陽AGATGGAGTTATG ATAGTTAAAC-3 ，， 特異下游引物為5，-ATTCAGAAGATATTGTCATCAAGG-3,。此外，為了初步分析正反義轉(zhuǎn)基因煙草中的葉綠體光合作用是否正常，我們 同時對葉綠素結(jié)合蛋白cab基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測。 用于擴增葉綠素結(jié)合蛋白cab基因的特異上游引物為 5'-ATGGCTGCTGCTACAATGGC-3，， 特異下游引物為5，-TCACTTTCCGGGGACAAAGT-3，。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性2min;94。C lmin,55。C lmin,72。C 1 min， 35 個循環(huán)；72 。C ， 10min。
權(quán)利要求
1、一種細(xì)胞內(nèi)含有巨大葉綠體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系包含外源導(dǎo)入的正義、或反義ftsZ基因。
2、 如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于，所述ftsZ基因為NtFtsZ2-l 基因，其GenBank登陸注冊號為No. AF205858。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于，該細(xì)胞系為包含外 源導(dǎo)入的正義、或反義ftsZ基因的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞系。
4、 一種制備權(quán)利要求1所述細(xì)胞系的方法，其特征在于，所述方法包括以下 步驟1) 構(gòu)建包含正義、或反義ftsZ基因的表達(dá)載體；和2) 用構(gòu)建的表達(dá)栽體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。
5、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述ftsZ基因為NtFtsZ2-l基因， 其GenBank登陸注冊號為No. AF205858。
6、 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述的細(xì)胞系為 煙草細(xì)胞系。
7、 權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種細(xì)胞內(nèi)含有巨大葉綠體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的細(xì)胞系包含外源導(dǎo)入的正義、或反義ftsZ基因。所述方法包括以下步驟1)構(gòu)建包含正義、或反義ftsZ基因的表達(dá)載體；和2)用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。本發(fā)明所獲得的轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體數(shù)目的明顯減少意味著葉綠體同質(zhì)化篩選效率的提高，為研制高效葉綠體生物反應(yīng)器奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/10GK101165175SQ200610113810
公開日2008年4月23日 申請日期2006年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月18日
發(fā)明者何奕昆, 孔冬冬, 東 王, 勇 胡 申請人:首都師范大學(xué)