專利名稱：一種生產(chǎn)木二糖的方法及其專用固定化酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)木二糖的方法及其專用固定化酶。
背景技術(shù)：
木二糖(Xylobiose)具有獨(dú)特的生理功能和良好的工藝性能，甜度約為蔗糖的40％，甜味清爽柔和，可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健品等諸多領(lǐng)域，是低聚木糖的主要有效成分，也是低聚木糖的定性和定量成分，是功能性低聚糖研究的一個(gè)熱點(diǎn)。其主要功能特性有1)顯著的雙歧桿菌增殖能力，可使雙歧桿菌等有益菌群快速增殖，從而抑制腸道內(nèi)有害菌群的生長。2)難消化性木二糖在人體消化系統(tǒng)中非常穩(wěn)定，不能被唾液、胰液、小腸絨毛腺均質(zhì)液等分解。可滿足患有諸如糖尿病、肥胖病和高血脂癥等特殊人群的需要。3)無齲齒性木二糖不能被口腔內(nèi)變異鏈球菌等細(xì)菌分解成黏著性的單糖，無齲齒性并具有抗齲齒效果。另外，木二糖還具有良好的工藝性能同濃度下木二糖的水分活度與葡萄糖相近；在凝膠的冷凍解凍中，木二糖的保水性能優(yōu)良，在5％～40％濃度下，保水性能高于蔗糖；木二糖還具有良好的酸堿穩(wěn)定性和耐熱性，在pH 2～8條件下，即使煮沸60min也不分解。
木二糖的制備主要采用水解木聚糖或半纖維素，再經(jīng)過分離純化獲得。木聚糖是半纖維素的主要成分，在植物細(xì)胞壁中的含量僅次于纖維素，是自然界中最主要的可再生資源之一。木聚糖是一種雜合多聚分子，主鏈由β-1，4-糖苷鍵相連的β-D-吡喃型木糖殘基聚合而成，側(cè)鏈上連著多種不同大小的短的取代基。不同植物所含木聚糖的多少也有所差別，在一些農(nóng)業(yè)廢棄物中，如小麥桿、玉米芯、棉籽殼、甘蔗渣等中，木聚糖含量非常高，一般都能高達(dá)30％以上，這些原料價(jià)廉易得，是制備木二糖的理想原料。
低聚木糖各單一組分除分子質(zhì)量有所差別外，其它理化性質(zhì)都比較接近，因此導(dǎo)致了單一組分分離困難且成本高昂。采用凝膠色譜柱法分離分析低聚木糖或制備少量高純度的單一木二糖已有一些報(bào)道。凝膠柱層析技術(shù)處理量小、產(chǎn)品濃度低、操作要求高，所以目前該技術(shù)僅用于低聚木糖的分析和少量標(biāo)準(zhǔn)品的制備，并不適合木二糖的工業(yè)生產(chǎn)。木二糖水解得率低以及分離純化困難，造成木二糖生產(chǎn)技術(shù)難度大和成本過高，價(jià)格昂貴，目前，木二糖產(chǎn)品僅能作為標(biāo)準(zhǔn)品出售和使用。以Sigma公司產(chǎn)的木二糖為例，95％純度，5mg包裝售價(jià)高達(dá)200美元。Megazyme公司的木二糖也售價(jià)高達(dá)134歐元/50mg。
β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)能夠以內(nèi)切的方式作用于木聚糖的主鏈，得到不同聚合度的低聚木糖和少量的單糖，是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶，也是生產(chǎn)低聚木糖的關(guān)鍵酶。目前關(guān)于低聚木聚糖的專利主要集中在酶法水解生產(chǎn)低聚木糖領(lǐng)域，如日本特開昭62-155095、JP02119791A2、06261750JPA2、JP10215866A2、JP10295372A2等。國內(nèi)蔡敬民(ZL99126547.5)等用玉米芯、玉米秸桿、稻草等作為原料，堿法提取半纖維素(木聚糖)后，加酶水解生產(chǎn)低聚木糖；陶文沂(ZL00109788.1)等以麩皮、蔗渣或玉米芯為原料，堿法制備木聚糖，然后以突變株假單胞菌(Pseudomonas sp.XUN024)來源的木聚糖酶進(jìn)行水解生產(chǎn)低聚木糖，低聚木糖產(chǎn)品中木二糖、木三糖含量占總糖組分90％以上；余世袁(ZL 02112568.6)等采用里氏木霉產(chǎn)木聚糖酶水解堿法提取精制木聚糖生產(chǎn)低聚木糖；本發(fā)明的發(fā)明人以前的專利(ZL 01131171.1)將原料玉米芯用堿金屬氫氧化物預(yù)處理，在弱酸型催化劑如乙酸、甲酸、檸檬酸等作用下進(jìn)行直熱裂解，然后與木聚糖酶液反應(yīng)制備低聚木糖。這些方法均能制備低聚木糖，但木二糖所占比例低。
與游離酶相比，固定化酶具有穩(wěn)定性高，產(chǎn)物與酶分離回收容易，可多次重復(fù)使用，酶的利用效率高、可連續(xù)操作及自動化控制、工藝簡便、生產(chǎn)成本低等一系列優(yōu)點(diǎn)，成為現(xiàn)代酶工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。工業(yè)化生產(chǎn)中，固定化載體通常采用環(huán)氧載體。環(huán)氧載體性質(zhì)非常穩(wěn)定，長期運(yùn)輸、儲存及酶與載體長時(shí)間反應(yīng)，載體都表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種固定化木聚糖酶及其制備方法。
本發(fā)明所提供的固定化木聚糖酶的制備方法，包括如下步驟1)用金屬螯合環(huán)氧載體Eupergit C 250L固定重組木聚糖酶XynB，得到固定化酶；2)將步驟1)得到的固定化酶懸浮于0.5-1.25M、pH為5.5-8.0磷酸鹽緩沖液中，20-35℃反應(yīng)12-60小時(shí)，得到固定化木聚糖酶。
所述重組木聚糖酶XynB是將核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列(由1079個(gè)脫氧核苷酸組成，參見中國專利ZL02156022.6)的木聚糖酶基因經(jīng)大腸桿菌表達(dá)得到的木聚糖酶。
所述重組木聚糖酶XynB具體可按照如下方法制備以海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)MSB8DSM3109的基因組DNA為模板，利用核苷酸序列是序列表中序列2和序列3的引物(參見中國專利ZL02156022.6)PCR擴(kuò)增核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列的木聚糖酶基因，將PCR擴(kuò)增到的木聚糖酶基因插入表達(dá)載體pET28a(+)(Novagen，美國)得到含有核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列的木聚糖酶基因的重組表達(dá)載體pET28a/XynB，將重組表達(dá)載體pET28a/XynB導(dǎo)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)得到重組木聚糖酶XynB。
所述金屬螯合環(huán)氧載體Eupergit C 250L固定化重組木聚糖酶XynB中的金屬來自Cu2+、Co2+、Zn2+或Ni2+。
所述步驟1)中，可按照下述方法用金屬螯合環(huán)氧載體Eupergit C 250L固定重組木聚糖酶XynB環(huán)氧載體Eupergit C 250L經(jīng)亞氨基二乙酸(IDA)活化后螯合金屬離子Cu2+、Co2+、Zn2+或Ni2+，再按80-1500U重組木聚糖酶XynB/g環(huán)氧載體Eupergit C 250L的比例加入重組木聚糖酶XynB，固定12-48h得到固定化酶。
實(shí)驗(yàn)證明Ni2+或Co2+的螯合環(huán)氧載體Eupergit C 250L固定化木聚糖酶的酶活回收率比Cu2+和Zn2+螯合環(huán)氧載體Eupergit C 250L固定化木聚糖酶的酶活回收率高20％。以Ni2+最優(yōu)，Ni2+螯合環(huán)氧載體Eupergit C 250L固定化木聚糖酶的酶活回收率達(dá)到70％以上。
其中，所述金屬離子優(yōu)選為Ni2+，所述重組木聚糖酶XynB與環(huán)氧載體EupergitC 250L的比例優(yōu)為288U/g，所述固定時(shí)間優(yōu)選為24h。
所述步驟2)中磷酸鹽緩沖液的濃度優(yōu)選為1M、pH 7.0，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)。
由上述方法制備的固定化木聚糖酶也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用上述任一種固定化木聚糖酶生產(chǎn)木二糖的方法。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)木二糖的方法，包括如下步驟1)對含木聚糖的纖維質(zhì)原料進(jìn)行汽爆或高溫蒸煮處理，得到含有木聚糖溶出物的汽爆液或高溫蒸煮液，將所述汽爆液或高溫蒸煮液的pH調(diào)至5.5-7.0；2)將上述任一種固定化木聚糖酶裝柱，在70～95℃下，將汽爆液或高溫蒸煮液以1.0-8.0倍柱床體積/小時(shí)的流速過柱，收集流出液，得到木二糖溶液。
所述含木聚糖的纖維質(zhì)原料為玉米芯、甘蔗渣、棉籽殼和小麥秸稈中的一種或其任意組合；所述汽爆或高溫蒸煮可按常規(guī)方法進(jìn)行，在多次試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定的適宜條件是將所述含木聚糖的纖維質(zhì)原料粉碎后，加入是所述含木聚糖的纖維質(zhì)原料質(zhì)量6-10倍的水，在160-180℃反應(yīng)20-60min，收集濾液得到汽爆或高溫蒸煮液。
所述含木聚糖的纖維質(zhì)原料優(yōu)選為玉米芯；所述汽爆或高溫蒸煮處理?xiàng)l件優(yōu)選為將玉米芯粉碎至40目-80目，加入是玉米芯質(zhì)量8倍的水，在170℃反應(yīng)為30min，收集濾液得到汽爆或高溫蒸煮液，其聚合度為3-6。
步驟2)中，將固定化木聚糖酶裝柱后，在90℃下，將pH為6.2的汽爆液或高溫蒸煮液以1.5-4.0倍柱床體積/小時(shí)的流速過柱。
所述方法中還包括純化流出液得到木二糖結(jié)晶的步驟。
所述純化方法為將所述步驟2)收集的流出液過活性炭層析柱，先用去離子水洗凈單糖和鹽分，再用0-15％乙醇溶液線性洗脫得到木二糖，經(jīng)過結(jié)晶得到木二糖結(jié)晶。
本發(fā)明固定化木聚糖酶的酶活力回收較高，穩(wěn)定性和裝柱后連續(xù)操作性能優(yōu)良，便于連續(xù)化生產(chǎn)，且產(chǎn)物組成穩(wěn)定易于控制；與游離重組木聚糖酶XynB相比，本發(fā)明固定化木聚糖酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性以及水解能力都有所提高，并具有良好的操作穩(wěn)定性，水解操作簡單，可節(jié)約酶的用量，還可實(shí)現(xiàn)酶與水解液的分離，大幅度降低生產(chǎn)成本并提高生產(chǎn)效率。
在進(jìn)行酶水解前，采用汽爆或高溫蒸煮處理玉米芯等農(nóng)業(yè)廢棄物，使玉米芯等農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖降解而成溶解狀態(tài)，便于采用固定床反應(yīng)器連續(xù)生產(chǎn)低聚木糖。利用本發(fā)明的固定化木聚糖酶在連續(xù)柱反應(yīng)器中水解木聚糖溶出物。采用活性炭柱分離酶水解液并將分離所得木二糖組分濃縮后結(jié)晶得到木二糖晶體。分離木二糖的過程中僅用到乙醇和水，能夠安全無污染的得到高純度木二糖。
本發(fā)明解決了以農(nóng)業(yè)廢棄資源為原料生產(chǎn)高價(jià)值木二糖的諸多技術(shù)問題，不僅降低了生產(chǎn)成本，還可解決困擾多年的環(huán)境問題。所確定的汽爆和高溫蒸煮條件有利于提高木聚糖的溶出率并使其聚合度控制在合適的范圍。固定化酶載體和離子以及螯合條件使其在盡可能結(jié)合較多酶蛋白的同時(shí)具有較高的穩(wěn)定性，固定化酶應(yīng)用于木二糖的生產(chǎn)不僅節(jié)約了酶制劑還簡化了后續(xù)分離過程。連續(xù)水解裝置以及據(jù)此確定的水解條件在達(dá)到較好水解效果的同時(shí)，降低了勞動強(qiáng)度，提高勞動效率。因此，本發(fā)明具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和極高的社會效益。


圖1為本發(fā)明利用固定化木聚糖酶生產(chǎn)結(jié)晶木二糖的工藝流程圖2為Eupergit C 250L-Ni固定化XynB經(jīng)過1M磷酸緩沖液處理前后的溫度穩(wěn)定性變化情況圖3為游離XynB和Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的最適pH曲線圖4為游離XynB和Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的最適溫度曲線圖5為固定化酶連續(xù)反應(yīng)器系統(tǒng)示意6為活性炭柱層析分離玉米芯汽爆液的固體酶水解液的洗脫曲線圖7為木二糖晶體的HPLC圖
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
本發(fā)明在多次試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定一種具有工業(yè)化應(yīng)用前景的生產(chǎn)結(jié)晶木二糖的方法。該方法首先將富含木聚糖的纖維質(zhì)原料通過汽爆或高溫蒸煮法獲得適宜聚合度的木聚糖溶出物。選用能定向水解木聚糖溶出物為木二糖的重組木聚糖酶XynB，對固定化酶所用離子、載體及螯合條件進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究，制備了固定化木聚糖酶，利用固定化木聚糖酶連續(xù)水解木聚糖溶出物。根據(jù)試驗(yàn)得出的分離條件，用活性炭柱分離酶水解液并將分離所得木二糖組分濃縮后結(jié)晶得到結(jié)晶木二糖。本發(fā)明利用固定化木聚糖酶生產(chǎn)結(jié)晶木二糖的工藝流程如圖1所示。
實(shí)施例1、制備固定化木聚糖酶一、Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的制備1、XynB酶液的制備按照中國專利ZL 02156022.6的實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4、至實(shí)施例5第一段描述的方法獲得粗酶液。具體方法如下(1)木聚糖酶基因xynB的擴(kuò)增所使用的引物為TM-XynB-Nco I-FWD和TM-XynB-Hind-His-REV，其序列分別如下所示TM-XynB-Nco I-FWD5’-CCATGGAAA TATTACCTTC TGTGTGAT(序列2)TM-XynB-Hind-His-REV5’-AAGCTTT CTTTCTTCTA TCTTTTTCTC CA(序列3)根據(jù)保藏于德國微生物保藏中心(DSM)的海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)MSB8DSM3109的xynB基因的全序列，設(shè)計(jì)上述一對引物，引物上引入能插入pET28a(+)(Novagen，美國)質(zhì)粒的NcoI-Hind III酶切位點(diǎn)。在設(shè)計(jì)TM-XynB-Nco I-FWD正向引物時(shí)，考慮到在表達(dá)載體中C-末端帶6×His標(biāo)簽，在5′端由引物導(dǎo)入一個(gè)密碼子突變即ATGA*AA…→ATGG*AA…，這樣翻譯后從NcoI酶切位點(diǎn)第二個(gè)氨基酸由K變?yōu)镋。根據(jù)引物設(shè)計(jì)的這一突變確保目的基因克隆于開放閱讀框內(nèi)，同時(shí)具有ATG起始密碼子和6×His標(biāo)簽序列，而不會發(fā)生開放閱讀框漂移。
以海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)MSB8的基因組DNA為模板，采用聚合酶進(jìn)行xynB基因的PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合物為海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)MSB8的基因組DNA，1μL；10×KOD-Plus buffer，2.5μL；2mM dNTP，2.5μL；25mM MgSO4，1.5μL；100pM TM-XynB-Nco I-FWD，0.5μL；100pM TM-XynB-Hind-His-REV，0.5μL；1Unit/μL KOD-Plus，0.5μL；H2O，16μL；反應(yīng)混合物總體積為25μL。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為循環(huán)參數(shù)為98℃，5min；98℃，30seconds，62℃，1min和68℃，1min，22個(gè)循環(huán)后68℃延伸10min，然后冷卻至4℃，反應(yīng)完成后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。在紫外下照射，切下目標(biāo)DNA，然后采用QIAquick GelExtraction kit(QIAGEN公司)從瓊脂糖凝膠中回收DNA，即為擴(kuò)增出的xynB基因DNA片段。
(2)PCR產(chǎn)物的克隆和DNA序列測定PCR擴(kuò)增反應(yīng)之后，采用拓?fù)銽A克隆將xynB基因片段克隆到pCR-2.1Topo質(zhì)粒(Invitrogen公司)載體上，用菌落PCR方法篩選帶有重組子的菌落。然后，使用pCR-2.1Topo質(zhì)粒載體上的標(biāo)準(zhǔn)引物序列作為引物測xynB基因的DNA序列，將含有正確xynB基因序列(序列表中的序列1)的重組質(zhì)粒pCR2.1-Topo 10/xynB提純供進(jìn)一步亞克隆和表達(dá)用。
3、木聚糖酶基因xynB的亞克隆和在大腸桿菌中的表達(dá)所使用的表達(dá)基因載體為pET28a(+)，是常用的表達(dá)載體之一，靶基因克隆于pET28a(+)載體上，使其表達(dá)置于T7噬菌體強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄及翻譯信號控制之下。由于Thermotoga屬的基因在大腸桿菌中表達(dá)較難，研究設(shè)計(jì)使xynB基因的C末端帶有6×His標(biāo)簽(tag)，這樣表達(dá)出的目標(biāo)蛋白質(zhì)帶有6×His tag，利用6×His tag與Ni-NTA的親和性，可將表達(dá)出的重組蛋白進(jìn)行親和層析提純，這樣可方便快速地純化表達(dá)的酶。NcoI-Hind III酶切位點(diǎn)pET28a(+)載體的編碼了羧基端6×His標(biāo)簽，可以用羧肽酶除去His標(biāo)簽。實(shí)際上，在蛋白質(zhì)分子上接上6×His純化標(biāo)簽，這種修飾對蛋白質(zhì)的表達(dá)、折疊和生物學(xué)活性均無影響。
提取已經(jīng)確定正確DNA序列的Topo克隆的質(zhì)粒pCR2.1-Topo 10/xynB，分別用一對限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII酶切，在紫外下照射，觀察電泳后的瓊脂糖凝膠，并迅速切下目標(biāo)DNA。然后采用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN公司)從瓊脂糖凝膠中回收DNA，回收的DNA片段即為所要插入的xynB基因。采用同樣酶切方法制備pET28a(+)載體，將制備好的xynB基因片段和pET28a(+)載體混合，并加入ligation High T4 DNA ligase kit(TOYOBO公司)在16℃下連接4h。然后用電穿孔法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21，將100μL菌液涂在含卡那霉素抗性的LB平板上，于37℃過夜培養(yǎng)。將生長出的單菌落標(biāo)號，采用菌落PCR篩選帶重組質(zhì)粒的菌落。提取幾個(gè)陽性菌落的質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切電泳和DNA序列測定，經(jīng)鑒定正確的質(zhì)粒即為含有xynB基因的重組質(zhì)粒，命名為pET28a/XynB。同時(shí)所得陽性克隆菌落，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后進(jìn)行酶的表達(dá)實(shí)驗(yàn)。將完全正確且符合要求的菌落作為菌種保存?zhèn)溆谩?br> 4、重組木聚糖酶B的表達(dá)和初步純化新鮮制備100mL含有重組質(zhì)粒pET28a/XynB的E.coli BL21，接種于1000mL含有50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani broth(LB)培養(yǎng)基，在30℃的搖床中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm。測定培養(yǎng)液在600nm下的吸光度的變化，當(dāng)吸光度達(dá)0.5-0.6時(shí)，加入1mL的1M IPTG誘導(dǎo)，再繼續(xù)培養(yǎng)16h。用冷凍離心機(jī)將培養(yǎng)液在4℃下以離心10min，離心力為29200×g，收獲細(xì)菌沉淀，用50mL磷酸緩沖溶液(50mM，pH 8.0)懸浮。在冰水浴中用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)破碎細(xì)菌細(xì)胞，將破碎液在4℃下以離心10min，離心力29200×g，所得上清液即為粗酶液。將所得粗酶液在90℃下處理10min，在4℃下以離心10min，離心力29200×g，所得上清液即為固定化用游離酶XynB，置4℃下儲存?zhèn)溆谩?br> 2、XynB酶的Eupergit C 250L-Ni固定化稱取10g Eupergit C 250L(多孔丙烯酸微球，由甲基丙烯酰氨、N，N’-亞甲基-雙-(甲基丙烯酰氨)縮水甘油甲基丙烯酸酯形成的含環(huán)氧官能團(tuán)的聚合物，孔徑為100nm，德國Rohm Pharma公司產(chǎn)品)，加入80mL硼酸鈉-亞氨基二乙酸(IDA)緩沖液(硼酸鈉濃度為0.1M，亞氨基二乙酸濃度為2M，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.5)，于30℃水浴搖床中反應(yīng)2h，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm(旋轉(zhuǎn)半徑50mm)。玻璃砂芯漏斗過濾后，用蒸餾水沖洗三次，得到40g(濕態(tài))經(jīng)亞氨基二乙酸活化的EupergitC 250L，記為IDA-Eupergit C 250L。將40g IDA-EupergitC 250L懸浮于200mL磷酸緩沖溶液(pH 6.0，50mM)中，并加入2.016g NiCl2·6H2O和11.688g NaCl，150rpm(旋轉(zhuǎn)半徑50mm)，30℃水浴搖床中反應(yīng)2h后玻璃砂芯漏斗真空抽濾，得到Ni螯合環(huán)氧載體Ni-IDA-Eupergit C 250L。
將Ni螯合環(huán)氧載體Ni-IDA-Eupergit C 250L懸浮于200mL(pH7.0，50mM)磷酸緩沖液中，并加入含木聚糖酶活力分別為800U、2880U、4000U、8000U的XynB酶液25mL，150rpm(旋轉(zhuǎn)半徑50mm)，30℃水浴搖床中反應(yīng)48h后玻璃砂芯漏斗真空抽濾，得到Eupergit C 250L-Ni固定化XynB。測定濾液中木聚糖酶XynB的酶活，以確定Eupergit C 250L與XynB的最佳配比。酶活測定結(jié)果表明，80-800U XynB可被1g Eupergit C 250L對應(yīng)的Ni-IDA-Eupergit C 250L完全吸附，綜合考慮加酶量與酶活回收率、固定化酶絕對酶活力及固定化酶比酶活等因素的關(guān)系，加酶量選為288U/g Eupergit C 250L。
其中，采用4-羥基苯甲酸酰肼(PHBAH)法測定木聚糖酶XynB的酶活。游離XynB的酶活測定方法10μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液加入到190μL的底物中(0.25％的可溶燕麥木聚糖，50mM檸檬酸緩沖液為緩沖體系pH 6.2)，70℃反應(yīng)10min，加入400μL PHBAH試劑終止反應(yīng)，沸水中煮6min，在420nm下測吸光度值。一個(gè)酶活力單位(U)定義為在上述實(shí)驗(yàn)條件下，在1mL反應(yīng)體系中每分鐘生成1μmol木糖所需要的酶量。
固定化XynB酶活力測定方法稱取一定量的固定化XynB酶，加入190μL的0.25％的可溶燕麥木聚糖，50mM檸檬酸緩沖液為緩沖體系pH 6.2，70℃反應(yīng)10min，加入400μL PHBAH試劑終止反應(yīng)，沸水中煮6min，在420nm下測吸光度值。一個(gè)酶活力單位(U)定義為在上述實(shí)驗(yàn)條件下，在1mL反應(yīng)體系中每分鐘生成1μmol木糖所需要的酶量。
3、提高Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的溫度穩(wěn)定性Eupergit C 250L-Ni固定化XynB在高溫下(90℃)穩(wěn)定性較差，在90℃下處理30min后酶活保持率(處理后的剩余酶活/初始酶活)只有55％。為了能夠提高Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的溫度穩(wěn)定性，以便固定化酶能夠適應(yīng)高溫操作的環(huán)境，采用促進(jìn)酶分子與載體多點(diǎn)共價(jià)交聯(lián)的辦法，提高固定化酶的溫度穩(wěn)定性。具體方法如下將0.5g Eupergit C 250L-Ni固定化XynB懸浮于2.5mL、1M、pH 7.0的磷酸緩沖液中以提高固體酶的熱穩(wěn)定性，150rpm(旋轉(zhuǎn)半徑50mm)，30℃水浴搖床中振蕩48h后玻璃砂芯漏斗真空抽濾，得到經(jīng)1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB，于4℃冷藏備用。以未經(jīng)1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB在70℃、pH 6.2酶活力為100％，按照下述方法測定經(jīng)過上述1M磷酸緩沖液處理前后的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的溫度穩(wěn)定性將經(jīng)1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB和未經(jīng)1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB分別在90℃下處理30min，取出立即放冰水浴中冷卻10min，用玻璃砂心漏斗抽濾，按上述酶活測定方法測定經(jīng)1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB和未經(jīng)1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB熱處理前后的酶活。
結(jié)果如圖2所示，表明Eupergit C 250L-Ni固定化XynB經(jīng)過1M磷酸緩沖液處理前后的溫度穩(wěn)定性變化情況。未經(jīng)過上述1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB當(dāng)在90℃下處理30min后相對酶活保持率僅為55％。如果將Eupergit C 250L-Ni固定化XynB先用1M磷酸緩沖液處理，則固定化酶的耐熱性有較大提高，其中磷酸緩沖液處理過程中有部分酶活損失，70℃、pH 6.2酶活保持率為87.6％。然后在90℃下保溫30min，最終酶活保持率86.8％。比未經(jīng)過磷酸緩沖液處理的固定化酶最終酶活保持率提高了32％。圖2中，1，Eupergit C 250L-Ni固定化XynB；2，Eupergit C 250L-Ni固定化XynB在90℃下處理30min；3，Eupergit C 250L-Ni固定化XynB經(jīng)1M磷酸緩沖液處理48h；4，1M磷酸緩沖液處理48h后Eupergit C 250L-Ni固定化XynB在90℃下處理30min。
4、經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的的特性(1)游離XynB和經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的最適pH具體測定方法如下采用不同緩沖體系配成一系列濃度為200mM的緩沖液，pH值范圍為2.18～11.78。緩沖體系和pH范圍分別為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH2.18～6.0；Tris-HCl緩沖液，pH 7.0～9.0；甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH 8.8～11.78。用以上緩沖液稀釋4倍替代標(biāo)準(zhǔn)酶活力測定中的0.05M、pH 6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，測定酶活力，以最大值為100％。
結(jié)果如圖3所示，表明經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB最適pH值范圍變寬了，5.1-6.6范圍內(nèi)相對酶活較高。在酸性環(huán)境下，經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的相對酶活較游離XynB高。圖3中，○示游離酶，●示固定化酶。
(2)游離XynB和經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的最適溫度具體測定方法如下在pH 6.2，濃度為50mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系中，反應(yīng)時(shí)間為10min，在不同溫度下(40～100℃)測定酶活力，以最大值為100％。結(jié)果如圖4所示，表明經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB酶活隨著溫度的升高逐漸升高，100℃的酶活依然沒有下降。經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的最適溫度提高到100℃，經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB與游離XynB相比，溫度穩(wěn)定性較游離XynB也有所提高，經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB操作穩(wěn)定性很高，90℃間歇水解半衰期為62次(每次水解時(shí)間45min)，90℃下連續(xù)水解木聚糖半衰期為577.6h。圖4中，○示游離酶，●示固定化酶。
二、Eupergit C 250L-Co固定化XynB的制備1、XynB酶液的制備同步驟一中的1。
2、XynB酶的Eupergit C 250L-Co固定化稱取10g Eupergit C 250L，加入80mL硼酸鈉-亞氨基二乙酸(IDA)緩沖液(硼酸鈉濃度為0.1M，亞氨基二乙酸濃度為2M，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.5)，于30℃水浴搖床中反應(yīng)2h，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm(旋轉(zhuǎn)半徑50mm)。玻璃砂芯漏斗過濾后，用蒸餾水沖洗三次，得到40g IDA-Eupergit C 250L。將40g IDA-EupergitC250L懸浮于200mL磷酸緩沖溶液(pH 6.0，50mM)中，并加入2.3793g CoCl2·6H2O和11.688g NaCl，150rpm(旋轉(zhuǎn)半徑50mm)，30℃水浴搖床中反應(yīng)2h后玻璃砂芯漏斗真空抽濾，得到Co螯合環(huán)氧載體Co-IDA-Eupergit C 250L。
將Co螯合環(huán)氧載體Co-IDA-Eupergit C 250L懸浮于200mL(pH 7.0，50mM)磷酸緩沖液中，并加入含木聚糖酶活力分別為800U、2880U、4000U、8000U的XynB酶液25mL，150rpm(旋轉(zhuǎn)半徑50mm)，30℃水浴搖床中反應(yīng)48h后玻璃砂芯漏斗真空抽濾，得到Eupergit C 250L-Co固定化XynB。測定濾液中木聚糖酶XynB的酶活，以確定Eupergit C 250L與XynB的最佳配比。酶活測定結(jié)果表明，120-600U XynB可被1g Eupergit C 250L對應(yīng)的Co-IDA-Eupergit C 250L完全吸附，綜合考慮加酶量與酶活回收率、固定化酶絕對酶活力及固定化酶比酶活等因素的關(guān)系，加酶量選為232U/g Eupergit C 250L。
3、提高Eupergit C 250L-Co固定化XynB的溫度穩(wěn)定性的方法中，除將EupergitC 250L-Ni固定化XynB換為Eupergit C 250L-Co固定化XynB，其余方法同步驟一中的3。
以未經(jīng)磷酸緩沖液處理過的Eupergit C 250L-Co固定化XynB在70℃、pH 6.2酶活力為100％，結(jié)果表明Eupergit C 250L-Co固定化XynB在90℃下處理30min后酶活保持率僅為49％。如果將Eupergit C 250L-Co固定化XynB先用1M磷酸緩沖液處理，則固定化酶的耐熱性有較大提高，其中磷酸緩沖液處理過程中有部分酶活損失，70℃、pH 6.2酶活保持率為86.2％。然后在90℃下保溫30min，最終酶活保持率82.3％，比未經(jīng)過磷酸緩沖液處理的固定化酶最終酶活保持率提高了33.3％。
4、經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Co固定化XynB的的特性(1)游離XynB和經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Co固定化XynB的最適pH測定方法同步驟一。結(jié)果表明經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C250L-Co固定化XynB最適pH值范圍變寬了，pH 5.3-6.5范圍內(nèi)相對酶活較高。
(2)游離XynB和經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Co固定化XynB的最適溫度測定方法同步驟一。結(jié)果表明經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C250L-Co固定化XynB酶活隨著溫度的升高逐漸升高，100℃的酶活依然沒有下降。經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Co固定化XynB與游離XynB相比，pH穩(wěn)定性有所提高，經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Co固定化XynB的最適溫度提高到100℃，溫度穩(wěn)定性較游離XynB也有所提高，經(jīng)過步驟3的1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Co固定化XynB操作穩(wěn)定性很高，90℃間歇水解半衰期為57次(每次水解時(shí)間45min)，90℃下連續(xù)水解木聚糖半衰期為496.6h。
三、測定Eupergit C 250L-Ni固定化XynB、Eupergit C 250L-Co固定化XynB、Eupergit C 250L-Cu固定化XynB和Eupergit C 250L-Zn固定化XynB的木聚糖酶的酶活回收率按Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的方法制備Eupergit C 250L-Cu固定化XynB和Eupergit C 250L-Zn固定化XynB，稱取1g固定化XynB(酶活為300U)，加入5mL磷酸鈉鹽緩沖溶液(pH 7.0，50mM)，于25℃水浴搖床中反應(yīng)48h，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm(旋轉(zhuǎn)半徑50mm)。抽濾至干，分別測定固定化酶活力，酶活回收率為固定化酶活/總酶活，其中總酶活為300U。試驗(yàn)結(jié)果表明，Eupergit C 250L-Ni固定化XynB或Eupergit C 250L-Co固定化XynB的酶活回收率比Eupergit C250L-Cu固定化XynB和Eupergit C 250L-Zn固定化XynB的木聚糖酶的酶活回收率高20％。以Ni2+最優(yōu)，Ni2+螯合環(huán)氧載體Eupergit C 250L固定化木聚糖酶的酶活回收率達(dá)到70％以上。
實(shí)施例2、汽爆液或高溫蒸煮液的制備一、玉米芯汽爆液或高溫蒸煮液的制備1、汽爆液的制備稱取100g玉米芯(含木聚糖32.4％)，按1∶8的固液比加入蒸餾水800mL，室溫浸泡12h后加入高壓罐中，加蓋密封，加熱，溫度控制在165～170℃維持30min后立即打開球型閥，釋放物料到收集罐中。待所收集的物料溫度降至60～70℃時(shí)抽濾，濾液即為汽爆液。冷卻至室溫后測定其總糖及還原糖含量。其中，還原糖含量測定采用Somogyi法，以D-木糖為標(biāo)準(zhǔn)?？偺菧y定采用Orcinol-HCl法，以D-木糖為標(biāo)準(zhǔn)。平均聚合度(DP值)＝總糖含量/直接還原糖含量。結(jié)果表明總糖含量22.0mg/mL，還原糖含量4.66mg/mL，DP＝4.72。
用1M NaOH溶液將汽爆液pH調(diào)節(jié)至6.2，4℃冰箱冷藏備用。
2、高溫蒸煮液的制備固液比1∶8，即每100g玉米芯(含木聚糖32.4％)中添加800mL水，加熱至170℃-175℃、保溫時(shí)間30min，保溫過程中不斷攪拌，攪拌速度為60rpm，反應(yīng)結(jié)束后迅速通入冷卻水冷卻至室溫，取出反應(yīng)混合物，經(jīng)布什漏斗抽濾，收集濾液得到高溫蒸煮液，測定其總糖及還原糖含量。其中，還原糖含量測定采用Somogyi法，以D-木糖為標(biāo)準(zhǔn)?？偺菧y定采用Orcinol-HCl法，以D-木糖為標(biāo)準(zhǔn)。平均聚合度(DP值)＝總糖含量/直接還原糖含量。結(jié)果表明總糖含量19.6mg/mL，還原糖含量3.80mg/mL，DP＝5.16。
用1M NaOH溶液將高溫蒸煮液pH調(diào)節(jié)至6.2，4℃冰箱冷藏備用。
實(shí)施例3、利用實(shí)施例1的固定化木聚糖酶連續(xù)水解實(shí)施例2汽爆液或高溫蒸煮液1、用1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB柱水解實(shí)施例2玉米芯汽爆液或高溫蒸煮液實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)在內(nèi)徑15mm的不銹鋼夾套層析柱中加入40g濕態(tài)(由10g Eupergit C 250L制備)1M磷酸緩沖液處理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB，酶床實(shí)際高度為33cm，連接恒流泵和部分收集器(圖5)，用50mM，pH 6.2的檸檬酸緩沖液平衡30min。底物為玉米芯汽爆液或高溫蒸煮液，其中，玉米芯汽爆液總糖含量22.0mg/mL，還原糖含量4.66mg/mL；玉米芯高溫蒸煮液總糖含量19.6mg/mL，還原糖含量3.80mg/mL。使不銹鋼夾套的溫度保持90℃，底物流速1.5倍柱床體積/h連續(xù)反應(yīng)，收集流出液(水解液)，用HPLC分析流出液糖組成以及采用Somogyi法，以D-木糖為標(biāo)準(zhǔn)測定流出液中還原糖含量。合并并濃縮流出液用于制備木二糖。其中，高效液相分析(HPLC)采用KS-802型糖柱，柱溫80℃；流動相為超純水，流速0.6mL/min；采用視差檢測器，檢測溫度45℃。
結(jié)果表明玉米芯汽爆液水解產(chǎn)物主要以木二糖為主，HPLC測得其糖組分及比例為阿拉伯糖∶木糖∶木二糖∶木三糖∶木四糖∶木五糖＝6.1∶12.7∶27.9∶5.4∶2.9∶1.0；木二糖所占比例為49.8％，單糖為33.6％，其他寡糖為16.6％。
玉米芯高溫蒸煮液水解產(chǎn)物主要以木二糖為主，HPLC測得其糖組分及比例為阿拉伯糖∶木糖∶木二糖∶木三糖∶木四糖∶木五糖＝5.6∶10.5∶25.8∶5.2∶2.8∶1.3；木二糖所占比例為50.3％，單糖為31.4％，其他寡糖為18.7％。
實(shí)施例4、活性炭柱分離和木二糖結(jié)晶將活性炭柱(直徑3.5cm，高45cm，內(nèi)裝層析用活性炭85g)用去離子水以流速為110mL/h平衡12h后備用。取實(shí)施例3玉米芯汽爆液連續(xù)水解液濃縮至200mL，總糖16.0g(總糖含量為80mg/mL，還原糖含量為48mg/mL)，木二糖為7.97g。將含總糖為16g的濃縮液以流速110mL/h上樣，結(jié)束后開始進(jìn)行程序洗脫，洗脫速度穩(wěn)定在110mL/h，洗脫程序?yàn)槿ルx子水水洗1L以洗凈單糖和鹽分，再用0-15％乙醇溶液(總體積8L)線性洗脫72.7小時(shí)，洗脫液全部用自動部分收集器收集，1瓶/h，110mL/瓶，線性洗脫后采用50％乙醇溶液1L洗脫并收集。測定所收集的每瓶糖液的總糖含量，并TLC檢測糖組成。合并木二糖組分。其中，薄層層析法(TLC)薄層板采用硅膠板(Merck，Gel Plate F254)；展層系統(tǒng)采用乙腈∶水＝85∶20(v/v)；5％硫酸甲醇溶液蘸板，晾干后100℃顯色2min。
活性炭層析分離酶解液的結(jié)果見圖6，表明0-15％乙醇溶液線性洗脫能很好的發(fā)揮活性炭柱層析的分離效果，得到明顯的2個(gè)峰，分別對應(yīng)了水解液單糖(圖6中第一個(gè)峰，即第4瓶-第7瓶洗脫液，110mL/瓶)和木二糖(圖6中第二個(gè)峰，以X2(8-38)示，第8瓶-第38瓶洗脫液，110mL/瓶)。說明先用的770mL去離子水完全洗凈單糖和鹽分，再用0-15％乙醇溶液線性洗脫33小時(shí)(3300ml)就可將木二糖完全洗脫。
結(jié)果表明收集所得總糖共計(jì)14.49g，總糖回收率為90.5％。含木二糖單一組分的收集液中總糖為6.67g，木二糖的回收率為83.4％，占收集液中總糖的46.0％。最后合并含單一木二糖組分的收集液于55℃真空濃縮至過飽和糖漿狀態(tài)，加入木二糖晶種，室溫靜置等待結(jié)晶。共得到晶體5.51g，晶體的收得率為34.4％。晶體熔點(diǎn)為184-186℃。經(jīng)HPLC測定純度為99.1％且保留時(shí)間(圖7)與標(biāo)準(zhǔn)品一致。圖7中，X2示木二糖。
木二糖晶體收得率(％)＝木二糖晶體質(zhì)量/原料中木聚糖質(zhì)量×100。
序列表<160>3<210>1<211>1079<212>DNA<213>海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)<400>1atggaaatat taccttctgt gttgatcctt ttgttgggat gtgttccagt tttcagctct 60cagaatgtat ctctgagaga actcgcagaa aagctgaaca tctatattgg ttttgccgca120atcaacaact tttggtctct ttccgacgca gaaaagtaca tggaagttgc aagaagagaa180ttcaacatcc tgacccctga gaaccggatg aagtgggata cgattcatcc agaaagagac240agatacaatt tcactcccgc agaaaaacac gttgagtttg cagaagaaaa cgacatgatc300gtgcatggac acactcttgt ctggcacaac cagcttcctg gatggatcac tggtagagaa360tggacaaagg aagaactttt gaacgttctt gaagaccaca taaaaacggt ggtgtctcat420ttcaaaggta gagtgaagat ctgggatgtg gtgaacgaag cggtgagcga ttctggaacc480tacagggaaa gcgtgtggta caagacgatc ggtcctgaat acattgaaaa agcgttcaga540tgggcgaaag aagccgatcc agatgcgatt ctcatctaca acgactacag catagaagaa600atcaacgcaa aatcgaantt cgtctacaac atgataaaag agctgaaaga aaagggagta660cctgttgatg gaataggatt tcagatgcac atagactaca gagggctcaa ttatgacagt720ttcagaagga atttggagag atttgcgaaa ctcggtcttc aaatatacat cacagagatg780gatgtgagaa ttcctctcag tggttcggag gagtattatt tgaaaaaaca ggctgaagtt840tgtgcgaaga tcttcgatat atgcttggac aaccctgcag ttaaagcgat ccagttttgg900ggattcacag acaaatactc ctgggttccc ggctttttca aagggtacgg gaaagcgttg960ctcttcgatg agaattacaa ccccaagcct tgttattacg cgataaaaga ggtgctggag 1020aaaaagatag aagaaagaaa aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccac1079<210>2<211>27<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ccatggaaat attaccttct gtgtgat27<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3aagctttctt tcttctatct ttttctcca 29
權(quán)利要求
1.一種固定化木聚糖酶的制備方法，包括如下步驟1)用金屬螯合環(huán)氧載體Eupergit C 250L固定重組木聚糖酶XynB，得到固定化酶；2)將步驟1)得到的固定化酶懸浮于0.5-1.25M、pH為5.5-8.0磷酸鹽緩沖液中，20-35℃反應(yīng)12-60小時(shí)，得到固定化木聚糖酶；所述重組木聚糖酶XynB是將核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列的木聚糖酶基因經(jīng)大腸桿菌表達(dá)得到的木聚糖酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述重組木聚糖酶XynB按照如下方法制備以海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)MSB8 DSM3109的基因組DNA為模板，利用核苷酸序列是序列表中序列2和序列3的引物PCR擴(kuò)增核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列的木聚糖酶基因，將PCR擴(kuò)增到的木聚糖酶基因插入表達(dá)載體pET28a(+)得到含有核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列的木聚糖酶基因的重組表達(dá)載體pET28a/XynB，將重組表達(dá)載體pET28a/XynB導(dǎo)入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)得到重組木聚糖酶XynB。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述金屬螯合環(huán)氧載體Eupergit C250L固定化重組木聚糖酶XynB中的金屬來自Cu2+、Co2+、Zn2+或Ni2+；所述步驟1)中按照下述方法用金屬螯合環(huán)氧載體Eupergit C 250L固定重組木聚糖酶XynB環(huán)氧載體Eupergit C 250L經(jīng)亞氨基二乙酸活化后螯合金屬離子Cu2+、Co2+、Zn2+或Ni2+，再按80-1500U重組木聚糖酶XynB/g環(huán)氧載體Eupergit C 250L的比例加入重組木聚糖酶XynB，固定12-48h得到固定化酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述金屬離子為Ni2+，所述重組木聚糖酶XynB與環(huán)氧載體Eupergit C 250L的比例為80-800U/g，優(yōu)選為288U/g，所述固定時(shí)間為24h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中磷酸鹽緩沖液的濃度為1M、pH 7.0，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)。
6.由權(quán)利要求1至5中任一所述方法制備的固定化木聚糖酶。
7.一種利用權(quán)利要求6所述的固定化木聚糖酶生產(chǎn)木二糖的方法，包括如下步驟1)對含木聚糖的纖維質(zhì)原料進(jìn)行汽爆或高溫蒸煮處理，得到含有木聚糖溶出物的汽爆液或高溫蒸煮液，將所述汽爆液或高溫蒸煮液的pH調(diào)至5.5-7.0；2)將權(quán)利要求6所述的固定化木聚糖酶裝柱，在70～95℃下，將汽爆液或高溫蒸煮液以1.0-8.0倍柱床體積/小時(shí)的流速過柱，收集流出液，得到木二糖溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述含木聚糖的纖維質(zhì)原料為玉米芯、甘蔗渣、棉籽殼和小麥秸稈中的一種或其任意組合；所述汽爆或高溫蒸煮按照如下方法處理將所述含木聚糖的纖維質(zhì)原料粉碎后，加入是所述含木聚糖的纖維質(zhì)原料質(zhì)量6-10倍的水，在160-180℃反應(yīng)20-60min，收集濾液得到汽爆或高溫蒸煮液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述含木聚糖的纖維質(zhì)原料為玉米芯；所述汽爆或高溫蒸煮處理?xiàng)l件為將玉米芯粉碎至40目-80目，加入是玉米芯質(zhì)量8倍的水，在170℃反應(yīng)為30min，收集濾液得到汽爆或高溫蒸煮液。
10.根據(jù)權(quán)利要求7、8或9所述的方法，其特征在于步驟2)中，將固定化木聚糖酶裝柱后，在90℃下，將pH為6.2的汽爆液或高溫蒸煮液以1.5-4.0倍柱床體積/小時(shí)的流速過柱。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述方法中還包括純化木二糖溶液得到木二糖結(jié)晶的步驟；所述純化方法為將所述步驟2)收集的流出液過活性炭層析柱，先用去離子水洗凈單糖和鹽分，再用0-15％乙醇溶液線性洗脫得到木二糖，經(jīng)過結(jié)晶得到木二糖結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備木二糖的方法及其專用固定化酶。本發(fā)明的固定化木聚糖酶按照包括如下步驟的方法制備1)用金屬螯合環(huán)氧載體Eupergit C 250L固定重組木聚糖酶XynB，得到固定化酶；2)將步驟1)得到的固定化酶懸浮于0.5－1.25M、pH為5.5－8.0磷酸鹽緩沖液中，20－35℃反應(yīng)12－60小時(shí)，得到固定化木聚糖酶；所述重組木聚糖酶XynB是將核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列的木聚糖酶基因經(jīng)大腸桿菌表達(dá)得到的木聚糖酶。該固定化木聚糖酶的酶活力回收較高，穩(wěn)定性和裝柱后連續(xù)操作性能優(yōu)良，便于連續(xù)化生產(chǎn)，且產(chǎn)物組成穩(wěn)定易于控制；利用該固定化木聚糖酶生產(chǎn)木二糖，水解操作簡單，可節(jié)約酶的用量，還可實(shí)現(xiàn)酶與水解液的分離，大幅度降低生產(chǎn)成本并提高生產(chǎn)效率。因此，該方法是一種適宜工業(yè)化生產(chǎn)木二糖的方法。
文檔編號C12N9/24GK1916171SQ200610113099
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月11日
發(fā)明者江正強(qiáng), 李里特, 李道義, 朱運(yùn)平 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)